Phân tích công cụ Slide Chương 1

Độ đặc hiệu specificity đo khả năng của một phương pháp phân tích để phân biệt các chất phân tích từ tất cả mọi chất khác mà có thể có trong mẫu... Độ thu hồi spike recovery được định ng

Trần Thị Thúy

Bộ môn Hóa phân tích Viện Kỹ thuật hóa học, Trường ĐHBK Hà Nội

09-2016

Phần mở đầu: Đại cương về phương pháp phân tích công cụ

Phần 1 Các phương pháp phân tích quang học

1.1 Mở đầu

1.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

1.3 Phương pháp phổ phát xạ

1.4 Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử

Phần 2 Các phương pháp phân tích điện hóa

2.1 Phương pháp điện phân

2.2 Phương pháp đo điện thế

2.3 Phương pháp von-ampe

Phần 3 Các phương pháp tách

3.1 Phương pháp tách chiết

3.2 Phương pháp sắc ký khí

Thuật ngữ “phân tích” theo quan điểm thông tin là thu nhận các

thông tin từ đối tượng nghiên cứu về hai phương diện được

biểu diễn bằng hai đại lượng là hằng số vật chất đặc trưng cho

đối tượng nghiên cứu ví dụ như thế nửa sóng, thế điện cực,

bước sóng, thời gian lưu và các thông tin về thành phần định

lượng ví dụ như lượng điện tiêu thụ cho quá trình, cường độ

dòng, cường độ ánh sáng, thể tích lưu

Hình 0.1: Quá trình thu nhận thông tin trong phương pháp PTCC

• Các phương pháp quang học dựa trên việc đo sự tương tác giữa bức xạ điện từ với nguyên tử hay phân tử hay quá trình tạo ra

bức xạ của chất phân tích

• Các phương pháp phân tích điện hóa bao gồm các phương pháp

đo các tính chất điện như điện thế, dòng, điện trở và điện lượng

• Các phương pháp tách bao gồm chiết, sắc ký khí, sắc ký lỏng

hiệu năng cao, điện di mao quản.

• Thẩm định phương pháp là quá trình chứng minh một phương pháp phân tích được chấp nhận cho một mục đích phân tích đề

ra Các thông số trong thẩm định phương pháp bao gồm tính đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, miền tuyến tính, độ thu hồi, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

Độ đặc hiệu (specificity) đo khả năng của một phương pháp phân tích để phân biệt các chất phân tích từ tất cả mọi chất khác mà có thể có trong mẫu

Hình 0.2: Sắc đồ điện di của thuốc cefotaxim (pic số 4) và các tạp chất đã được biết đến

trong quá trình sản xuất thuốc (pic số 1-3 và 5-9)

Độ tuyến tính (linearity) đo mức độ đường hiệu chuẩn tuân theo hàm

bậc nhất như thế nào Nếu chúng biết khoảng nồng độ của chất phân

tích, chúng ta thường xây dựng đường hiệu chuẩn có 5 điểm chuẩn

khoảng nồng độ từ 0,5 đến 1,5 lần so với nồng độ chất cần phần tích

Mỗi dung dịch chuẩn cần được chuẩn bị và phân tích lặp ba lần Các

dung dịch trắng cũng được chuẩn bị để loại trừ ảnh hưởng của nền

mẫu

Người ta thường đánh giá mức độ tuyến tính thông qua giá trị bình

phương của hệ số tương quan R:

(0.1)

Hình 0.5 Đường hiệu chuẩn xác định Ho bằng phương pháp ICP-MS

Độ thu hồi (spike recovery) được định nghĩa:

(0-2)

Trong đó: R là độ thu hồi (tính bằng %); C mẫu không thêm : là nồng độ của

dung dịch trước khi thêm chuẩn; C mẫu được thêm : là nồng độ của dung dịch

sau khi thêm một một lượng chuẩn biết trước; C thêm : là nồng độ chất

chuẩn đã thêm;

Ví dụ: Một mẫu nước uống được xác định có nồng độ nitrat là 10,0

µg/l Người ta thêm 5,0 µg/l nitrat vào mẫu trên rồi lặp lại quá trình

phân tích Kết quả phân tích cho 14,6 µg nitrat /l Hãy tính phần trăm

thu hồi.

