Xác định hàm lượng lutein và zeaxanthin trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

31 Biểu đồ 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ KOH tới hàm lượng lutein và zeaxanthin trên nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe .... 25Biểu đồ 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệ

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ MINH HỒNG

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LUTEIN VÀ ZEAXANTHIN TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG SẮC KÝ

LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ MINH HỒNG

1401257

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LUTEIN VÀ ZEAXANTHIN TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG SẮC KÝ

LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà

2 ThS Nguyễn Thị Hồng Ngọc Nơi thực hiện

1 Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất

2 Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ

sinh Thực phẩm Quốc gia

HÀ NỘI – 2019

Em cũng xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

Bộ môn Hóa phân tích- Độc chất

Viện Kiểm Nghiệm An toàn Vệ Sinh Thực phẩm Quốc gia

Đã tạo điều kiện hỗ trợ cho em hoàn thành nghiên cứu

Và cuối cùng em xin bày tỏ lòng yêu thương, biết ơn tới gia đình và bạn bè những người đã luôn động viên, đồng hành em trong trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Lê Minh Hồng

Mục lục

Đặt vấn đề 1

Chương 1 Tổng quan 2

1.1 Thực phẩm bảo vệ sức khỏe 2

1.1.1 Khái niệm 2

1.1.2 Thực phẩm bảo vệ sức khỏe về mắt 2

1.2 Carotenoid 2

1.2.1 Khái niệm 2

1.2.2 Phân loại 2

1.2.3 Tác dụng sinh học chung 3

1.3 Lutein và zeaxanthin 3

1.3.1 Công thức cấu tạo và tính chất vật lý, hóa học 3

1.3.2 Nguồn gốc trong tự nhiên của lutein và zeaxanthin 4

1.3.2.1 Thực phẩm 4

1.3.2.2 Nguồn nguyên liệu sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe 4

1.3.3 Công dụng 5

1.3.3.1 Lutein và zeaxanthin đối với bệnh thoái hóa điểm vàng do lão hóa 5

1.3.3.2 Các tác dụng khác trên sức khỏe người (kết quả từ các nghiên cứu in vitro, thuần tập, dịch tễ và thử nghiệm lâm sàng) 6

1.3.3.3 Công dụng trong ngành công nghiệp sản xuất chế biến thực phẩm 7

1.4 Các phương pháp xác định hàm lượng lutein và/hoặc zeaxanthin 7

1.4.1 Các phương pháp chung 7

1.4.2 Các phương pháp sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA 11

1.4.2.1 Điều kiện phân tích mẫu 11

1.4.2.2 Điều kiện xử lý mẫu 11

Chương 2 Nguyên liệu, thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu 17

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 17

2.1.1 Nguyên vật liệu, hóa chất 17

2.1.2 Chất chuẩn 17

2.1.2.1 Chất chuẩn 17

2.1.2.2 Phương pháp chuẩn bị dung dịch chuẩn 17

2.1.3 Trang thiết bị, dụng cụ 18

2.2 Nội dung nghiên cứu 19

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2.2 Xây dựng và thẩm định phương pháp 19

2.2.2.1 Khảo sát điều kiện phân tích 19

2.2.2.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 19

2.2.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích 20

2.2.3 Áp dụng phương pháp phân tích một số mẫu thực tế 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp 20

2.3.1.1 Phương pháp khảo sát điều kiện phân tích 20

2.3.1.2 Phương pháp khảo sát điều kiện xử lý mẫu 20

2.3.1.3 Phương pháp xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích 21

2.3.2 Áp dụng phân tích một số mẫu thực tế 22

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 22

Chương 3 Thực nghiệm, kết quả và bàn luận 23

3.1 Khảo sát điều kiện phân tích 23

3.1.1 Lựa chọn cột phân tích 23

3.1.2 Lựa chọn pha động 23

3.1.3 Lựa chọn bước sóng phát hiện 24

3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 25

3.2.1 Khảo sát nồng độ dung dịch kiềm 25

3.2.2 Khảo sát nhiệt độ xà phòng hóa 26

3.2.3 Khảo sát thời gian xà phòng hóa 26

3.2.4 Khảo sát khối lượng cân mẫu 27

3.2.5 Khảo sát số lần chiết mẫu: 28

3.2.6 Quy trình xử lý mẫu đã tối ưu hóa 30

3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 30

3.3.1 Độ đặc hiệu, chọn lọc 30

3.3.2 Khoảng tuyến tính, đường chuẩn 31

3.3.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 33

3.3.4 Độ lặp lại và độ tái lập nội bộ 35

3.3.5 Độ thu hồi 36

3.4 Áp dụng phương pháp phân tích một số mẫu thực tế 39

Kết luận và kiến nghị 41

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Bảng 1.1 Một số tính chất vật lý, hóa học của lutein và zeaxanthin 4

Bảng 1.2 Các phương pháp xác định hàm lượng lutein và/hoặc zeaxanthin sử dụng kĩ thuật khác kĩ thuật HPLC detector PAD 8

Bảng 1.3 Các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA xác định hàm lượng lutein và/hoặc zeaxanthin 12

Bảng 2.1 Cách chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc từ dung dịch chuẩn gốc 17

Bảng 3.1 Pha động trong các nghiên cứu sử dụng cột phân tách C18 23

Bảng 3.2 Kết quả xây dựng đường chuẩn lutein 31

Bảng 3.3 Kết quả xây dựng đường chuẩn Zeaxanthin 32

Bảng 3.4 Kết quả LOD và LOQ – nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe nang mềm 33

Bảng 3.5 Kết quả LOD và LOQ – nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe nang cứng 34

Bảng 3.6 Kết quả độ lặp lại - nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe dạng nang mềm 35

Bảng 3.7 Kết quả độ lặp lại - nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe dạng nang cứng 35

Bảng 3.8 Kết quả độ thu hồi – thực phẩm bảo vệ sức khỏe dạng nang mềm 37

Bảng 3.9 Kết quả độ thu hồi – thực phẩm bảo vệ sức khỏe dạng nang cứng 38

Bảng 3.10 Kết quả áp dụng phương pháp phân tích một số mẫu thực tế 39

Danh mục các hình vẽ, biểu đồ và đồ thị

Hình 1.1 Công thức cấu tạo dạng all-trans của lutein và zeaxanthin 3Hình 3.1 Sắc ký đồ với pha động hexan:ethyl acetat = 65:35 (v/v) 23Hình 3.2 Sắc ký đồ với pha động MeOH/dichloromethan/ACN/nước 67,5:22,5:9,5:0,5 24Hình 3.3 Sắc ký đồ với pha động ethyl acetat/ACN (12:88) + 0,1% (v/v) n-decanol 24Hình 3.4 Phổ của Lutein và Zeaxanthin – dung dịch chuẩn hỗn hợp 25Hình 3.5 Kết quả độ đặc hiệu, chọn lọc 31

