Báo cáo các phương pháp sắc ký ứng dụng trong nghiên cứu Dược liệu

Sắc ký khí là kỹ thuật phân tích được sử dụng để xác định sản phẩm trong điều kiện được kiểm soát tốt và phải được ghép trực tiếp với bộ phận phát hiện để xác định các tính hiệu.. Một số

KHOA DƯỢC

BÁO CÁO MÔN PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ỨNG DỤNG

TRONG NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU Lớp cao học khóa 2016 - 2018

BỘ PHẬN PHÁT HIỆN TRONG SẮC KÝ KHÍ

TRÌ KIM NGỌC

Chuyên ngành: Dược liệu – Dược học cổ truyền

Mã số:60720406 Khóa 2016-2018

TP HCM, 05/2018

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA DƯỢC

BÁO CÁO MÔN PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ỨNG DỤNG

TRONG NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU Lớp cao học khóa 2016 - 2018

BỘ PHẬN PHÁT HIỆN TRONG SẮC KÝ KHÍ

Chuyên ngành: Dược liệu – Dược học cổ truyền

Mã số:60720406 Khóa 2016-2018

Thầy hướng dẫn: PGS.Ts Trần Hùng Học viên : Trì Kim Ngọc

TP HCM, 05/2018

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

I ĐẶT VẤN ĐỀ 3

II TỔNG QUAN SẮC KÝ KHÍ 4

2.1 Giới thiệu 4

2.2 Nguyên tắc hoạt động 4

2.3 Ứng dụng 5

2.4 Ưu điểm 6

2.4 Cải tiến kỹ thuật sắc ký khí 6

III CÁC LOẠI BỘ PHẬN PHÁT HIỆN (DETECTOR) TRONG SẮC KÝ KHÍ 7

3.1 Detector ion hóa ngọn lửa (Flame Ionization Detector-FID) 7

3.1.1 Giới thiệu vai trò, cấu tạo 7

3.1.2 Yếu tố ảnh hưởng 8

3.2 Detector độ dẫn nhiệt (Thermal Conductivity Detector -TCD) 10

3.2.1 Giới thiệu vai trò, cấu tạo 10

3.2.2 Yếu tố ảnh hưởng 11

3.3 Detector Nitơ-phospho (Nitrogen-Phosphorus Detector-NPD) 11

3.3.1 Giới thiệu vai trò, cấu tạo 11

3.3.2 Yếu tố ảnh hưởng 12

3.4 Detector bẫy electron (Electron Capture Detector-ECD) 12

3.4.1 Giới thiệu vai trò, cấu tạo 12

3.4.2 Yếu tố ảnh hưởng 13

3.5 Detector quang hóa ngọn lửa (Flame Photometric Detector - FPD) 13

3.5.1 Giới thiệu vai trò, cấu tạo 13

3.5.2 Yếu tố ảnh hưởng 14

3.6 Detector phổ khối MS 15

3.6.1 Giới thiệu vai trò, cấu tạo 15

3.6.2 Nguyên tắc 15

3.6.3 Khối phổ ghép nhiều lần 16

IV KẾT LUẬN 17

TÀI LIỆU THAM KHẢO 18

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Các phương pháp tách bằng sắc ký là kỹ thuật phân tích được sử dụng thường xuyên nhất để phân tích thành phần Sắc ký khí là một kỹ thuật độc đáo và linh hoạt Trong giai đoạn ban đầu khi mới phát triển nó đã được áp dụng cho việc phân tích các loại khí và hơi từ các thành phần rất

dễ bay hơi Sắc ký khí là kỹ thuật phân tích được sử dụng để xác định sản phẩm (trong điều kiện được kiểm soát tốt) và phải được ghép trực tiếp với bộ phận phát hiện để xác định các tính hiệu Nguyên tắc cơ bản của sắc ký khí là mối tương quan của hợp chất đối với pha tĩnh càng lớn thì hợp chất sẽ bị giữ lại bởi cột lâu hơn Vì vậy, trái tim của sắc ký khí là cột và kiểm soát luồng khí

mang qua cột [9]

