Báo cáo các phương pháp phổ ứng dụng trong nghiên cứu Dược liệu

Trước đây khi chỉ có các kỹ thuật tách ở trước điểm cuối của khối phổ, chỉ có một khoảng thời gian nhất định để có được tất cả thông tin này trên một giải phân chất phân tích.. Phổ khối

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA DƯỢC

BÁO CÁO MÔN PHƯƠNG PHÁP PHỔ ỨNG DỤNG TRONG

NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU

TP HCM, 05/2018

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA DƯỢC

BÁO CÁO MÔN PHƯƠNG PHÁP PHỔ ỨNG DỤNG TRONG

NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU

MỤC LỤC

MỤC LỤC 3

I ĐẶT VẤN ĐỀ 5

II GIỚI THIỆU PHỔ KHỐI 6

2.1 Giới thiệu 6

2.2 Nguyên tắc 6

2.3 Sự cải tiến của phổ khối 7

III CÁC CHẤT CAO PHÂN TỬ 8

3.1 Khái niệm chất cao phân tử 8

3.2 Các hợp chất cao phân tử điển hình 8

3.2.1 Axid amin 8

3.2.2 Carbohydrat 9

3.2.3 Lipid 9

3.2.4 Nucleotid 9

IV ỨNG DỤNG PHỔ KHỐI TRONG PHÂN TÍCH CÁC CHẤT TRONG HỖN HỢP, CÁC CHẤT CAO PHÂN TỬ 9

4.1 Protein và Peptid 9

4.1.1 Phân tích protein và peptid bằng phương pháp ion hóa ESI và MALDI 10

4.1.2 Cấu trúc và xác định chuỗi thông qua sự phân mảnh 12

4.1.3 Ứng dụng 15

4.2 Oligonucleotid 17

4.2.1 Khối phổ của Oligonucleotid 17

4.2.2 Sự phân mảnh của Oligonucleotid 18

4.2.3 Đặc trưng của sự biến đổi Oligonucleotid 20

4.2.4 Các ứng dụng của phổ khối trên Oligonucleotid 21

4.3 Oligosaccharid 21

4.3.1 Khối phổ của Oligosaccharid 22

4.3.2 Phân mảnh Oligosaccharid 22

4.4 Lipid 23

4.4.1 Acid béo 24

4.4.2 Acylglycerol 26

4.4.3 Axid mật 27

4.5 Metabolomic 28

4.5.1 Phổ khối trong Metabolomic 28

4.5.2 Ứng dụng 28

III KẾT LUẬN 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO 29

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Phương pháp phổ khối hay phổ khối lượng viết tắt là MS (Mass Spectrometry), là một một phương pháp phân tích công cụ quan trọng để phân tích thành phần và cấu trúc của các hợp chất

vô cơ và hữu cơ Phổ khối ngày nay khác biệt rất nhiều so với các phương pháp phân tích cổ điển

và so với năm mươi năm trước khi nó lần đầu tiên được sử dụng như một công cụ phân tích chung Nguyên tắc cơ bản của nó vẫn không thay đổi nhưng các thiết bị hỗ trợ liên tục được cải tiến Từ đó các ứng dụng của phổ khối trong sinh học đã mở rộng với một tốc độ phi thường và các cải tiến mới để giải thích thông tin phổ khối đang được phát triển để giải quyết các câu hỏi mới [5]

Đại phân tử sinh học là các phân tử hữu cơ phức tạp Những phân tử này hình thànhthành phần cấu trúc cơ bản của một tế bào sống Các hợp chất hữu cơ nnhư axit amin, nucleotid và monosaccharid đóng vai trò như các khối xây dựng các phân tử sinh học phức tạp Các phân tử sinh học quan trọng là protein, carbohydrat và chất béo, enzym, vitamin, kích thích tố và axit nucleic.Hầu hết các phân tử sinh học đều rất lớn và cực kỳ phức tạp Phản ứng của chúng liên

quan đến các cơ chế phức tạp [1]

Ngày nay, khối phổ đã trở thành một trong những kỹ thuật phân tích được sử dụng rộng rãi nhất trong khoa học đời sống Do đó trong phạn vi bài báo cáo này sẽ trình bày ứng dụng của phổ khối trong phân tích các đại phân tử sinh học như: peptide, protein, axit nucleic, oligosaccharides và chất béo