Biểu đồ 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ KOH tới hàm lượng lutein và zeaxanthin trên nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe 25Biểu đồ 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ xà phòng hóa tới hàm lượng lutein và zeaxanthin trên nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe 26Biểu đồ 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian xà phòng hóa với hàm lượng lutein và zeaxanthin trên nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe 27Biểu đồ 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của khối lượng cân mẫu đến hàm lượng lutein

và zeaxanthin trên nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe 28Biểu đồ 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết đến hiệu suất chiết trên nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe 29

Đồ thị 3.1 Đường chuẩn lutein 32

Đồ thị 3.2 Đường chuẩn zeaxanthin 33

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sử dụng TPBVSK mỗi ngày đã trở thành một thói quen của nhiều người dân trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng, nhằm mục đích cung cấp các dưỡng chất lành mạnh cho cơ thể Trong số đó, dưỡng chất có nguồn gốc từ thực vật (phytonutrient) đang được nhắc đến càng ngày càng nhiều, mặc dù không phải là dưỡng chất thiết yếu cho cơ thể như vitamin hay chất khoáng, nhưng chúng lại có vai trò bảo vệ cơ thể chống lại bệnh tật Khi ô nhiễm môi trường đang gia tăng và tình hình dịch tễ bệnh diễn biến phức tạp, việc tiêu thụ các dưỡng chất thực vật đang được khuyến cáo mạnh mẽ nhằm mục đích bảo vệ sức khỏe Carotenoid là một nhóm dưỡng chất thực vật có tác dụng bảo vệ mắt, bao gồm phân nhóm xanthophyll với hai đại diện tiêu biểu là lutein và zeaxanthin đã được chứng minh có tác dụng chống lại và làm chậm sự tiến triển của thoái hóa điểm vàng do lão hóa

Lutein và zeaxanthin là hai thành phần chính cấu tạo nên điểm vàng của mắt, thường luôn đi kèm với nhau trong tự nhiên Cấu tạo hoàn chỉnh này giúp mắt nhìn rõ được mọi vật Khi đó mắt không phải điều tiết nhiều, tránh nhức mỏi mắt, giảm nguy

cơ mắc bệnh Chúng còn được gọi là carotenoid võng mạc

Mức lutein được khuyến cáo cần tiêu thụ là 6mg mỗi ngày để đạt được tác dụng

có hiệu quả Tuy nhiên trên thực tế chúng ta mới chỉ nạp một lượng rất ít so với mức khuyến cáo, cần bổ sung thêm Do đó, các TPBVSK chứa lutein và zeaxanthin đã ra đời và được sử dụng ngày càng phổ biến

Từ đó, nảy sinh ra yêu cầu cần thiết phải quản lý chất lượng TPBVSK như trên, đồng thời ở Việt Nam hiện nay chưa có phương pháp chính thống nào xác định đồng thời hàm lượng lutein và zeaxanthin trong TPBVSK, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xác định hàm lượng lutein và zeaxanthin trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”

Với các mục tiêu:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng lutein và zeaxanthin trên hai nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe dạng bào chế viên nang mềm và viên nang cứng

2 Áp dụng phương pháp để xác định hàm lượng lutein và zeaxanthin trong một số

TPBVSK trên thị trường

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Thực phẩm bảo vệ sức khỏe

1.1.1 Khái niệm

phẩm chức năng; chương I, điều 2:

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe (Health Supplement, Food Supplement, Dietary Supplement) là sản phẩm được chế biến dưới dạng viên nang, viên hoàn, viên nén, cao, cốm, bột, lỏng và các dạng chế biến khác có chứa một hoặc hỗn hợp của các chất sau đây:

a) Vitamin, khoáng chất, axit amin, axit béo, enzym, probiotic và chất có hoạt tính sinh học khác;

b) Hoạt chất sinh học có nguồn gốc tự nhiên từ động vật, chất khoáng và nguồn gốc thực vật ở các dạng như chiết xuất, phân lập, cô đặc và chuyển hóa

Cách sử dụng: cách dùng phổ biến nhất là dùng đường uống

Dựa theo công thức cấu tạo, carotenoid có thể chia thành hai nhóm:

+ Hydrocacbon tan trong dung môi kém phân cực: caroten, lycopen,…

+ Xanthophyll: dẫn chất oxy hóa của carotenoid (alcol, aldehyd, ceton, epoxid

và acid) Đại diện tiêu biểu là lutein và zeaxanthin, các dẫn chất epoxid của carotenoid

1.2.3 Tác dụng sinh học chung

Cấu trúc của các carotenoid có chứa nhiều nối đôi liên hợp, nên các hợp chất này dễ bị oxy hóa Do đó, các carotenoid đều có tác dụng chống oxy hóa, từ đó quy định nên nhiều tác dụng khác đối với sức khỏe như bảo vệ thị giác, phòng chống các bệnh tim mạch, bảo vệ da chống lão hóa, cải thiện chức năng thần kinh,…

Vì vậy, hiện nay các carotenoid đang được nghiên cứu nhiều nhằm ứng dụng trong sản xuất thuốc, TPBVSK, mỹ phẩm,…

1.3 Lutein và zeaxanthin

1.3.1 Công thức cấu tạo và tính chất vật lý, hóa học

tạo chứa hai nhóm hydroxy, hai vòng và cấu trúc C40 isoprenoid như các carotenoid khác Điểm khác nhau duy nhất là ở vị trí của một liên kết đôi, dẫn đến lutein có một vòng β và một vòng ε, còn zeaxanthin có hai vòng β Lutein có 10 liên kết đôi liên hợp, zeaxanthin có 11 liên kết đôi liên hợp Do đó, lutein có màu vàng nhạt còn zeaxanthin có màu vàng đậm hơn