Bên cạnh đó, bộ phận phát hiện (Detector) đóng vai trò quan trọng không kém trong các hệ thống sắc ký nói chung và sắc ký khí nói riêng Theo thời gian và sự tiến bộ không ngừng của khoa học

kỹ thuật, bộ phận phát hiện của sắc ký khí ngày càng đa dạng, hoạt động theo các cơ chế khác nhau Thêm vào đó, độ nhạy và tính chính xác của bộ phận phát hiện cũng ngày càng cao Một số

bộ phận phát hiện hiện nay được sử dụng trong sắc ký khí như: detector ion hóa ngọn lửa (FID), detector dẫn nhiệt (TCD), detector bẫy electron (ECD), detector ion hóa quang (PID), detector quang hóa ngọn lửa (FPD), detector ion hóa nhiệt (thermionic detector), detector phát xạ nguyên

tử (AED), detector huỳnh quang hóa học tạo bởi ozon hay fluor, phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS) Bài báo này sẽ trình bày sơ lược về một số bộ phận phát hiện được sử dung trong sắc ký khí hiện nay

II TỔNG QUAN SẮC KÝ KHÍ

2.1 Giới thiệu

Archer J.P Martin và Anthony T James đã giới thiệu phép sắc ký khí - lỏng trong năm 1950 tại cuộc họp của Hội Sinh hóa được tổ chức tại London Việc này đã tạo nền tảng cho sự phát triển của sắc ký khí Trong thực tế, Martin đã hình dung sắc ký khí gần mười năm trước khi làm việc với R L M Synge về sắc ký phân vùng Martin và Synge, người được trao giải Nobel hóa học vào năm 1941, gợi ý rằng việc tách các hợp chất dễ bay hơi có thể đạt được bằng cách sử dụng hơi làm pha động thay vì chất lỏng Sắc ký khí nhanh chóng được chấp nhận chung bởi vì nó đã được giới thiệu vào thời điểm đó cần có các biện pháp kiểm soát phân tích cải tiến trong các ngành công nghiệp hóa dầu và cần có các kỹ thuật mới để khắc phục những hạn chế của phương pháp cũ trong phòng thí nghiệm Ngày nay, sắc ký khí là một kỹ thuật hoàn chỉnh được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới để phân tích gần như tất cả các loại hợp chất hữu cơ, thậm chí cả những trạng thái ban đầu không linh động của chúng nhưng có thể chuyển đổi thành các dẫn xuất dễ bay hơi [2]

Phân tách sắc ký khí là một lựa chọn mang lại nhiều lợi ích từ việc giảm thời gian phân tích Giảm bớt thời gian phân tích có thể đạt được bằng cách thay đổi thông số cột như: chiều dài ngắn hơn, đường kính bên trong của cột nhỏ hơn, màng pha tĩnh mỏng hơn Hoặc các thông số vận hành như: tốc độ chương trình nhiệt độ nhanh hơn, phân tích đẳng nhiệt Khí mang khác nhau, tốc độ dòng khí vận chuyển cao hơn hoặc kết hợp cả hai cách có thể được áp dụng

Gas Chromatography (GC) đã được sử dụng 50 năm trước để giúp xác định thành phần thực phẩm, khám phá dinh dưỡng , nâng cao chất lượng thực phẩm và giới thiệu các loại thực phẩm mới Hơn nữa, GC đã là cách tiếp cận đầy đủ duy nhất để đo lường nhiều chất gây ô nhiễm hữu

cơ xảy ra tại nồng độ vi lượng trong thực phẩm và môi trường mẫu phức tạp GC là công cụ giúp

đỡ con người nhận ra rằng chúng ta phải thận trọng với nông nghiệp và hóa chất công nghiệp để

tránh tổn hại sức khỏe và môi trường [9]