II GIỚI THIỆU PHỔ KHỐI

2.1 Giới thiệu

Trong phổ khối, người ta tạo ra các ion từ một mẫu để phân tích Những ion này sau đó được tách biệt và phát hiện để định lượng Việc tách các ion được thực hiện trên cơ sở sự khác nhau về quỹ đạo chuyển động của các ion với các tỷ lệ (m/z) khác nhau trong điện và/hoặc từ trường Khối phổ đã phát triển từ các thí nghiệm và nghiên cứu vào đầu thế kỷ 20 đã giải thích trạng thái của các hạt tích điện trong các trường lực từ trường và tĩnh điện Những cái tên nổi tiếng từ những ngày đầu này là J J Thompson điều tra htrạng thái ion trong điện trường và từ trường (1912), A

J Dempster hướng tập trung (1918) và F W Aston tập trung năng lượng (1919) Các ứng dụng phân tích đầu tiên sau đó tiếp tục khi phổ khối thương mại đáng tin cậy đầu tiên được sản xuất Chủ yếu cho định lượng xác định một số thành phần trong hỗn hợp phức tạp của dầu thô Vào đầu những năm sáu mươi, bắt đầu việc áp dụng phổ khối để xác định và làm sáng tỏ cấu trúc các hợp chất hữu cơ phức tạp hơn, bao gồm cả polyme và biomolecul Kể từ đó, kỹ thuật này đã phát triển thành một công cụ mạnh mẽ và linh hoạt cho mục đích này, cung cấp thông tin một phần bổ sung và kết hợp với các kỹ thuật khác, chẳng hạn như NMR Điều đáng ngạc nhiên là một kỹ thuật mà ngay từ cái nhìn đầu tiên dường như không cung cấp thêm thông tin gì ngoài trọng lượng của một hạt nhân Nhưng kiểm soát sự phân mảnh của các ion phân tử ban đầu mang lại

những thông tin thú vị có thể đóng góp cho việc xác định cấu trúc [6]

- Việc tách các ion diễn ra trong máy phân tích đặt trong từ trường, tại áp suất khoảng 10-8 mbar

Từ trường mạnh được áp dụng vuông góc với hướng chuyển động của các ion Các ion chuyển động nhanh sau đó sẽ đi theo quỹ đạo hình tròn, do với gia tốc Lorentz, bán kính được xác định bởi tỷ số khối lượng/điện tích của ion và sức mạnh của từ trường Các ion với các tỷ lệ khối lượng/điện tích khác nhau bị buộc thông qua lối thoát-khe bằng biến thể của điện áp tăng tốc (A> B) hoặc bằng cách thay đổi lực từ trường

- Sau khi các ion đã đi qua khe thoát, chúng va chạm vào một điện cực thu Các kết quả hiện tại

được khuếch đại và ghi nhận như một hàm của lực từ trường hoặc điện áp tăng tốc [6]

Hình 2.1 Các bộ phận thiết yếu của máy đo phổ khối phân tích [6]

Hình 2.2 Sơ đồ buồng ion hóa[6]

2.3 Sự cải tiến của phổ khối

Tiến sỹ Guido Verbeck, Phó Giáo sư hóa học tại Đại học Bắc Texas kiêm Giám đốc Phòng thí nghiệm Ghi ảnh Khối phổ, đã thiết kế các thiết bị quang học ion mới nhằm thu nhỏ, chuẩn bị và phân tích khối phổ Ông đã phát triển một khối phổ kế bẫy ion thu nhỏ tại Phòng thí nghiệm Quốc gia Oak Ridge, ba khối phổ chuẩn bị mẫu để lọc vật liệu mới và chất xúc tác và một số ứng dụng phân tích mới đối với tế bào đơn và phân tích pháp y Tiến sỹ Verbeck đã nhận bằng Tiến

sỹ khi còn là một nghiên cứu sinh về hóa học của Proctor & Gamble tại trường Đại học Texas A&M.Ông nhận định, Sự thay đổi lớn nhất trong lĩnh vực phổ khối là thay vì hầu hết các chuyên gia MS đến từ các nhóm hóa hữu cơ như trước đây, hiện nay MS xuất hiện ở mọi lĩnh vực và có nhiều hơn các chuyên gia MS trong từng lĩnh vực Về mặt thiết bị, sự thay đổi lớn nhất là ở độ nhạy Dường như tuân theo Quy luật Moore (một thuật ngữ máy tính cho thấy sức mạnh xử lý của máy tính cứ hai năm sẽ tăng gấp đôi), độ nhạy hiện nay đã đạt tới dưới mức 10-12

và 10

-15

mol/l Sự tiến bộ này thật tuyệt vời, nó cho phép chúng ta ghi hình và làm việc với khối lượng mẫu thấp và vẫn nhận được dữ liệu tốt Một sự thay đổi nữa là tiểu hình hóa đang giúp khối phổ

kế dần nhỏ hơn với độ nhạy cao hơn [4]