Vì công thức cấu tạo dễ bị oxi hóa nên lutein và zeaxanthin dễ bị phân hủy thậm chí bởi các tác nhân yếu như ánh sáng, nhiệt độ,… Điều này quy định nên tác dụng chống oxi hóa cho cơ thể của hai chất này Tuy nhiên trong quá trình xử lý mẫu

và phân tích cần chú ý tránh các tác nhân gây phân hủy như ánh sáng, nhiệt độ cao

Mặc dù cả lutein và zeaxanthin đều có chuỗi liên kết đôi liên hợp có thể tồn tại

ở dạng cis hoặc dạng trans, nhưng trong tự nhiên chúng thường tồn tại ở dạng all-trans Công thức cấu tạo dạng all-trans được trình bày trong hình 1.1

Hình 1.1 Công thức cấu tạo dạng all-trans của lutein và zeaxanthin

Một số tính chất vật lý, hóa học của lutein và zeaxanthin được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số tính chất vật lý, hóa học của lutein và zeaxanthin

Phân tử lượng 568,88 g/mol 568,88 g/mol

Danh pháp 3R,3'R,6’R-β,ε-caroten-3,3'-diol 3R,3'R-β,β-caroten-3,3'-diol

Cảm quan Bột màu vàng cam, mùi đặc trưng Bột màu vàng cam sẫm, ít

hoặc không mùi

Độ tan Không tan trong nước

Tan trong hexan

Không tan trong nước Tan ít trong cloroform

t o

1.3.2 Nguồn gốc trong tự nhiên của lutein và zeaxanthin

1.3.2.1 Thực phẩm

Lutein và zeaxanthin thường luôn đi cùng nhau trong thức ăn và trong mô của

cơ thể người, trong đó, lutein thường có hàm lượng cao hơn [25] Lutein và zeaxanthin trong thực phẩm tồn tại ở cả dạng tự do hoặc dạng ester kết hợp với các acid béo Lutein trong thực phẩm

Một số loại thức ăn chứa lutein: lòng đỏ trứng (143 +/- 28μg trên một lòng đỏ [24]; 292 +/- 117μg [14], 197,14 +/- 131,4μg hoặc 598,92 +/- 131,7μg tùy mẻ trứng [52]); rau bina (18mg/100g sau khi nấu), ngô (267μg/100g sau khi nấu) [13]

Lutein dường như có hàm lượng cao nhất trong rau bina và cũng có hàm lượng cao trong trứng (loại thức ăn giúp hấp thụ lutein tốt nhất)

Zeaxanthin trong thực phẩm

Các loại thức ăn đã được chứng minh có chứa zeaxanthin bao gồm: trứng (xấp

xỉ 85 μg mỗi lòng đỏ), quả đào [23], quả hồng [55]

Rau xanh đậm chứa nhiều zeaxanthin hơn trứng nhưng zeaxanthin trong trứng lại rất dễ hấp thụ, do đó trứng là nguồn thực tế để hấp thu zeaxanthin và lutein [41]

1.3.2.2 Nguồn nguyên liệu sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Trong công nghiệp sản xuất TPBVSK, nguồn nguyên liệu tự nhiên phổ biến để chiết xuất lutein và zeaxanthin là hoa cúc vạn thọ (Tagetes erecta L.) Cúc vạn thọ là nguồn giàu lutein ester nhất và cũng có thể xem là nguồn nguyên liệu tự nhiên có khả năng chiết xuất lutein ester cao nhất

1.3.3 Công dụng

1.3.3.1 Lutein và zeaxanthin đối với bệnh thoái hóa điểm vàng do lão hóa

Thoái hóa điểm vàng do lão hóa (age mascular degenerated – AMD)

AMD là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây mù lòa ở người lớn tuổi AMD gồm hai giai đoạn là AMD sớm, thường không có triệu chứng, và AMD muộn,

có thể dẫn đến mất thị lực trung tâm và có khả năng gây mù lòa

Sự có mặt duy nhất của lutein và zeaxanthin ở trung tâm điểm vàng thể hiện vai trò quan trọng của chúng đối với thị giác [15] Giả thuyết cơ chế bảo vệ mắt chống lại AMD của lutein và zeaxanthin là do các tính chất chống oxy hóa và lọc ánh sáng xanh bước sóng ngắn của chúng [5]

Lutein và zeaxanthin đối với AMD (các nghiên cứu dịch tễ và can thiệp)

Đã có một lượng lớn nghiên cứu thuần tập và đối chứng ca lâm sàng đánh giá mối liên quan giữa chế độ ăn chứa lutein và zeaxanthin với nguy cơ AMD [31], [44], [43]

Tác dụng bảo vệ chống lại AMD muộn: năm 2012, một tổng quan hệ thống và sáu phân tích thuần tập theo chiều dọc đưa ra bằng chứng cho thấy tác dụng bảo vệ tiềm năng của lutein và zeaxanthin đối với bệnh nhân mắc AMD muộn và những người có yếu tố nguy cơ di truyền cao AMD [28]

Chống lại sự tiến triển của AMD: có bằng chứng cho thấy lutein và zeaxanthin

có thể bảo vệ chống lại sự tiến triển của AMD từ nghiên cứu AREDS2 Kết quả phân tích cho thấy lutein và zeaxanthin đứng đầu trong các chất được nghiên cứu về việc làm chậm tiến triển thành AMD giai đoạn nặng, mặc dù điều này chỉ đúng ở những người có chế độ ăn chứa ít lutein và zeaxanthin [7]

Nguy cơ di truyền: có bằng chứng cho thấy khi tiêu thụ nhiều lutein và zeaxanthin có thể bảo vệ chống lại AMD ở người có nguy cơ di truyền cao dựa trên hai gen AMD chính [51]

Thị lực: năm 2015, phân tích meta các thử nghiệm ngẫu nhiên có đối chứng cho thấy việc bổ sung lutein và zeaxanthin có liên quan đến những cải thiện có ý nghĩa trên thị lực và độ nhạy cảm với tương phản, phụ thuộc liều dùng [27] Hơn nữa, một mối quan hệ tuyến tính đã được chỉ ra giữa sự cải thiện trên và sự gia tăng mật độ quang sắc tố hoàng điểm (MPOD) [27]

Mật độ quang sắc tố hoàng điểm (MPOD) và AMD: Nồng độ mật độ quang sắc

tố hoàng điểm, đặc biệt là ở võng mạc trung tâm, có thể ảnh hưởng đến AMD [33] Một lượng lớn các nghiên cứu cho thấy MPOD giảm theo tuổi và có sự thiếu hụt MPOD ở bệnh nhân AMD so với người khỏe mạnh [23] Một phân tích meta 20 thử nghiệm ngẫu nhiên có đối chứng vào năm 2016 cho thấy bổ sung lutein, zeaxanthin và meso-zeaxanthin (chất chuyển hóa của lutein) cải thiện MPOD ở cả đối tượng khỏe mạnh và bệnh nhân AMD phụ thuộc vào liều [29]

Hàm lượng lutein và zeaxanthin cần tiêu thụ ở người

Chưa có khuyến cáo chính thức về hàm lượng lutein và zeaxanthin cần tiêu thụ Tuy nhiên, dựa trên một nghiên cứu công bố vào năm 1994 [44], mức 6 mg lutein và zeaxanthin mỗi ngày (khoảng ≥ 6 lòng đỏ trứng hoặc xấp xỉ 1,3 kg ngô) đã được đề xuất là mục tiêu để giảm nguy cơ AMD cho cả nam và nữ

Mặc dù dữ liệu nghiên cứu còn hạn chế, nhưng cho thấy lượng tiêu thụ lutein và zeaxanthin thực tế thấp hơn đáng kể so với mục tiêu được đề nghị Người Mỹ trưởng thành tiêu thụ khoảng 1−2 mg lutein mỗi ngày [31] Người lớn tuổi ở Blue Mountain,

Úc, tiêu thụ trung bình 0,9 mg mỗi ngày [30]

Nguồn thức ăn chính để hấp thu lutein và zeaxanthin là bông cải xanh, đậu xanh

và cam Tuy nhiên, kết quả từ “Khảo sát Sức khỏe” ở Úc cho thấy chỉ có 7% người Úc trưởng thành tiêu thụ các loại rau ≥ lượng được khuyến cáo [3]

Hiện nay chưa có dữ liệu về lượng lutein và zeaxanthin thực tế được người Việt Nam tiêu thụ mỗi ngày nhưng có thể dự đoán là thấp hơn mục tiêu được đề nghị dựa trên dữ liệu ở các nước phát triển và lượng rau xanh người Việt Nam tiêu thụ thấp Do

đó các TPBVSK bổ sung lutein và zeaxanthin vào chế độ ăn là cần thiết và đang trở nên càng ngày càng phổ biến ở Việt Nam

1.3.3.2 Các tác dụng khác trên sức khỏe người (kết quả từ các nghiên cứu in vitro, thuần tập, dịch tễ và thử nghiệm lâm sàng)

Chống oxy hóa: lutein và zeaxanthin đều có tác dụng chống oxy hóa, làm chậm quá trình oxy hóa do tia UV, bảo vệ màng lipid tế bào chống lại các gốc tự do [47]

Bệnh tim mạch: tiêu thụ thực phẩm giàu lutein có tác dụng bảo vệ chống lại sự tiến triển của bệnh xơ vữa động mạch sớm [11] Nồng độ lutein và zeaxanthin trong huyết thanh có liên quan đến việc giảm nguy cơ xơ vữa động mạch [53], nồng độ thấp

biomarker của các bệnh tim mạch một cách có ý nghĩa thông qua peroxy hóa lipid và đáp ứng viêm [51]

Hệ thần kinh trung ương: lutein là một carotenoid chính trong mô não và nó có thể ảnh hưởng đến chức năng thần kinh ở người lớn tuổi Nổng độ lutein cao có liên quan đến khả năng nhận thức tốt hơn ở người lớn tuổi [20] Mật độ quang sắc tố thấp liên quan đến việc đạt kết quả kém trong bài kiểm tra tình trạng tâm thần và đánh giá nhận thức Montreal [12]

Các tác dụng khác: trong điều kiện in vitro, lutein đã được chứng minh có tác dụng ức chế sự phát triển của một số loại tế bào ung thư Lutein cũng có các tác dụng bảo vệ chống lại đái tháo đường và các biến chứng đi kèm [32], kháng khuẩn và chống viêm, …

1.3.3.3 Công dụng trong ngành công nghiệp sản xuất chế biến thực phẩm

Xu hướng hiện nay trong công nghiệp sản xuất chế biến thực phẩm là ưu tiên

các chất màu có nguồn gốc tự nhiên hơn nguồn gốc tổng hợp do tính an toàn đối với sức khỏe người dùng Vì vậy, lutein và zeaxanthin (chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ) càng ngày càng được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để tạo màu vàng cam cho dẩu ăn, các loại sốt, bánh, kẹo, thức ăn cho trẻ em,…

1.4 Các phương pháp xác định hàm lượng lutein và/hoặc zeaxanthin

1.4.1 Các phương pháp chung

Đã có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để xác định hàm lượng lutein và/hoặc zeaxanthin trong dược liệu và các sản phẩm sữa công thức, sản phẩm dinh dưỡng

Các phương pháp này sử dụng các kĩ thuật khác nhau bao gồm: quang phổ huỳnh quang [4]; quang phổ UV – VIS [26]; UPLC [10], [21], [37], [42]; HPLC detector PDA [1], [2], [17], [18], [34], [38], [48], detector UV đa bước sóng [54], MS [9], [49]; kết hợp HPLC và quang phổ UV-VIS [19],… Trong đó, kĩ thuật HPLC detector PDA được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu do các ưu điểm như trang thiết bị phổ biến tại các phòng thí nghiệm, độ chính xác cao, độ nhạy cao,… Kĩ thuật này sẽ được trình bày ở phần 1.4.2 Một số ví dụ về các phương pháp khác dùng để xác định hàm lượng lutein và/hoặc zeaxanthin được tóm tắt trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Các phương pháp xác định hàm lượng lutein và/hoặc zeaxanthin sử dụng kĩ thuật khác kĩ thuật HPLC detector PAD

các cộng sự

[26]

Chlorophyll và carotenoid

Lá của thực vật bậc cao, Euglena, tảo nâu và các loại vi khuẩn lam khác nhau

Quang phổ UV-VIS

Đơn giản và tiết kiệm thời gian, chi phí

- Độ chính xác không cao khi xác định các chất có hệ

số hấp thụ thấp (trong vùng phổ phân tích) hoặc hàm lượng thấp

- Không thể phân biệt các chất sắc tố màu có phổ hấp thụ UV-VIS (gần như) giống nhau

chóng (rửa giải hoàn toàn các carotenoid trong vòng

4 Dugo và các

cộng sự [10]

ζ-carotene, phytofluene, lutein và các lutein ester, các β-cryptoxanthin ester, antheraxanthin ester, luteoxanthin ester, auroxanthin ester,

Thiết bị không phổ biển, đắt tiền

Gạo (Oryza sativa L.)

Quang phổ huỳnh quang

- Khả năng phân tích tương đương HPLC, đặc biệt là ở nồng độ thấp của carotenoid

- Ít gây phân hủy lutein và zeaxanthin

carotenal, lycopene, carotene, phytoene

β-Nguyên liệu sản xuất

MS/MS

UHPLC-Độ nhạy và độ chọn lọc cao

Thiết bị không phổ biển, đắt tiền

đa bước sóng

- Giảm hao hụt xanthophyll do chiết hexan trước khi xà phòng hóa

- Thêm THF + hexane tăng hiệu suất chiết

Chỉ phân tích lutein

cis-isomer zeaxanthin, zeasxanthinal,

apo-parasiloxanthin, diatoxanthin

Bột tinh thể zeaxanthin tinh khiết

Kết hợp VIS & HPLC

UV-Phương pháp đơn giản, phân tích được nhiều chất

Nền mẫu là bột tinh thể tinh khiết

cộng sự [9]

Zeaxanthin; lutein; cis-isomer β-carotene; 5,6-epoxyxanthophyll; 5,8-epoxy xanthophyll diasteroisomer

9Z,9'Z-Nho Negroamaro

HPLC với detector ESI-

HPLC với detector ESI/APCIMS

Phân tách được hỗn hợp phức tạp nhiều cis, trans-lutein khác nhau

Độ chọn lọc không cao

1.4.2 Các phương pháp sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA

1.4.2.1 Điều kiện phân tích mẫu

Về pha tĩnh, cột C18 và C30 thường được lựa chọn Trong đó, cột C18 có ưu điểm về giá thành và về tính phổ biến tại các phòng thí nghiệm ở Việt Nam, đồng thời cũng có thời gian cho một lần chạy ngắn hơn nhiều so với cột C30

Về pha động, các hệ dung môi có thành phần chính là ACN và/hoặc methanol được sử dụng chủ yếu [40] ACN được chọn do có độ nhớt thấp, độ hấp thụ UV thấp,

áp suất cột thấp và đa phần cho hình dạng pic tốt [40] Một tỷ lệ nhỏ dung môi ít phân cực hơn thường được cho thêm vào để đạt thời gian lưu mong muốn, tăng độ hòa tan của chất phân tích và cải thiện độ phân giải Các dung môi được sử dụng thường xuyên nhất là dichloromethan, THF, MtBE, ethyl acetat, hexan, aceton, các dung môi clo (ví dụ: chloroform) và nước cất hai lần [40]

1.4.2.2 Điều kiện xử lý mẫu

Lutein và zeaxanthin trong tự nhiên ngoài dạng tự do còn tồn tại ở cả dạng các lutein ester và zeaxanthin ester, do đó trước khi phân tích cần có quá trình xà phòng hóa để chuyển toàn bộ dạng ester về dạng tự do Một số nghiên cứu không thực hiện quá trình này, vì trong dược liệu nghiên cứu không tồn tại dạng ester (hàm lượng thấp, không có ý nghĩa) [1] hoặc xác định đồng thời cùng các chất bị loại bỏ bởi quá trình xà phòng hóa (ví dụ như chlorophyll) [49]

Các tác nhân xà phòng hóa đã được sử dụng trong các nghiên cứu bao gồm dung dịch kiềm [2], [34], [38] và enzym lipase [6], [56] Dung dịch kiềm thường được

ưu tiên do có ưu điểm về độ phổ biến và giá thành, ngoài ra hiệu quả xà phòng hóa của enzym lipase cũng cần được nghiên cứu thêm [6], [56]

Hexan là thành phần phổ biến của dung môi chiết [2], [34], [38] THF có thể được thêm vào vì có khả năng hòa tan lutein và zeaxanthin cao, độ tan của lutein trong THF là 8000mg/L, gấp 400 lần so với trong hexan là 20 mg/L [8] Tuy nhiên, THF có khả năng làm peroxid hóa lutein nên các chất chống oxy hóa (ví dụ như BHT [8], acid ascorbic [45]) được thêm vào để ngăn chặn điều này Trong môi trường kiềm, tránh

chống oxi hóa, làm giảm phân hủy lutein từ 0,04% – 2,5%/ngày [45]

Một số ví dụ các phương pháp xác định hàm lượng lutein và/hoặc zeaxanthin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA được trình bày trong bảng 1.3

Bảng 1.3 Các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA xác định hàm lượng lutein và/hoặc zeaxanthin

Stt Tác giả Đối tượng Nền mẫu Xử lý mẫu Phương pháp phân tích Ưu nhược điểm

cis-Dịch chiết cúc vạn thọ

- Xà phòng hóa bằng KOH 40%

vòng 20 phút

- Chiết bằng hexan

- Nhược: dung môi chiết có chứa toluen độc hại

các cộng

sự [34]

Lutein, zeaxanthin, β-cryptoxanthin

Dịch chiết xuất

từ ngô

- Xà phòng hóa bằng dung dịch KOH 85%,

- Chiết bằng hexan

- Cột: 4,6mm x 250mm C30

- Pha động:

+ A: MeOH/MtBE/nước 81:15:4 + B: MeOH/MtBE 9:91

+ Gradient: 100%A → 50% A trong 45 phút → 100% B trong 15 phút

- Tốc độ dòng: 1,0mL/phút

- Ưu: phân tách tốt lutein và zeaxanthin, thời gian 1 lần chạy ngắn (<25 phút)

- Nhược: quy trình xử lý mẫu không chiết được toàn

bộ xanthophyll với một số mẫu ngô

[2]

Cis, lutein;

trans-cis, carotene;

trans-β-Sản phẩm dinh dưỡng trẻ

em, trẻ sơ

-Xà phòng hóa bằng KOH 45%,

- Ưu: phân tách tốt, độ nhạy

và độ chọn lọc cao

- Nhược: các ưu điểm trên chỉ đúng với nền mẫu sản

cis, lycopene;

trans-sinh và người trưởng thành

hợp hexan/

MtBE 75:25

+ Gradient: 0-10 phút 100% A; 10,1-18 phút 65% A; 18,1-27 phút 25% A; 27,1-

30 phút 100% A

- Tốc độ dòng: 1mL/phút

phẩm dinh dưỡng trẻ em, trẻ sơ sinh và người trưởng thành

[18]

Lutein, zeaxanthin

Tinh thể tinh khiết

β-; β-carotene

Lá Cyphostemma digitatum

Không có quá trình xà phòng hóa

- Cột: C30 (250 × 4.6 mm, 5 µm) và tiền cột tương ứng

- Pha động: MtBE/MeOH; gradient

- Tốc độ dòng: 1,3 mL/phút

- Bước sóng phát hiện: 470 nm

- Ưu: độ nhạy cao

- Nhược: thời gian một lần chạy dài (70 phút), độ chọn lọc với lutein và zeaxanthin không cao mặc dù sử dụng cột C30

các cộng

sự [48]

β-carotene, lutein, neoxanthin, violaxanthin, tocopherols

Lá, nụ, hoa Capparis spinosa

Không có quá trình xà phòng hóa

- Cột: C18 (250 mm x 4.6 mm)

- Pha động:

+A: acetonitril/nước 90:10 + B: ethyl acetat

+ Gradient: 0 phút 100% A → 35 phút 100% B → 40 phút 100% A

-Nhược: không phân tích đồng thời lutein và zeaxanthin

trình xà phòng hóa

- Cột C30 (250 mm × 4.6 mm, 5 µm)

- Pha động:

+ A: MeOH/MtBE/nước 81:15:4 + B: MeOH/MtBE/nước 4:92:4 + Gradient: 0-60 phút B tăng từ 0-80%;

60-65 phút B tăng 100%; 65-70 phút giảm 0% B; 70-80ph 0% B

- Tốc độ dòng: 0,42 mL/phút

- Thể tích tiêm mẫu: 20 µL

- Bước sóng phát hiện: 450 nm

- Ưu: hiệu suất chiết cao do

tới hạn

- Nhược: thời gian cho một lần chạy dài (80 phút), không phân tích đồng thời lutein và zeaxanthin

Dịch chiết CO2 siêu tới hạn daylily

-Cột: C30 (250 × 4.6 mm, 5 µm) -Pha động: MeOH/MtBE 86:14 -Tốc độ dòng: 1 mL/phút;

-Thể tích tiêm mẫu: 20 µL -Bước sóng phát hiện: 450 nm

- Ưu: phân tách tốt (Rs > 1), hiệu suất chiết cao, thời gian cho một lần chạy ngắn (20 phút)

- Nhược: phương pháp phức tạp, thiết bị đắt tiền

Loại bỏ diệp lục thông qua quá trình xà phòng hóa và tinh chế bằng cách chiết bằng dung môi

-Cột: Zorbax ODS 150 mm x 4.6 mm hoặc tương đương

-Pha động: ethyl acetat/ACN 12:88 + 0.1% (v/v) n-decanol

-Thể tích tiêm mẫu: 10 µL -Bước sóng phát hiện: 450 nm

- Ưu: phương pháp đơn giản, các thiết bị phổ biến,

- Ly tâm 2ml dịch nuôi cấy, loại bỏ tế bào

- Thêm 1mL hỗn hợp chiết gồm 2,5% acid ascorbic và KOH 10M

- Xà phòng hóa, 60°C, 10 phút, làm nguội

- Chiết với 19mL MeOH

-Cột C18 250 x 4.6 mm (5μm) -Pha động: MeOH/dichloro methan/ACN/nước cất 67,5:22,5:9,5:0,5 -Tốc độ dòng: 1mL/phút

-Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng -Bước sóng phát hiện: 450 nm

- Ưu: trình bày được các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của lutein

- Nhược: không có độ chọn lọc cao với lutein Không phân tích đồng thời lutein

và zeaxanthin

11 Zorn và

các cộng

sự [56]

Lutein, zeaxanthin

Hoa cúc vạn thọ

Xà phòng hóa bằng lipase

- Cột: C30 250mm ×4.6mm (5 μm)

- Pha động:

+ A: MeOH/MtBE/nước 81:15:4 + B: MeOH/MtBE/nước 6:90:4 + Gradient: 99% A, 56% B sau 39 phút, 100% B sau 45 phút, 100% A sau 50 phút,

- Ưu: độ chọn lọc cao giữa lutein và zeaxanthin

vạn thọ

Xà phòng hóa bằng lipase

- Cột: C18 Zorbax ODS (250 x 4.6 mm),

5 µm

- Pha động:

+ A: ACN/nước 9:1 + 0,25 % TEA + B: ethyl acetat + 0,25% TEA + Gradient: 20 % B → 50% B sau 3 phút

→ 75 % sau 12 phút → giữ nguyên đến phút 60

- Tốc độ dòng: 1mL/phút

- Bước sóng phát hiện: 450nm

- Nhược: điều kiện xà phòng hóa bằng enzym (nồng độ, thời gian) chưa được tối ưu hóa, cần nghiên cứu thêm Không phân tích đồng thời lutein và

zeaxanthin

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu, hóa chất

Các hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích, bao gồm:

- Kali hydroxid (KOH), acid ascorbic, hexan

- Tetrahydrofuran (THF), ethyl acetat, 1 – decanol, dichloromethan (DCM), acetonitril

(ACN) dùng cho HPLC của hãng Merck

2.1.2.2 Phương pháp chuẩn bị dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn lutein gốc: hòa tan hoàn toàn và vừa đủ 1 mg chất chuẩn (độ tinh khiết 97,6%) trong bình định mức 20mL bằng hỗn hợp DCM:ACN 1:1 để được dung dịch chuẩn gốc nồng độ 48,80 ppm

Dung dịch chuẩn zeaxanthin gốc: hòa tan hoàn toàn và vừa đủ 1 mg chất chuẩn (độ tinh khiết 98,7%) trong bình định mức 20mL bằng hỗn hợp DCM:ACN 1:1 để được dung dịch chuẩn gốc 49,35 ppm

Chuẩn làm việc: các dung dịch chuẩn làm việc là dung dịch chuẩn hỗn hợp lutein và zeaxanthin, được pha loãng bằng ACN từ dung dịch chuẩn gốc, bằng các dụng cụ chính xác (micropipet, bình định mức, pipet chính xác )

Bảng 2.1 Cách chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc từ dung dịch chuẩn gốc

Nồng độ dung dịch

chuẩn hỗn hợp

lutein/zeaxanthin

Pha loãng Thể tích

định mức (mL)

