Tiêu chuẩn này qui định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC để xác định hàm lượng cafein của: cà phê nhân; cà phê rang; cà phê hòa tan, loại thông thường và loại đã tách cafein; c
Trang 1Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM Khoa Chăn Nuôi – Thú Y
Môn: Dược Phân Tích
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFEIN TRONG CAFÉ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) – PHƯƠNG PHÁP CHUẨN
GVHD:
Sv thực hiện: mssv lớp
Trang 2M c L c ục Lục ục Lục
I Đặt vấn đề: 3
II Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 3
Đối tượng: 3
Phương pháp nghiên cứu: 4
Dấu hiệu nhận biết cafein: 4
Ảnh hưởng cafein đối với con người: 4
Thiết bị, dung cụ và hóa chất: 5
Thiết bị dụng cụ: 5
Hóa chất : 7
Điều kiện quy trình và quá trình thực hiện: 9
Lấy mẫu 9
Chuẩn bị mẫu thử 9
Đồ uống hỗn hợp 9
III Tính toán kết quả: 13
Hàm lượng cafein trong mẫu 13
Phép xác định tùy chọn hàm lượng cafein trong mẫu theo chất khô 14
IV Kết quả và bàn luận: 14
Kết quả: 14
Độ chụm 14
Độ lặp lại 16
Độ tái lập 16
Bàn luận: 16
Tài liệu tham khảo: 17
Trang 3I Đặt vấn đề:
Café là một thức uống quen thuộc với mọi người, nó phổ biến trên toàn thế giới Café được sử dụng lần đầu vào thế kỉ 9, khi được khám phá ra từ vùng cao nguyên Ethiopia
Và phổ biến ở Việt Nam gần 100 năm nay Ở Việt Nam bất kì nơi nào từ lề đường đến những quán cà phê sang trọng ta cũng có thể thấy ly cà phê được mọi người nhâm nhi thưởng thức Không giống như các loại đồ uống khác, chức năng chính của cà phê không phải là nước giải khát nhưng nhiều người dùng nó với mục đích tạo cảm giác hưng phấn Vậy “cảm giác hưng phấn” mà cà phê mang lại có từ đâu?
Câu trả lời nằm trong thành phần của hạt cà phê, vào năm 1820 nhà khoa học người Đức Friedlieb Ferdinand Runge đã tìm ra một chất có trong café bằng cách đun hạt cà phê đã rang lên và thu lại hơi nước sinh ra Chất đó tạo ra vị đắng cho cà phê Có lẽ nói đến đây chắc một số trong các bạn đã biết chất đó là gì Đó là cafein
Cafein là chất kích thích có thể tìm thấy trong một số loại hạt, trái cây,… tuy nhiên nguồn cung cấp cafein chủ yếu là từ cà phê và các loại trà Cung cấp một lượng cafein vừa đủ cho cơ thể sẽ có nhiều tác dụng khá hữu hiệu Ngoài ra cafein là chất có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương làm cho tỉnh táo, kích thích khả năng làm việc, đặc biệt làm việc bằng trí óc, tăng cường hoạt động cơ
Vậy cafein được xác định như thế nào, vì vậy bài thuyết trình của nhóm hôm nay xin
được đưa ra phương pháp “XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFEIN BẰNG SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) – PHƯƠNG PHÁP CHUẨN”.