Về mặt kỹ thuật ghép nối, dịch chuyển ion đã được cộng đồng chấp nhận như là một kỹ thuật tách cho MS thông lượng cao (IMS-MS) Với kỹ thuật ghi phổ MRM (multiple reaction monitoring) và dịch chuyển ion, có thể nhận được số lượng lớn các dữ liệu có cấu trúc rất nhanh chóng, trong cùng khoảng thời gian mà trước đó chỉ có thể thu thập một quang phổ Với dịch chuyển ion có thể nhận được sự phân tách cực kỳ nhanh chóng, chỉ trong vài phần ngàn giây Trước đây khi chỉ có các kỹ thuật tách ở trước điểm cuối của khối phổ, chỉ có một khoảng thời gian nhất định để có được tất cả thông tin này trên một giải phân chất phân tích Bây giờ, với sự dịch chuyển ion và MRM, có thể nhận được hàng gigabyte dữ liệu từ cột được giải phân trong 10 hoặc 15 giây Bước tiến lớn tiếp theo sẽ là khả năng thực hiện các phạm vi khối phổ lớn thông lượng cao với độ phân giải cao trên toàn bộ phạm vi khối phổ Một bước đột phá khác sẽ nằm trong lĩnh vực tin học - nhận 12 gigabyte dữ liệu hình ảnh và xử lý chính xác Chỉ mất 4 giờ để thu thập 12 gigabyte dữ liệu và mất một tuần để xử lý Những đổi mới về cơ sở dữ liệu và tin học giúp con người sử dụng các thuật toán để đánh giá dữ liệu dựa trên những gì họ đang tìm kiếm sẽ trở nên rất quan trọng [4]

III CÁC CHẤT CAO PHÂN TỬ

3.1 Khái niệm chất cao phân tử

Cơ thể sống rất phức tạp của ngay cả những dạng sống đơn giản nhất Tuy nhiên, từ góc độ hóa học, các thành phần tế bào có thể được tách biệt thành các đại phân tử (DNA, RNA, protein, …), tương đối đơn giản các phân tử (amino acid, monosaccharid, lipid) và tiền chất của chúng: CO2,

H2O và NH3 Nói chung, các đại phân tử có xu hướng là các polyme nhỏ, phân tử sinh học; tuy nhiên, mỗi phân tử này, dù đơn giản hay phức tạp đều tham gia vào vô số các phản ứng trao đổi chất phức tạp Một trường hợp điển hình là đường monosaccharid được tổng hợp từ H2O và CO2

Nó cung cấp năng lượng cho tế bào Ngoài ra, glucose là nguyên liệu xây dựng cơ bản của đại phân tử như tinh bột và cellulose [3]

3.2 Các hợp chất cao phân tử điển hình

3.2.1 Axid amin

Axit amin là các phân tử sinh học nhỏ đa năng nhất Chúng có vai trò cực kỳ quan trọng trong sinh học bao gồm: xây dựng các khối protein đó là các polyme của axit amin, tiền chất của kích thích tố và tiền chất của các phân tử có chức năng sinh lý đặc biệt, ví dụ chất dẫn truyền thần

kinh dopamin và hormon thyroxin đều là dẫn xuất của tyrosin axit amin Như tên gọi của nó, các axit amin chứa các nhóm amino và cacboxyl Có thể được chia thành các nhóm dựa trên tính axid khi hòa tan trong nước, cũng được phân loại theo độ hòa tan, ví dụ, ưa nước và kỵ nước [3]

3.2.2 Carbohydrat

Carbohydrat còn được gọi là đường hoặc sacarit, được định nghĩa là polyhydroxy aldehyd và ceton và/hoặc các dẫn xuất của chúng Chúng là nhóm các phân tử được tìm thấy nhiều nhất trong tự nhiên và tham gia vào cả vai trò vận động và cấu trúc,ví dụ: chúng là đầu mối trong chuyển hóa năng lượng và là trung gian chính trong cấu trúc thực vật và sự trao đổi chất Chúng

có thể tồn tại trong tự nhiên như carbohydrat, nhưng chúng cũng có thể được liên kết hóa học với lipid và protein Carbohydrat đơn giản được gọi là đường, trong khi carbohydrat phức tạp là được gọi là glycoconjugat tức là glycolipid và glycoprotein [3]

