Định lượng vitamin b12 bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp

Phơng pháp này đợc sử dụng để định lợng Vitamin B12 trong các chếphẩm có hàm lợng Vitamin B12 rất nhỏ : từ hàng ng đến hàng g/ viên, ml.. Vitamin B12 cao nhng đòi hỏi kỹ thuật chiết tác

Cuối cùng em xin gửi tới gia đình, bạn bè lòng biết ơn về tất cả những gì đã làm cho em.

Em xin chân thành cảm ơn!

Vinh, tháng 5/2006

Sinh viên:

Lê Minh Đức

Mở đầu:

Vitamin là một nhóm chất hữu cơ có phân tử lợng tơng đối lớn và cóbản chất lý, hoá học khác nhau Nhóm chất hữu cơ này đặc biệt cần thiết chohoạt động sống bình thờng của các cơ thể sinh vật dị dỡng Tuy nhiên, tácdụng sinh lý của các Vitamin lên các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vậtrất khác nhau So với nhu cầu về các chất dinh dỡng cơ bản nh Protein, Lipit,Gluxit thì nhu cầu về Vitamin rất thấp Trong cơ thể, Vitamin đảm nhiệm vaitrò nh những chất xúc tác

Vitamin là những chất mà cơ thể con ngời không thể tổng hợp đợc.Phần lớn phải đa từ ngoài vào trong bằng con đờng ăn, uống Vitamin có tácdụng lợng nhỏ, đóng vai trò rất quan trọng trong đời sống của con ngời, lànhững chất xúc tác không thể thiếu đợc trong chuyển hoá các chất Nhu cầuVitamin hàng ngày của cơ thể rất ít, nhng nếu thiếu sẽ gây ra những rối loạntrầm trọng, sinh bệnh và nếu kéo dài có thể chết

Trong những năm gần đây ngời ta đã chứng minh rằng Vitamin còn cầnthiết cho cả các cơ thể tự dỡng nh thực vật là những đối tợng có khả năng tổnghợp nên hầu hết các Vitamin Thật vậy một số bộ phận của thực vật xanhkhông có khả năng tổng hợp Vitamin, vì thế cần cung cấp thêm cho chúngmột số Vitamin để đảm bảo cho sự sinh trởng và phát triển của chúng

Cho đến nay ngời ta đã tách ra đợc khoảng 30 loại chất thuộc nhómVitamin, đa số đã đợc xác định đầy đủ cả cấu trúc hoá học cũng nh tính chất

lý hoá học và sinh lý học Về cách gọi tên, các Vitamin hiện nay ngời ta vẫnduy trì gọi theo 3 kiểu khác nhau, kiểu thứ nhất dựa theo tác dụng sinh lý củaVitamin: thêm chữ anti (chống) vào một bệnh đặc trng của hiện tợng thiếuVitamin, kiểu thứ 2: là dùng chữ cái để đặt tên, còn kiểu thứ 3 dựa trên cầutrúc hoá học, hiện này có xu hớng gọi bằng tên hoá học nhiều hơn

Nguyên nhân thiếu Vitamin thờng do thành phần thức ăn không đầy đủhoặc cơ thể mắc bệnh, không chuyển hoá đợc qua thức ăn Khi đó phải bù đắpVitamin cho cơ thể bằng các con đờng dẫn thuốc thích hợp nh: uống, tiêm,truyền Cơ thể con ngời thờng thiếu nhiều Vitamin một lúc, nên điều trị cầnphối hợp nhiều Vitamin Trừ A, D, E dùng liều cao và dài ngày có thể gâybệnh còn các Vitamin nếu thừa, cơ thể sẽ tự đào thải qua mồ hôi, nớc tiểu Vềcảnh giác thuốc, vẫn cần lu ý dùng đúng liều chỉ định và đờng dùng cho mồiVitamin, nhiều khi có tác dụng không mong muốn (nh Vitamin PP, C, B1)

