Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan thạch hộc tía

Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số loại Cytokinin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.. Nội dung 4: Nghiên cư

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

DƯƠNG THỊ TUYẾT

Tên khóa lu ận:

“NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT ĐIỀU TIẾT SINH TRƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY SINH KHỐI

IN VITRO C ỦA LAN THẠCH HỘC TÍA (Dendrobium officinale Kimura et Migo)”

H ệ đào tạo: Chính quy

Chuyên ngành: Công ngh ệ sinh học

LỜI CẢM ƠN

Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tập tốt nghiệp em đã

thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng

đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium offcinale Kimura et Migo )”

Trang đầu tiên của khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này

Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo TS Nguyễn Văn Hồng giảng viên Khoa Nông học và thầy giáo TS Nguyễn Xuân Vũ giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Trong quá trình thực tập, cũng như là quá trình làm báo cáo thực tập thời gian có hạn, trình độ và kỹ năng bản thân còn nhiều hạn chế nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo trong nhà trường, trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, cùng các bạn đồng nghiệp sức khoẻ, thành công trong cuộc sống

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày tháng năm

Sinh viên th ực tập

Dương Thị Tuyết

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

GA3 : Gibberellic acid

LSD05 : Least significant difference: Giá trị sai khác nhỏ nhất ở mức độ tin cậy 95%

MS : Murashige & Skoog’s, 1962

MT : Môi trường

NAA : α-Naphthalene acetic acid

TN : Thí nghiệm

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thiết bị,dụng cụ nghiên cứu 24

Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến quá trình sinh

trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (sau 30 ngày

nuôi cấy) Error! Bookmark not defined Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến quá trình sinh

trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (sau 30 ngày

nuôi cấy) 34 Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến quá trình sinh

trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía ( sau 30

ngày nuôi cấy) 36 Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với Kinetin đến

quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (sau 30 ngày nuôi cấy) 38 Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với NAA đến

quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

(sau 30 ngày nuôi cấy) 41

Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin kết hợp với NAA

đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc

Tía (sau 30 ngày nuôi cấy) 44

Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin (khi sử

dụng phối hợp) kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (sau 30 ngày nuôi cấy) 46 Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với GA3 đến

quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

(sau 30 ngày nuôi cấy) 49 Bảng 4.8 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin kết hợp với GA3 đến

quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

(sau 30 ngày nuôi cấy) 51 Bảng 4.9 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin (khi sử

dụng phối hợp) kết hợp với GA3 đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía ( sau 30 ngày nuôi cấy) 53

Bookmark not defined

Hình 4.2: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung BAP sau 30

ngày 35 Hình 4.3: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung Kinetin sau 30

ngày 38 Hình 4.4: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung BAP và Kinetin

sau 30 ngày nuôi cấy 40 Hình 4.5: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung BAP và NAA sau

30 ngày nuôi cấy 43 Hình 4.6: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung Kinetin và NAA

sau 30 ngày cấy 45 Hình 4.7: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung BAP, Kinetin và

NAA sau 30 ngày nuôi cấy 47 Hình 4.8: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung BAP và GA3 sau

30 ngày nuôi cấy 50 Hình 4.9: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung Kinetin và GA3 sau

30 ngày nuôi cấy 52 Hình 4.10: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung BAP, Kinetin và

GA3 sau 30 ngày nuôi cấy 54

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ii

DANH MỤC CÁC BẢNG iii

DANH MỤC CÁC HÌNH iv

MỤC LỤC v

Ph ần 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

1.3 Yêu cầu của đề tài 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

Ph ần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tổng quan về lan Thạch Hộc 4

2.1.1 Phân loại và nguồn gốc lan Thạch Hộc 4

2.1.2 Đặc điểm hình thái 6

2.2 Giới thiệu về giống lan Thạch Hộc Tía 7

2.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố 7

2.2.2 Đặc điểm hình thái 7

2.2.3 Giá trị của lan Thạch Hộc Tía 8

2.3 Nhân giống lan Thạch Hộc Tía 12

2.3.1 Phương pháp nhân giống hữu tính 12

2.3.2 Phương pháp nhân giống vô tính 12

2.4 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 13

2.4.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật 13

2.4.2 Sự phân hoá tế bào 14

2.4.3 Sự phản phân hoá tế bào 14

2.4.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 14 2.4.5 Môi trường dinh dưỡng 15