Tiêu chuẩn này qui định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định hàm lượng cafein của: cà phê nhân; cà phê rang; cà phê hòa tan, loại thông thường và loại
đã tách cafein; các sản phẩm cà phê hòa tan hỗn hợp (ví dụ: hỗn hợp cà phê/chicory (rễ rau diếp xoăn) hoặc đồ uống từ cà phê kiểu capuccino)
II Đối tượng và phương pháp nghiên cứu:
Đối tượng:
Trang 4Caffein được chiết xuất từ café và các sản phẩm của café: cà phê nhân, cà phê, bột có cà phê, cà phê hòa tan, hỗn hợp hòa tan…
Phương pháp nghiên cứu:
Dấu hiệu nhận biết cafein:
+ Tính chất lý hóa của caffeine:
Cafein (C8 H10 N4 O2) có công thức cấu tạo:
Caffein ở dạng tinh thể, không màu, không mùi, vị đắng
Khối lượng mol: 197.19 g/mol
Nhiệt độ nóng chảy 2380C Tan nhiều trong nước nóng và chloroform và tan 1
Phần trong rượu
Cafein có vị đắng và tạo ra hiệu ứng sinh lý rất dễ nhận biết Chúng được sử dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất đồ uống Cafein có khả năng tồn tại khá lâu trong máu và bị thăng hoa ở 178oc nên ít tổn thất nhiều trong khi sấy
Cafein được chuyển hóa trong gan bởi hệ thống enzyme cytochrome P450 oxydase thành
3 chất có tác dung riêng biệt đới với cơ thể paraxanthine, theobromin và theophiline
Trang 5Paraxanthine( 84%) có tác dụng tăng cường tiêu hóa chất béo dẫn đến tăng hàm lượng glycerol và axit béo tự do tromg huyết tương
Theobromin ( 12% ) làm dãn mạch máu và tăng lượng nước tiểu Theobromin cũng là alcoloid chính có trong các hạt cacao
Theophylline ( 4% ) có tác dụng làm dãn cơ trơn phế quản, do đó theophiline thường được dùng trong bệnh hen suyễn nhưng với liều lượng lớn hơn nhiều so với lượng theophiline thu được từ chuyển hóa cafein
Các chất này được chuyển hóa và và được bài tiết qua đường nước tiểu
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
+ Cân phân tích, có khả năng cân chính xác đến ± 0,1 mg.
+ Bộ lọc màng, cỡ lỗ 0,45 µm, để lọc pha động và các dịch chiết mẫu pha loãng + Máy sắc ký lỏng hiệu nâng cao, được trang bị để thực hiện rửa giải đẳng dòng,
có detector UV được cài đặt ở 272 nm (270 nm đến 280 nm) hoặc detector có bộ lọc (254 nm) và có hệ thống thu nhận/tích phân dữ liệu Việc sử dụng bộ khử khí
là tùy chọn
+ Cột sắc ký dùng cho HPLC, dài tối thiểu 125 mm, được nhồi bằng vật liệu C18,
tốt nhất là hạt hình cầu có cỡ 5 µm, hiệu quả tách ít nhất 5 000 đĩa lý thuyết Số
Trang 6đĩa lý thuyết của cột, Nth có thể tính được bằng cách xác định diện tích pic sau khi bơm dung dịch chuẩn cafein, bằng Công thức (1):
Nth = (t r
b)2×5 ,54
(1)
Trong đó:
T r là thời gian lưu của pic, tính bằng giây (s);
Blàchiều rộng pic, tại nửa chiều cao pic, tính bằng giây (s)
Trang 7Cột sắc ký
+ Máy khuất từ, có bộ phận gia nhiệt và nồi cách thủy.
+ Bể siêu âm.
+ Xiranh microlit.
+ Máy xay cà phê, phù hợp để xay nhân cà phê rang.
+ Máy xay với bánh xe có răng, có túi làm lạnh, hoặc máy nghiền phân tích, có
lưỡi dao và túi làm lạnh hoặc dụng cụ phù hợp khác để xay nhân cà phê nhân
+ Sàng, cỡ lỗ danh định 630 µm, phù hợp với các yêu cầu trong TCVN 2230 (ISO
565), dãy R 20
+ Bình định mức một vạch, dung tích 1 lít và 250 ml, phù hợp với loại A của TCVN
7153 (ISO 1042)
+ Pipet, dung tích 50 ml và 5 ml, phù hợp với loại A của TCVN 7151 (ISO 648).
Hóa chất :
+ Thuốc thử:
Trang 8Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước phù hợp với yêu cầu loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3696) trừ khi có quy định khác
+ Metanol, loại dùng cho HPLC.
+ Magie oxit (mgo), loại nặng, có chất lượng cao
CHÚ THÍCH: Việc sử dụng mgo rất quan trọng đối với tuổi thọ của cột phân tích, đặc biệt trong phân tích cà phê nhân Lượng mgo được sử dụng tùy thuộc vào thiết bị và dạng sản phẩm cà phê Dữ liệu về độ chụm thu được bằng quy trình mô tả trong tiêu chuẩn này
Việc xuất hiện các pic gây nhiễu trong sắc đồ có thể do hấp thụ không đúng Trong trường hợp này, cần kiểm tra mgo đã sử dụng
+ Cafein (1,3,7-trimetylxantin; 1,3,7-trimetyl-1H-purin-2,6(3H,7H)-dion;
metyltheobrom; C8H10N4O2), dạng khan tinh khiết
+ Pha động, 24 % phần thể tích metanol trong nước.