3.2.3 Lipid

Lipid còn được gọi là chất béo, là các phân tử sinh học hòa tan trong dung môi hữu cơ nhưng không hòa tan trong dung dịch nước Chúng đóng vai trò thiết yếu trong màng sinh học Tất cả các bào quan từ ty thể đến hạt nhân được bao quanh bởi màng lipid Chúng cũng đóng vai trò nổi bật trong sự trao đổi năng lượng như các thành phần của mô mỡ Cuối cùng, đóng vai trò như kích thích tố, chúng rất cần thiết cho điều hòa sinh lý cho sự trao đổi chất của tế bào Có nhiều hợp chất lipid Bao gồm các: axit béo, triacylglycerol, sphingolipid, phospholipid, glycolipid, lipoprotein, steroid và sterol, prostaglandin [3]

3.2.4 Nucleotid

Giống như các axit amin là các đơn vị xây dựng của protein, nucleotid là đơn vị xây dựng các khối axid nucleic, RNA và DNA Ngoài những vai trò sinh học chính, nucleotid đóng vai trò quan trọng trong chuyển hóa năng lượng, coenzym, và chuyển hóa trung gian Nucleotid bao gồm một base nitơ, đường và nhóm phosphoryl Loại bỏ các nhóm phosphoryl trong một hợp chất được gọi là một nucleosid Có hai loại base được tìm thấy trong nucleotid là purin và pyrimidin Đường là D-ribose hoặc 2-deoxy-D-ribose [3]

IV ỨNG DỤNG PHỔ KHỐI TRONG PHÂN TÍCH CÁC CHẤT TRONG HỖN HỢP, CÁC CHẤT CAO PHÂN TỬ

4.1 Protein và Peptid

Protein và peptid là các polyme tuyến tính được tạo thành từ sự kết hợp của 20 loại axit amin phổ biến nhất liên kết với nhau bằng liên kết peptit Hơn nữa, protein được sản xuất bởi ribosom có thể trải qua những sửa đổi cộng hóa trị, được gọi là sửa đổi sau phiên dịch, sau khi kết hợp các axit amin Hơn 200 sửa đổi như vậy đã được phát hiện, quan trọng nhất là glycosyl hóa, sự hình thành cầu disulfid, phosphoryl hóa, sulfat, hydroxyl hóa, carboxyl hóa và axetyl hóa Phổ khối không chỉ cho phép xác định chính xác khối lượng phân tử peptid và protein mà còn xác định trình tự của chúng, nhất là khi được sử dụng đồng thời với các kỹ thuật khối lượng Thật vậy, sự phân mảnh của peptid và protein cho thông tin chuỗi có thể được sử dụng để nhận dạng protein,

trình tự và xác định và bản chất hóa học của các sửa đổi sau phiên dịch hoặc các thay đổi cộng hóa trị khác [2]

4.1.1 Phân tích protein và peptid bằng phương pháp ion hóa ESI và MALDI

Các phương pháp ion hóa được sử dụng thường xuyên nhất để nghiên cứu các peptid và protein thông qua khối phổ là ESI và MALDI Tất cả các kỹ thuật này được đặc trưng bởi hình thành các ion ổn định (vì chúng chỉ có năng lượng thấp) và sự vắng mặt của mảnh vỡ ESI tạo ra các ion tích điện, cho phép phát hiện các phân tử lớn với phổ khối thông thường như tứ cực, bẫy ion và dụng cụ từ tính Các dòng electron phun với kích thước nano là một sự phát triển quan trọng của phương pháp ion hóa này Với dòng bơm trong khoảng 20 m /phút − 1, tín hiệu lâu dài có thể thu được từng phút số lượng mẫu, cho phép thực hiện nhiều thí nghiệm MS/MS làm sáng tỏ cấu trúc