Thể tích dung dịch chuẩn gốc lutein

Thể tích dung dịch chuẩn gốc zeaxanthin

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Alliance e2695 Separations module kết

nối với detector 2998 PDA của hãng Waters

- Cột Reliant C18 4,6 x 250 mm, 5 μm của hãng Waters (code 186007283) cùng tiền

cột (code 186007731) và gá cột (code 186007749) đi kèm

- Cân phân tích (có độ chính xác 0,0001 g) XS105, Metter Toledo

- Máy lắc vortex

- Máy lắc ngang IKA – KS501

- Máy ly tâm Hermle

- Máy cô quay Buchi Rotavapor R-300

- Bể điều nhiệt, Buchi Heating Bath B-491

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là lutein và zeaxanthin

Nền mẫu là TPBVSK có chứa lutein và zeaxanthin được lấy ngẫu nhiên trên thị trường Hà Nội, có các dạng bào chế khác nhau

2.2.2 Xây dựng và thẩm định phương pháp

2.2.2.1 Khảo sát điều kiện phân tích

- Khảo sát và lựa chọn cột sắc ký

- Khảo sát và lựa chọn pha động

- Khảo sát và lựa chọn bước sóng phát hiện

2.2.2.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

Nền mẫu được lựa chọn là TPBVSK chứa thành phần lutein và zeaxanthin chiết

xuất từ nguyên liệu tự nhiên ví dụ như hoa cúc vạn thọ (Tagetes erecta L.) Và trong tự

nhiên, lutein và zeaxanthin thường tồn tại dưới dạng ester với các acid béo khác nhau như acid palmitat, acid linoleat,… Do đó, cần có quá trình xà phòng hóa để chuyển dạng ester thành dạng tự do, đồng thời loại bỏ tạp không mong muốn (ví dụ như chlorophyll)

Thông qua tham khảo tài liệu, giữa dung dịch kali hydroxid [2], [34], [38] và enzym lipase [6], [56], chúng tôi lựa chọn dung dịch KOH là tác nhân xà phòng hóa trong nghiên cứu này vì các ưu điểm tính hiệu quả, tính phổ biến và giá thành Tuy nhiên lutein và zeaxanthin có độ ổn định không cao dưới tác động của các yếu tố như dung dịch kiềm đặc, nhiệt độ, v.v

Vì vậy, một số khảo sát sau đã được thực hiện nhằm tối ưu hóa quá trình phân tích, tăng hiệu suất quá trình xà phòng hóa và quá trình chiết lutein và zeaxanthin:

- Khảo sát và lựa chọn nồng độ KOH;

- Khảo sát và lựa chọn nhiệt độ xà phòng hóa;

- Khảo sát và lựa chọn thời gian xà phòng hóa;

- Khảo sát và lựa chọn khối lượng cân mẫu;

- Khảo sát và lựa chọn số lần chiết mẫu

Mỗi khảo sát đều được thực hiện trên hai nền mẫu là thực phẩm bảo vệ sức khỏe dạng bào chế viên nang mềm và viên nang cứng

2.2.3 Áp dụng phương pháp phân tích một số mẫu thực tế

- Đối tượng: TPBVSK chứa lutein và zeaxanthin

- Số lượng: 10 mẫu

- Cách lấy mẫu: lấy ngẫu nhiên từ thị trường Hà Nội

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp

2.3.1.1 Phương pháp khảo sát điều kiện phân tích

Dựa trên tài liệu tham khảo và thực tế, lựa chọn cột phân tách, thành phần pha động và bước sóng phát hiện phù hợp

2.3.1.2 Phương pháp khảo sát điều kiện xử lý mẫu

Mỗi điều kiện được khảo sát trên cả hai nền mẫu là TPBVSK dạng bào chế viên nang mềm và viên nang cứng

Quy trình xử lý mẫu dự kiến

Qua tham khảo tài liệu [2], quy trình xử lý mẫu dự kiến là:

- Bước 1: cân khoảng 1g mẫu (với nang mềm) và khoảng 0,1 – 0,2g mẫu (với

nang cứng vào ống ly tâm 50 mL Sau đó thêm 4 ml nước cất, lắc đều

- Bước 2: thêm dung môi chiết gồm 0,5 g acid ascorbic, 10 ml MeOH, 1 ml dung

dịch KOH 45%, lắc đều

- Bước 3: tiến hành xà phòng hóa ở 60oC trong 15 phút, sau đó làm lạnh ngay trong bể chứa đá lạnh

- Bước 4: thêm khoảng 10 – 15 mL n-hexan vào dịch mẫu sau khi xà phòng hóa,

lắc ngang ở 210 rpm trong 30 phút, ly tâm ở 6000rpm trong 3 phút, lấy phần dịch phía trên

- Bước 6: hòa cắn lại và định mức bằng ACN Phân tích trên hệ thống HPLC

Phương pháp khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu

Phương pháp khảo sát và lựa chọn nồng độ dung dịch KOH, nhiệt độ xà phòng hóa, thời gian xà phòng hóa và khối lượng cân mẫu: thay đổi yếu tố cần khảo sát ở các giá trị khác nhau, cố định tất cả các yếu tố còn lại và tiến hành xử lý mẫu theo các bước trong quy trình dự kiến Sau khi phân tích trên HPLC, so sánh hàm lượng lutein

và zeaxanthin và lựa chọn giá trị cho hàm lượng lutein và zeaxanthin cao nhất

Phương pháp khảo sát và lựa chọn số lần chiết mẫu:

- Lần 1: tiến hành xử lý mẫu từ bước 1 đến bước 4 trong quy trình xử lý mẫu dự

rồi phân tích trên hệ thống HPLC

- Lần 2: tiếp tục thêm khoảng 10 – 15mL hexan vào dịch sau khi xà phòng hóa

trong ống ly tâm Lắc ngang ở 210 rpm trong 30 phút, ly tâm ở 6000rpm trong

ACN rồi phân tích trên hệ thống HPLC

- Lần 3, lần 4 và lần 5: thực hiện tương tự như lần 2

- So sánh hiệu suất chiết sau các lần chiết và đưa ra kết luận

2.3.1.3 Phương pháp xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích

Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

Trong nghiên cứu này, giá trị LOD và LOQ được xác định bằng cách phân tích lặp lại 10 lần mẫu thực có hàm lượng thấp (khoảng 5 – 10 lần giá trị LOD ước lượng) LOD và LOQ được tính dựa trên giá trị 𝑥̅ và độ lệch chuẩn SD theo công thức sau:

