Báo cáo-SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan hỗ hợp mẫu phân tích theo từng lớp qua chất nhồi cột pha tĩnh từ đầu cột tách đến cuối cột tách.. Là sự vận chuyển và phân bố lạ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NAM CẦN THƠ

Khoa Dược

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

(Hight-performance Liquid Chromatography- HPLC)

1

Phạm Thị Huỳnh Hoa

Lê Quan Hải

Cao Thị Mỹ Duyên

Nguyễn Phước Duy

Lương Gia Hân

Phạm Phong Quang

Lê Kim Ngân

Nguyễn Thanh Nhẫn

DH17DUO01 – Nhóm 3

1970, ban đầu chỉ ra rằng áp suất cao được

sử dụng để tạo ra dòng chảy qua cột sắc ký

 Là công cụ mạnh mẽ nhất trong hóa học phân tích.

 Có khả năng tách, định danh và định lượng các hợp chất có mặt trong bất kỳ mẫu nào có thể hòa tan trong chất lỏng.

 Áp dụng cho bất kỳ mẫu nào, chẳng hạn như dược phẩm, thực phẩm, chế phẩm dinh dưỡng, mỹ phẩm, môi trường, pháp y và hóa chất công nghiệp

4

trên sự tương tác của các thành phần chất phân tích, pha tĩnh và pha động.

NGUYÊN TẮC VÀ PHÂN

LOẠI

1

6

Là kĩ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình vừa có tính chất hóa học + lý học

Là kĩ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình vừa có tính chất hóa học + lý học

Là những cân bằng động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động

Là những cân bằng động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động

Là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan (hỗ hợp mẫu phân tích) theo từng lớp qua chất nhồi cột (pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột tách

Là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan (hỗ hợp mẫu phân tích) theo từng lớp qua chất nhồi cột (pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột tách

Trong quá trình sắc ký có chất tan bị lưu giữ lâu

trên cột, có chất tan bị lưu giữ ít  có quá trình tách các chất xảy ra trên cột sắc ký

Trong quá trình sắc ký có chất tan bị lưu giữ lâu

trên cột, có chất tan bị lưu giữ ít  có quá trình tách các chất xảy ra trên cột sắc ký

1.1 NGUYÊN TẮC

Hình 2: Các chất được tách ra với thời gian lưu

tương ứng.

tĩnh

Sắc ký đại diện cho thấy phân tích 45 axit amin sử dụng thuốc thử aTRAQ và phân tích LC/MS/MS Tổng thời gian chạy là 18 phút.

Sắc ký trao đổi ion

Sắc ký loại trừ kích thước

1.2

Phân bố

Dựa vào vật liệu nhồi

- Pha tĩnh: được nhồi trong cột

- Pha động ở trạng thái lỏng: các dung môi, hỗn hợp

dung môi hoặc nước

+ Pha thông thường (Normal phase): vật liệu nhồi

là silica đơn giản

+ Trao đổi ion: silica biến tính (modified silica)

+ Pha đảo (reverse-phase): silica biến tính

CẤU TẠO MÁY HPLC

14

2.1 PHA ĐỘNG (dung môi)

Nhiệm vụ:

- Cung cấp dung môi cho quá trình sắc ký

- Đưa chất phân tích ra khỏi cột sắc ký

Nhiệm vụ:

- Cung cấp dung môi cho quá trình sắc ký

- Đưa chất phân tích ra khỏi cột sắc ký

2.1.1: Yêu cầu với dung môi

- Có một hoặc nhiều bình chứa dung môi (V=500 ml)

- Loại bỏ hoàn toàn khí hòa tan và cặn trong dung môi

- Đuổi khí hòa tan trong dung môi bằng khí trơn

- Lựa chọn chế độ tách rửa cho dung môi

- Trang bị các loại valves tỷ lệ cho phép đưa dung môi từ

2 bình chứa với các lưu lượng thay đổi liên tục

2.1.2: Lựa chọn dung môi

- Dựa vào sự phân cực của cấu tử phân tích, pha động,

pha tĩnh

- Quy tắc chung: độ phân cực của cấu tử cần phân tích +

pha động : tương đương, pha tĩnh có độ phân cực khác biệt  thời gian phân tích ngắn