Độ nhạy ESI không phụ thuộc vào tốc độ nano lít mỗi phút MALDI là một nguồn xung, và rất thích hợp để sử dụng với phổ khối lượng TOF, hoặc với quang phổ kế cho phép lưu trữ các ion như bẫy ion và FTICR Thường xuyên nhất được sử dụng là công cụ TOF Trong thập kỷ qua, những MALDI-TOF này là quang phổ kế đã có những tiến bộ quan trọng trong việc giới thiệu việc khai thác ion Kết quả là, hiệu suất của các máy phân tích TOF, về độ phân giải và độ chính xác khối lượng, đã được cải thiện rất nhiều Mặc dù không thể đạt được với các máy phân tích FTICR hoặc orbitrap, độ phân giải hiện có thể đạt tới 20.000 FWHM và với một giao thức hiệu chuẩn khối lượng tốt, khối lượng chính xác có thể thu được Các công cụ FTICR phức tạp hơn cũng đang được được sử dụng với sự thành công ngày càng tăng Các công cụ này hiện đang sử dụng tái thẩm định và các công cụ cải tiến khác Sự phức tạp và chi phí cao của các công cụ này

có nghĩa là chúng chỉ có sẵn rất hạn chế trong một số phòng thí nghiệm Một công cụ phát triển khác là kết hợp trình phân tích trình tự khác nhau như các công cụ Q-TOF, LIT-ICR hoặc LIT-orbitrap, theo thứ tự để tăng hiệu suất và tính linh hoạt và cho phép nhiều thử nghiệm được thực hiện Giới hạn phát hiện của ESI và MALDI phụ thuộc vào một số yếu tố, chẳng hạn như bản chất của mẫu và chuẩn bị và độ tinh khiết của nó, dụng cụ được sử dụng và kỹ năng của người vận hành Đối với peptid và protein, giới hạn phát hiện được thực hiện ở đâu đó giữa các femtomol và picomol, ngay cả khi giới hạn attomol đã được báo cáo Bởi vì độ phân giải cần thiết để tách các đỉnh khác nhau trong cụm đồng vị của một peptid thấp hơn độ phân giải của hầu hết các máy phân tích, khối lượng phân tử được đo tương ứng với tính toán bằng cách sử dụng đồng vị chiếm ưu thế của mỗi phân tử Vì vậy đây không phải trong trường hợp của protein Vì

độ phân giải cần thiết để giải quyết cụm đồng vị tăng theo khối lượng hoặc với điện tích do ion mang và vì độ phân giải của các máy phân tích bị giới hạn, các đỉnh khác nhau trong cụm đồng vị kết hợp và tạo thành đỉnh đơn trải rộng trên nhiều khối lượng (15 Da tại 10 000 Da và 45 Da tại

100 000 Da) [2]

Hình 3.3 Phổ khối của cụm đẳng hướng của một peptit proton đơn (C 101 H 145 N 34 O 44 ) [2]

Do đó khối lượng phân tử được xác định bởi các kỹ thuật này tương ứng với được tính bằng khối lượng hóa học của mỗi nguyên tố có trong protein Cả hai giá trị khác biệt đáng kể với nhau Thật vậy, sự khác biệt giữa đồng vị khối lượng và khối lượng hóa học của một peptid hoặc của một protein là khoảng 1 Da mỗi 1500 Da Vì thế, xác định khối lượng là quan trọng Lựa chọn được xác định bởi độ phân giải của máy phân tích và khối lượng của ion được phân tích Các lỗi đo khối lượng cũng phụ thuộc vào một số lượng lớn các yếu tố Một điển hình sai số đo 0,01% có thể thu được thường xuyên Tuy nhiên, những lỗi này có thể cao hơn 0,1% trong trường hợp xấu nhất (MALDI-LTOF) hoặc thấp hơn 0,0001% trong trường hợp tốt nhất (ESI-FTICR) Sự vắng mặt đặc trưng của các ion phân mảnh cho phép phân tích các hỗn hợp phức tạp mà không có sự tách biệt nào trước đó Tuy nhiên, việc phân tích các hỗn hợp protein có khối lượng phân tử bị giới hạn bởi độ phân giải của máy phân tích đang được sử dụng Ví dụ, điều tra hỗn hợp protein 10.000 Da và sản phẩm oxy hóa tương ứng để bổ sung một nguyên tử oxy đòi hỏi độ phân giải ít nhất là 1000, trong khi độ phân giải cần thiết để phân tích hỗn hợp là 10.000 nếu protein có khối lượng 100.000 Da Một yếu tố khác đóng vai trò trong khả năng phân tích loại hỗn hợp này là số lượng tương đối của mỗi thành phần Một hợp chất có sự phong phú là 10% của chính thành phần đòi hỏi độ phân giải ít hơn so với hỗn hợp tương tự với cùng một hợp chất có chỉ có 1% sự phong phú tương đối Hơn nữa, việc phân tích các hỗn hợp rở nên phức tạp bởi hiện tượng ion hóa cạnh tranh Hiện tượng này, được quan sát thấy trong MALDI và ESI, được đặc trưng bằng cách cạnh tranh các ion phân tử của một số peptid khi có mặt các peptid khác trong hỗn hợp Tín hiệu tương ứng với các peptid này có thể biến mất hoàn toàn và do đó các peptid này có thể không được phát hiện mặc dù chúng dễ dàng phát hiện được tín hiệu khi phân tích riêng lẻ [2]