Nếu độ thu hồi chấp nhận trong phạm vi từ 96 – 104% thì 92% là kết

quả không được chấp nhận, thì phương pháp phân tích trên cần phải

nghiên cứu tiếp để kết quả được cải thiện.

Độ chính xác (accuracy) là mức độ gần nhau của giá trị phân tích

(thường là giá trị trung bình ) với giá trị thực hay giá trị đã được chấp

nhận µ Khi không có sai số hệ thống thì giá trị trung bình tiến tới giá

trị thực nếu số phép đo rất lớn (n ) Vì vậy, có thể nói độ chính xác

tuỳ thuộc vào số phép đo.

Các cách để chứng minh độ chính xác bao gồm:

+ Phân tích mẫu chuẩn đã được chứng nhận trong cùng một nền mẫu

tương tự như dung dịch phân tích

+ So sánh kết quả phân tích với hai hay nhiều hơn các phương pháp

phân tích khác nhau Chúng phải có độ đồng nhất với một độ tụ nhất

định

+ Phân tích mẫu trắng với việc thêm một lượng chất phân tích đã biết

Nền mẫu của nó phải giống nền mẫu của dung dịch phân tích Khi

phân tích thành phần chính, 3 mẫu phân tích ở mức nồng độ khác

nhau nằm trong khoảng từ 0,5 đến 1,5 lần so với nồng độ dự kiến

được đo với số lần lặp 3 lần với mỗi mức nồng độ

+ Nếu không thể chuẩn bị mẫu trắng, chúng ta có thể sử dụng phương

pháp thêm chuẩn để phân tích chất cần xác định

Thêm chuẩn (spiking) là phương pháp phổ biến nhất để đánh giá chính

xác bởi vì các mẫu chuẩn đã được chứng nhận thường không có sẵn

và một phương pháp phân tích thứ hai có thể không thực hiện được ở

điều kiện phòng thí nghiệm

Độ chụm (precision) hay còn gọi là độ tụ là sự lặp lại của kết quả đo

Độ chụm của thiết bị, là khả năng tái quan sát khi phân tích định lượng

một mẫu với độ lặp lại (≥10 lần) trên cùng một thiết bị.

Ba khái niệm thống kê được dùng để mô tả độ chụm của một tập số

liệu là độ lệch chuẩn (SD), phương sai và hệ số biến thiên Tất cả các

khái niệm này có liên quan đến độ lệch của số liệu phân tích khỏi giá

trị trung bình: d i =

Độ chụm được xác định qua hệ số biến thiên Hệ số biến thiên

(coefficient of variation – CV) càng nhỏ độ chụm càng cao và được

định nghĩa là tỉ số giữa độ lệch chuẩn và giá trị trung bình.

Trong đó SD là độ lệch chuẩn; là giá trị trung bình của các kết quả

thực nghiệm;

Thường người ta sử dụng hệ số biến thiên dưới dạng phần trăm

(được gọi là độ lệch chuẩn tương đối RSD)

Khoảng tuyến tính (range) là khoảng nồng độ ở đó độ tuyến tính, độ

chính xác và độ chụm được chấp nhận

Một ví dụ cho các thông số kỹ thuật của khoảng tuyến tính khi phân

tích một cấu tử trong hỗn hợp trong khoảng nồng độ tuyến tính là hệ

số tương quan R 2 ≥0,095 (đo mức độ tuyến tính), độ thu hồi là 100±2%

(đo độ chính xác) và độ chụm là ±3%

Hình 0-6 Xác định khoảng tuyến tính khi phân tích Th bằng phương

pháp ICP-MS

Cách xác định giới hạn phát hiện:

+ Sau khi ước lượng giới hạn phát hiện từ các thí nghiệm trước đó,

chuẩn bị 1 mẫu với nồng độ lớn hơn từ 1 đến 5 lần so với giới hạn phát

hiện.

+ Đo tín hiệu với số lần lặp là n (n≥7)

+ Tính độ lệch chuẩn SD cho số lần lặp thí nghiệm là n

+ Đo các tín hiệu với n mẫu trắng tương ứng (không chứa chất phân

tích) và xác định giá trị trung bình y mẫu trắng

Cách xác định giới hạn phát hiện:

+ Giới hạn phát hiện, y dl được định nghĩa như sau:

Giới hạn phát hiện: y dl = y mẫu trắng + 3SD (0.5)

+ Tín hiệu đúng, y mẫu phân tích – y mẫu trắng , tỉ lệ với nồng độ của mẫu

Đường chuẩn hóa: y mẫu phân tích – y mẫu trắng = m × C (0.6)

+ Giới hạn phát hiện (nồng độ thấp nhất có thể đo được):

Trong đó m là độ dốc của đường chuẩn hóa

Giới hạn định lượng (Limit of quantitation – LOQ) là số lượng nhỏ nhất

của chất phân tích có thể đo cho kết quả phân tích được chấp nhận hay

chính là tín hiệu đo gấp 10 lần tín hiệu nhiễu

Ví dụ: Tín hiệu từ bảy mẫu lặp với nồng độ khoảng ba lần giới hạn phát

hiện là 5,0; 5,0; 5,2; 4,2; 4,6; 6,0; và 4,9 nA Mẫu trắng cho kết quả là: 1,4;

2,2; 1,7; 0,9; 0,4; 1,5; và 0,7 nA Độ dốc của đường hiệu chuẩn với nồng

độ cao hơn là 0,229 nA/μM

Tìm giới hạn phát hiện tín hiệu và nồng độ tối thiểu có thể phát hiện

được

Nếu tín hiệu của mẫu là 7,0 nA, hãy xác định nồng độ chất phân tích

trong mẫu.

(a) Trước tiên chúng ta sẽ tính giá trị trung bình cho các mẫu trắng và

độ lệch chuẩn cho mẫu phân tích.

Mẫu trắng: = 1,2 nA

Mẫu phân tích: Độ lệch chuẩn SD = 0,5 nA

y dl = y mẫu trắng + 3SD ↔ y dl = 1,2 nA + 3×0,5 nA = 2,9 nA

Giới hạn phát hiện LOD = = = 7µM

Giới hạn định lượng LOQ = = = 22µM

(b) Ta có: y mẫu phân tích – y mẫu trắng = m × C

→ C = = 25 µM

Độ ổn định (robustness) là khả năng của một phương pháp phân tích

không bị ảnh hưởng bởi những thay đổi nhỏ, cố ý về thông số vận

hành Ví dụ, phương pháp sắc ký là ổn định nếu nó cho kết quả chấp

nhận được khi thành phần dung môi, pH, nồng độ đệm, nhiệt độ, khối

lượng tiêm mẫu, và bước sóng detector được thay đổi nhỏ Trong khảo

nghiệm về độ ổn định, hàm lượng dung môi trong pha động có thể biến

thiên ±2%, pH dung dịch rửa giải có thể thay đổi ±0,1, và nhiệt độ của

cột có thể biến thiên ±5 °C

Hàm toán phổ biến xây dựng đường chuẩn trên thiết bị AES sử dụng đuốc ICP nguyên tử hóa là:

Trong đó x (g.l –1 ): nồng độ nguyên tố kim loại nặng;

Y (cps): tín hiệu a: là hệ số góc đặc trưng cho độ nhạy.

Các dung dịch chuẩn của

các đối tượng cần

nghiên cứu được chuẩn

bị sao cho nồng độ của

các dung dịch chuẩn chia

đều trên dải tuyến tính

của từng nguyên tố với

phương pháp ICP Các

dung dịch chuẩn có thể

được trải qua quá trình

xử lý giống như mẫu

phân tích hoặc không

(hình 0.8)

0

2 00000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000 1600000

f(x) = 2 2833.09x - 401.72 R² = 1

C, mg/L

Hình 0.8 Đường chuẩn xác định Zn bằng

phương pháp ICP-OES

Trong phương pháp

ICP-MS, tín hiệu các nguyên

tố cần phân tích (theo

cps) trong dãy dung dịch

chuẩn được ghi lại và lập

đường chuẩn tương ứng

với hàm chuẩn được

chọn Đối với mẫu cần

phân tích, thiết bị ICP-MS

sẽ ghi lại tín hiệu của các

Phương trình của phương pháp thêm chuẩn:

(0.11) Trong đó là nồng độ của dung dịch cần xác định; V o là thể tích dung

dịch chất phân tích, V S là thể tích dung dịch chất chuẩn với nồng độ , và

thể tích tổng V = V o + V S Do vậy các nồng độ trong phương trình 0-11 là:

; ; (0.12)

Ví dụ, huyết thanh chứa Na + cho tín hiệu trên thiết bị phân tích là 4,27

mV Nếu thêm 5,00 mL dung dịch NaCl 2,08M vào 95 mL huyết thanh

Mẫu sau khi thêm cho tín hiệu 7,98 mV Hãy xác định nồng độ ban đầu

của Na + trong huyết thanh.

Giải

Ta có:

Từ phương trình ta tính được nồng độ ban đầu của Na + là:

Hình 0.10 TN của PP thêm chuẩn với tổng thể tích không đổi

Sau khi thêm chất

chuẩn, tín hiệu phân

tích phải tăng lên với

Hình 0.11 Đồ thị của phương pháp thêm chuẩn

Ở phương pháp thứ hai, nếu chất phân tích không bị mất đi trong dung

dịch, chúng ta không phải chuẩn bị riêng cho từng phép đo Trong

trường hợp này, chúng ta thực hiện phép đo thứ nhất với chất phân

tích được tín hiệu của chất phân tích

Tiếp theo, chúng ta thêm một thể tích rất nhỏ dung dịch chuẩn (có

nồng độ tương đối lớn), đo tín hiệu phân tích

Thường số điểm thêm chuẩn lớn hơn hoặc bằng hai để đảm bảo độ tin

cậy và độ chính xác của phép đo Nồng độ của chất chuẩn phải đủ lớn,

để khi thêm một thể tích nhỏ dung dịch chuẩn, nền mẫu không bị thay

đổi.

Khi thực hiện phương pháp nội chuẩn, chúng ta chuẩn

bị một hỗn hợp gồm chất nội chuẩn đã biết nồng độ và chất phân tích và đo sự phản hồi của detector cho tỉ

số tín hiệu giữa chất nội chuẩn và chất phân tích.

(0.14)

Hay

Ví dụ: Trong một thí nghiệm sơ bộ, một dung dịch

chứa 0,0837 M chất X và 0,0666 M chất S cho diện

tích pic: AX = 423 và AS = 347 (hình 0.12) Để phân tích

một dung dịch chưa biết nồng độ, 10,0 mL 0,146 M

chất S đã được thêm vào 10,0 ml dung dịch cần phân

tích và hỗn hợp này được pha loãng thành 25,0 ml

trong bình định mức Tín hiệu phân tích trên sắc ký

đồ cho AX = 553 và AS = 582 Tìm nồng độ của của

chất X trong dung dịch cần phân tích.

Hình 0.12 Sắc ký đồ của một chất cần phân tích X và chất nội chuẩn S

Giải:

Ta có:

→ F = 0,970

Trong hỗn hợp của chất phân tích và chất nội chuẩn, nồng độ

của chất nội chuẩn do sự pha loãng sẽ là:

Ozon được tạo ra

nhân gây cháy da

và ung thư da.

Hình 1.2 Lượng O 3 trung bình trong khí quyển tại Halley ở Nam Cực trong tháng Mười

Một lời giải thích bắt đầu với chlorofluorocarbons (CCl 2 F 2 ), Freon-12, trước đây được sử dụng trong tủ lạnh và điều hòa không khí Các hợp chất này tồn tại lâu dài, nó không có sẵn trong tự nhiên, lan tỏa tới tầng bình lưu, nơi họ xúc tác phân hủy ozone

CCl 2 F 2 + hν → CClF 2 + Cl (a) (Sự tạo thành Cl bằng quang hóa)

phản ứng với hydrocacbon hoặc NO 2 tạo ra HCl hoặc ClONO 2

Để bảo vệ cuộc sống từ bức xạ tia cực tím, các điều ước quốc tế hiện nay cấm hoặc loại bỏ chlorofluorocarbons, và có một nỗ lực để tìm sản phẩm thay thế an toàn.

Hình 1.3 Quá trình xảy ra với phân tử khi hấp thụ ánh sáng ở các vùng

khác nhau

Theo mô hình sóng, bức xạ điện từ là những dao động có hai thành phần điện trường và từ trường làm truyền theo một phương Các thành phần điện trường và từ trường vuông góc với nhau và được biểu diễn bằng các sóng phân cực phẳng

Hình 1.4: Thành phần điện trường và từ trường

Tần số ν là số dao động mà bức xạ điện từ thực hiện trong một giây.

Bước sóng λ là quãng đường giữa hai điểm cân bằng bất kỳ mà bức xạ

điện từ đi qua (khoảng cách giữa hai cực đại hay cực tiểu)

Vận tốc truyền bức xạ điện từ vi (m/s) là tích số giữa tần số ν và

bước sóng λ (tính bằng m): vi = ν λ (1-1)

Vận tốc của bức xạ điện từ phụ thuộc vào thành phần của môi

trường mà bức xạ điện từ đi qua Chỉ số dưới diễn tả môi

trường mà nó truyền qua.

Môi trường chân không:

vận tốc của bức xạ điện từ (c) trở nên không phụ thuộc vào bước sóng và nó đạt cực đại

C = 2,99792×108 m/s

Vận tốc của bức xạ điện từ trong không khí chỉ khác rất ít (khoảng 0,03% nhỏ hơn) vận tốc ánh sáng trong chân không Trong các trường hợp này phương trình (1-1) có thể viết dưới dạng:

c = ν λ = 3,00×108 m/s = 3,00×1010 cm/s (1-2)

Trong các môi trường khác, vận tốc của bức xạ điện từ bị chậm lại

do sự tương tác giữa trường điện từ của bức xạ và các electron xung quanh các nguyên tử hay phân tử có mặt trong môi trường

Do tần số của bức xạ là bất biến và cố định bởi nguồn, bước sóng

sẽ phải giảm khi bức xạ từ môi trường chân không sang môi trường khác

thủy tính và truyền trở lại không khí

Số sóng, được định nghĩa là nghịch đảo của bước

sóng (tính bằng đơn vị cm) là một cách khác để mô

tả bức xạ điện từ Đơn vị của số sóng là cm– 1

Số sóng được sử dụng rộng rãi trong phổ hồng ngoại Số sóng là một đơn vị thuận tiện, vì ngược với bước sóng, nó tỉ lệ thuận với tần số (do vậy tỉ lệ với năng lượng) của bức xạ Như vậy, ta có thể viết:7

= kν (1-3)

ở đây, k là hệ số tỉ lệ, phụ thuộc vào môi trường và

về giá trị là nghịch đảo của vận tốc.

Ví dụ: Tính số sóng của tia bức xạ hồng ngoại với bước sóng là 5,00 μm.

= = 2000 cm–1

Năng lượng của photon phụ thuộc vào tần số của

bức xạ và được đưa ra dưới dạng:

Ví dụ: Tính năng lượng photon (J) của bức xạ điện từ

nếu biết = 2000 cm–1

Áp dụng phương trình (1-5):

3,98.10–20 (J)

Hình 1.6 Mỗi một màu sắc tương ứng với một

bước sóng ánh sáng khác nhau

Bảng 1 Màu sắc của ánh sáng vùng trông thấy

Màu sắc nào bạn trông đợi khi bạn có một dung dịch chứa ion phức có độ hấp thụ cực đại ở vùng trông thấy ở λmax =

562 nm

A xanh B tím C Vàng D Xanh tím

Hình 1.7 Các sóng của phổ bức xạ điện từ thay đổi độ dài trong một phạm vi vô cùng rộng, từ bước sóng dài như kích thước của tòa nhà là sóng radio, đến vô cùng ngắn như hạt nhân của một nguyên tử là tia γ

1 Nêu tính chất sóng và tính chất hạt của phổ bức xạ điện từ.

2 Tại sao người ta hay sử dụng số sóng trong phổ hồng ngoại?

3 Bước sóng của phổ trông thấy dao động trong miền nào?

4 Tính năng lượng (kJ) của 1 mol photon của ánh sáng đỏ với λ=650nm?

ĐS 184 kJ/mol

5 Tính năng lượng (kJ) của 1 mol photon của ánh sáng tím với λ=400nm?

ĐS 299 kJ/mol

6 Hãy tính tần số (Hz), số sóng (cm -1 ) và năng lượng (J/photon, và J/mol

photon) của ánh sáng trong vùng trông thấy có λ=562nm

ĐS 5,33×10 14 Hz, 1,78×10 4 cm -1 , 3,53×10 -19 J/photon, 213kJ/mol