Chính vì việc dùng Vitamin là rất cẩn trọng nên chúng ta phải hết sức

chú ý khi dùng thuốc ở luận văn này chúng tôi chỉ định lợng Vitamin B12trong viên thuốc tổng hợp Vitamin 3B (B1, B6, B12) để xác định rõ xem hàmlợng của Vitamin B12 trong thuốc có phù hợp với nhãn không ở luận văn nàychúng tôi xin chọn phơng pháp Sắc kí lỏng cao áp Sắc kí lỏng cao áp là mộtphơng pháp hiện đại cho ta biết kết quả nhanh và chính xác, có thể tiết kiệm

đợc thời gian và lợng mẫu cần dùng

Với khuôn khổ luận văn và thời gian ngắn nên ở đề tài này chúng tôichỉ định lợng đợc Vitamin B12 trong viên Vitamin 3B

Nhiệm vụ của đề tài:

Nghiên cứu các điều kiện Sắc kí khi Vitamin B12 tồn tại trong hỗn hợp

áp dụng các điều kiện đã chọn để định lợng trong viên nén Vitamin 3B

Phần I Tổng quan tài liệu

- ở động vật, các vi khuẩn của ruột có khả năng tổng hợp Vitamin B12

và cung cấp nó cho động vật chủ, vì vậy các sản phẩm động vật thờng giàuVitamin B12 Gan, thịt, cá, trứng, sữa là các sản phẩm giàu Vitamin B12

- Năm 1948 thu đợc Vitamin B12 ở dạng kết tinh từ dịch gan

Cấu trúc hoá học của Cyanocobalamin và Hyđroxocobalamin

Hydroxo CyanocobalaminH.axetat  R lµ CH3COOH

H OH

H H

H H

O

OH

H

o R

H cloric  R là HCL

- Vitamin B12 tồn tại ở dạng bột kết tinh hoặc tinh thể màu đỏ đậm

- Hoà tan trong nớc và trong etanol 96%, không hoà tan trong axeton vàete

Bảng độ hấp thụ quang của các dạng.

Dạng Cực đại hấp thụ (nm) Độ hấp thụ riêng (E 1cm1%)

Hyđroxocobalamin axetat 274; 351; 525 ở 351nm: 187Hyđroxocobalamin sunfat 274; 351; 525 ở 351nm: 188Hyđroxocobalamin clorit 274; 351; 525 ở 351nm: 190

- Vitamin B12 chuyển vào cơ thể gắn với một hợp chất glucoprotit củadạ dày để tạo nên một phức hợp dễ hấp thụ cho cơ thể

- Vai trò của Vitamin B12 đợc nghiên cứu rất nhiều, song vẫn cònnhững chi tiết cha rõ

+ Nhiều dẫn liệu đã chứng minh rằng nó tham gia vào quá trình tổnghợp protein ở cơ thể

+ Vitamin B12 là thành phần của các coenzim, xúc tác cho các quátrình tổng hợp protein ở trên

+ Vitamin B12 cũng tham gia vào sự trao đổi các hợp chất chứa mộtcacbon và thờng phối hợp, tác dụng với axit folic trong các phản ứng metylhoá; Ví dụ trong quá trình tổng hợp metionin từ homo xistin

S (CH2)2

HCHO

- Các phản ứng chuyển hoá Metyl hoá khác trong đó có sự tham gia củaVitamin B12 là phản ứng tổng hợp N-Metyl Nico Tiamit hoặc tổng hợpCreatin,

- Vitamin B12 còn liên quan tới sự chuyển hoá của các hợp chấtSunfidryl, nó tham gia vào sự khử các hợp chất Đisunfit thành các hợp chấtSunfidryl do đó nó duy trì hoạt tính của các Enzim chứa nhóm SH và ảnh h-ởng tới sự trao đổi Protein, Gluxit cũng nh Lipit

- Khi bảo quản các sản phẩm giàu Vitamin B12 nh: sữa, gan, trứng, ngời ta nhận thấy, hàm lợng Vitamin B12 trong sản phẩm có thể thay đổi ítnhiều tuỳ theo điều kiện xử lý trớc khi bảo quản và trong khi bảo quản Nhữngdẫn chứng cho ta biết:

+ Khi tiệt trùng sữa bằng phơng pháp làm nóng trực tiếp (hoặc sục hơinớc vào sữa) hoặc gián tiếp (hấp trong các thiết bị vô trùng) sự hao hụtVitamin B12 thay đổi từ 40 - 20% Khi quấy sữa cô đặc không thêm đờng ởnhiệt độ thấp, sau 4 năm sẽ mất đi khoảng 35% lợng Vitamin B12

+ Trứng cũng là sản phẩm rất quan trọng về phơng diện Vitamin nóichung và Vitamin B12 nói riêng Trong 7 tháng đầu khi bảo quản trứng,Vitamin B12 khá bền, trứng sau thời gian đó hàm lợng Vitamin B12 sẽ giảm

đi rõ rệt và mất đi tới 32% Sau 1 năm ở lòng trắng trứng chỉ có ít VitaminB12 Do trọng lợng phân tử của Vitamin B12 lớn nên không có sự di chuyển

S (CH2)2

CHNH2

COOH

C O

(Vitamin B12)

S (CH2)2

CHNH2

COOH

CH3

từ lòng đỏ sang lòng trắng trong quá trình bảo quản.

- Trong kỹ nghệ, ngời ta lợi dụng khả năng sinh tổng hợp Vitamin B12bởi hàng loạt vi sinh vật, đặc biệt các loại xạ khuẩn, nấm mốc loạiStreptomyces, các vi khuẩn lên men Propinic để sản xuất Vitamin B12

* Trong quá trình ủ thức ăn cho gia súc, các vi sinh vật phát triển ở thức

ăn cũng tổng hợp đợc một lợng đáng kể Vitamin B12 Thêm muối Cacbon vào

đó nuôi cấy của chúng hoặc thức ăn ủ kích thích sự tổng hợp Vitamin B12

- Vitamin B12 có ý nghĩa quan trọng đối với chăn nuôi gia súc Nó làmtăng sự hấp thụ thức ăn Protein thực vật, tăng trởng và tích luỹ mỡ VitaminB12 cũng làm tăng sinh sản đẻ trứng và nở trứng ở gà mái Ngoài ra còn cónhững dẫn liệu chứng minh rằng tác dụng của Vitamin B12 sẽ tăng lên nhiềunếu phối hợp thêm vào thức ăn của gia súc một ít chất khoáng sinh Biomixin

I.3 Công dụng

- ở ngời, thiếu Vitamin B12 sẽ gây rối loạn sản xuất máu ở trong xơng,dẫn đến thiếu máu nguyên bào khổng lồ (Biermen) do hồng cầu không trởngthành đợc

- Theo những nghiên cứu mới đây cho thấy:

+ ở những phụ nữ mang thai có hàm lợng Vitamin B12 trong máu thấp,thai nhi rất dễ tật nứt đốt sống - hiện tợng này gây liệt chân và chậm phát triểntrí não ở trẻ

+ Uống bổ sung Vitamin B12 là một trong các phơng pháp hữu hiệu đểngăn ngừa hội chứng Alzheimer (suy giảm trí nhớ) ở ngời cao tuổi

+ Nghiên cứu của Israel cho thấy phụ nữ thiếu Vitamin B12 có nguy cơ

bị vô sinh hay sẩy thai liên tiếp Đa số họ đã có thai và sinh con bình thờngsau khi điều trị bằng Vitamin B12

- Vitamin B12 thờng đợc dùng chữa chứng thiếu máu nguyên bàokhổng lồ, rối loạn về thần kinh, viêm đa dây thần kinh (thờng đợc dùng phốihợp với Vitamin B1, Vitamin B6) nhất là ở ngời nghiện rợu hoặc đái tháo đ-ờng, cũng đợc dùng cho bệnh nhân suy nhợc

- Vitamin B12 có tác dụng tốt với nhiều quá trình, nó tham gia gia vàophản ứng tổng hợp Thymidylate, một thành phần trong phân tử AND, cungcấp nguyên liệu để tổng hợp AND, góp phần vào quá trình phân chia và trởngthành của tế bào trong cơ thể

II Các phơng pháp định lợng Vitamin B12.