CHÚ Ý AN TOÀN – Đeo găng tay, kính bảo vệ mắt và phân phối các thuốc thử trong buồng hút khói tốt.
Chuyển 240 ml metanol vào bình định mức một vạch 1 lít Thêm nước đến vạch, trộn và lọc qua bộ lọc cỡ lỗ 0,45 µm
CHÚ THÍCH: Thời gian lưu của cafein có thể được chỉnh để tối ưu hóa việc tách HPLC trên cột được sử dụng bằng cách thay đổi tỷ lệ metanol với nước
+ Dung dịch chuẩn cafein.
Dung dịch gốc, tương ứng với 200 mg/l
Cân (0,200 ± 0,100) g cafein dạng khan vào bình định mức một vạch 1 lít Thêm nước
ấm đủ đến nửa bình Xoay bình để hòa tan cafein, để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm nước đến vạch và trộn
Dung dịch có thể bền trong một tháng khi được bảo quản ở +4 oc Bảo quản dung dịch trong tủ lạnh
Dung dịch chuẩn pha loãng đối với cà phê thông thường, tương ứng với
khoảng 40 mg/l
Trang 9Dùng pipet lấy 50 ml dung dịch chuẩn gốc cafein cho vào bình định mức một vạch 250
ml Thêm nước đến vạch và trộn Chuẩn bị dung dịch chuẩn pha loãng mới trong ngày sử dụng
Điều kiện quy trình và quá trình thực hiện:
Lấy mẫu
Phòng thử nghiệm phải nhận được mẫu đại diện Mẫu không được hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này Các bên có liên quan cần thỏa thuận với nhau về vấn đề này
Bảo quản mẫu thử sao cho mẫu không bị giảm chất lượng và thay đổi thành phần
Trong trường hợp bột uống hỗn hợp, cần tối thiểu 50 g sản phẩm (đối với các bao gói chia nhỏ: tối thiểu năm bao gói)
Chuẩn bị mẫu thử + Cà phê nhân
Dùng máy nghiền để nghiền nhân cà phê nhân sao cho 50 % phần khối lượng của mẫu lọt qua sàng Sau đó lấy mẫu thử từ toàn bộ cà phê bột đã được trộn kỹ
+ Cà phê rang
Dùng máy xay để xay nhân cà phê rang sao cho trên 50 % khối lượng lọt qua sàng
Dùng luôn cà phê rang xay bao gói bán sẵn mà không cần xử lý thêm và đồng hóa mẫu
+ Cà phê hòa tan
Đối với cà phê hòa tan thì không cần xay
Đồ uống hỗn hợp
Dùng máy xay, đồng hóa bột uống cà phê hỗn hợp ngay trước khi chiết để tránh bị tách rời
Cách tiến hành
+ Phép xác định tùy chọn chất khô của cà phê
Tính hàm lượng chất khô cà phê từ độ ẩm xác định được trên phần mẫu thử theo:
- TCVN 6928 (ISO 6673) đối với cà phê nhân,
- TCVN 9721 (ISO 11817) đối với cà phê rang,
Trang 10- TCVN 5567 (ISO 3726) đối với cà phê hòa tan.