2.2 Nguyên tắc hoạt động

Cơ sở của sự phân tách là sự di chuyển chậm của các thành phần riêng lẻ khi chúng được di chuyển qua một cột bằng khí mang, thường là heli hoặc nitơ Các cột bao gồm một ống thép hoặc thủy tinh chứa đầy vật liệu trơ như thủy tinh hoặc hạt gốm (hình 1) Trong sắc kí khí - lỏng (GLC), chúng được phủ với một chất lỏng dễ bay hơi, để diện tích bề mặt của chất lỏng tiếp xúc với khí lớn Đối với một số trường hợp, giá mang có thể là một chất rắn mà không có bất kỳ chất lỏng nào phủ lên; nó được gọi là sắc ký khí - rắn (GSC), nhưng điều này ít được sử dụng rộng hơn GLC

Mẫu được bơm vào dòng khí mang Vì nó di chuyển qua cột với khí mang, các phân tử của mỗi chất có trong mẫu sẽ phân bố giữa khí và chất lỏng Từng phân tử sẽ liên tục di chuyển giữa khí

và chất lỏng trong trạng thái cân bằng động Một phân tử nằm trong pha khí nó sẽ đi dọc theo cột, trong khi nó vẫn còn hòa tan trong chất lỏng nó sẽ được giữ lại Một chất dễ bay hơi, các phân tử

sẽ chuyển động trong khí mang với thời gian ngắn hơn, và vì vậy nó sẽ xuất hiện từ cột sớm hơn

Bằng cách này, mỗi chất sẽ bị tách ra trong cột và xuất hiện tại thời gian khác nhau ở cuối Thời gian thực hiện từ tiêm mẫu đến khi chất xuất hiện được gọi là thời gian lưu (Rt), và là đặc trưng cho mỗi chất dưới điều kiện nhất định Nó phụ thuộc vào sự biến động của chất, cũng như nhiệt

độ của cột, chiều dài và đường kính của nó Nhiều chất có thời gian lưu giữ dài bất tiện tại nhiệt

độ phòng, và điều này được khắc phục bằng cách nung nóng cột

Khi đã tách các thành phần trong cột ra riêng lẻ, cần một số phương pháp phát hiện Hai loại bộ

phậ phát hiện thường được sử dụng là: dẫn nhiệt và ion hóa ngọn lửa [9]

Hình 2.1 Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký khí 2.3 Ứng dụng

Sắc ký khí (GC) được sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng liên quan đến phân tích thực phẩm Các ứng dụng điển hình liên quan đến phân tích định lượng và/hoặc định tính của thực phẩm thành phần, sản phẩm tự nhiên, phụ gia thực phẩm, hương vị và thành phần hương liệu, một loạt các sản phẩm chuyển hóa và các chất gây ô nhiễm, chẳng hạn như thuốc trừ sâu, thuốc xông hơi, chất gây ô nhiễm môi trường, độc tố tự nhiên, thuốc thú y và vật liệu đóng gói [5]

Và thức ăn đặc biệt các ứng dụng liên quan đến GC, chẳng hạn như carbohydrate vàaxit amin Lipid và lipophilic đi kèm hợp chất, hương vị và hương thơm GC có thể được sử dụng để tách và phân tích trực tiếp mẫu khí, dung dịch lỏng và chất rắn dễ bay hơi Nếu mẫu được phân tích là không bay hơi, các kỹ thuật của có thể sử dụng dẫn xuất hoặc nhiệt phân GC Sắc ký khí (GC) là một kỹ thuật phân tích không thể thiếu trong việc áp dụng các phép xác định axit béo trong hạt

giống cây có dầu, sinh tổng hợp và con người sự trao đổi chất Cũng như đặc tính phức tạp hỗn hợp của các đồng phân hình học khi kết hợp với nhau tách sắc ký và quang phổ nhận dạng Các nhà nhân giống cây trồng sử dụng GC như 1 phương pháp chính xác và nhanh chóng hơn để nghiên cứu biến thể và dẫn xuất các axit béo trong các loại cây có dầu như hạt Cải dầu, hạt Lanh,

và cây Rum [8]

Hình 2.2 So sánh GC và HPLC ứng dụng trong thực phẩm trong khoảng thời gian

(11 năm) của các tài liệu khoa học trong PubMed [8]

2.4 Ƣu điểm

Phân tích GC là phương pháp định tính và định lượng tối ưu hỗn hợp phức tạp presupposes: (1) độ phân giải tốt, thể hiện bằng các đỉnh nhọn và đối xứng;

