THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ GEN

Bố trí thí nghiệm Tuần-1: Lý thuyết - Chuẩn bị dụng cụ và môi trường thí nghiệm Tuần-2: Tách chiết plasmid vector - Điện di kiểm tra plasmid thu được Tuần -3: Phản ứng PCR gene đích

1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ GEN

3-2021 Lưu hành nội bộ

2

GIỚI THIỆU

1 Mục đích

Giúp sinh viên thực hiện hoàn thiện một quy trình tái tổ hợp và chuyển gen ở vi sinh vật, qua

đó hiểu rõ hơn các bài giảng lý thuyết về sinh học phân tử và công nghệ gen cũng như bước đầu tiến hành các kỹ thuật thao tác trên gen

2 Yêu cầu

- Hiểu được nguyên lý chung của quy trình tái tổ hợp và chuyển gen ở vi sinh vật;

- Hiểu rõ nguyên lý các bước thí nghiệm;

- Thao tác thành thạo, cẩn thận;

- Đi học đầy đủ, đúng giờ;

- Thực hiện đúng nội quy phòng thí nghiệm;

- Ghi lại đầy đủ các bước thí nghiệm thực tế, kết quả của nhóm để viết bài thu hoạch

3 Bố trí thí nghiệm

Tuần-1: Lý thuyết

- Chuẩn bị dụng cụ và môi trường thí nghiệm

Tuần-2: Tách chiết plasmid vector

- Điện di kiểm tra plasmid thu được

Tuần -3: Phản ứng PCR gene đích

- Điện di sản phẩm PCR

- Tinh sạch sản phẩm PCR

- Điện di kiểm tra sản phẩm PCR sau tinh sạch

Tuần -4, 5: Tái tổ hợp gene vào vector

- Cắt sản phẩm PCR và plasmid với RE

- Điện di kiểm tra các sản phẩm cắt

- Tinh sạch sản phẩm PCR và plasmid vector sau cắt RE

- Phản ứng nối gen vào vector

Tuần – 6, 7: Biến nạp và sàng lọc

- Chuẩn bị tế bào khả biến

- Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli

- Chuẩn bị môi trường sàng lọc

- Cấy sàng lọc

Tuần -8: Đánh giá các dòng E.coli biến nạp bằng PCR khuẩn lạc

- Gửi sản phẩm PCR cho giải trình tự DNA

- Tin sinh học

- Nộp báo cáo thực hành

- Q & A; Vệ sinh

Tuần -9: Kiểm tra môn học/Vấn đáp

3

4 Sơ đồ chung

Hình-1: Sơ đồ toàn bộ thí nghiệm tạo dòng gen g56 của thực khuẩn thể IP008 vào pUC57, trong đó 10 kỹ thuật cơ bản

4

Tuần 1: LÝ THUYẾT

1 Lý thuyết: bài giảng Powerpoint

2 Chuẩn bị dụng cụ và môi trường thí nghiệm

- Các loại đầu tip và ống Eppendorf, ống phản ứng PCR;

- Nước loại ion;

- Môi trường Luria Broth (LB) có thành phần như sau:

Thành phần Khối lượng (cho 1 lít)

Tất cả dụng cụ và môi trường hấp tiệt trùng ở 121 o C, 15 phút

TUẦN 2: TÁCH CHIẾT PLASMID VECTOR

1 Các nội dung thí nghiệm chính:

- Tách chiết plasmid vector pUC57

- Điện di kiểm tra độ lớn của plasmid thu được

2 Chuẩn bị

- Nuôi cấy vi khuẩn DHα (5 ml) mang plasmid pUC57 trong môi trường LB lỏng (1% v/v

giống) có chứa 5μl kháng sinh ampicillin (100mg/μl), lắc 150 rpm, ủ ở 370C, qua đêm

(12-16 giờ)

- 1 lít dung dịch đệm TAE 10X: 48.5 g Tris-base + 11.4 mL glacial acetic acid + 20

mL 0.5M EDTA (pH 8.0)

- Dung dịch nạp mẫu 6X (loading buffer)

- Agarose

- Thang DNA chuẩn (DNA ladder): mua từ nhà cung cấp NEB (0.1 kb-2 kb)

Kít tách chiết plasmid: GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo)

3 Tiến hành

3.1 Tách chiết plasmid pUC57

Trình tự thực hiện:

5

- Bước 1: Ly tâm khoảng 1.5 ml dịch E.coli/pUC57 (sau khi tăng sinh) ở 12000 rpm 4 oC, trong 2 phút sử dụng ống eppendorf 2mL Hút bỏ dịch nổi sử dụng pipetman 1000μl Lặp lại bước 1 ba lần để ly tâm hết 4.5 mL dịch nuôi cấy vi khuẩn