Có thể tránh ion hóa cạnh tranh bằng cách thay đổi điều kiện pH hoặc ma trận, thông qua dẫn xuất hóa học của các peptid chứa trong hỗn hợp này, hoặc thông qua phân tách một phần hỗn hợp bằng sắc ký lỏng pha đảo sao cho mỗi phần chứa peptid có tính kỵ nước tương tự nhau Đối với

cả ESI và MALDI, nồng độ của mẫu và độ phức tạp của chất gây ô nhiễm đóng vai trò quan trọng trong cả độ nhạy và độ chính xác khối lượng Các giải pháp cho peptid hoặc protein là mẫu

sinh học có chứa một số lượng lớn chất gây ô nhiễm thường được pha loãng Hai vấn đề, pha loãng và chất gây ô nhiễm không dễ xử lý, đặc biệt là khi tổng số lượng mẫu thấp Các chất ô nhiễm có nguồn gốc khác nhau và bao gồm đệm, muối không bay hơi, chất tẩy rửa và nhiều hợp chất không rõ nguồn gốc ESI chỉ có thể chịu đựng được một lượng nhỏ các ion gây ô nhiễm Những ion này có thể làm giảm sự phong phú của các ion từ hợp chất quan tâm và thậm chí có thể hoàn toàn đàn áp chúng Chúng cũng rất thường dẫn đến sự hình thành ion cộng, làm giảm độ nhạy Hơn nữa, chúng có thể làm phức tạp việc xác định khối lượng phân tử, hoặc giảm độ chính xác của khối lượng phân tử nếu một số chất phụ gia không được tách ra khỏi các ion của phân tử Nói chung, MALDI thích hợp hơn ESI với nhiều chất gây ô nhiễm Điều này một phần có thể là

do một số sự phân tách xảy ra trong quá trình kết tinh của mẫu với ma trận Dù phương pháp ion hóa nào thì chất lượng của phổ khối sẽ cao hơn nếu giảm ô nhiễm mẫu [2]

Vấn đề thứ hai là các mẫu sinh học có nồng độ thấp của hợp chất quan tâm Khối lượng cần thiết cho việc phân tích rất thấp khoảng microlit cho cả MALDI và ESI, và chỉ một phần của nó thực

sự được sử dụng trong phân tích Nhưng nồng độ có ảnh hưởng rõ rệt trên quang phổ quan sát được Phương pháp cổ điển cho peptid và protein là chuẩn bị sắc ký lỏng pha đảo, tiếp theo là cô đặt lại (thường là đông khô) Trong các bước thực hiện với số lượng mẫu rất nhỏ, mất mẫu có thể xảy ra Việc sử dụng các phương pháp tách trực tuyến với phổ khối phổ thường được ưu tiên Micro- hoặc nano-HPLC và điện di mao quản, cả hai cùng chủ yếu là ion hóa electro spray / khối phổ (ESI-MS), được sử dụng ngày càng nhiều [2]

4.1.2 Cấu trúc và xác định chuỗi thông qua sự phân mảnh

Phân mảnh các peptid

Mặc dù các kỹ thuật khác nhau cho phép truyền năng lượng, phương pháp phổ biến nhất vẫn là