(2) độ lặp lại cao và độ lặp lại của thời gian lưu;

(3) độ chính xác và độ chính xác cao trong định lượng dựa trên diện tích pic phép đo, tức là không phân biệt các thành phần thông qua sự biến động, phân cực hoặc tập trung;

(4) hạn chế phân hủy mẫu bởi nhiệt và xúc tác [9]

2.4 Cải tiến kỹ thuật sắc ký khí

Phương pháp sắc ký khí được phát triển cho các sản phẩm mới khi không có sẵn phương pháp chính thức Phương pháp thay thế cho các sản phẩm hiện có (NonPharmacopoeial) làm giảm chi phí và thời gian để có độ chính xác và độ chắc chắn tốt hơn Một số bước đang được xem xét để phát triển phương pháp GC như chọn cột (kích thước: đường kính cột, độ dài và độ dày), lựa chọn khí mang (nitơ, helium), lập trình nhiệt độ (nhiệt độ ban đầu, ban đầu giữ, tốc độ dốc, nhiệt

độ cuối cùng và giữ cuối cùng), nhiệt độ vòi phun và nhiệt độ đầu dò

Các bước liên quan đến cải tiến phương pháp:

- Hiểu các đặc tính lý hóa của mẫu

- Lựa chọn các điều kiện sắc ký

- Cải tiến phương pháp phân tích

- Chuẩn bị mẫu

- Tối ưu hóa phương pháp

- Phương pháp kiểm chứng [9]

III CÁC LOẠI BỘ PHẬN PHÁT HIỆN (DETECTOR) TRONG SẮC KÝ KHÍ

Một loạt các đầu dò thương mại có sẵn để được sử dụng với GC, mỗi loại đều có những hạn chế

và lợi thế riêng Đầu dò thường được sử dụng nhất trong GC là đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID) Nhiệt độ đầu dò và lưu lượng tương đối của khí mang, khí hydro và không khí vào đầu dò là chìa khóa thông số hoạt động Một loạt các tiêu chuẩn được định nghĩa để đánh giá các thông số detector như trôi, nhiễu, độ nhạy, phạm vi tuyến tính, phạm vi động,… trong phản ứng detector với tốc độ dòng chảy phụ thuộc vào nồng độ hoặc khối lượng Detector phụ thuộc nồng độ (ví dụ: detector độ dẫn nhiệt (TCD), detector ion hóa quang(PID)) tốc độ dòng chảy không ảnh hưởng đến chiều cao đỉnh tuy nhiên chiều rộng đỉnh tăng lên Ngược lại, đối với detector phát hiện dòng chảy khối lượng (ví dụ, ion hóa ngọn lửa (FID), detector quang hóa ngọn lửa (FPD), detector nitơ photpho) tỷ lệ thuận với thời gian lưu [9]

Trước đây đầu dò ion hóa ngọn lửa được sử dụng đầu tiên kể từ khi nó được giới thiệu vào năm

1958, đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID) phát triển thành một trong những công cụ được sử dụng phổ biến nhất của hóa học phân tích [4]

Ngày nay với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, có thêm nhiều loại đầu dò được ứng dụng trong sắc ký khí với cấu tạo và cơ chế được cải tiến không ngừng theo thời gian như: Một số bộ phận phát hiện hiện nay được sử dụng trong sắc ký khí như: detector dẫn nhiệt (TCD), detector bẫy electron (ECD), detector ion hóa quang (PID), detector quang hóa ngọn lửa (FPD), detector ion hóa nhiệt (thermionic detector), detector phát xạ nguyên tử (AED), detector huỳnh quang hóa học tạo bởi ozon hay fluor, phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS)