- Bước 2: Huyền phù tủa hoàn toàn trong 250μl Resupension Solution, sử dụng Vortex

- Bước 3: Thêm 250μl Lysis Solution Trộn đều lên- xuống nhẹ nhàng 5 lần bằng pipetman Ủ nhiệt độ phòng, 5 phút

- Bước 4: Thêm 350μl Neutralization Solution Trộn đều lên-xuống nhẹ nhàng 5 lần bằng pipetman

- Bước 5: Ly tâm 13000 rpm, trong 5 phút ở nhiệt độ phòng

- Bước 6: Lấy 800μl dịch nổi vào eppendorf 1.5mL Ly tâm 13000 rpm, trong 5 phút ở nhiệt độ phòng

- Bước 7: Nạp 700μl dịch nổi vào cột GeneJET Ly tâm 13000 rpm, trong 1 phút ở nhiệt độ phòng Loại bỏ dịch

- Bước 8: Thêm 500μl Washing Solution Ly tâm 13000rpm, trong 1 phút ở nhiệt độ phòng Loại bỏ dịch

- Bước 9: Lặp lại bước 8 Phơi khô cột trong 30 phút ở nhiệt độ phòng

- Bước 10: Chuyển cột GeneJET vào Effpendort 1.5 mL sạch mới Thêm 50μl Elution Buffer, ủ 2 phút ở nhiệt độ phòng Ly tâm 13000rpm, trong 2 phút ở nhiệt độ phòng Dung dịch chứa plasmid được rửa khỏi cột thu được trong ống Effpendort

- Lấy 2 μL để điện di kiểm tra Phần thể tích DNA còn lại trữ ở tủ -20 oC

3.2 Điện di kiểm tra sản phẩm plasmid vector thu được

A Chuẩn bị gel agarose 1%:

- Cân 0.7 g agarose trong bình erlen 250ml sạch, thêm vào 70 ml đệm TAE 1X

- Đặt vào lò viba, đun cho nóng chảy hoàn toàn (lắc đều vài lần), lấy ra để nguội đến khoảng 40-50 oC

- Đổ dung dịch vào khuôn đổ gel

- Đợi đến khi gel đông hoàn toàn (sau ít nhất 30 phút), tháo lược ra, đặt gel vào bồn điện

di Gel này có thể chuẩn bị từ những ngày trước nhưng phải ngâm trong TAE

- Đổ dung dịch TAE 1X vào bồn điện di đến khi vượt bề mặt gel agarose

B Chuẩn bị mẫu DNA

- Trên một miếng paraffin nhỏ: trộn lần lượt 3 μL nước cất, 1μL 6X loading buffer, 2 μL mẫu khuôn DNA

C Nạp mẫu và điện di

- Nạp hết 6 μL mẫu đã trộn trên miếng paraffin cho 1 giếng

- Nạp 1 μL thang DNA chuẩn cho mỗi gel agarose

- Đóng nắp buồng điện di, cắm điện cực (chú ý chiều của điện cực đối với vị trí của bản gel)

- Chạy điện di với điện thế 110V trong 25 phút (hoặc quan sát vạch màu xanh thứ 2 chạy đến khoảng giữa gel)

D Quan sát vạch DNA

- Đảm bảo đã ngắt nguồn điện!!

6

- Lấy gel ra khỏi buồng điện di

- Quan sát vạch DNA dưới buồng UV và chụp hình để lưu lại kết quả

3.3 Yêu cầu tường trình

1 Giải thích các bước của quá trình tách chiết plasmid?

2 Nồng độ agarose có liên quan gì đến độ lớn của plasmid DNA cần điện di?

3 Thang DNA nên có thành phần như thế nào để phù hợp với độ lớn của plasmid cần xác định?

4 Gắn hình ảnh gel vào bài tường trình cho biết cách xác định kích thước vạch DNA plasmid?

Giải thích nếu kết quả xuất hiện những vạch DNA không mong muốn

TUẦN 3: CHUẨN BỊ ĐOẠN DNA CẦN CHÈN

1 Các nội dung thí nghiệm chính

- Phản ứng PCR gene đích (khuếch đại gene mục tiêu g56 (từ genome của thực khuẩn

thể IP008) cần tạo dòng dựa trên cặp mồi chuyên biệt;

- Điện di sản phẩm PCR;

- Tinh sạch sản phẩm PCR;