sự phân ly do va chạm gây ra (CID) Do đó, phổ khối song song (MS / MS) đã trở thành một kỹ thuật cần thiết cho phân tích cấu trúc của peptid và protein Kỹ thuật này bao gồm việc chọn ion được phân mảnh bằng phổ khối đầu tiên và đưa nó vào một ô va chạm, nơi nó va chạm với các nguyên tử khí không tích điện Vì vậy, động năng được biến đổi một phần thành năng lượng dao động và các mảnh kết quả được phân tích bởi một máy phân tích thứ hai, do đó có tên là phổ khối CID song song hoặc CID MS / MS Nếu độ phân giải của thiết bị đủ, bộ phân tích đầu tiên chỉ có thể chọn đỉnh đồng vị chứa các đồng vị chính, chẳng hạn như 12C và 16O, cho phép phổ phân mảnh không thu được các cụm đẳng hướng phức tạp (đặc biệt là ở các khối lượng cao) Phổ khối song song có thể thu được bằng cách sử dụng nhiều công cụ khác nhau, chẳng hạn như phản xạ TOF, bẫy ion, tứ cực ba cực, ICR hoặc dụng cụ lai Chính sự khác biệt là ở động năng của các ion Trong từ tính và dụng cụ TOF là động năng ion tiền thân là vài keV trong khi các loại máy phân tích khác, chẳng hạn như tứ cực, bẫy ion hoặc ICR, động năng ion không bao giờ vượt quá

100 eV Sự khác biệt này ảnh hưởng đến quá trình phân mảnh [2]

Sự phân mảnh của peptid cũng có thể được quan sát bằng kỹ thuật hậu nguồn phân rã (PSD) khi các dụng cụ TOF phản xạ được sử dụng Kỹ thuật này, không chỉ được sử dụng để phân tích peptid, các ion của các phân tử được tạo ra bởi MALDI có đủ năng lượng để phân mảnh nhưng

phân mảnh siêu bền này xảy ra trong quá trình di chuyển giữa nguồn và đầu dò Với một phổ kế TOF tuyến tính các mảnh tiếp cận máy dò cùng với các ion tiền thân Ngược lại, lần sau chúng sẽ

có quá trình di chuyển khác và do đó khối lượng của chúng có thể được xác định [2]

Sự phân mảnh của peptid cũng có thể thu được bằng các dụng cụ FTICR Bên cạnh phương pháp kích hoạt thường được sử dụng nhất, cụ thể là CID, việc kích hoạt khác có thể thực hiện mà không có khí bằng cách phân chia multiphoton hồng ngoại (IRMPD) và chụp electron phân ly (ECD) Những phương pháp này phân đoạn các ion peptid trong tế bào ICR bằng cách phát ra một chùm tia laser hoặc chùm electron, tương ứng Phân tích MS / MS của nhiều peptid với các trình tự đã biết cho phép nhận diện các quá trình phân mảnh khác nhau Phân mảnh năng lượng cao và thấp Từ quan điểm thực tế, có thể được phân loại theo một trong hai loại: những dẫn xuất

từ sự phân cắt một hoặc hai liên kết trong chuỗi peptid và phân cắt của chuỗi amino acid bên [2]

Hình 3.4 Phổ phân mảnh năng lƣợng cao và thấp của methionin-enkephalin

(chuỗi YGGFM) [2]

Danh pháp được đề xuất bởi Roepstorff và Fohlman và sau đó được sửa đổi bởi Biemann cho phép ghi các mảnh khác nhau thu được Các mảnh đầu tiên được xác định được tạo ra bởi sự phân cắt của một liên kết trong chuỗi chính Sự phân tách của một liên kết trong chuỗi peptid đó

có thể xảy ra ở một trong ba loại liên kết, Cα – C, C – N hoặc N – Cα, tạo ra sáu loại mảnh tương ứng được gắn nhãn an, bn, cn khi điện tích dương được giữ bởi phía N đầu cuối và xn, yn, zn khi điện tích dương được giữ bởi C phía đầu cuối Các đoạn liên kết cn và yn chuyển đổi thêm hai nguyên tử hydro, nguyên tử đầu tiên chịu trách nhiệm cho các proton và nguyên tử thứ hai có nguồn gốc từ phía bên kia của peptid Chỉ số n cho biết số lượng axit amin chứa trong phân đoạn Hình 3.5 cho thấy các loại khác nhau của các mảnh vỡ được tạo ra thông qua sự phân cắt của một liên kết trong chuỗi peptit [2]

Hình 3.5 Đường phân mảnh chính của peptid trong phổ khối lượng song song CID [2]

Sự khác biệt khối lượng giữa các ion liên tiếp trong một chuỗi cho phép nhận diện axit amin liên tiếp được xác định và do đó biết được trình tự peptid.ác loại ion phân đoạn quan sát được trong phổ MS / MS phụ thuộc vào nhiều yếu tố bao gồm thành phần axit amin, trình tự peptid, lượng năng lượng được chuyển giao bên trong, phương pháp kích hoạt ion được sử dụng, v.v Có sự khác biệt rõ rệt giữa các mảnh vỡ được quan sát ở năng lượng cao và thấp Ở năng lượng cao, tất

cả các mảnh vỡ được có thể được tạo ra theo nguyên tắc mô tả trong hình 3.5 [2]