Đối với các dạng khác của cà phê và các sản phẩm có nguồn gốc từ cà phê, thì các bên có liên quan cần thỏa thuận phép xác định hàm lượng chất khô
+ Phần mẫu thử
Cà phê rang và cà phê nhân
Dùng cân ,cân khoảng 1 g mẫu thử (cà phê nhân, cà phê rang) chính xác đến miligam và chuyển vào bình định mức 250 ml (5.11)
Cà phê hòa tan
Dùng cân,cân khoảng 0,5 g mẫu thử (cà phê hòa tan) chính xác đến miligam và chuyển vào bình định mức 250 ml
Đồ uống hỗn hợp
Dùng cân ,cân khoảng 1 g mẫu thử (đồ uống hỗn hợp) chính xác đến miligam và chuyển vào bình định mức 250 ml
Chiết cafein
Thêm 5 g magie oxit và khoảng 200 ml nước vào phần mẫu thử (cà phê: rang, nhân, hỗn hợp,hòa tan) đựng trong bình định mức Đặt bình vào nồi cách thủy được duy trì ở điểm sôi và chờ cho đến khi dung dịch đạt đến ít nhất 90 oc Tiếp tục gia nhiệt bình trong nồi cách thủy trong 20 min, thỉnh thoảng trộn lượng chứa trong bình bằng cách khuấy hoặc lắc bình Lấy bình ra khỏi nồi cách thủy, làm nguội đến nhiệt độ phòng dưới vòi nước và thêm nước đến vạch Chờ cho đến khi chất rắn lắng xuống
Lấy phần dịch lỏng nổi phía trên và lọc qua bộ lọc cỡ lỗ 0,45 µm, loại bỏ vài mililit đầu tiên Dịch lọc này được dùng để tách bằng HPLC
Tiến hành xác định:
Nhồi đầy các cột
Cột I (Cột kềm)
Lớp A
Trộn cẩn thận 3 g điatomit và 2 ml dung dịch hyđroxit natri bằng dao trộn mềm, cho đến
Trang 11cột sắc ký đường kính 21 mm, đầu dưới của cột được nhồi bằng bông hoặc len thủy tinh Sau mỗi lần đưa bột lên cột, dùng đũa thủy tinh có 1 đầu phẳng khít với đường kính trong của cột lèn nhẹ lên để có một lớp đồng nhất và kết chặt với nhau Có thể dùng 1 miếng bông hoặc len thủy tinh nhỏ để phủ lên trên mặt lớp A
Chú thích – Chất liệu nhồi cột có thể được chuẩn bị trước và bảo quản trong vật chứa kín Mỗi cột kiềm cần 5,16 g
Lớp B
Chuyển hỗn hợp đất diatomit và mẫu thử vào cột lên trên mặt lớp A Làm khô cốc thí nghiệm 2 lần, với khoảng 1 g đất điatomit rồi cho điatomit này vào cột Lèn nhẹ xuống để
có được 1 lớp đồng nhất và phủ 1 miếng bông hoặc len thủy tinh lên trên mặt lớp B Cột II (Cột axit)
Cho lên cột sắc ký đường kính 17 mm, đầu dưới của cột được nhồi bằng len thủy tinh, 3 g điatomit và 3 ml dung dịch axit sunphuric trộn cẩn thận và nhồi vào cột như đã mô tả đối với lớp A của cột I Dùng 1 miếng len thủy tinh để phủ lên trên mặt lớp này
Chú thích – Chất liệu nhồi cột có thể được chuẩn bị trước và bảo quản trong vật chứa kín Mỗi cột kiềm cần 6,36 g
Chạy sắc ký
Dựng các cột chồng lên nhau, sao cho khi chất chảy ra từ cột I sẽ giọt trực tiếp vào cột II Cho 150 ml đietyl ete chảy qua cả 2 cột Điều chỉnh van khóa của cột 2 sao cho còn 1 lượng chất lỏng trên bề mặt lớp (cột II) Tháo cột I ra Cho 50 ml đietyl ete chảy qua cột
II, dùng 1 phần đietyl ete để rửa miệng cột I rồi cho nốt phần này lên cột II Cho chất lỏng chảy hết khỏi cột II
Chú thích – Đietyl ete đã dùng có thể tái sinh bằng cách lắc khuấy trong sắt (II) sunphat Thổi luồng không khí từ đỉnh xuống đáy cột II (thí dụ dùng quả bóp cao su), cho đến khi không còn đietyl ete nhỏ giọt từ cột và luồng không khí từ van khoá chỉ thoang thoảng có mùi đietyl ete (xem cảnh báo sau) Dùng 45 đến 50 ml cloroform để làm thôi chất hấp thụ trên cột II Thu chất thôi ra vào bình thể tích 50 ml một vạch, dùng cloroform pha loãng tới vạch và khuấy kỹ
Tốc độ chảy của đietyl ete và của cloroform dưới điều kiện chảy tự nhiên phải nằm trong khoảng từ 1,5 ml/phút đến 3 ml/phút Nếu vượt quá tốc độ này phải nghi ngờ có chảy xói
và tiến hành xác định lại
Trang 12Cảnh báo – Việc cho đietyl ete và cloroform phải được thực hiện trong tủ hút thông gió tốt để đề phòng cả khả năng hít phải hơi dung môi và lẫn cả khả năng nổ.