- Điện di kiểm tra sản phẩm PCR sau tinh sạch

2 Chuẩn bị

- Các vật liệu và dung dịch cho phản ứng PCR (mồi và PCR kits mua từ Phusa.Biochem)

- Các vật liệu và dung dịch cho chạy điện di sản phẩm PCR: agarose, thang DNA 0.2

kb-10 kb mua từ nhà cung cấp Bioline

3 Tiến hành

3.1 Đặt phản ứng PCR

- Lấy các hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR, để rã đông trong đá lạnh;

- Cài đặt chương trình PCR trên máy PCR như sau:

30

- Lần lượt hút các thành phần phản ứng vào ống PCR loại 0,2 ml như sau: (chuẩn bị sẵn stock thành phần phản ứng)

Chú ý: Trộn các dung dịch của phản ứng PCR thực hiện trên đá lạnh

7

DNA mẫu (template) 0.5 µl (dịch nuôi thực khuẩn thể)

Dream Taq PCR Master Mix (2X) 12.5 µl

- Trộn đều nhẹ nhàng bằng pipetman (3-5 lần);

- Tiếp tục để trong đá lạnh;

- Mỗi nhóm làm tương tự 1 phản ứng âm tính (sử dụng 0.5 µl nước deionized tiệt trùng thay thế 0.5 µl DNA khuôn);

- Khởi động (Start) chương trình PCR đã cài đặt;

- Khi nhiệt độ bắt đầu đạt 95 oC, nhanh chóng đặt các ống phản ứng PCR vào máy;

3.2 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR

A Chuẩn bị gel agarose 1.5%:

- Cân 1.05 g agarose trong bình erlen 250-ml sạch, thêm vào 70 ml đệm TAE 1X

- Đặt vào lò vi sóng, đun cho nóng chảy hoàn toàn (lắc đều vài lần), lấy ra để nguội đến khoảng 40-50 oC

- Đổ dung dịch vào khuôn đổ gel

- Đợi đến khi gel đông hoàn toàn (sau ít nhất 30 phút), tháo lược ra, đặt gel vào bồn điện

di Gel này có thể chuẩn bị từ những ngày trước nhưng phải ngâm trong TAE

- Đổ dung dịch TAE 1X vào bồn điện di đến khi vượt bền mặt gel agarose

B Chuẩn bị mẫu DNA

- Sau khi hoàn thành phản ứng PCR, lấy 2µl sản phẩm chạy điện di kiểm tra

- Trên một miếng paraffin nhỏ: trộn lần lượt 3 μL nước cất, 1μL 6X loading buffer, 2 μL mẫu khuôn DNA

C Nạp mẫu và điện di

- Nạp hết 6 μL mẫu đã trộn trên miếng paraffin cho 1 giếng

- Nạp 1 μL thang DNA chuẩn cho mỗi gel agarose

- Đóng nắp buồng điện di, cắm điện cực (chú ý chiều của điện cực đối với vị trí của bản gel)

- Chạy điện di với điện thế 110V trong 25 phút (hoặc quan sát vạch màu xanh chạy đến khoảng giữa gel)

D Quan sát vạch DNA

- Đảm bảo đã ngắt nguồn điện!!

- Lấy gel ra khỏi buồng điện di

- Quan sát vạch DNA dưới buồng UV và chụp hình để lưu lại kết quả

3.3 Tinh sạch sản phẩm PCR

8

Bước 1: Thêm một lượng thể tích Binding Buffer

bằng với thể tích mẫu DNA vào eppendorf chứa

mẫu DNA Trộn đều

Chú ý: Nếu hỗn hợp màu vàng là pH tối ưu Nếu

màu cam hoặc tím thì thêm 10uL Natri acetate 3M,

pH 5.2 và trộn đều, màu hỗn hợp sẽ chuyển vàng

Nếu kích thước đoạn tinh sạch <500bp, và không

có primer-dimers xuất hiện thì nên thêm 1 thể tích

(bằng với thể tích mẫu) 100% isopropanol vào hỗn

hợp rồi trộn đều

- Bước 2: Chuyển hỗn hợp trên vào cột lọc

GeneJET

- Bước 3: Ly tâm 13000rpm, 1 phút Bỏ dịch

- Bước 4: Thêm 700μl Wash Buffer (đã pha loãng

với ethanol 99% theo tỷ lệ 1:5) Ly tâm 13000 rpm,

25 oC, 1 phút Bỏ dịch Đặt cột trở lại Collection

tube

- Bước 5: Ly tâm cột 13000rpm, 2 phút

Chú ý: Bước này để loại bỏ hoàn toàn ethanol

- Bước 6: Chuyển cột lọc GeneJET qua ống eppendorf 1.5ml sạch Thêm 50μl Elution Buffer vào giữa cột lọc (KHÔNG chạm lớp màng lọc) Ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng Chú ý: Thể tích Elution Buffer có thể thêm trong khoảng 20-50uL