II.1 Vitamin B12 trong thuốc đơn thành phần.

Hoà tan 25,00 mg chế phẩm trong nớc và pha loãng đến 1000,0 ml bằngdung môi Đo độ hấp thụ tử ngoại ở bớc sóng cực đại 361 nm đối với CyanoCobalamin và 351 nm đối với Hiđroxo Cobalamin, tính kết quả dựa vào độhấp thụ riêng (E1% /1cm ).

Phơng pháp này chính xác, áp dụng cho các chế phẩm, tá dợc tan trongnớc không hấp thụ tử ngoại

II.2 Vitamin B12 trong thuốc đa thành phần.

II.2.1 Phơng pháp vi sinh vật.

Phơng pháp này dựa vào nguyên tắc: Vitamin B12 làm phát triển nhanhchóng chủng vi sinh vật Lactobacililus bichmanic trong môi trờng và điềukiện nuôi cấy thích hợp đã quy định, tiến hành song song với một dãy mẫuchuẩn: 0.01ng đến 0.04 ng Vitamin B12

Để tính kết quả ngời ta đo độ đục của mẫu thử và mẫu chuẩn so vớimẫu trắng là chủng vi sinh vật đợc nuôi cấy trong cùng môi trờng nuôi cấykhông có Vitamin B12

Phơng pháp này đợc sử dụng để định lợng Vitamin B12 trong các chếphẩm có hàm lợng Vitamin B12 rất nhỏ : từ hàng ng đến hàng g/ viên, ml

Tuy nhiên chủng vi sinh vật Lactobacililus bichmanic rất hiếm và khónuôi cấy Nên không phải phòng thí nghiệm nào cũng có đợc để thực hiện ph-

ơng pháp này cho nên phơng pháp này rất hạn chế

II.2.2 Phơng pháp quang phổ khả kiến.

Phơng pháp quang phổ khả kiến có thể dùng để tính hay định lợngVitamin B12 trong các chế phẩm dợc

Phơng pháp này dựa trên nguyên tắc đo quang phổ ở bớc sóng khả kiến(548  2 nm) song song với chuẩn

Dung dịch thử đợc chiết trong môi trờng Etanol 95 % và làm sạch đểloại bớt Vitamin B1 và Vitamin B6 Không làm lạnh hoặc chiết trong môi tr-ờng đệm Axetat

Phơng pháp này không có tính chọn lọc do không loại trừ đợc chất màu,nhất là phẩm màu hồng thờng có trong chế phẩm và vấn còn nhiều VitaminB1, B6 trong mẫu thử Do đó phơng pháp này chỉ áp dụng đợc với các chếphẩm có hàm lợng Cyano cobanlamin lớn (trên 500 g/viên.ml) và tá dợckhông có chất màu

II.2.3 Phơng pháp đo quang phổ tử ngoại.

- Phơng pháp này dựa trên nguyên tắc đo quang phổ ở cực đại vùng tửngoại 361  1nm, song song với chuẩn.

Dung dịch thử đợc chiết nhiều lần trong hỗn hợp Phenol + Butanol hoặcchỉ với Butanol trong môi trờng Axit Boric

- Phơng pháp này có khả năng áp dụng hạn chế vì kiểm nghiệm viênphải tiếp xúc lâu với dung môi độc và Vitamin B1, B6 vẫn còn ảnh hởng lớn

Chỉ nên áp dụng với các chế phẩm có hàm lợng Cyano cobanlamin cao(từ 1000 g/viên,ml)

kí lớp mỏng đợc thực hiện theo phơng pháp rửa giải Có thể tóm tắt nguyêntắc tiến hành nh sau:

+ Rải một lớp chất hấp thụ trên một tấm kính (hoặc tấm kim loại) rồichấm một giọt dung dịch các chất phân tích lên gần một đầu mép lớp mỏng(điểm xuất phát) Sau đó, nhúng kính đã có lớp mỏng (bản mỏng) chất hấp thụvào dung môi đến mức dới điểm xuất phát

+ Do tác dụng của lực mao quản, đun thấm theo lớp mỏng giao điểmxuất phát Kết quả là mỗi chất trong hỗn hợp đợc phân chia theo 1 vùng riêng

Sơ đồ tách bằng sắc kí lớp mỏng

II.2.4.2 Phơng pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao.

Đợc dùng để tách các Vitamin hoà tan trong nớc

+ Với Đelecter uv/vis

+ Cột tách: Lichrosorla 18 (5 - 10 m, 250 x 4 mm)

+ Pha tĩnh (chất nhồi) Silicagel

+ Dung môi: Meltanol + nớc (35: 65)

II.2.5 Kết luận chọn phơng pháp phân tích Vitamin B12.

Thông qua tổng quan về các phơng pháp xác định Vitamin B12 trongviên nén Vitamin3B, chúng ta thấy nó khá phong phú Mỗi phơng pháp cómột u nhợc điểm riêng và khả năng áp dụng khác nhau

- Phơng pháp vi sinh vật có độ chọn lọc và độ nhạy cao nên áp dụng chocác mẫu Vitamin 3B có hàm lợng Vitamin B12 rất nhỏ mà các phơng phápkhác không định lợng đợc

- Phơng pháp đo quang tử ngoại khả kiến có thể áp dụng khi phòngkiểm nghiệm không có máy HPLC, với các mẫu Vitamin3B có hàm lợng

Điểm xuất phát Dung môi

Vitamin B12 cao nhng đòi hỏi kỹ thuật chiết tách cao để tránh ảnh hởng củaVitamin B1, B6 và tá dợc chất màu.

- Phơng pháp HPLC với các chơng trình sắc kí lỏng pha đảo khác nhauchiếm tỷ lệ lớn trên 80% trong số các tiêu chuẩn cơ sở của thuốc 3B đang luhành hiện nay Phơng pháp HPLC có độ chính xác và tin cậy cao, tiến hành

đơn giản, khả năng áp dụng rộng rãi trên nhiều loại chế phẩm

Với ý nghĩa này, đề tài này đợc thực hiện bằng phơng pháp sắc kí lỏnghiệu suất cao Chúng tôi hy vọng rằng các kết quả thu đợc đáp ứng yêu cầucủa phép phân tích và có độ tin cậy cao

III Một số vấn đề khi áp dụng phơng pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao để xác định Vitamin B12 trong viên nén Vitamin 3B.

III.1 Cơ sở lý thuyết của phơng pháp HPLC.

III.1.1 Khái niệm:

Sắc kí lỏng hiệu năng cao là một phơng pháp chia tách trong đó pha

động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất mang rắn đã đợc phânchia dới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, haymột chất mang đợc biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ Quátrình sắc kí lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi Ion hay phân loạitheo kích cỡ

III.1.2 Nguyên tắc của quá trình sắc kí trong cột.

- Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trìnhsắc kí và loại sắc ký

+ Nếu pha tĩnh là chât hấp phụ thì ta có sắc kí hấp phụ pha thuận hoặcpha đảo

+ Nếu pha tĩnh là chât trao đổi Ion thì ta có sắc kí trao đổi Ion

+ Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc kí phân bố hay sắc kí chiết.+ Nếu pha tĩnh là gen thì ta có sắc kí gen hay sắc kí Rây phân tử

- Cùng với pha tĩnh, để rữa giải chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần

có một pha động

Nh vậy nếu ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C, vào cột tách, kết quả là các chất A, B, C, sẽ đợc tách ra khỏi nhau sau khi điqua cột Quyết định hiệu quả của sự tách sắc kí ở đây là tổng của các tơng tác

III.1.3 Các đặc trng của Pic sắc kí.

Đờng cong rữa giải (tín hiệu phụ thuộc thời gian) Sau một quá trình sắc

kí tách đợc gọi là sắc đồ, nó thờng có các dạng sau:

Trong đó:

t0: Thời gian chết là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thốngtách

tR: Thời gian lu: thời gian cần thiết kể từ khi chất đợc bơm vào cột cho

đến khi đạt đợc nồng độ cực đại của nó, xuất hiện ở thời điểm cuối của hệthống tách

t’ R: thời gian lu thực bằng thời gian lu tR - thời gian chết t0

III.1.3.1 Thời gian lu tR

Thời gian lu của một chất là thời gian tính từ lúc bỏ mẫu vào cột đếnkhi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại

Thời gian lu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thờigian lu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn Vì vậy thời gian

lu là đại lợng đặc trng để phát hiện định tính các chất

Thời gian lu phụ thuộc vào các yếu tố:

+ Bản chất sắc kí của pha tĩnh

+ Bản chất thành phần, tôc độ của pha động

+ Cấu tạo và bản chất phân tích của chât tan

+ Trong một số trờng hợp còn phụ thuộc và PH của pha động

tR = to (dd) (1 + K’)

- Trong một phép phân tích nếu tR nhỏ quá thì sự tách kém, còn tR lớnquá (tR> 20phút) thì Pic bị loãng và độ lặp lại kém, thời gian phân tích dài Đểthay đổi thời gian lu ta tìm cách thay đổi một hoặc nhiều yếu tố trong các yếu

tố phụ thuộc trên đây

III.1.3.2 Hệ số dung lợng K’

Hệ số dung lợng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đótrong 2 pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ lệ số giữa lợng chất tan trongpha tĩnh và lợng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng

Hệ số dung lợng K’ phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích, đặc tínhcủa pha tĩnh và pha động, K’ thờng đợc tính theo công thức:

III.1.3.3 Độ chọn lọc 

Độ chọn lọc  cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc kí, khi hai chất

A, B có K’ A và K ’ B khác nhau thì mới có khả năng tách , mức đọ tách biểu thị

ở độ chon lọc 

' '

RB o A

Số đĩa lý thuyết là đại lợng biểu thị hiệu năng của cột trong một điềukiện sắc kí nhất định Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc kí nh là một lớp pha tĩnh

có chiều cao là H, tất nhiên lớp này có tính chất động, tức là một khu vực của

hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động đợc thiết lập giữa nồng độtrung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động

Vì vậy với một điều kiện sắc kí xác định thì chiều cao H cùng hằng

định đối với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng xác định:

Số đĩa lý thuyết N đợc tính theo công thức:

Độ phân giải phụ thuộc vào các hằng số K2 (hệ số dung lợng của cấu tử

ra sau), độ chọn lọc  và số đĩa lý thuyết N của cột

2 2

1

K N

+ Làm thay đổi K’ bằng cách thay đổi lực rữa giải của pha động (thay

đổi độ phân cực nếu là RP-HPLC, thay đổi cờng độ nếu là IE-HPLC, )

+ Làm tăng số đĩa lý thuyết của cột bằng cách dùng cột dài hơn hoặccột có kích thớc hạt nhỏ hơn,

+ Làm tăng độ chọn lọc  bằng cách dùng cột khác phù hợp hơn vớiquá trình tách, hoặc thay đổi thành phần pha động

Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu, tốn nhiều pha động, dộnhạy sẽ kém, lúc này phải tìm cách làm giảm R bằng cách: ứng dụng quá trìnhrữa giải Gradient để cho chất thứ 2 ra nhanh hơn, nếu thiết bị không có khảnăng này thì phải thay đổi thành phần hoặc tỷ lệ pha động

III.1.3.6 Hệ số không đối xứng T.

Hệ số đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của Pic trên sắc độthu đợc T đợc tính bằng tỷ số độ rộng của 2 nữa Pic tại điểm 1/10 hoặc 1/20chiều cao của Pic

T = b/a

Pic dạng đối xứng hình Gaus trên thực tế khó đạt đợc, vì vậy phải quantâm đến hệ số không đối xứng T, khi T  2,5 thì phép định lợng đợc chấpnhận, nếu T > 2,5 thì điểm cuối của Pic rất khó xác định, vì vậy cần thay đổicác điều kiện sắc kí để làm cho Pic cân xứng hơn theo các cách sau:

+ Làm giảm thể tích chết, tức là đoạn nối từ cột đến Đetecter

+ Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rữa giải tăng lên.+ Giảm bớt lợng mẫu đa vào cột bằng cách pha loãng mẫu phân tíchhoặc giảm thể tích thân

III.2 Đánh giá Pic (diện tích, chiều cao) và các phơng pháp định ợng thờng dùng trong HPLC.

l-III.2.1 Đánh giá diện tích Pic.

Diện tích Pic của một chất là tơng ứng với lợng chất đó Để tính diệntích Pic, hiện nay ngời ta thờng dùng tích phân kế Phơng pháp này có thểdùng cho các Pic không bị trôi đờng nền và cả Pic có đờng nền bị trôi Phơngpháp này đo chỉ cần điểm đầu và cuối của Pic đợc nhận ra chính xác và nó chokết quả tốt đối với nồng độ trung bình và cao

Việc xác định diện tích Pic phải đợc sử dụng trong các trờng hợp yếu tốdung lợng không thay đổi vì ảnh hởng của các chất khác

Việc tính toán diện tích Pic sẽ không gặp khó khăn khi Pic có cờng độquá cao hoặc quá loãng, không đối xứng và Đetecter bị nhiễu

III.2.2 Xác định chiều cao Pic.

- Khi Pic có dạng không đổi thì chiều cao Pic (khoảng cách giữa đờngnền và đỉnh Pic) là một đại lợng tỷ lệ với diện tích và nó cũng có thể đợc dùng

để đánh giá sắc phổ.

- Chiều cao Pic đợc xác định dễ dàng bằng tay vì thế nó là phơng pháp

đợc chọn nếu sắc đồ đợc vẽ trên một máy ghi

- Một điều kiện để áp dụng việc đánh giá bằng chiều cao Pic là các chỉ

số K’ hằng định

- Để đo độ tuyến tính, việc đo chiều cao Pic chỉ thích hợp khi nồng độmẫu từ thấp đến trung bình Khoảng tuyến tính sẽ rộng hơn đối với các cấu tử

đợc rữa giải chậm hơn so với trờng hợp các cấu tử này đợc rữa giải nhanh

- Với các Pic có đờng nền bị nhiễu, việc xác định chiều cao Pic sẽ dễdàng hơn xác định diện tích Pic

III.2.4 Phơng pháp chuẩn ngoại.

- So sánh trực tiếp độ lớn của các tín hiệu (diện tích Pic hoặc chiều caoPic) trong mẫu thử cho biết với một dung dich chuẩn của chất đó là một phơngpháp phổ biến trong sắc kí

- Phơng pháp này yêu cầu bơm các thể tích xác định trong điều kiện sắc

kí Các chất đợc bơm vào dới dạng dung dich chuẩn có khoảng nồng độ nhtrong mẫu thử

- Phơng pháp này có thể tiến hành ở các nồng độ khác nhau ( chuẩn hoámột điểm, 2 điểm, nhiều điểm) Trong phơng pháp chuẩn 1 điểm nồng độ củamẫu có thể đợc tính nh sau:

S : độ lớn của Pic mẫu chuẩn.

- Với phơng pháp xác định 2 điểm hay nhiều điểm, phân tích chuẩnphải đợc xác định đầu tiên Thờng đợc mô tả bằng đờng chuẩn thu đợc từ các

điểm đo, cùng với Phơng pháp phân tích hồi quy

m: độ dốc của đờng chuẩn

Trong thí nghiệm này, nồng độ của mẫu thử đợc tính theo công thứcsau:

a

S S C

m





Độ lớn của Pic mẫu thử S a nên nằm giữa độ lớn của Pic chuẩn thấp nhất

và cao nhất bởi vì đờng chuẩn đợc xác định trong vùng nồng độ đã nghiên cứunày

III.2.4 Phơng pháp chuẩn nội.

- Để giảm sai số và đạt độ lặp lại cao trong định lợng bằng HPLC, ngời

ta sử dụng Phơng pháp chuẩn hoá với chất thứ hai thêm vào chất chuẩm ngoại

và mẫu thử Chất này gọi là chuẩn nội

- Trong cùng điều kiện sắc kí nó có thời gian lu gần thời gian lu củachất cần phân tích trong mẫu thử Nó đợc tách hoàn toàn, và có nồng độ gầnbằng nồng độ của chất cần phân tích và có cấu trúc hoá học tơng ứng

- Độ nhạy của chất chuẩn nội và chất cần phân tích là khác nhau, vì thểyếu tố hiệu chỉnh Fx phải đợc xác định đầu tiên với dung dịch chuẩn tinhkhiết

Nếu gọi: Cx là nồng độ của dung dich chuẩn

Cis là nồng độ của dung dich chất chuẩn nội

Sx là độ lớn Pic chuẩn (chuẩn ngoại)

Sis là độ lớn Pic chuẩn nội

Thì:

.

is

is x x

x

S C F

- Phơng pháp thêm chuẩn đợc sử dụng trong HPLC chủ yếu khi có vấn

đề ảnh hởng của chất phụ

- Dung dịch mẫu thử đợc thêm vào một lợng xác định chất chuẩn.

- Các Pic thu đợc của cả 2 dung dich mẫu thử và mẫu thử thêm chấtchuẩn phải đợc đo trong cùng một điều kiện sắc kí

- Phơng pháp thêm chất chuẩn có thể đợc thực hiện 1 lần, 2 lần, nhiềulần:

+ Trong trờng hợp đơn giản nhất đối với một lần chất thêm chuẩn ,

nồng độ cho biết của mẫu Ca đợc tính bằng sự chênh lệch nồng độ c

(lợngchất chuẩn thêm vào) và độ tăng của độ lớn Pic s

- Nhợc điểm: đòi hỏi nhiều thời gian phân tích vì phải chuẩn hoá đối vớitừng mẫu mà không chuẩn hoá định kỳ nh khi dùng Phơng pháp chuẩn ngoại

III.2.6 Phơng pháp quy về 100% diện tích Pic.

- Kỹ thuật này đơn giản nhng trong HPLC thì việc ứng dụng bị hạn chế,thờng hay đợc dùng trong sắc kí khí Nó đòi hỏi cấu tử trong hỗn hợp chất cầnphân tích đều đợc rửa giải và đợc phát hiện

.100

A X

A A A



 

%X: giá trị % của cấu tử X trong hỗn hợp X, Y, Z

AX, AY, AZ: diện tích Pic của cấu tử X, Y, Z

- Trong HPLC, các công thức này chỉ đúng khi sự đáp ứng của Detectortrên các cấu tử X, Y, Z là nh nhau Nếu không nh nhau, mỗi cấu tử cần có hệ

VÝ dô:

( ) ( )

c x x x

X c

A W f f

Phần II Thực nghiệm

I Dụng cụ - hoá chất

I.1 Dụng cụ:

I.1.1 Máy sắc kí:

- Máy sắc kí lỏng cao áp (HPLC của hãng Shimadzu Nhật Bản)

+ Detecter: uv/vis+ Cột tách: Lichrosorb RP 18 (5-10m, 150 x 4 mm)+ Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút

+ Bớc sóng phát hiện: 550 nm+ Thể tích tiêm: 20l

+ Cột nhồi Silicagel+ Pha tĩnh: SilicagelSơ đồ:

Thiết bị có thể hiện một khối hay nhiều khối riêng biệt lắp ráp vàonhau

Các bộ phận của thiết bị gồm:

+ (1), (4) Bộ phận kiểm tra bơm và chơng trình hoá

+ (2) Bình chứa dung môi

+ (3) Bơm cao áp

+ (4) Bộ phận bão hoà dung môi

+ (6) áp kế