3.1 Detector ion hóa ngọn lửa (Flame Ionization Detector-FID)

3.1.1 Giới thiệu vai trò, cấu tạo

Cho đến nay, FID là máy dò phổ biến nhất được sử dụng trong sắc ký khí (GC) do phạm vi ứng dụng rộng và độ nhạy cao của nó được xác định theo phát hiện số ion trên mỗi gam cacbon và theo thứ tự 0,015 C/gC Cũng là FID có Giới hạn phát hiện tối thiểu thấp (MDL - được định nghĩa là tín hiệu được đo bằng tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu đường nền (S/ N) bằng hai), thông thường theo thứ tự gram carbon trên giây (gC/s) FID thường được sử dụng để định lượngcác hợp chất

hữu cơ dễ bay hơi trong các mẫu khí do độ nhạy chọn lọc cao của chúng đối vớihydrocacbon FID có thể được sử dụng như các thiết bị độc lập cho tổng phân tích hydrocacbon (THA) hoặc detector cho các GC FID thường làm bằng thép không gỉ kết nối các máy dò để thích hợp nguồn cung cấp khí đốt Đầu dò thường được nối với ba nguồn khí riêng biệt cùng nhau với bộ điều khiển lưu lượng khối tương ứng của chúng Khí được sử dụng để đốt cháy là hydro và khí (oxy) trong khi khí hydro, nitơ và (ít thường xuyên hơn) là khí hydro thường được sử dụng làm khí mang Khí vận chuyển các mẫu qua cột và cung cấp các phân tích cho ngọn lửa tạo thành "trái tim" của thiết bị FID thường được đặt trong một lò riêng biệt để đảm bảo rằng không có chất tan được ngưng tụ trong ống và cột kết nối [4]

Đầu dò ion hóa ngọn lửa truyền mẫu và khí mang từ cột thông qua ngọn lửa khí hydro Ngọn lửa khí hydro tạo ra một vài ion, nhưng khi một hợp chất hữu cơ bị đốt cháy thì có sự gia tăng các ion sinh ra Điện áp phân cực thu hút các ion này tới một bộ thu gần ngọn lửa Các ion được tạo ra tỷ

lệ thuận với lượng mẫu được đốt cháy Điều này làm cho dòng điện được cảm nhận bởi một máy

đo điện, được chuyển thành dạng số và được gửi đến thiết bị đầu ra [1]

Hình 3.3 Sơ đồ cấu tạo đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID)

3.1.2 Yếu tố ảnh hưởng

Ảnh hưởng của các thông số khác nhau

Do ảnh hưởng của việc thay đổi các thông số khác nhau khi các đặc tính của detector ion hóa ngọn lửa không phải lúc nào cũng được hiểu rõ, nên cần phải nghiên cứu một cách có hệ thống

Sự ổn định dòng chảy của dòng khí mang và luồng hydro phải được xem xét đối với mức phát hiện nồng độ hơi tối thiểu Trong hầu hết các trường hợp thường lệ phân tích sự ion hóa hydro có thể bị bỏ qua Không khí đốt tốc độ dòng chảy có ảnh hưởng nhẹ đến độ nhạy của đầu dò Hiệu

ứng được biểu diễn trong hình.3.4 Sự tăng của độ nhạy xảy ra với tốc độ dòng khí cao hơn Do

đó, bộ điều khiển lưu lượng không khí có thể rất đơn giản và phải đủ tốt để không ảnh hưởng đến tín hiệu trong một phân tích Tốc độ dòng khí khoảng 501 / h phù hợp với dòng khí hydro 2,5I /

h Carbon dioxid trong không khí không chịu trách nhiệm về độ dẫn không của tế bào

Một yếu tố khác ảnh hưởng đến độ nhạy của máy dò là tỷ lệ hydro/nitơ Một sự gia tăng nhỏ về

độ nhạy được thu được bằng đầu mối nitơ Tỷ lệ giữa I: 1 đến I: I.5 cho kết quả tăng độ nhạy 25% so sánh với một mình hydro Một hiệu ứng thuận lợi bổ sung là ion hóa hidro giảm nhẹ khi

bổ sung nitơ

Hình 3.4 Ảnh hưởng tốc độ dòng chảy đến độ nhạy của đầu dò [6]

Các điều kiện sau đây ngăn đầu dò hoạt động

• Nhiệt độ được đặt dưới 150 °C

• Lưu lượng không khí hoặc hydro được đặt ở chế độ Tắt hoặc đặt ở 0.0

• Lỗi đánh lửa