- Bước 7: Ly tâm 13000rpm, 2 phút Thu dịch DNA sau tich sạch

- Bước 8: Điện di 2 μl kiểm tra sản phẩm gen g56 tinh sạch

- Phần sản phẩm gen còn lại giữ ở -20 oC

Yêu cầu tường trình

1 Nguyên tắc thiết kế mồi cho phản ứng PCR?

2 Tại sao chuẩn bị cho phản ứng PCR phải thực hiện trong đá lạnh?

3 Nguyên tắc của quá trình tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng Kit?

4 Biện luận mối quan hệ giữa kích thước sản phẩm PCR và hiệu suất thu hồi sản phẩm tinh sạch?

5 Gắn hình điện di thu được trên đó có ghi chú tên và kích thước của các vạch DNA?

9

TUẦN 4, 5: TÁI TỔ HỢP GEN g56

1 Các nội dung thí nghiệm chính

- Phản ứng cắt sản phẩm PCR (gen g56) và plasmid pUC57 với cặp RE tương ứng;

- Điện di kiểm tra các sản phẩm cắt;

- Tinh sạch sản phẩm PCR và plasmid vector sau cắt RE;

- Phản ứng nối gen vào vector plasmid pUC57

2 Chuẩn bị

- Enzyme cắt giới hạn (RE): KpnI, XbaI

- Dung dịch đệm cho RE: Tango

- T4 DNA ligase

- Dung dịch đệm cho T4 DNA ligase

- Nước deionized

- Hóa chất cho điện di

3 Tiến hành

3.1 Phản ứng cắt sản phẩm PCR bởi RE

- Lần lượt cho các thành phần sau vào Eppendorf 0,5 ml:

Dung dịch đệm 10X (Tango) 5 µl

XbaI enzyme 0,5 µl

- Ủ hỗn hợp ở 37oC trong 2 giờ

3.2 Phản ứng cắt plasmid vector bởi RE

- Lần lượt cho các thành phần sau vào Eppendorf 0,5 ml:

Dung dịch đệm 10X (Tango) 5 µl

pUC57 (tách chiết được ở tuần 2) 30 µl

XbaI enzyme 0,5µl

- Ủ hỗn hợp ở 37oC trong 2 giờ

3.3 Điện di kiểm tra sản phẩm cắt

- Trong quá trình chờ phản ứng cắt, chuẩn bị các vật liệu cần thiết cho thí nghiệm điện di

- Lấy mỗi sản phẩm cắt 5 µl (sản phẩm PCR và plasmid sau khi cắt) để thực hiện thí nghiệm điện di

- Ước lượng nồng độ DNA trong thang mẫu từ đó dự đoán nồng độ DNA trong mẫu thí nghiệm

3.4 Bất hoạt RE

- Phần thể tích còn lại sau cắt RE (45µl) được ủ ở 80oC, 20 phút

10

3.5 Tinh sạch các sản phẩm cắt RE bằng kít

Quá trình tinh sạch DNA sản phẩm PCR và vector tương tự như trình bày ở Hình-2 và như hướng dẫn trong tuần 2+3

- Ở bước 6; thêm 30μl Elution buffer vào cột lọc

- Trữ DNA ở -20oC để chờ phản ứng nối (ligase)

3.6 Phản ứng nối bởi ligase

- Dựa vào kết quả điện di sản phẩm cắt, ước tính tính thể tích từng sản phẩm cắt (vector

và sản phẩm PCR) cho phản ứng nối sao cho tỉ lệ mole của vector : mole sản phẩm PCR

là khoảng 1 : 3

- Thực hiện phản ứng nối với các thành phần sau:

10X DNA T4 ligase buffer 2,0 µl

Mix nhẹ nhàng hỗn hợp và ủ ở 22oC, 1 h và trữ ở -20 oC cho bước tiếp theo

Chú ý: Sau khi ủ, sinh viên có thể ra về

Yêu cầu tường trình

1 Gắn hình điện di thu được lên trường trình, có ghi chú tên và kích thước của các vạch DNA

2 Điều kiện nào cho phép thực hiện phản ứng cắt cùng lúc bởi 2 enzyme cắt giới hạn (RE)?