Giải trình tự peptid và protein

Bởi vì phổ khối là hoàn toàn khác với các kỹ thuật giải trình tự khác, nó cung cấp một số ưu điểm chẳng hạn như phân tích peptit trong hỗn hợp hoặc peptid bị chặn ở phía đầu N hoặc mang theo sau phiên dịch sửa đổi,… Như vậy phổ khối bổ sung cho các phương pháp hiện có khác Khối phổ cũng nhạy hơn và nhanh hơn các phương pháp khác Việc thu nhận phổ phân mảnh của peptid chỉ cần vài phút Mặt khác, việc giải thích phổ này là trong nhiều trường hợp đơn giản hơn Diễn giải của phổ phối được dựa trên cơ chế và các con đường phân mảnh được mô tả ở trên, được minh họa trong ví dụ sau Phổ phân đoạn MS / MS CID của một peptid có trình tự Gly-Ile – Pro-Thr-Leu-Leu-Leu-Phe-Lys đo ở mức năng lượng cao được thể hiện trong hình 8.13 [2]

Hình 3.6 Theo dõi MSB MS / MS năng lƣợng va chạm cao của 1001 peptid với trình tự

Gly – Ile – Pro – Thr – Leu-Leu-Leu-Phe-Lys [2]

Phổ này chứa một loạt các ion bn, do đó cho phép suy ra chuỗi peptit từ axit N-terminal đến đầu cuối C axit, trong khi hàng loạt các ion yn cho phép nhận dạng chuỗi ngược hướng Trong thực tế,

sự khác biệt khối lượng của 97 Da giữa đỉnh b2 và b3 chỉ ra rằng axit amin ở vị trí 3 tương ứng với prolin Tương tự, 147 Da sự khác biệt giữa các đỉnh y1 và y2 chỉ ra rằng, axit amin ở vị trí tiếp theo đến vị trí cuối cùng là một phenylalanin Các giá trị m/z của các ion w3, w4, w5 và w8 ngụ ý rằng axit amin ở các vị trí 3, 4 và 5 bắt đầu từ phía đầu cuối C là leucin, trong khi đó axit amin ở

vị trí 8 là một isoleucin Sự hiện diện của prolin gây ra sự hình thành nội bộ các mảnh có nhãn

PT, PTL và PTLL để xác minh trình tự suy luận Các các đỉnh có nhãn P, F và X đại diện cho các ion vô cơ và biểu thị sự hiện diện của prolin, phenylalanin và leucin và/hoặc isoleucin Việc giải thích quang phổ phân mảnh có thể khó khăn và tốn thời gian Nó có thể đơn giản hóa nếu peptid được sửa đổi theo cách mà một loại phân mảnh được ưu tiên Điều này có thể đạt được bằng cách tạo dẫn xuất nhóm đầu cuối amin với N-succinimidyl-2- (3- pyridyl) acetat, thúc đẩy các mảnh

bn Sửa đổi peptid cũng có thể làm cho sự khác biệt giữa các mảnh C-và N đầu cuối dễ dàng hơn Dẫn xuất cũng cho phép phát hiện và xác định dư lượng cụ thể bằng cách so sánh quang phổ trước và sau khi dẫn xuất Các dẫn xuất thường được sử dụng cho mục đích này là: sự hình thành các este etyl từ các axit cacboxylic Asp, Glu và C-terminal; sự axetyl hóa của nhóm amin N-terminal và Lys; và phản ứng Edman cho N-terminal amino axit [2]

4.1.3 Ứng dụng

Việc xác định một peptid hoặc một khối lượng phân tử protein với độ chính xác cao cho phép nhiều vấn đề cần được giải quyết, chẳng hạn như nhận dạng protein, phát hiện đột biến bên trong protein, nhận dạng và bản địa hóa các sửa đổi sau phiên dịch, xác minh cấu trúc và độ tinh khiết của peptid tổng hợp và protein được sản xuất bởi kỹ thuật di truyền, và thậm chí trình tự gián tiếp Đối lập với trình tự trực tiếp dựa trên các phân đoạn pha khí, trình tự gián tiếp dựa trên việc tạo ra các thông tin cụ thể theo trình tự từ phương pháp khác với phương pháp pha khí, ví dụ: