GT hóa sinh t11 (TMai) 1

giáo trình viết theo chương trình giảng dạy tịch hợp, theo tình huống, theo vấn đề, sv làm chung tâm với tình huống giả định. theo hướng dẫn của sở lao động thương binh xã hội. ........................................................................................................

ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH BẮC NINH TRƯỜNG CAO ĐẲNG Y TẾ BẮC NINH

GIÁO TRÌNH HÓA SINH

(DÙNG CHO ĐÀO TẠO HỆ CAO ĐẲNG DƯỢC)

Bắc Ninh, năm 2019

TUYÊN BỐ BẢN QUYỀN

Tài liệu này thuộc loại sách giáo trình nên các nguồn thông tin có thểđược phép dùng nguyên bản hoặc trích dùng cho các mục đích về đào tạo vàtham khảo

Mọi mục đích khác mang tính lệch lạc hoặc sử dụng với mục đích kinhdoanh thiếu lành mạnh sẽ bị nghiêm cấm

LỜI GIỚI THIỆU

Theo quyết định của Bộ Lao động - Thương Binh và Xã hội, trường Caođẳng Y tế Bắc Ninh được thành lập với một trong các mục tiêu quan trọng làđào tạo hệ Cao đẳng Dược Hóa sinh là môn khoa học cơ sở quan trọng nhằmtrang bị cho sinh viên Cao đẳng Dược những kiến thức cơ bản, cần thiết để họtiếp thu tốt những môn chuyên ngành như: Hóa dược - Dược lý, Dược liệu,Bào chế…

Để đáp ứng yêu cầu trang bị kiến thức Hóa sinh cho sinh viên Cao đẳngDược theo quy định, chúng tôi biên soạn giáo trình “Hóa sinh” (Hệ Cao đẳngDược) này

Nội dung cuốn giáo trình bao gồm kiến thức cơ bản về hoá học của cáchợp chất chủ yếu của cơ thể sống, quá trình chuyển hoá của chúng ở tế bào,các xúc tác sinh học và năng lượng sinh học, hoá sinh các mô và các dịch sinhvật nhằm đáp ứng được mục tiêu đào tạo nghề Cao đẳng Dược chính quy do

Bộ Lao động - Thương binh và Xã hội; Bộ Y tế đề ra

Cao đẳng Dược là một mô hình đào tạo mới, chúng tôi lần đầu tiên viếttài liệu phục vụ mục tiêu đào tạo theo mô hình này vì vậy không thể tránhđược thiếu sót Chúng tôi rất mong nhận được những ý kiến quý báu từnhững nhà giáo, nhà khoa học, các bạn đọc và các bạn sinh viên để sau nàycuốn sách sẽ được chỉnh sửa, bổ sung hoàn chỉnh hơn, đáp ứng ngày càng tốtnhu cầu học tập của sinh viên

Xin trân trọng cảm ơn!

Bắc Ninh, ngày 05 tháng 01 năm 2019

Tham gia biên soạn

1 Ngô Thanh Mai

2 Nguyễn Văn Khoa

1 Đại cương về enzym

2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzym

3 Điều hòa hoạt động của enzym trong tế bào

4 Ứng dụng của enzym trong y dược

II THỰC HÀNH

1 Khảo sát hoạt động của một số enzym

2 Đo hoạt độ CK (Creatin kinase) toàn phần huyết thanh

I LÝ THUYẾT

1 Đại cương

2 Các hormon protein và peptid

3 Hormon dẫn xuất acid amin

2 Oxy hóa sinh học (hô hấp tế bào)

3 Chu trình krebs (chu trình acid citric)

II BÀI TẬP THỰC HÀNH

I LÝ THUYẾT

1 Tiêu hóa và hấp thu glucid

2 Thoái hóa glucid

3 Tổng hợp glucid ở tế bào và mô

4 Điều hòa chuyển hóa glucid

5 Rối loạn chuyển hóa glucid

II THỰC HÀNH

1 Định tính và sơ bộ định lượng đường niệu

2 Định lượng glucose trong huyết thanh

I LÝ THUYẾT

1 Tiêu hóa và hấp thu lipid

2 Thoái hóa lipid

3 Tổng hợp lipid

4 Điều hòa chuyển hóa lipid

5 Chuyển hóa cholesterol

6 Lipoprotein và sự chuyển lipid trong huyết tương

II THỰC HÀNH

1 Định lượng triglycerid trong huyết thanh

2 Định lượng cholesterol toàn phần trong huyết thanh

Chương 6 ACID NUCLEIC VÀ CHUYỂN HÓA ACID

I LÝ THUYẾT

1 Cấu tạo, vai trò các thành phần của acid nucleic

2 Cấu trúc của acid nucleic

3 Một số tính chất và ứng dụng của nucleic

II BÀI TẬP THỰC HÀNH

I LÝ THUYẾT

1 Tiêu hóa hấp thu của acid nucleic

2 Thoái hóa acid nucleic

3 Sinh tổng hợp acid nucleic

4 Điều hòa chuyển hóa acid nucleic

5 Rối loạn chuyển hóa acid nucleic

II BÀI TẬP THỰC HÀNH

I LÝ THUYẾT

1 Thoái hóa protein

2 Chuyển hóa acid amin

3 Sinh tổng hợp protein đặc hiệu

4 Chuyển hóa hemoglobin (hb)

II BÀI TẬP THỰC HÀNH

Chương 8 TRAO ĐỔI NƯỚC VÀ CÁC CHẤT VÔ CƠ -

I LÝ THUYẾT

1 Trao đổi nước và các chất vô cơ

2 Sự thăng bằng acid - base

II BÀI TẬP THỰC HÀNH

I LÝ THUYẾT

1 Đại cương

2 Những vấn đề cơ bản về hóa sinh máu

3 Những thành phần cơ bản về hóa sinh gan

4 Những vấn đề cơ bản của hóa sinh thận và nước tiểu

II BÀI TẬP THỰC HÀNH

PHỤ LỤC 2 MẪU PHIẾU CHẤM ĐIỂM CHUYÊN CẦN TỰ

CHƯƠNG TRÌNH MÔN HỌC Tên môn học: HÓA SINH

Mã môn học: 12

Vị trí, tính chất, ý nghĩa và vai trò của môn học

- Vị trí: Hóa sinh là môn học cơ sở trong chương trình giáo dục chuyên

ngành Dược Cao đẳng hệ 3 năm

- Tính chất: Môn học này cung cấp cho sinh viên những kiến thức cơ bản

về

+ Cơ sở phân tử của sự sống, sự xắp xếp và sự tương tác của chúng, là cơ

sở xây dựng những đại phân tử sinh học

+ Cơ chế hóa học của nhiều quá trình cơ bản của sự sống, bản chất của sựsống

+ Chẩn đoán lâm sàng: xét nghiệm hóa sinh để sàng lọc, chẩn đoán, tiênlượng và theo dõi điều trị

- Ý nghĩa và vai trò của môn học: Có ý nghĩa quan trọng trong lĩnh vực

nghiên cứu và phát triển thuốc mới như: khám phá cơ chế tác dụng của thuốc ởmức độ phân tử và tế bào, trên cơ sở đó giúp thiết kế các phân tử thuốc tác dụngtại đích đặc hiệu; kỹ thuật tái tổ hợp ADN và công nghệ sinh học dược mở ranhững khả năng sản xuất nhiều protein trị liệu Đặc biệt, có giá trị ứng dụng tolớn trong điều trị là trị liệu gen và trị liệu bằng tế bào gốc

Mục tiêu của môn học

1 Thể hiện thái độ chuyên cần, tỷ mỉ, cẩn thận trong quá trình thực hành

2 Tôn trọng các nguyên tắc, quy ước của quy trình kỹ thuật để đảm bảo

an toàn trong quá trình thực hành

3 Phát huy năng lực cá nhân và phối hợp làm việc nhóm trong quá trìnhthực hiện các kỹ thuật thực hành.

Phương pháp đánh giá

Kết quả môn học được đánh giá bằng:

+ Kết quả tự học (sản phẩm tự học theo nhóm (báo cáo power point), sảnphẩm tự học cá nhân (sổ tự học) và chuyên cần)

+ Kết quả thuyết trình, thảo luận nhóm, bình luận và phản biện giữa cácnhóm trong quá trình học tập

+ Kết quả kiểm tra tự luận và trắc nghiệm khách quan

- Đánh giá kết quả môn học:

Điểm kiểm tra

định kỳ 2 Kiểm tra tự luận (xử lý tình huống)

Điểm thi kết

thúc học phần

Thi trắc nghiệm trên máy tính (theo quy định củatrường)

Nội dung của môn học

* Nội dung tổng quát và phân bổ thời gian

Tổng số

Lý thuyết

Thự c hành / tích hợp

4 Chương 3: Trao đổi chất, oxy hóa sinh học, chu

5,6 Chương 4: Chuyển hóa Glucid 8 4 4

9,10 Chương 6: Acid nucleic và chuyển hóa Acid

13,14 Chương 8: Trao đổi nước và các chất vô cơ,

Chương 1 ENZYM MỤC TIÊU

Về kiến thức:

1 Trình bày được thành phần cấu tạo, danh pháp, phân loại enzym vàcoenzym có minh họa

2 Trình bày được năm đặc điểm cấu trúc phân tử và hai tính chất đặc

hiệu của enzym

3 Giải thích được các đặc tính của trung tâm hoạt động và cơ chế hoạtđộng của enzym

4 Giải thích được các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động và nguyên lý điềuhòa hoạt động enzym

5 Giải thích được một số ứng dụng của enzym trong thực tế

Về kỹ năng:

Thực hiện đúng quy trình các thí nghiệm minh họa những yếu tố ảnhhưởng đến hoạt động của enzym, tính đặc hiệu của enzym

Về năng lực tự chủ và trách nhiệm:

1 Thể hiện thái độ chuyên cần, tỷ mỉ, cẩn thận trong quá trình thực hành

2 Tôn trọng các nguyên tắc, quy ước của quy trình kỹ thuật để đảm bảo

an toàn trong quá trình thực hành

3 Phát huy năng lực cá nhân và phối hợp làm việc nhóm trong quá trìnhthực hiện các kỹ thuật thực hành

NỘI DUNG

I LÝ THUYẾT

1 ĐẠI CƯƠNG VỀ ENZYM

1.1 KHÁI NIỆM VỀ ENZYM

Enzym là những chất xúc tác sinh học đặc biệt của cơ thể sống, có bản chất là protein, có tác dụng xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa sinh xảy ra trong cơ thể sống.

Enzym có một số tính chất giống các chất xúc tác hóa học thông thường,

đó là:

- Các enzym không bị tiêu hao hoặc được sinh ra thêm trong quá trìnhphản ứng

- Các enzym không tạo ra phản ứng, nhưng chúng làm tăng đáng kể tốc

độ phản ứng Enzym làm thay đổi tốc độ phản ứng nhưng không làm thay đổihằng số cân bằng của phản ứng mà chúng xúc tác

Tuy nhiên, enzym còn có những tính chất khác với tính chất của các chấthóa học thông thường, đó là:

Các enzym thường chỉ hoạt động ở vùng nhiệt độ và pH vừa phải

1.2 CÁCH GỌI TÊN ENZYM

Có 4 cách gọi tên enzym:

Tên cơ chất và thêm tiếp vĩ ngữ ase Ví dụ: có chất là ure tên enzym làurease, cơ chất là protein tên enzym là proteinase,

- Tên tác dụng và thêm tiếp vĩ ngữ ase, Ví dụ: tác dụng oxy hóa, enzym làoxidase, tác dụng trao đổi amin enzym là amino transferase, tác đụng khử nhómCO2, enzym là decarboxylase,

Tên cơ chất, tác dụng và thêm tiếp vĩ ngữ ase Ví dụ: cơ chất là lactat vàtác dụng là khử hydro thì tên enzym là lactat dehydrogenase, cơ chất là tyrosin

và tác dụng là khử nhóm CO2 thì tên enzym là tyrosin decarboxylase,

- Tên thường gọi: cách gọi tên này không có tiếp vĩ ngữ ase Ví dụ:pepsin, trypsin, chymotrypsin,

1.3 PHÂN LOẠI ENZYM

Hiệp hội enzym quốc tế (Enzym Commission: EC.) đã phân loại enzymtheo phản ứng mà chúng xúc tác, thành 6 loại (class), theo thứ tự từ 1 đến 6, mỗiloại lại được chia thành các dưới lớp (subclass), mỗi dưới lớp lại được chiathành các nhóm (sub-subclass), mỗi nhóm gồm một số enzym

Như vậy, mỗi enzym đều được ký hiệu bằng một mã số EC chứa 4 chữ số,cách nhau bởi các dấu chấm thập phân Chữ số thứ nhất chỉ loại enzym, chữ sốthứ hai chỉ dướỉ lớp, chữ số thứ ba chỉ nhóm và chữ số thứ tư chỉ tên của bảnthân từng enzym riêng biệt trong nhóm Ví dụ: enzym hexokinase có ký hiệu là

EC 2.7.1.1 là enzym thuộc loại 2, dưới lớp là 7, thuộc nhóm 1 và có số thứ tựcủa enzym trong nhóm là 1 Sáu loại enzym được sắp xếp theo thứ tự:

1.3.1 Enzym oxy hóa khử (Oxidoreductase)

Là loại enzym xúc tác cho phản ứng oxy hóa và phản ứng khử, nghĩa làcác phản ứng có sự trao đổi H hoặc điện tử theo phản ứng tổng quát sau:

AH2 + B —► A + BH2Loại enzym oxy hóa khử gồm các dưới lớp:

- Các dehydrogenase: sử dụng các phân tử không phải oxy (ví dụ: NAD+)làm chất nhận điện tử Ví dụ: lactat dehydrogenase, malat dehydrogenase

- Các oxidase: sử dụng oxy như một chất nhận điện tử nhưng không thamgia vào thành phần cơ chất Ví dụ: cytochrom oxidase, xanthin oxidase

- Các reductase: đưa H và điện tử vào cơ chất Ví dụ: β-cetoacyl-ACPreductase

- Catalase: xúc tác phản ứng: H2O2 + H2O2––––► O2 + 2H2O

- Các peroxidase: xúc tác phản ứng: H2O2 + AH2 –––► A + 2H2O

- Các oxygenase (hydroxylase): gắn một nguyên tử O vào cơ chất, ví dụ:Cytochrom P-450 xúc tác phản ứng:

RH + NADP + H+ + O2 –––► ROH + NADP+ + H20, phenylalanin

1.3.2 Enzym vận chuyển nhóm (transferase)

Là loại enzym xúc tác cho phản ứng vận chuyển một nhóm hóa học(không phải hydro) giữa hai cơ chất theo phản ứng tổng quát sau:

AX + B –––► A + BXLoại enzym vận chuyển nhóm gồm các dưới lớp:

- Các aminotransferase: chuyển nhóm —NH2 từ acid amin vào acidcetonic Ví dụ: aspartat transaminase, alanin transferase,

- Transcetolase và transaldolase: chuyển đơn vị 2C và 3C vào cơ chất Vídụ: transcetolase, transaldolase,

- Các acyl- metyl - , glucosyl-transferase, phosphrylase: chuyển các nhómtương ứng vào cơ chất Ví dụ: acyl CoA-cholesterol acyl transferase (ACAT),glycogen phosphorylase,

Các kinase: chuyển gốc -PO3- từ ATP vào cơ chất Ví dụ: hexokinase,nucleoside diphospho kinase, PEP carboxykinase,

- Các thiolase: chuyển nhóm CoA-SH vào cơ chất- Ví dụ: acyl-CoAacetytransferase (thiolase),

- Các polymerase: chuyển các nucleotid từ các nucleotid triphosphat(NTP) vào phân tử DNA hoặc RNA Ví dụ: các DNA polymerase, các RNApolymerase

1.3.3 Enzym thủy phân (hydrolase)

Là loại enzym xúc táe cho phản ứng cắt đứt liên kết của chất hóa họcbằng cách thủy phân, nghĩa là phản ứng có sự tham gia của phân tử nước, theophản ứng tổng quát sau:

AB + H2O –—► AH + BOH

Loại enzym thủy phân gồm các dưới lớp:

- Các esterase: thủy phân liên kết este Ví dụ: triacylglycerol lipase

- Các glycosidase: thủy phân liên kết glycosid.

- Các protease: thủy phân liên kết peptid trong phân tử protein

- Các phosphatase: thủy phân liên kết este phosphat, tách gốc PO3- khỏi cơchất

- Các phospholpase: thủy phân liên kết este phosphat trong phân tửphospholipid

- Các amidase: thủy phân liên kết N-osid Ví dụ: nucleosidase

- Các desaminase: thủy phân liên kết C-N, tách nhóm amin ra khỏi cơchất Ví dụ: adenosin desaminase, guanin desaminase,

- Các nuclease: thủy phân các liên kết este phosphat trong phân tử DNAhoặc RNA

1.3.4 Enzym phân cắt (lyase)

Enzym phân cắt còn gọi là enzym tách nhóm, là loại enzym xúc tác chophản ứng chuyển đi một nhóm hóa học khỏi một cơ chất mà không có sự thamgia của phân tử nước Phản ứng tổng quái như sau:

AB ——► A + B

Loại enzym tách nhóm gồm các dưới lớp;

- Các decarboxylase: tách phân tử CO2 từ cơ chất Ví dụ: pyruvatdecarboxylase, glutamat decarboxylase,

- Các aldolase: tách một phân tử aldehyd từ cơ chất Ví dụ: aldolase xúctác phản ứng tách fructose 1,6-diphosphat thành GAP và DHAP

- Lyase: tách đôi một phân tử mà không có sự tham gia của phân tử H2O.

hydroxyacyl-ACP dehydratase, β-hydroxyacyl- CoA dehydratase,

- Các synthase: gắn hai phân tử mà không cần sự tham gia của ATP đểcung cấp năng lượng Ví dụ: ATP synthase, citrat synthase, glycogen synthase,arid béo synthase, δ-levulenat synthase,

1.3.5 Enzym đồng phân (isomerase)

Là loại enzym xúc tác cho phản ứng biến đổi giữa các dạng đồng phâncủa chất hóa học Phản ứng tổng quát như sau:

ABC ––––► ACBLoại enzym đồng phân gồm các dưới lớp:

- Các racetnase: chuyển dạng đồng phân giữa dãy D và dãy 1

- Các epimerase: chuyển dạng đồng phân epi Ví dụ: ribose 5-phosphatepimerase

- Các isomerase: chuyển dạng giữa nhóm ceton và nhóm aldehyd Ví dụ:phosphopentose isomerase

- Các mutase: chuyển nhóm hóa học giữa các nguyên tử trong một phântử

1.3.6 Enzym tổng hợp (ligase hoặc synthetase)

Là loại enzym xúc tác cho phản ứng gắn hai phân tử với nhau thành mộtphân tử lớn hơn, sử dụng ATP hoặc các nucieosiđ triphosphat khác để cung cấpnăng lượng; phản ứng tổng quát như sau:

A + B ––––––––> ABLoại enzym tổng hợp gồm các dưới lớp:

Các synthetase: gắn hai phân tử với sự tham gia của ATP để cung cấpnăng lượng

Các carboxylase: gắn CO2 vào phân tử cơ chất Ví dụ: pyruvatcarboxylase,

Ligase: sử dụng cho việc gắn 2 đoạn nucleotid với nhau Ví dụ: DNAligase.

1.4 CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA ENZYM

1.4.1 Thành phần cấu tạo của enzym

Các enzym là các protein có khối lượng phân tử từ 12.000 đến hàng triệuđơn vị Dalton (Da) Cũng như các protein, về thành phần cấu tạo, enzym cũngđược chia làm hai loại: enzym thuần và enzym tạp,

Enzym thuần là các enzym mà phân tử chỉ do các gốc acid amin cấu tạonên (còn gọi là enzym một thành phần),

Enzym tạp (còn gọi là enzym hai thành phần, haloenzym), là các enzym

mà ngoài thành phần protein (được gọi là apoenzym), phân tử enzym còn cóchất cộng tác (cofactor, coenzym) là các ion như Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, hoặc

là một phân tử chất hữu cơ hoặc phức hợp hữu cơ kim loại, cấu tạo nên

1.4.2 Trung tâm hoạt động của enzym

Trung tâm hoạt động hoặc vị trí hoạt động (active site) của enzym là mộtvùng đặc biệt của enzym có tác dụng gắn với cơ chất để xúc tác cho phản ứnglàm biến đổi cơ chất thành sản phẩm Mỗi enzym có thể có một, hai hoặc vàitrung tâm hoạt động Trung tâm hoạt động của enzym gồm những nhóm hóa học

và những liên kết tiêp xúc trực tiếp với cơ chất hoặc không tiêp xúc trực tiếp với

cơ chất nhưng có chức năng trực tiếp trong quá trình xúc tác

Về thành phần cấu tạo, trung tâm hoại động thường bao gồm các acidamin có các nhóm hóa học có hoạt tính cao như serin (có nhóm -OH), cystein(có nhóm -SH), glutamic (có nhóm γ-COO), lysin (có nhóm ε-NH3+), histidin(có nhóm imidazol+), tryptophan (có nhóm indol+), là những nhóm phân cựchoặc ion hóa, có khả năng tạo liên kết hydro hoặc ion với cơ chất

Về quan hệ giữa trung tâm hoạt động và cơ chất, có hai giả thuyết đượcđưa ra:

Thuyết "ổ khóa và chìa khóa”: Fisher E (1890) đã đưa ra thuyết "ổ khóa

và chìa khóa" ("lock and key”) về tác động của enzym, theo thuyết này, tươngtác giữa enzym E và cơ chất S, nghĩa là sự gắn giữa enzym và cơ chất để tạothành phức hợp enzym - cơ chất ES cũng giống như quan hệ giữa "ổ khóa" và

"chìa khóa”, nghĩa là enzym nào thì chỉ xúc tác cho đúng cơ chất đó Thuyết nàychỉ giải thích được tính đặc hiệu tuyệt đối của enzym nhưng không giải thíchđược tính đặc hiệu tương đối của enzym

- Thuyết "mô hình cảm ứng không gian”: để giải thích tính đặc hiệu tươngđối của enzym, Koshland D (1958) đã đưa ra thuyết "mô hình cảm ứng khônggian” ("induced fit model") Theo thuyết này, trung tâm hoạt động của enzym E

có tính mềm dẻo và linh hoạt, có thế biến đổi về cấu hình không gian trong quátrình tương tác với cơ chất S sao cho phù hợp với cấu hình không gian của cơchất, để có thể tạo thành phức hợp enzym - cơ chất ES

Hình 1.1 Mô hình "ổ khóa" và "chìa khóa" (a) của Emil Fischer và mô hình

"cảm ứng không gian” của Daniel E Koshland (b)

1.4.3 Các dạng cấu trúc của phân tử enzym

1.4.3.1 Enzym đơn chuỗi và enzym đa chuỗi

Enzym có thể do một chuỗi, cũng có thể do nhiều chuỗi tạo nên

- Enzym đơn chuỗi (monomer) là enzym chỉ do một chuỗi polypepid cấưtạo nên, ví dụ: ribonuclease A, lysozym, lipase, pepsin, chymotrvpsin5

- Enzym đa chuỗi (oligomer hoặc polymer) là enzym do hai hoặc nhiềuchuỗi polypeptid cấu tạo nên, ví dụ:

2 chuỗi: aspartat transaminase (AST); alkalin phosphatase (ALP); creatinkinase (CK); hexokỉnase (HK);

4 chuỗi: lactat dehydrogenase (LDH);

5 chuỗi: RNA polymerase;

12 chuỗi: ATP synthetase;

40 chuỗi: glutamat dehydrogenase (GLDH)

1.4.3.2 Enzym dị lập thể (allosteric enzym)

Enzym dị lập thể là loại enzym ngoài trung tâm hoạt động còn một hoặcvài vị trí dị lập thể; trung tâm hoạt động tiếp nhận cơ chất để xúc tác cho phảnứng enzym trong khi vị trí dị lập thể tiếp nhận yếu tố dị lập thể để điều chỉnhhoạt động xúc tác của enzym Về cấu tạo phân tử, enzym dị lập thể có thể là loạienzym đơn chuỗi hoặc loại enzym đa chuỗi Phân tử enzym dị lập thể có thể cóloại vị trí dị lập thể dương, loại vị trí dị lập thể âm hoặc có cả hai.

1.4.3.3 Các dạng phân tử của enzym (isoenzym hoặc isozym)

Trong cùng một loài, cùng một cơ thể, có những enzym tuy cùng xúc tácmột loại phản ứng hóa học nhưng lại tồn tại dưới những dạng phân tử khácnhau, có những tính chất vật lý và hóa học khác nhau Các dạng phân tử khácnhau của một loại enzym được gọi là isoenzym hoặc isozym

1.4.3.4 Các tiền chất của enzym

Một số enzym sau khi được tổng hợp còn ở dạng chưa có hoạt tính (dạngkhông hoạt động) được gọi là các tiền enzym (proenzym hoặc zymogen) Cáctiền chất này khi được bài tiết vào môi trường khắc nghiệt của cơ thể sẽ chịu tácdụng thủy phân của môi trường, bị thủy phân cắt đi một đoạn polypeptiđ vốnche lấp trung tâm hoạt động để bảo vệ trung tâm hoạt động, làm cho enzymđược hoạt hóa, trở nên đạng enzym chính thức có hoạt tính

l.5 CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG CỦA COENZYM

Các coenzym có chức năng là tham gia cùng enzym trong quá trình xúctác Coenzym thường có ái lực với enzym cũng tương tự như ái lực của enzymvới cơ chất; vì vậy, coenzym có thể được coi như một cơ chất thứ hai Trong cáctrường hợp khác, các coenzym được gắn đồng hóa trị với enzym và có chứcnăng như hoặc gần như vị trí hoạt động trong quá trình xúc tác

Một số coenzym được tổng hợp từ các vitamin nhóm B Vitamin B6,pyridoxin cần biến đổi chút ít đã có thể chuyển thành pyridoxal phosphat là dạngCoenzym hoạt động Trong khi đó, niacin cần một sự biến đổi cơ bản bởi tế bàomới có khả năng tác động như một Coenzym

1.5.1 Các coenzym oxy hóa khử

1.5.1.1 Các coenzym Niacin (acid nicotinic: vitamin B3): NAD + và NADP +

Nacitin là acid pyridin 3-carboxylic, có thể được biến đổi thành 2coenzym chủ yếu tham gia vào loại enzym oxy hóa khử Hai coenzym này lànicotinamid adenin dinuclotid (NAD+) và nicotinamid adenin dinucleotidpbosphat (NADP+) Cấu trúc của coenzym NADP+ khác với Coenzym NAD+ ởchỗ có thêm một gốc phosphat ở vị trí 2’ của ribose trong phân tử adenosinmonophosphat

Cả hai coenzym này đều có chức năng là vận chuyển 2 điện tử và một H+giữa chất cho và chất nhận H trong phản ứng oxy hóa khử xúc tác bởi enzymdehydrogenase Tuy nhiên, có enzym dehydrogenase cần coenzym NAD+, cóenzym dehydrogenase cần Coenzym NADP+ trong quá trình xúc tác

Hình 1.2 Cấu tạo phân tử và cơ chế hoạt động của coenzym NAD+ và NADP+Ghi chú: trong cấu tạo của NAD+ thì R = -OH

trong cấu tạo của NADP+ thì R = -O-PO3H2

1.5.1.2 Các coenzym Flavin (vitamin B2): FMN và FAD

Có 2 dạng coenzym của riboflavin là flavin mononucleotid (FMN) vàflavin adenin dinucleotid Riboflavin chứa một dị vòng, isoalloxazin (flavin),nôi qua nguyên tử N-10 đến một alcol là ribitol FMN có một gốc phosphat ở vịtrí 5’ của ribitol trong phân tử riboflavin FAD có cấu trúc tương tự như NAD+,nhưng có adenosin liên kết qua pyrophosphat gắn với dị vòng riboflavin

Cả FMN và FAD đều có chức năng là tham gia vào phản ứng oxy hóakhử bằng cách trao đổi 2 điện tử và 2H+ ở vòng isoallosazin

FMN (FAD) FMNH (FADH) FMNH 2 (FADH 2 )

Hình 1.3 Cấu tạo phân tử và cơ chế hoạt động của coenzym FMN và FAD

1.5.1.3 Các porphyrin Fe 2+ (còn gọi là coenzym hem)

Coenzym hem là coenzym của hệ thống cytochrom, của enzyrn catalase,peroxidase, monooxygenase và dioxygenase

Vai trò của các coenzym hem là vận chuyển điện tử nhờ khả năng biếnđổi thuận nghịch giữa Fe2+ và Fe3+:

Fe2+ - e <––––––> Fe3+

Các phản ứng được xúc tác bởi các loại coenzym hem:

Hai điện tử được vận chuyển từ cytochrom b sang cytochroxn c trongchuỗi hô hấp tế bào như sau:

2 Cyt b Fe2+ + 2 Cyt c Fe3+ ◄––––––► 2 Cyt b Fe3+ + 2 Cyt c Fe2+

Phản ứng phân hủy H2O2 được xúc tác bởi catalase (có coenzym Hem):

Catalase 2H2O2 –––––––► 2H2O + O2Phản ứng phân hủy H2O2 được xúc tác bởi peroxidase (có coenzym Hem)

và đòi hỏi kèm theo một cơ chất dạng khử như sau:

Peroxidase 2H2O2 + AH2 –––––––––► 2H2O + A

Phản ứng oxygen hóa một cơ chất (thường là thuốc hoặc các chấtxenobiotic) được xúc tác bởi các enzym monooxygenase (thuộc hệ thốngcytochrom P-450) có coenzym là cytochrom P-450 là một loại coenzym hem vàđòi hỏi một coenzym dạng khử là NADPH + H+ như sau:

Monooxygenase (Cytochrom P-450)

RH + NADPH + H+ + O2 –––––––––––––––––► ROH + NADP+ + H2OCoA có vai trò trong chuyển hóa các acid béo, thể cetonic, acetat và cácacid amin Ví dụ: coenzym A kết hợp với acetat để tạo nên "acetat hoạt động" làacetyl CoA, chất này có thể kết hợp với acid oxaloacetat để tạo thành acid Phảnứng này nói chung có tác dụng biến một chất độc, ít tan trong nước thành mộtchất không độc hoặc ít độc hơn và tan trong nước nhiều hơn để có thể đào thảikhỏi cơ thể

Các enzym dioxygenase là loại enzym có coenzym hem, có tác dụng xúctác phản ứng peroxy hóa một cơ chất Phản ứng được thể hiện như sau:

1.5.2 Các coenzym vận chuyển nhóm

1.5.2.1 Thiamin pyrophosphat (TPP) vận chuyển nhỏm CO2

Trong thành phần của TPP có thiamin là vitamin B1 TPP là coenzym củacác enzyni có vai trò tách nhóm CO2 của các acid a-cetonic như acid pyruvichoặc acid a-cetoglutaric Sự thiếu hụt thiamin ảnh hưởng chủ yếu đến hệ thầnkinh ngoại biên, đường tiêu hóa và hệ thống tim mạch Thiamin có giá trị trongđiều trị các bệnh như Beriberi, viêm thần kính do rượu, viêm thần kinh do thainghén,

1.5.2.2 Coenzym A vận chuyển nhóm acyl

Coenzym A (viết tắt là CoA-SH) gồm acid pantotenic (vitamin B5) nối vớimột thioethanolamin tạo thành pantethein và nối với một gốc phosphat và vớimột nucleotid là adenosin monophosphat qua liên kết pyrophosphate Coenzymcitric, mở đầu cho chu trình acid citric, có thể tham gia vào quá trình sinh tổnghợp acid béo, sinh tổng hợp cholesterol và các hormon steroid,

1.5.2.6 Pyridoxalphosphat

Pyridoxal phosphat là dẫn xuất của pyridoxin (vitamin B6) Pyridoxalphosphat là coenzym của enzym trao đổi amin, có vai trò vận chuyển nhómamin của acid α-amin 1 cho một acid α-cetonic 2 để biến thành acid α-cetonic

1 còn acid α-cetonic 2 nhận nhóm amin để biến thành acid α-amin 2

Ngoài vai trò tham gia vào thành phần của các enzym trao đổi amin,pyridoxalphosphat còn có vai trò là coenzym của các enzym khử carboxyl của

một soos acid amin như tyrosin, arginin, acid glutamic và một số acid aminkhác Sản phẩm của sự khử carboxyl của aciđ amin là các amin có hoại tính sinhhọc Ví dụ: sự khử carboxyl của acid glutamic sẽ tạo thành γ-amino butyric acid(GABA) là một chất ức chế hoại động của thần kinh Sự khử carboxyl củahistidin sẽ tạo thành histamin là mộí hormon của mô, làm tăng tính thấm thànhmạch, gây hiện tượng dị ứng Sự hydroxy hóa cùng với sự khử carboxyl củaphenylalanin và tyrosin sẽ tạo thành norepinephrin và epinephrm là nhũnghormon quan trọng,

l.6 CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG XÚC TÁC CỦA COENZYM

l.6.1 Sự biến thiên năng Lượng tự do ΔG < 0)

Năng lượng tự do của một hệ thống phản ứng là năng lượng có thể tạo racông có ích Năng lượng tự đo được ký hiệu là G Một phản ứng hóa học chỉ cóthể xảy ra theo chiều năng lượng tự do giảm, biến chất có năng lượng tự do caothành chất có mức năng lượng thấp hơn Điều này có nghĩa là điều kiện cần củamột phản ứng hóa học là biến thiên năng lượng tự do phải âm (ΔG < 0);

A + B = C + D

Gl > G2 ––—► ΔG = G2 - G1 < 0Tuy nhiên, do vật chất có sức ỳ về mặt hóa học nên một phản ứng dù có

ΔG < 0, vẫn chưa thể tự xảy ra được,

Đối với cùng một lượng cơ chất, tốc độ phản ứng enzym tăng khi tăngnồng độ enzym và ngược lại

1.6.2 Nhiệt độ

Nhiệt độ tăng thường làm tăng tốc độ của một phản ứng hóa học Tuynhiên, sau khi đạt được tốc độ tối đa, tốc độ phản ứng giảm dần bởi vì bản chấtcủa enzym là protein nên khi nhiệt độ tăng cao sẽ dẫn đến biến tính protein, làmmất hoạt tính xúc tác của chúng Hầu hết các enzym có một ranh giới nhiệt độtối ưu giống như điều kiện nhiệt độ sinh lý của cơ thể

1.6.3 Sức ỳ về mặt hóa học của vật chất

Vật chất thường có sức ỳ về mặt hóa học, do các yếu tố sau gây nên:

- Yếu tố về entropy (sự chuyển động hỗn loạn của các phân tử vật chất)

- Lớp áo nước cản trở và có thể làm mất hoạt tính của cơ chất

- Hình thể không gian cồng kềnh của cơ chất

- Sự sắp xếp chưa định hướng của các nhóm chức năng trên phân tửenzym

Vì vậy, một số phản ứng hóa học mặc dù có điều kiện cần là khả năng xảy

ra theo hướng năng lượng thấp hơn (ΔG < 0), nhưng phản ứng vẫn không xảy rađược Muốn phản ứng xảy ra phải có thêm điều kiện đủ, nghĩa là phải cung cấpcho hệ thống phản ứng một năng lượng để thắng được sức ỳ về hóa học của vậtchất Năng lượng cần cung cấp ấy được gọi là năng lượng hoạt hóa

1.6.4 Năng lượng hoạt hóa (activation energy: Ea)

Năng lượng hoạt hóa là năng lượng cần thiết để nâng tất cả các phân tửcủa 1 mol cơ chất ở một nhiệt độ nhất định lên trạng thái chuyển tiếp (transitionState) ở đỉnh của hàng rào năng lượng, để phản ứng enzym có thể xảy ra Ởtrạng thái chuyển tiếp, mỗi phân tử cơ chất có thể sẵn sàng tham gia vào sự tạothành sản phẩm phản ứng

1.6.5 Cơ chế hoạt động của enzym

Cơ chế tác dụng của enzym là enzym làm giảm năng lượng hoạt hóa củaphản ứng để các cơ chất dễ dàng đạt được mức năng lượng để đưa phản ứng vàoreạng thái chuyển tiếp, từ đó phản ứng có thể xảy ra Tốc độ của phản ứng phụ

tiếp

Hình 1.4 Tiến trình phản ứng enzym và sự biến đổi năng lượng tự do

ΔG1: Năng lượng hoạt hoá của phản ứng không được xúc tác

ΔG2: Năng lượng hoạt hoá của phản ứng có enzym xúc tác

Vậy enzym lâm giảm năng lượng hoại hóa của phản ứng bằng cách nào?Thật sự, enzym làm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng bằng cách kết hợpvới cơ chất tạo thành phức hợp enzym-cơ chất (E-S) theo phản ứng qua 2 bước:

E + S ◄—––►ES ––––► E + P

(a) (b)

Ở đây, E là enzym, S là cơ chất (substrate), ES là phức hợp enzym-cơchất và P(product) là sản phẩm của phản ứng Như vậy, enzym có tác dụng biếnmột hóa học đơn thuần thành một phản ứng hóa học qua 2 bước gồm một phảnứng liên phân tử (a) và một phản ứng nội phân tử (b) nhờ tạo thành phức hợpenzym- cơ chất, cả hai phản ứng này đều đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp hơnrất nhiều so với phản ứng không có sự xúc tác của enzym

Sự tạo thành phức hợp ES đặc hiệu trong hoạt động xúc tác của enzym cónhững đặc điểm khác với hầu hết các chất xúc tác không phải là enzym Phứchợp trung gian tạo thành là nhờ những liên kết yếu (hydro, ion, lực Van derWails, kị nước, ) Những phản ứng tương tác xảy ra trong phức hợp ES đềukèm theo sự giải phóng một phần năng lượng tự do, đây là nguồn năng lượngchính để đưa cợ chất vào trạng thái chuyển tiếp tạm thời và do đó làm hạ thấpđược năng lượng hoạt hóa của phản ứng enzym

Sự biến đổi các mức năng lượng trong phản ứng xúc tác của enzym chothấy rằng: trước hết cơ chất phải được hoạt hóa chuyển vào trạng thái chuyểntiếp tạm thời, phản ứng tương tác với cơ chất, tạo nên phức hợp ES Sau đó phứchợp ES lại được hoạt hóa, đưa vào trạng thái chuyển tiếp tạm thời để biến, thànhphức hợp EP Ở bước tiếp theo, phức hợp EP chuyển vào trạng thái chuyển tiếptạm thời rồi tách ra thành sản phẩm P và giải phóng enzym Quá trình này được

Trong một số trường hợp thì ngược lại, các nhóm xúc tác của enzym lại

có thể nhân điện tử, mà chất cho điện tử là các nhóm ái nhân của cơ chất Những

nhóm xúc tác ái điện tử này có thể là ion kim loại và nhóm NH3.

+ Trong TTHĐ của một số enzym

- Nhiều enzym làm việc theo nguyên tắc xúc tác acid-base, nghĩa là hoạttính của một trong các chất phản ứng tăng lên khi nhận proton hay khi bị táchmất proton Các nhóm có tính acid hay tính base trong TTHĐ có hoạt tính xúctác này, ví dụ nhóm carboxyl, amin, phenol, thiol và đặc biệt là vòng imidazoLCác nhóm này hoạt động đồng thời như chất cho hay chất nhận proton

+ Trong điều kiện pH sinh lý

- Nhiều phản ứng enzym diễn ra nhờ các cofacior Khi gắn với enzym, cơchất tiếp xúc trực tiếp với cofactor, tạo điều kiện thuận lợi cho phản ứng xảy ra,Đồng thời các cofactor cũng thường xuyên cung cấp năng lượng cho các phảnứng enzym (đối với cofactor có mạch phosphate cao năng hay các nucleotid)

- Rất nhiều enzym làm tăng tốc độ phản ứng nhờ tạo sản phẩm trung gianrất hoạt động với cơ chất Sau đó phản ứng phân thành hai hay nhiều phần nhỏ,

và như vậy các năng lượng hoạt hóa cũng chia thành những phần nhỏ hơn

1.7 TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA ENZYM

1.7.1 Khái niệm

Do cấu trúc lý hóa đặc biệt của phân tử enzym và đặc biệt là của trungtâm hoạt động mà enzym có tính đặc hiệu rất cao so với những chất xúc tácthông thường khác Mỗi enzym chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hóa mộthay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định Đặc tính tác dụnglựa chọn cao này gọi là tính đặc hiệu hoặc tính chuyên biệt của enzym Tính đặchiệu là một trong những đặc tính cơ bản quan trọng nhất của enzym

1.7.2 Các hình thức đặc hiệu

1.7.2.1 Đặc hiệu kiểu phản ứng

Phần nhiều mỗi enzym đều có tính đặc hiệu với một loại phản ứng nhấtđịnh Những chất có khả năng xảy ra nhiều loại phản ứng hóa học thì mỗi loại

phản ứng ấy phải do một enzym đặc hiệu xúc tác Ví dụ, amino acid có khả năngxảy ra phản ứng khử carboxyl, phản ứng khử amin bằng cách oxy hóa và phảnứng vận chuyên nhóm amin, vì vậy mỗi phản ứng đó cần có một enzym đặc hiệutương ứng xúc tác theo thứ tự là decarboxylase, aminoacid oxydase vàaminotransferase.