- Độ phân cực của cấu tử + pha tĩnh giống nhau  thời gian phân tích kéo dài

Độ phân cực của một số dung môi

Polar Solvents (dung môi phân cực)

Water > Methanol > Acetonitrile > Ethanol > Oxydipropionitrile

Non-porla Solvents (dung môi không

phân cực)

N-Decane N-Hexane N-Pentane Cyclohexane

2.1.3 Chế độ chạy- Quá trình tách rửa

Van mẫu

Bơm

Bộ phận hòa trộn

Bộ phận hòa trộn Dung môi 3

Nhược điểm Hệ thống 3 van lấy 3 dung

môi phức tạp, chi phí cao

Hệ thống 3 van lấy 3 dung môi phức tạp, chi phí cao

* Ở áp suất cao

Dung môi 1

Van mẫu Dung môi 2

Dung môi 3 Bơm 3

Bơm 2

Bơm 1

Bộ phận hòa trộn

Ưu điểm Độ đúng và độ lặp lại cũng cao hơn

Nhược điểm Tốn kém + cồng kềnh

môi

Yêu cầu

Máy sắc ký lỏng hiện đại (UPLC)

có cấu hình hoàn thiện hơn

Bơm tạo được áp suất cao có thể đến 700 bar

Bơm tạo được áp suất cao có thể đến 700 bar

Tạo lưu lượng dòng trong

lý cơ bản là mẫu ban đầu

được nạp vào trong vòng

- Sử dụng vale 6 cổng

- Có thể thay thế sampling loops từ 5µl đến 500 µl

- Sai số của lượng mẫu nạp dưới 1%

Tiêm mẫu bằng xi lanh

Auto sampler chứa nhiều mẫu và tiêm lần lượt các mẫu

vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn

Tiêu đề

28

2.4 CỘT TÁCH VÀ PHA TĨNH

Cột được chế tạo bằng thép không gỉ trơ với hoá chất và chịu được áp suất cao

Cột được chế tạo bằng thép không gỉ trơ với hoá chất và chịu được áp suất cao

*Nhiệm vụ: Cột chứa pha tĩnh,Tách các mẫu chất ra khỏi

+ Cột tốc độ cao và hiệu quả hơn:

 L=3-7 cm và có thể nối tiếp 2 cột hoặc nhiều hơn

 ID=1- 4,6 mm

 Kích thước hạt nhồi: 3 hoặc 5 µm

 100.000 đĩa/m cột

30

2.4.1: Cột nhồi

Cột có chiều dài thường cỡ hạt 5 hoặc 10 µm

Số đĩa lý thuyết dao động 4000 đến 60000/m.

Hạt hình cầu Hạt không đều Hình dạng hạt hồi (pha tĩnh)

2.4.2 Cột bảo vệ

2.4.3 Ổn định nhiệt độ của cột

Phần lớn ứng dụng của HPLC được thực hiện ở nhiệt

độ phòng

Tuy vậy chất lượng của sắc ký sẽ tốt hơn nếu duy trì

nhiệt độ của cột không thay đổi (sai số < 0,05 độ C)

Thiết bị HPLC hiện đại được trang bị thêm lò gia nhiệt cho cột (Column heater) ổn định nhiệt độ ở gần 150 độ C

Trang bị hệ thống phun nước làm lạnh từ bể ổn nhiệt để khống chế chính xác nhiệt độ

Nhiệm vụ

Phát hiện và đo nồng các chất phân tích theo tính chất hoá lý (định tính và định lượng) bằng cách chuyển các tính hiệu không điện thành tín hiệu điện

Phát hiện và đo nồng các chất phân tích theo tính chất hoá lý (định tính và định lượng) bằng cách chuyển các tính hiệu không điện thành tín hiệu điện

2.5.2 Detector UV-VIS

Đây là loại được sử dụng phổ biến trong sắc ký lỏng dựa trên

sự hấp phụ bực xạ UV-VIS (bước sóng 190-800nm) của các chất phân tích

*3 cấu hình của Detector hấp phụ UV-VIS

 Detector đo ở bước sóng cố định

 Detector đo ở bước sóng thay đổi

 Detector máng diod UV-VIS

Detector US-VIS

2.5.3 Detector huỳnh quang

 Sử dụng thiết bị huỳnh

quang kính lọc hoặc quang

phổ huỳnh quang cho

detector huỳnh quang

 Do độ nhạy cao nên sử

dụng cho phân tích lượng

vết, mẫu sinh học, giám

định pháp y…

2.5.4 ĐẦU DÒ DAD (Detector Diod Array)

Định tính

Có khả năng quét chồng phổ chất thử với chất chuẩn để định tính được ngay chất phân

tích theo thư viện phổ.

Khối phổ

Phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các chất ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định

Là một kỹ thuật cao, áp dụng cho phân tích hầu hết các loại

chất, chất bền nhiệt hay không bền nhiệt

Độ nhạy cao, có thể phát hiện được chất có LOD < 1 pg

Thể hiện thời

gian lưu của

chất

Tách chất và xác định hàm lượng của chất thông qua độ hấp thụ.

2.6 MÁY TÍNH

CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG TRONG HPLC

3

Cân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc kí có thể được

mô tả bằng phương trình như sau:

Xpha động Xpha tĩnh

Hằng số k cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố hay hằng số phân bố

K =

Với C S : nồng độ cấu tử trong pha tĩnh

C M : nồng độ cấu tử trong pha động

Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động

và chất phân tích

3.1 HỆ SỐ PHÂN BỐ

đầu cột đến cuối cột và còn gọi là thời gian lưu chết.

 t R’ : là thời gian lưu thật của một cấu tử

3.2 THỜI GIAN LƯU

 k’ được định nghĩa theo công thức sau :

lâu, mũi có khả năng bị tù

 Khoảng k’ lý tưởng là 2-5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp, k’ có thể chấp nhận trong khoảng rộng 1-20

 

3.3 HỆ SỐ DUNG LƯỢNG K’

 Số đĩa lý thuyết có thể đo trên sắc ký đồ.

N = 5.54 *()2 hay N = 16*()2

Với W 1/2 là chiều rộng pic sắc ký ở vị trí ½ chiều cao pic (phút).

W là chiều rộng pic sắc ký ở vị trí đáy pic (phút).

 Hiệu năng hay số đĩa lý thuyết N của cột đặt trưng cho khả năng tách sắc ký của các cấu tử trên cột N càng lớn, hiệu năng tách càng cao

 

3.4 HIỆU NĂNG (Số đĩa lý thuyết)

 Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột.

 =

 Giá trị chọn lọc luôn lớn hơn 1

 Giá trị lớn hay nhỏ đều tác động đến quá trình tách sắc ký

 

3.5 ĐỘ CHỌN LỌC

 Đây là đại lượng biểu thị rỏ cả ba khả năng của cột sắc ký: sự giải hấp, sự chọn lọc và hiệu quả tách Nó được xác định qua phương trình sau:

R = 2*

R =

 

3.6 ĐỘ PHÂN GIẢI

Kỹ Thuật

Tách HPLC

4

 Sắc ký phân bố (partition chrmatgraphy)

 Sắc ký hấp phụ hoặc lỏng rắn (adsorption or liquid-solid

chromatography)

 Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography)

 Sắc ký loại trừ kích thước (size exclusion chromatography)

4.1 CÁC KỸ THUẬT SẮC LỎNG HIỆU NĂNG

CAO

Các chất phân tích có khối

lượng phân tử dưới 5000, ít

tan trong nước hoặc trong

hỗn hợp nước-dung môi hữu

cơ không thích hợp với sắc

ký pha đảo

Có thế mạnh trong việc tách các đồng phân vị trí các hợp chất hữu cơ, phân tích các chế phẩm dầu mỏ, thực phẩm, dược phẩm…

Ứng dụng

Dựa vào lực hút của ion chất tan và vị trí mang điện tích trên pha tĩnh Chất trao đổi anion có nhóm mang điện tích

dương trên pha tĩnh hút anion chất tan

Chất trao đổi cation có nhóm mang điện tích âm sẽ hút

cation chất tan

Chất trao đổi cation và anion là polymer không tan trong

nước mang các nhóm trao đổi ion

4.4 SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION

Nguyên lý

Tinh chế nguyên liệu loại tạp chất: Tăng nồng độ các thành phần vi lượng trong dung dịch đủ để phân tích

Áp dụng cho sắc ký hiện đại

Ứng dụng

Sự tách ở đây dựa theo kích thước của phân tử của các

chất mẫu được phân bố khác nhau vào trong các lỗ xốp của pha tĩnh

Các phân tử có kích thước nhỏ sẽ chui vào bên trong lỗ xốp của hạt pha tĩnh nên được rửa giải sau Các phân tử có

kích thước lớn nằm ở ngoài nên được rửa giải ra trước

4.5 SẮC KÝ PHÂN BỐ (SKPB)

Nguyên lý

Tuân theo các quy luật phân bố của chất tan giữa 2 pha không trộn lẫn là pha động

và lớp màng pha tĩnh

Ứng dụng

SKPB được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000)

4.5.1 Phân loại SKPB

Được chia thành 2 loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động:

- Sắc ký pha thường (SKPT):

+ pha tĩnh (triethylen glycol, nước) có độ phân cực cao hơn

pha động (hexan, isopropyl ether)

+ Phương pháp này dùng để tách và phân tích các hợp chất

có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm (dược phẩm, y học, môi trường)

Tại sao thường sử dụng sắc ký pha

đảo?

1 Thuốc muốn được hấp thu thường phải đi qua màng

Mục đích: Có được sự tách hoàn toàn các chất cần phân

tích trong thời gian ngắn nhất khi đi qua cột

TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH

SẮC KÝ

5

 Sắc ký đồ rửa giải của 1 pic có dạng giống với biểu đồ phân bố

Gauss

 Phương trình Gauss có đồ thị là 1 đường cong đối xứng, đồ thị đi qua 2 điểm uốn tại x = +1 và x = -1 (chiều cao pic tương ứng tại

điểm uốn là 60%) Độ rộng tại điểm uốn là 2s.

 Trong sắc ký đồ w1/2 là ký hiệu cho độ rộng tại ½ chiều cao pic

(w=2,35s) Độ rộng của pic tính tại nền và được đo ở chiều cao

đạt được 13,5% so với chiều cao cực đại là w=4s

Khu vực giữa -2 và +2 chiếm 95,4% tổng diện tích dưới đường cong và giáp

- Pic thực tế thu được từ sắc đồ thường sai lệch với pic trong trường hợp lý tưởng của phân bố Gauss do nhiều lý

do như sai lệch về nồng độ giữa các lần tiêm, tốc độ dòng pha động không đều tại các vị trí trong cột

 Đĩa lý thuyết của Craig được coi là thuyết giải thích quá

trình di chuyển và phân tách các cấu tử chất tan trong cột là hợp lý nhất

 Trong sắc ký lỏng-rắn các tiến trình cơ bản này là tuần hoàn của sự hấp phụ và giải hấp phụ Các bước này tái lập lại

tuần hoàn theo sự di chuyển của các cấu tử trong cột

 Đĩa lý thuyết: là mỗi bước tương ứng với 1 trạng thái cân

bằng mới, xếp dọc theo chiều dài của cột

 Ta có H =

5.2 ĐĨA LÝ THUYẾT

 Nếu tính lượng chất trên đĩa thứ J tại thời điểm I ta có:

m t (I,J)=m M (I-1,J-1)+m S (I-1,J)

 Hạn chế của đĩa lý thuyết: không giải thích được hiện

tượng giãn rộng pic do không tính đến phân tán trong cột

Đĩa

Đĩa

Đĩa

 Phương trình mô tả sự ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động đến hiệu quả tách

Tăng chiều dài của cộtGiảm đường kính của cộtGiảm lưu lượng pha động

Pha tĩnh đồng nhấtGiảm thể tích bơm mẫuLựa chọn pha tĩnh sạch hơnLựa chọn pha động tinh khiết hơn

Sử dụng áp suất ổn định hơn

Thành phần của pha động thay đổi hợp lý

5.4 CÁC PHƯƠNG NÂNG CAO ĐỘ PHÂN

GIẢI

ỨNG DỤNG CỦA

HPLC

6

73

HPLC sử dụng để

làm gì?