Đo quang phổ
Đo dung dịch thử
Để tránh sai sót do cloroform bay hơi, dùng cuvet silica đo độ hấp thụ của dung dịch caphêin trong cloroform đối chiếu với cloroform trên máy đo quang phổ được dùng ở bước sóng hấp thụ cực đại (khoảng 276 nm), và ở các bước sóng trên và dưới bước sóng này 30 nm nhằm kiểm tra độ tinh khuyết của caphêin thu được
Trang 13Nếu như độ hấp thụ cực đại vượt quá khả năng đo chính xác của máy sử dụng thì tiến hành đo lại với một phần thử khác của dung dịch caphêin được pha loãng trong
cloroform Trong trường hợp đó khi tính kết quả cần chú ý đến hệ số pha loãng; những thừa số thích hợp của công thức nêu trong vàcũng phải được điều chỉnh cho phù hợp Nếu độ hấp thụ cực đại thấp hơn 0,2 thì tiến hành lại trên phần thử khác có khối lượng lớn hơn
Chuẩn bị và đo dung dịch chuẩn (đối chứng)
Chuẩn bị dung dịch caphêin chuẩn theo cách như sau:
Cân lấy 100 mg ± 20 mg caphein khan tinh khiết, chính xác tới 0,1 mg Cho vào bình định mức dung tích 1 000 ml hòa tan trong cloroform và pha loãng đến vạch Dung pipet chuyển 5,0 ml dung dịch này vào bình định mức dung tích 50 ml và pha loãng đến vạch bằng cloroform
Đo độ hấp thụ của dung dịch này theo mô tả trong Độ hấp thụ đúng của dung dịch chuẩn phải nằm trong vùng 0,4
Số lần xác định
Tiến hành hai phép xác định trên các phần thử riêng rẽ lấy từ cùng một mẫu thử
Thử trắng
Tiến hành thử trắng trên các thuốc thử, sử dụng qui trình đã mô tả ở trên, nhưng bỏ qua phần mẫu thử
Trước khi sử dụng các thuốc thử đã tái tinh chế , cần lặp lại thử trắng để kiểm tra độ tinh khiết của chúng
III Tính toán kết quả:
Hàm lượng cafein trong mẫu
Tính hàm lượng cafein, wx, được biểu thị phần trăm khối lượng, tương đương với gam trên 100 g cà phê, theo Công thức:
Wx =
A x ρ c V ×100
A c m s =
A x ρ c×25
A c m s
Trong đó:
Trang 14Ac là diện tích pic cafein của dung dịch chuẩn cafein xác định bằng HPLC, tính bằng đơn
vị diện tích;
Ax là diện tích pic cafein của dung dịch mẫu xác định bằng HPLC, tính bằng đơn vị diện tích;
Ms là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);
V là thể tích dung dịch mẫu chiết được, xác định (V = 0,25 l), tính bằng lít (l);
Ρc là nồng độ khối lượng của dung dịch chuẩn cafein, tính bằng gam trên lít (g/l)
CHÚ THÍCH: Chiều cao pic có thể được sử dụng để thay cho diện tích pic
Nếu sử dụng nhiều hơn một chuẩn hiệu chuẩn thì dựng đường chuẩn tuyến tính đối với các nồng độ chuẩn cafein, để thu được độ dốc và giá trị chắn Sử dụng đường chuẩn này
để tính nồng độ cafein trong mẫu
Lấy kết quả là giá trị trung bình của hai lần xác định tiến hành dưới các điều kiện lặp lại (10.2)
Phép xác định tùy chọn hàm lượng cafein trong mẫu theo chất khô.
Tính hàm lượng cafein, w’x, theo phần trăm khối lượng, tương ứng với số gam trên 100 g chất khô, bằng Công thức (3):
W’x =
A x ρ c V ×100
A x ρ c×2500
Trong đó wd là hàm lượng chất khô của mẫu (gam trên 100 g), như xác định được trong Lấy kết quả là giá trị trung bình của hai lần xác định tiến hành dưới các điều kiện lặp lại
IV Kết quả và bàn luận:
Kết quả:
Độ chụm
Phép thử liên phòng thử nghiệm
Các kết quả chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm để xác định độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A Các kết quả về cafein được đưa ra theo loại cà phê Các giới hạn lặp lại và giới hạn tái lập TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994), tương ứng, được tính theo 4.14 của TCVN 6910-6:2002 (ISO 5725-6:1994)