1.7.2.2 Đặc hiệu cơ chất

- Đặc hiệu tuyệt đối

Một số enzym hầu như chỉ xúc tác cho phản ứng chuyển hóa một cơ chấtxác định và chỉ xức tác cho phản ứng ấy mà thôi

Ví dụ: Urease, arginase, glucose oxydase v.v Đối với các enzym này,ngoài các cơ chất đặc hiệu của chúng là ure, arginin, β - D - Glucose (theo thứ tựtương ứng) chúng cũng có thể phân giải một vài chất khác nhưng với tốc đô thấphơn nhiều Chẳng hạn như trường hợp glucose oxydase: enzym này có trong cácloại nấm mốc, có khả năng oxy hóa đặc hiệu β-D-glucose thành gluconic acid

Glucose oxydaseβ-D-glucose –––––––––––––► gluconic acidEnzym này có khả năng phân giải 10 cơ chất khác, với khả năng nhỏ hơn

Ví dụ: nếu coi tốc độ oxy hóa tương đối acid β-D-glucose là 100% thìα.D.glucose chỉ bằng 0,64 % (maltose 0,19%, D-galactose 0,14%)

Hình như trong trường hợp đặc hiệu tuyệt đối, cấu trúc trung tâm hoạtđộng của enzym tương ứng rất chặt chẽ với cấu trúc của cơ chất đến mức chỉmột sai khác nhỏ về cấu trúc của cơ chất cũng đủ làm cho enzym không xúc tácđược

Những enzym có tính đặc hiệu tuyệt đối thường được dùng để định lượngchính xác cơ chất của nó

- Đặc hiệu nhóm tuyệt đối: Các enzym này chỉ tác dụng lên những chất cócùng một kiểu cấu trúc phân tử, một kiểu liên kết và có những yêu cầu xác định

đối với nhóm nguyên tử ở phần liên kết chịu tác dụng Ví dụ: maltase thuộcnhóm α - glycosidase chỉ xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết glycosid đượctạo thành từ nhóm OH glycosid của α- glucose với nhóm OH của một monosekhác.

- Đặc hiệu nhóm tương đối: Mức độ đặc hiệu của các enzym thuộc nhómnày kém hơn nhóm trên Enzym có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hóahọc nhất định trong phân tử cơ chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo của cácphần tham gia tạo thành mối liên kết đó Ví dụ lipase có khả năng thủy phânđược tất cả các mối liên kết este Aminopeptidase có thể xúc tác thủy phân nhiềupeptid

- Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể): Hầu như tất cả các enzym đều cótính đặc hiệu không gian rất chặt chẽ, nghĩa là enzym chỉ tác dụng với một tronghai dạng đồng phân không gian của cơ chất

Enzym chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân quang học của cácchât Ví dụ phản ứng khử nước của malic acid để tạo thành fumaric acid dướitác dụng của fumarat hydratase chỉ xảy ra đối với L-malic acid mà không tácđụng lên D - malic acid

Enzym cũng thể hiện tính đặc hiệu lên một dạng đồng phân hình học cishoặc trans Ví dụ: enzym fumarat hydratase chỉ tác dụng lên dạng trans củaftimaric acid mà không tác dụng lên dạng cis để tạo thành L - malic acid

Trong tự nhiên cũng có các enzym xúc tác cho phản ứng chuyển hóatương hổ giữa các cặp đồng phân không gian tương ứng Ví dụ, lactat racemasecủa vi khuẩn xúc tác cho phản ứng chuyên hóa lẫn nhau giữa D và L- lactic acid,aldo - 1 - epimerase xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa α - D - glucose thành

β - D - Glucose, maleinat cis - trans isomerase của vi khuẩn xúc tác cho phảnứng đồng phân hóa giữa maleic acid (dạng cis) và fumaric acid (dạng trans)v.v Các enzym này có vai trò quan trọng khi sản xuất các chất dinh dưỡng bằng

phương pháp hóa học, vì chúng có thể chuyển các chất từ dạng cơ thể không thể

sử dụng được thành dạng có thể hấp thụ

Enzym còn có khả năng phân biệt được 2 gốc đối xứng trong phân tửgiống nhau hoàn toàn về mặt hóa học Ví dụ, hai nhóm - CH2OH trong phân tửglycerin, glycerophosphatkinase xúc tác cho phản ứng chuyển vị gốc phosphat

từ ATP đến C3 của glycerin (chứ không phải C1)

1.8 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ENZYM

1.8.1 Nguyên tắc chung khi nghiên cứu enzym

Xuất phát từ enzym là những chất xúc tác sinh học có bản chất protein vàrất không ổn định Trong những điều kiện bất lợi, chúng rất không bền, có thể dễdàng bị biến tính (denaturation) và bị mất hoạt độ Do đó, khi làm việc vớienzym, phải luôn luôn chú ý tránh những điều kiện dễ làm mất hoạt độ của nó

1.8.2 Hoạt độ enzym

1.8.2.1 Phương pháp xác định hoạt độ enzym

Để xác định hoạt độ của enzym ở các dịch chiết hoặc ở chế phẩm người tathường dùng các phương pháp vật lý hoặc hóa học Các phương pháp so màu,

đo khí, đo độ phân cực, đo độ nhớt, chuẩn độ được dùng phổ biến trongnghiên cứu định lượng các phản ứng enzym

Có thể chia ra ba nhóm phương pháp sau:

1 Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trongmột thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzym xác định

2 Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của

cơ chất hay sản phẩm với một nồng độ enzym nhất định

3 Chọn nồng độ enzym như thế nào để trong một thời gian nhất định thuđược sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm

1.8.2.2 Đơn vị hoạt độ enzym

Hội nghị quốc tế về hóa sinh enzym đã đưa ra khái niệm đơn vị enzym

quốc tế (hoặc đơn vị enzym tiêu chuẩn) vào năm 1961.

Đơn vị hoạt độ enzym (U) là lượng enzym có khả năng xúc tác làmchuyển hóa 1 micromole (1 μmoI) cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn

1U = 1 μmol cơ chất (10-6 mol)/ phút

Từ năm 1972 người ta lại đưa thêm khái niệm Katal (Kat)

- Katat (Kat) là lượng enzym có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 mol

cơ chất sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn : 1kat = 6.107U và IU =1/60 μkat

Đối với chế phẩm enzym, ngoài việc xác định mức độ hoạt động còn cầnphải đánh giá độ sạch của nó Đại lượng đặc trưng cho độ sạch của chế phẩmenzym là hoạt độ riêng

- Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzym là số đơn vị enzym/1mg protein(U/mg) cũng có thể lg chế phẩm hoặc 1ml dung dịch enzym Thông thường hàmlượng protein được xác định bằng phương pháp Lowry Khi đã biết khối lượngphân tử của enzym thì có thể tính hoạt độ phân tử

- Hoại độ phân tử là số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân tửenzym trong một đơn vị thời gian

Hoạt độ phân tử lớn (còn gọi là con số chuyển hóa hoặc con số vòng:turnover number) có nghĩa là phản ứng được xúc tác xảy ra rất nhanh Như vậy,hoạt độ phân tử chính là khả năng xúc tác: hoạt độ phân tử càng cao thi khảnăng xúc tác càng lớn Ví dụ người ta đã xác định được hoạt độ phân tử cao củamột số enzym tinh khiết như catalase (5,6 x 106) acetyl-cholinesterase (3,0 x

106), (β- amylase (1,2 x 106)

2 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT ĐỘNG ENZYM

Vì các enzym có trong huyết thanh với những lượng rất nhỏ nên trongthực tế lâm sàng người ta thường đo hoạt độ enzym chứ không đo nồng độenzym Các yếu tố sau có thể ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng enzym

- Nồng độ cơ chất [S] tăng, tốc độ phản ứng tăng (nếu các yếu tố khác:

nhiệt độ, pH, nồng độ enzym không đổi); nhưng khi nồng độ cơ chất tăng đếnmức nhất định thì tốc độ phản ứng đạt đến mức cực đại không tăng nữa.

- Nồng độ enzym [E] cũng ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng enzym Đốivới cùng môt lượng cơ chất, tốc độ phản ứng enzym tăng khi tăng nồng độenzym và ngược lại Tuy nhiên, giá trị KM không bị phụ thuộc vào nồng độenzym

- Nhiệt độ tăng thường làm tăng tốc độ của một phản ứng hóa học do làmtăng sự chuyển động của các phân tử, làm tăng số va chạm hiệu quả của cácphân tử enzym và cơ chất Đồng thời cũng cung cấp năng lượng cho phản ứng.Tuy nhiên, sau khi đạt được tốc độ tối đa, tốc độ phản ứng giảm dần bởi vìenzym khi nhiệt độ tăng cao sẽ dẫn đến biến tính, làm mất hoạt tính xúc tác Hầuhết các enzym có một ranh giới nhiệt độ tối ưu giống như điều kiện nhiệt độ sinh

- Chất ức chế là những chất khi kết hợp với enzym có tác dụng ức chếhoạt động của enzym, nghĩa là làm giảm hoặc làm mất hoạt tính của enzym nhấtđịnh

- Các yếu tố khác:

+ Ánh sáng: Có ảnh hưởng khác nhau đến từng loại enzym, các bướcsóng khác nhau có ảnh hưởng khác nhau, thường ánh sáng trắng có tác động

mạnh nhất, ánh sáng đỏ có tác động yếu nhất.

+ Ánh sáng vùng tử ngoại cũng có thể gây nên những bất lợi, enzym ởtrạng thái dung dịch bền hơn khi được kết tinh ở dạng tinh thể, nồng độ enzymtrong dung dịch càng thấp thì càng kém bền, tác động của tia tử ngoại sẽ tănglên khi nhiệt độ cao Ví dụ dưới tác động của tia tử ngoại ở nhiệt độ cao enzymamylase nhanh chóng mất hoạt tính

+ Sự chiếu xạ: Xạ chiếu với cường độ càng cao thì tác động phá huỷ càngmạnh Tác động sẽ mạnh hơn đối với dịch enzym có nồng độ thấp Có thể do tạothành những gốc tự do, từ đó tấn công vào phản ứng enzym

+ Sóng siêu âm: Tác động rất khác nhau đối với từng loai enzym, cóenzym bị mất hoạt tính, có enzym lại không chịu ảnh hưởng

Nhận xét chung: Độ bền phụ thuộc vào trang thái tồn tại của enzym, càngtinh khiết thì enzym càng kém bền, dịch càng loãng thì độ bền càng kém, tácđộng của một số ion kim loại trong dịch với nồng độ khoảng 10-3 như làm tăngtính bền

3 ĐIỀU HÒA HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYM TRONG TẾ BÀO

3.1 Sự phân bố enzym trong tế bào

Như đã trình bày ở phần tmớc, enzym có trong tất cả các cơ thể động vậtthực vật và vi sinh vật Tuy vậy, sự phân bố enzym không đồng đều giữa cácloài, các tế bào mô và cơ quan khác nhau Người ta thấy có những enzym tồn tạihầu hết ở mọi mô mọi tế bào: Như các enzym xúc tác cho quá trình đường phân,sinh tổng hợp protein, acid nucleic Một số enzym khác chỉ có trong một số cơquan riêng biệt, ví dụ như pepsin chỉ có trong dạ dày Đó là enzym đặc biệt, đặctrưng cho một mô Mặt khác, cùng một enzym có trong các mô khác nhau hoặcthậm chí ở các bộ phận khác nhau của cùng một loại tế bào cũng có thể khácnhau về lượng và có khi cả về chất,

Hàm lượng enzym trong một mô hoặc một cơ quan nhất định còn phụ

thuộc vào nhiều yếu tố khác như: Giai đoạn sinh trưởng và phát triển, trạng tháisinh lý của tế bào, các yếu tố bên ngoài

3.2 Điều hòa hoạt động của enzym trong tế bào

Như chúng ta đã biết, các bộ phận của tế bào hoạt động rất nhịp nhàng,bảo đảm hoạt động sống bình thường của tế bào Trong tế bào có hàng nghìnphản ứng khác nhau tạo nên toàn bộ quá trình chuyển hóa của một chất do nhiềuenzym xúc tác

Thực tế mỗi một quá trình xảy ra theo đúng nhu cầu của tế bào không quáthừa ngay cả trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ Những hiện tượng đó có thểđược giải thích bằng hai cơ chế: điều hòa hoạt tính của chính phân tử enzymtrong chuỗi phản ứng (bản thân enzym đó hoạt động bình thường hay giảm hoạtđộng do bị ức chế) và điều hòa sinh tổng hợp các enzym (số lượng các enzymđược sản xuất ra ít hay nhiều) Những quá trình này có liên quan mật thiết vớinhau và điều chỉnh lẫn nhau

3.2.1 Cơ chế điều hòa hoạt độ enzym

Trong tế bào có những tác nhân diều hòa hoạt độ của enzym và tạo ra khảnăng biến đổi thích ứng của các quá trình chuyển các enzym trong một chuỗiphản ứng không có sự đồng đều về trị số hoạt độ Những tác nhân hoặc yếu tốảnh hưởng của môi trường nội bào có thể chia thành ba loại chính Loại thứ nhất

là cấc yếu tố không đặc hiệu của môi trường phản ứng như pH, thế năng oxy hóakhử, lực ion, nhiệt độ Loại thứ hai là các hợp chất có tác dụng đặc hiệu vớitrung tâm hoạt động do sự phù hợp về cấu trúc không gian Đó là các chất thamgia phản ứng enzym như cơ chất, coenzym, các chất vận chuyển trung gian hoặc

là các chất hoạt hóa hay chất ức chế enzym Loại thứ ba là các hợp chất có tácdụng đặc hiệu nhưng không tham gia về mặt hóa học vào phản ứng do enzym đóxúc tác và thường không giống về mặt không gian với các chất tham gia phảnứng Đó là các chất có tác dụng dị lập thể

Điều hòa theo ca chế dị lập thể được thực hiện khi sản phẩm chuyển hóacuối cùng của một dãy phản ứng hóa học xúc tác bởi nhiều enzym có thể tácdụng hoạt hóa hay ức chế lên enzym xúc tác phản ứng đầu tiên là một enzym dịlập thể.

Người ta thường nói đến hiện tượng ức chế ngược (feed back inhibition)

Đó chính là một loại cơ chế điều hòa dị lập thể mà thông thường sản phẩm cuốicùng của quá trình phản ứng là chất điều hòa dị lập thể âm Do đó hiện tượng ứcchế ngược được gọi là ức chế dị lập thể Khi enzym cần có tác dụng hoạt hóacủa một chất điều hòa dương để chuyển thành dạng enzym hoạt động thì hiệntượng đó được gọi là sự hoạt hóa dị lập thể Ức chế dị lập thể là nguyên tắc rấtphổ biến đối với các quá trình chuyển hóa và có các đặc điểm sau đây:

- Cơ chế ức chế ngược xảy ra ở các chuỗi phản ứng dẫn đến sự tổng hợpmột chất nào đó (chất này được dùng để tổng hợp các đại phân tử: ví dụ cácamino acid isoleucin và histidin được dùng để tổng hợp protein, nucleotid đượcdùng để tổng hợp acid nucleic)

- Sản phẩm cuối cùng có tác dụng ức chế dị lập thể

- Sản phẩm cuối cùng thường chỉ tác dụng đặc hiệu và trực tiếp lên enzymđầu tiên là enzym dị lập thể

- Sản phẩm cuối cùng (chất ức chế ngược) có cấu trúc hóa học khác với

cơ chất của phản ứng mà nó ức chế, vì vậy tác dụng ức chế của nó không phải

do cạnh tranh với cơ chất đó, mà do nó làm thay đổi cấu dạng không gian củaenzym khiến enzym không tiếp nhận được cơ chất

Cơ chế ức chế ngược có thể được biểu thị theo sơ đồ sau:

Như vậy, mỗi khi sản phẩm cuối cùng Z được tổng hợp tăng lên vượt quánhu cầu của tế bào thì nó ức chế enzym đầu tiên E1 khiến cho phản ứng đầu tiên

A —> B giảm đi và do đó, mặc dù các enzym sau là E2, E3 không bị ức chế(vẫn có khả năng hoạt động bình thường), nhưng vì chúng không có các cơ chất

B, C để chuyển hóa, nên kết quả là toàn chuỗi phản ứng bị giảm sút, sự tổnghợp sản phẩm cuối cùng Z giảm đi Khi tế bào thiếu chất Z, enzym El không bị

ức chế nên phản ứng đầu tiên lại xảy ra và cả chuỗi phản ứng cũng vậy: kết quả

là sự tổng hợp các chất Z tăng lên đáp ứng nhu cầu của tế bào

Như vậy, việc tổng hợp nên sản phẩm cuối cùng được điều hòa một cáchhoàn toàn tự động dựa trên sự ức chế hoặc giải ức chế đối với enzym có sẵntrong tế bào Đó là cơ chế điều hòa nhanh vì nó tác động trực tiếp trên hoạt độcủa enzym Cơ chế điều hòa ức chế ngược rất có lợi đối với tế bào vì nó làmngừng sản xuất thừa các sản phẩm cuối cùng, do đó tiết kiệm được năng lượng

và các nguyên liệu dùng để tổng hợp nên sản phẩm đó

Trong việc điều hòa hoạt động enzym theo cơ chế thay đổi cân bằng giữahai dạng enzym hoạt động và không hoạt động, trước hết phải kể đến quá trìnhhoạt hóa zymogen

Phần lớn các enzym được tổng hợp trong cơ thể thành những phân tửenzym có hoạt tính, nhưng có những enzym như các protease của tụy tạng, dạdày cũng như các protease xúc tác cho quá trình đông máu thường được tổnghọp nên qua một dạng trung gian chưa có hoạt tính xúc tác gọi là zymogen hoặcproenzym Đó là những tiền chất để tạo thành enzym, chứ không phải là enzymthực sự Những chất này không có hoạt tính, phải trải qua một quá trình biếnđổi, sắp xếp lại cấu trúc phân tử mới trở thành enzym hoạt động được Quá trìnhchuyển hóa pro-enzym thành enzym gọi là quá trình hoại hóa, được thực hiệnnhờ sự tự xúc tác hoặc do các enzym khác xúc tác Quá trình hoạt hóa zymigen

có một số đặc điểm chung như sau:

- Là quá trình thủy phân giới hạn protein (limited proteolysis), cắt đứt một

số liên kết peptid ở gần đầu N của phân tử zymogen Đoạn peptid được tạothành có thể bị loại ra hoặc vẫn gắn với phần còn lại của phân tử nhờ các cầudisulfide,

- Khi liên kết peptid bị cắt đứt thường làm thay đổi cấu hình không giancủa phân tử theo hướng có lợi cho hoại động xúc tác, tạo thành phân tử enzym

- Hiệu suất hoạt hóa zymogen phụ thuộc vào điều kiện hoại hóa, nồng độzymogen, bản chất và nồng độ của enzym xúc tác cho quá trình hoạt hóa, nhiệt

độ, pH và một số yếu tố khác

Ở người và nhiều loài động vật có vú, các enzym thủy phân protein(protease) trong ống tiêu hóa đều được tổng hợp ra dưới dạng tiền chất củaenzym Ví dụ pepsinogen do những tế bào chính của tuyến dạ dày tổng hợp nên

và là tiền chất của pepsin, chymotrysinogen và trypsinogen của tuyến tụy theothứ tự là tiền chất của chymotrysin và trypsin Các chất này đều chỉ được hoạihóa thành dạng enzym hoạt động sau khi đã tiết vào lòng ống tiêu hóa.Pepsinogen được hoại hóa thành trypsin dưới tác dụng của chính trypsin hoặcenterokinase, còn chymotrypsinogen được hoạt hóa dưới tác dụng của trypsin vàchymotrysin

Hiện tượng tổng hợp ra các zymogen có một ý nghĩa sinh học quan trọng,

Có thể nói rằng, các protease trong ống tiêu hóa được tổng hợp qua giai đoạntrung gian như vậy chính là mt cơ chế tự bảo vệ của cơ thể Nếu không như vậythì chính các tuyến đã tổng hợp nên các loại enzym này sẽ có nguy cơ bị tiêuhủy bởi chính những enzym do chúng tổng hợp nên

Hoạt độ enzym cũng được điều hòa nhờ sự biển đổi lẫn nhau giữa cácdạng hoạt động và không hoạt động qua những thay đổi đồng hóa trị về cấu trúcphân tử của chúng

Ví dụ enzym glycogen phosphorylase ở mô cơ và gan được điều hòa hoạt

độ bằng cách gắn thêm (hoặc lấy đi) nhóm phosphat Enzym này xúc tác phảnứng bẻ gãy phân tử polysaccarid glycogen thành những glucose-1 -phosphat

Enzym này

hạng là phosphorylase a (dạng hoạt động) và phosphorylase b (dạng không hoạtđộng) Phosphorylase a là một protein olygomer với hai đơn vị cấu tạo, mỗi đơn

vị có một gốc serin được phosphoryl hóa ở nhóm hydroxyl Những nhómphosphat này là cần thiết cho hoạt động xúc tác của enzym và có thể chịu phảnứng thủy phân bởi enzym phosphorylase - phosphatase

Hình 1.5 Điều hòa phosphorylase nhờ quá trình phosphoryl hóa

Các nhóm phosphat bị loại bỏ đã làm cho phosphorylase a trở thànhphosphorylase b Các phân tử enzym này hoạt động rất kém hoặc không hoạtđộng trong quá trình cắt glycogen so với phosphorylase a Những phân tửphosphorylase b không hoạt động này có thể được tái hoạt hóa trở thànhphosphorylase a có hoạt tính cao, dưới tác dụng của phosphorylase-kinase Phảnứng enzym này xúc tác sự phosphoryl hóa các gốc serin của phosphorylase nhờcác phân tử ATP.

phosphorylase 2ATP + phosphor ylase b ––––––––––––––––> 2ADP + phosphorylase a

kinaseNhư vậy, quá trình điều hòa hoạt độ của glycogen phosphorylase đượcthực hiện bằng cách biến đổi đồng hóa trị

Cùng với kiểu điều hòa dị lập thể bởi các enzym dị lập thể, các enzymđiều hòa đồng hóa trị đáp ứng với những sự biến đổi về trạng thái chuyển hóacủa một tế bào hoặc mô trong những thời gian tương đối ngắn: những enzym dịlập thể, tính bằng giây, còn những enzym điều hòa đồng hóa trị thường tínhbằng phút

3.2.2 Cơ chế điều hòa hoạt động bằng sinh tổng hợp enzym

Đây là cơ chế chậm vì phải qua nhiều khâu trung gian (tác động lên hoạtđộng của gen và qua đó lên sự tổng hợp protein - enzym) Cơ chế này chậmsong rất kinh tế: tiết kiệm được nguyên liệu để tổng hợp protein - enzym Trong

cơ thể thường tồn tại hai loại enzym, loại thứ nhất là enzym thường trực hayenzym cơ cấu (constitutive enzym), là những enzym tham gia thành phần cơ bảncủa hoạt động tế bào, gồm tất cả các loại enzym xúc tác quá trình chuyển hóacủa tế bào và lúc nào cũng có trong tế bào, loại thứ hai là enzym cảm ứng(inductive - enzym) bình thường có lượng rất ít, không đáng kể, chúng sẽ đượctăng lên nhanh chóng khi đưa vào môi trường chất xác định