• Định tính, định lượng

• Tách và phân tích chủ yếu các hợp chất khó bay hơi

hoặc không bền nhiệt.

* Loại hợp chất không bền nhiệt gồm:

 Ngoài ra còn có thể xác định với các hợp chất bền nhiệt, tuy nhiên dùng GC thích hợp hơn

• nd

76

6.1 Phạm vi ứng dụng

Vì sao HPLC được lựa chọn trong phân tích dược liệu?

o HPLC có rất nhiều ứng dụng trong nghiên cứu các hợp

chất tự nhiên nới chung và nghiên cứu dược liệu nói riêng

o Ưu điểm lớn nhất là có thể phân tích được rất nhiều loại

hợp chất khác nhau, khả năng phân tích của nó rộng hơn GC

o Có thể dùng HPLC để phân tích các chất từ chất phân cực

-> không phân cực, từ chất bay hơi -> chất không bay hơi, từ chất trung tính -> chất điện ly.

o Tính linh hoạt của HPLC cũng cao hơn các phương pháp

khác nhờ các cơ chế tách, pha tĩnh và pha động đa dạng,

phong phú.

o Với hiệu năng tách cao, khả năng phân tích rộng như

vậy, HPLC hiện vẫn là lựa chọn ưu tiên trong phân tích hay điều chế các chất

 Thiết bị HPLC và HPLC/MS là một trong những công cụ

hỗ trợ rất lớn cho nghiên cứu thực nghiệm (trên động

vật: chuột, thỏ) về mặt đánh giá một số thông số dược

động học.

 LC-MS được ứng dụng rất nhiều trong nghiên cứu về dược phẩm Những nghiên cứu trên HPLC cung cấp

một cách nhanh chóng các thông tin về lưu lượng,

chu kỳ phân huỷ của 1 loại thuốc trong máu, gan hay

các bộ phận của cơ thể

 Xác định được các sản phẩm chuyển hoá trung gian,

biến tính của dược phẩm trong cơ thể: sàng lọc thuốc,

kiểm tra sự ổn định, nhận dạng các chất chuyển hoá,

xác định tạp chất, định lượng và kiểm soát chất lượng

Dược động học

 Định lượng riêng lẻ các chất trong hỗn hợp phức tạp của

dịch chiết dược liệu

 Có thể dễ dàng phân tích các chất trong hỗn hợp ở mức ppm tới ppb, thậm chí ppt

 Phân tích điểm chi xác định nguồn gốc xuất xứ của dược

liệu, xác định các nguyên liệu khác pha trộn vào dược liệu, xác định các sản phẩm nhái, giả mạo,…

 Xác định và phân tích tính chất của các loại thuốc được sản xuất bởi các hợp chất hoá học hay thiên nhiên Kiểm tra chất

lượng hợp chất trong thuốc suốt quá trình sản xuất.

 Nhiều nhà nghiên cứu hiện nay sử dụng các thiết bị ghép nối

LC-MS-NMR để phân tích thành phần các dịch chiết và xác

định cấu trúc của các chất trong hỗn hợp mà không cần tách riêng

Dược phẩm

 Phân tích đa lượng các vitamin, kháng sinh, kháng

khuẩn, chất bảo quản phụ gia thực phẩm, các loại

đường,… trong thực phẩm, dược liệu, hoá chất, phân bón, thức ăn gia súc,

 Phân tích vi lượng các vitamin trong trái cây, sữa, bánh kẹo,…

 Đặc biệt, hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang có

độ nhạy và tính chọn lọc cao có thể phân tích các độc

tố Mycotoxin trong thực phẩm, nguyên liệu chế biến

thức ăn, gia súc như Aflatoxin, Orchatoxin,

Zearalenone,…

VD: Xác định đồng thời hàm lượng paracetamol và caffein

trong một số dược phẩm bằng phương pháp HPLC

- Chọn điều kiện phù hợp để tách và xác định đồng thời hàm lượng 2 chất trên bằng hệ thống sắc kí HPLC sử dụng detector UV-VIS.