𝐿𝑂𝐷 = 3 𝑥 𝑆𝐷;

𝐿𝑂𝑄 = 10 𝑥 𝑆𝐷;

Trong đó: 𝑆𝐷 = √∑(𝑥𝑖 −𝑥̅) 2

𝑛−1

𝐿𝑂𝐷

- 4 < R < 10: nồng độ dung dịch thử phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy

- R < 4: phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm một ít chất chuẩn vào

dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R

- R > 10: phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoặc pha loãng dung thử đã dùng

và làm lại thí nghiệm và tính lại R

2.3.2 Áp dụng phân tích một số mẫu thực tế

Áp dụng phương pháp đã được xây dựng và thẩm định để phân tích 5 mẫu TPBVSK dạng bào chế nang mềm và 5 mẫu dạng bào chế nang cứng thu thập ngẫu nhiên từ thị trường Hà Nội

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được tính toán và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2016

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Khảo sát điều kiện phân tích

3.1.1 Lựa chọn cột phân tích

Qua tham khảo tài liệu, hai cột sắc ký được sử dụng phổ biến để phân tích lutein và zeaxanthin là cột C18 và C30 Trong đó, cột C18 có ưu điểm về giá thành, độ phổ biến, đồng thời cũng cho thời gian phân tích ngắn hơn

Vì các ưu điểm này và dựa trên điều kiện trang thiết bị của các phòng thí nghiệm tại Việt Nam, chúng tôi đã lựa chọn cột C18 cho nghiên cứu này

67,5:22,5:9,5:0,5 (v/v) Qua thực tế, nhận thấy pha động với thành phần ethyl acetat/ACN (12:88) + 0,1% (v/v) n-decanol có khả năng tách tốt nhất Chúng tôi lựa chọn pha động có thành phần như trên cho nghiên cứu này Sắc ký đồ của chuẩn lutein, zeaxanthin và chuẩn hỗn hợp với từng pha động được trình bày trong hình 3.1, 3.2 và 3.3

Hình 3.1 Sắc ký đồ với pha động hexan:ethyl acetat = 65:35 (v/v)

Minutes

Dựa trên tài liệu tham khảo nhận thấy bước sóng 450nm thường được lựa chọn

để xác định đồng thời hàm lượng lutein và zeaxanthin [6], [16], [17], [45], [46], [56]

Và qua khảo sát thực tế nhận thấy lutein có dải bước sóng hấp thụ tối đa nằm trong khoảng từ 446 – 474 nm, zeaxanthin có dải bước sóng hấp thụ tối đa nằm trong khoảng từ 452 – 480 nm

Chúng tôi lựa chọn bước sóng phát hiện là 450 nm cho nghiên cứu này Phổ của lutein và zeaxanthin từ dung dịch chuẩn hỗn hợp được trình bày trong hình 3.4

Minutes 0.00 5.00 10.00 15.00

Minutes 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00

346.2

452.2 480.2

Chuẩn Zeaxanthin

Chuẩn hỗn hợp

Chuẩn hỗn hợp

Phổ lutein

Hình 3.4 Phổ của Lutein và Zeaxanthin – dung dịch chuẩn hỗn hợp

3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

3.2.1 Khảo sát nồng độ dung dịch kiềm

Nồng độ dung dịch KOH có ảnh hưởng đến quá trình xà phòng hóa lutein và zeaxanthin Ở nồng độ thấp quá trình xà phòng hóa có thể xảy ra chưa hoàn toàn, trong khi dung dịch kiềm đặc có thể gây phân hủy lutein và zeaxanthin Do đó, để tối ưu quá trình xử lý mẫu cũng như tăng hiệu quả chiết, khảo sát nồng độ dung dịch kiềm đã được thực hiện

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ KOH tới hàm lượng lutein và zeaxanthin trên nền mẫu TPBVSK dạng bào chế nang mềm và nang cứng được trình bày trong biểu đồ 3.1

Biểu đồ 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ KOH tới hàm lượng lutein và

zeaxanthin trên nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe

221.3

268.6

336.6

446.1 474.1

346.2

452.2 480.2

Hàm lượng Lutein (%) Hàm lượng Zeaxanthin (%) Phổ zeaxanthin

Kết quả khảo sát cho thấy lutein và zeaxanthin đều đạt hàm lượng cao nhất khi

sử dụng dung dịch KOH 45% trên cả hai nền mẫu TPBVSK Như vậy, nồng độ KOH được lựa chọn là 45%

3.2.2 Khảo sát nhiệt độ xà phòng hóa

Nhiệt độ có ảnh hưởng đến quá trình xà phòng hóa lutein và zeaxanthin Phản ứng xà phòng hóa cần được cung cấp nhiệt, nếu nhiệt độ quá thấp, quá trình xà phòng hóa có thể xảy ra chưa hoàn toàn, trong khi nhiệt độ cao có thể dẫn đến sự phân hủy lutein và zeaxanthin Do đó, để tối ưu quá trình xử lý mẫu cũng như tăng hiệu quả chiết, khảo sát nhiệt độ xà phòng hóa đã được thực hiện

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ xà phòng hóa tới hàm lượng lutein và zeaxanthin trên nền mẫu TPBVSK dạng bào chế viên nang mềm và viên nang cứng được trình bày trong biểu đồ 3.2

Biểu đồ 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ xà phòng hóa tới hàm lượng

lutein và zeaxanthin trên nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Kết quả khảo sát cho thấy hàm lượng lutein và zeaxanthin thu được tối ưu khi

3.2.3 Khảo sát thời gian xà phòng hóa

Thời gian phản ứng có ảnh hưởng đến quá trình xà phòng hóa lutein và zeaxanthin Nếu thời gian phản ứng quá ngắn, quá trình xà phòng hóa có thể xảy ra chưa hoàn toàn, còn kéo dài thời gian phản ứng có thể dẫn đến phân hủy lutein và

Nhiệt độ xà phòng hóa (oC)

Kết quả khảo sát nhiệt độ xà

phòng hóa - nang mềm

Hàm lượng Lutein (%)

Hàm lượng Zeaxanthin (‰)

0.0000 0.0100 0.0200 0.0300 0.0400 0.0500 0.0600 0.0700

Nhiệt độ xà phòng hóa (oC)

Kết quả khảo sát nhiệt độ xà phòng hóa - nang cứng

Hàm lượng Lutein (%) Hàm lượng Zeaxanthin (%)