3 Tại sao phải thực hiện thí nghiệm điện di sau khi thực hiện phản ứng cắt bởi RE?

4 Tại sao phải bất hoạt RE ở bước 3.4

5 Tại sao phải tinh sạch ở bước 3.5?

11

Tuần 6,7 : BIẾN NẠP

1 Các nhiệm vụ chính

- Chuẩn bị tế bào khả biến E.coli DH5

- Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli

- Chuẩn bị môi trường sàng lọc

- Cấy sàng lọc

Chú ý: Mỗi lớp phải thực hiện các nội dung công việc này trong 1 ngày

2 Chuẩn bị

+ Môi trường LB lỏng (GV chuẩn bị trước);

+ Dung dịch 0.1M CaCl2 (GV chuẩn bị trước);

+ Dịch nuôi cấy E coli DH5α qua đêm (GV chuẩn bị trước);

+ Đĩa thạch LB chứa 100mg/L ampicillin và một lớp mỏng (trang 40 μl dung dịch

40mg/ml X-gal trên bề mặt thạch)

3 Tiến hành

3.1 Chuẩn bị tế bào khả biến

- Lấy 2 mL dịch nuôi cấy E coli qua đêm cấy vào 50 mL LB trong bình tam giác 250 hoặc

300 mL, nuôi ở 37 oC, lắc 250 rpm đến khi OD600 ~ 0.35;

- Đặt bình nuôi cấy trong đá lạnh 15 phút, lắc nhẹ trong đá mỗi 2-3 phút (dung dịch 0.1M CaCl2 cũng giữ trong đá lạnh);

- Mỗi nhóm chuẩn bị 2 ống Eppendorf loại 2 mL để trong đá lạnh, lấy 1,8 mL dịch nuôi cấy cho vào mỗi ống và ly tâm 2,500 rpm trong 5 phút, 4 oC;

- Bỏ dịch nổi, thêm vào mỗi ống 0.9 mL dung dịch 0.1M CaCl2, mix nhẹ nhàng bằng tay và pipetman, dồn 2 ống vào 1 ống (tổng thể tích là 1.8 mL), ly tâm 2,500 rpm trong 5 phút, 4

oC;

- Bỏ dịch nổi, thêm vào mỗi ống 1.8 mL dung dịch 0.1M CaCl2, mix nhẹ nhàng bằng tay và pipetteman, ly tâm 2,500 rpm trong 5 phút, 4 oC;

- Bỏ dịch nổi, thêm vào mỗi ống 50 μL dung dịch 0.1M CaCl2, mix nhẹ nhàng, giữ trong đá lạnh

3.2 Chuẩn bị môi trường sàng lọc

Chú ý: bước này chuẩn bị khi chờ dịch nuôi E coli đạt OD 600 ~0.35

- Chuẩn bị 200 mL môi trường LB;

- Tiệt trùng;

- Để nguội đến 40-50 oC;

- Đổ đĩa thạch, đợi cho đông hoàn toàn;

- Trải mỗi đĩa thạch với 40 µL X-gal stock (40 mg/mL);

3.3 Chuyển plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến

- Chuẩn bị block nhiệt 42 oC;

- Plasmid tái tổ hợp từ thí nghiệm tuần trước để trong đá lạnh;

12

- Trộn 2 µL plasmid vào mỗi ống tế bào khả biến, trộn nhẹ nhàng và nhanh chóng ủ trong

đá lạnh 15 phút;

- Lấy ống tế bào khả biến đã trộn plasmid ủ trong block nhiệt 42 oC trong 30 giây

- Nhanh chóng ủ lại trong đá lạnh 2 phút;

- Thêm 250 µL môi trường SOC và lắc ngang 200 rpm ở 37 oC trong 0.5-1 giờ;

- Lấy 2 mẫu 10 và 100µL dịch ủ để trải trên 3 đĩa sàng lọc (LB/Amp);

- Ủ 37oC, 16-20 giờ;

- Trữ đĩa có khuẩn lạc trắng ở 4 oC cho bước tiếp theo

Yêu cầu tường trình

1 Để hiệu quả biến nạp của tế bào khả biến cao, ban đầu cần nuôi tế bào vi khuẩn đến

OD 600 ~ 0.35 Giải thích tại sao

2 Vai trò của CaCl 2 trong quá trình chuẩn bị tế bào khả biến?

3 Vai trò của ampicillin và X-gal trong sàng lọc dòng mang vector tái tổ hợp?

4 Gắn hình của đĩa sàng lọc thu được và cho biết số lượng khuẩn lạc xanh và trắng Số khuẩn lạc xanh hay trắng chiếm ưu thế trên đĩa, giải thích?