2.5 Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu chất điều tiết sinh trưởng trong nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào 18

2.6 Công nghệ sinh khối tế bào thực vật 19

2.6.1 Một số khái niệm cơ bản 19

2.6.2 Ưu điểm của công nghệ sinh khối tế bào thực vật 20

2.6.3 Những khó khăn khi triển khai công nghệ sinh khối tế bào thực vật 21

2.7 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Thạch Hộc Tía 21

Ph ần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 Đối tượng, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 24

3.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 24

3.1.2 Hoá chất sử dụng 24

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 24

3.2 Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 24

3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 24

3.2.2 Địa điểm nghiên cứu 25

3.2.2 Thời gian nghiên cứu 25

3.3 Nội dung nghiên cứu 25

3.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu môi trường nền thích hợp đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía Error! Bookmark not defined 3.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số loại Cytokinin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía 25

3.3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp Cytokinin và Auxin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía 25

3.3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp Cytokinin và Gibberellin (GA3) đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía 25

3.4 Phương pháp nghiên cứu 26

3.4.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro 26

3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 26

3.4.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 26

3.5 Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu 31

Ph ần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33

4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh

trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.Error! Bookmark not

defined

4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số loại Cytokinin quá trình

sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía 33

4.2.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía 33

4.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía 36

4.2.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với Kinetin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía 38 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp Cytokinin và Auxin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía 41

4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía 41

4.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía 43 4.3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin (khi sử dụng phối hợp) kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía 45

4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp Cytokinin và Gibberellin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía 48

4.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với GA3 đến quá trình sinh trưởng và tích lũy tăng sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía 49

4.4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin kết hợp với GA3 đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía 51 4.4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin (khi sử dụng phối hợp) kết hợp với GA3 đến quá trình sinh trưởng và tích lũy tăng sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía 53

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

5.1 Kết luận 56

5.2 Kiến nghị 56

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 57

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Việt Nam có nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú, từ xa xưa ông cha

ta đã có rất nhiều các bài thuốc sử dụng dược liệu để chữa bệnh Ngày nay, việc sử dụng các loại thực vật cũng như các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật trong công tác phòng trị bệnh, làm thực phẩm chức năng được các nước trên thế giới rất quan tâm Nhờ có nguồn gốc tự nhiên, cơ thể con người dễ dung nạp, hòa hợp và có những ưu điểm riêng Hầu hết các vị thuốc trong y học cổ truyền đã được sử dụng từ rất lâu, đều đã được sàng lọc qua nhiều thế hệ [5] Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, những hiểu biết về thành phần hóa học, tác dụng dược lý cũng như cơ chế tác

dụng của các loại thảo dược ngày càng được củng cố

Hoa lan là một loài hoa rất được ưu chuộng ở Việt Nam nói riêng và các nước trên thế giới nói chung Chúng được mệnh danh là nữ hoàng của các loài hoa Không

chỉ ở vẻ đẹp, màu sắc, hương thơm mà còn có giá trị dược liệu Trong số những loài lan có giá trị dược liệu quý ở Việt Nam, phải kể đến lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium

offcinale Kimura et Migo)

Lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) hay còn gọi là Thạch hộc thiết bì, Thạch hộc gỉ sắt thuộc chi Thạch Hộc, họ lan (Orchidaceae) [4]

là một cây dược liệu rất quý, mọc ở vùng cao núi đá, nhiệt đới, á nhiệt đới Lan Thạch

Hộc Tía (Dendrobium offcinale Kimura et Migo) có nguồn gốc xuất sứ từ rất nhiều

nơi đặc biệt vùng Nhiệt Đới và cận Nhiệt Đới Tại Việt Nam phân bố chủ yếu ở vùng trung du và miền núi phía Bắc xuất hiện tại các tỉnh như Hòa Bình, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng

Lan Thạch Hộc Tía được xếp vào loại cây thuốc giúp đề kháng ung thư và tăng tuổi thọ [9] Ngoài ra, lan Thạch Hộc Tía còn là loài cây cảnh, loại thực phẩm tốt có giá trị kinh tế cao Lan Thạch Hộc Tía khó sinh sản, mọc chậm, khó trồng Hiện nay, trong quá trình phát triển kinh tế xã hội, đời sống con người càng được

nâng cao và nhu cầu sử dụng dược liệu ngày càng gia tăng mà nguồn lan Thạch Hộc Tía không đủ đáp ứng nhu cầu

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật việc ứng dụng nuôi cấy mô tế bào

thực vật (in vitro) trong nhận giống đã trở nên phổ biến, Nuôi cấy in vitro tạo ra những

giống cây trông sạch bệnh, chất lượng tốt, đồng đều cao và hệ số nhân lớn trong thời gian ngắn Bởi vậy, phương pháp nhân giống vô tính in vitro lan Thạch Hộc Tía đã và đang mở ra triển vọng tốt cho việc bảo tồn các loài thực vật quý hiếm và phát triển các giống lan quý hiếm này Tuy nhiên, các yếu tố như quang chu kỳ, nhiệt độ, các chất điều tiết sinh trưởng, dịch chiết hữu cơ, thành phần đa lượng hay vi lượng trong môi trường nuôi cấy có vai trò rất quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Trong đó, các chất điều tiết sinh trưởng ảnh hưởng trực tiếp tới sự sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía Xuất phát từ cõ sở đó chúng tôi tiến hành

đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng sinh

trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium offcinale

Kimura et Migo)”

1.2 M ục đích nghiên cứu

Xác định được ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng

sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

1.3 Yêu c ầu của đề tài

- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ một số loại Cytokinin đến quá trình

sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

- Xác định được ảnh hưởng của sự kết hợp Cytokinin và Auxin đến quá trình

sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

- Xác định được ảnh hưởng của sự kết hợp Cytokinin và Gibberellin đến quá

trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

1.4 Ý ngh ĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp xác định được ảnh hưởng của một chất

điều tiết sinh trưởng đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan

Thạch Hộc Tía Đây là nguồn dữ liệu khoa học bổ sung cho nhân giống và sản xuất

sinh khối lan Thạch Hộc Tía bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Kết quả

đề tài cũng góp phần làm phong phú cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nuôi cây mô lan Thạch

Hộc Tía phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo trên đối tượng này trong tương lai .- Ý nghĩa thực tiễn

- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn

- Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế cũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho công tác sau này

Đề xuất được quy trình nhân nhanh lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium offcinale Kimura et Migo) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, tạo ra sinh khối lan Thạch Hộc

Tía góp phần đáp ứng nhu cầu về dược liệu của thị trường đồng thời tạo nguồn vật liệu cho nghiên cứu khoa học

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về lan Thạch Hộc

2.1.1 Phân loại và nguồn gốc lan Thạch Hộc

2.1.1.1 Phân loaòi lan Thạch Hộc

Theo từ điển Bách khoa dược học của Việt Nam (1999) đã ghi “Thạch Hộc”

(Dendrobium nobile Lindt) có tên khác là Kim Thạch Hộc, thuộc chi Thạch Hộc, họ Lan (Orchidaceae) [26] Lan Thạch Hộc là một cây thảo phụ sinh, mọc bám trên cành

cây to hoặc ở vách đá ẩm Thân dẹt có rãnh dọc chia nhiều đốt, phía cuống thuôn hẹp, phía ngọn dày hơn, màu vàng nhạt Lá ngắn có bẹ Hoa màu hồng hoặc trắng pha hồng, mọc thành chùm ngắn ở kẽ những lá đã rụng Quả dài hình thoi

Các loài Thạch Hộc thường thấy là:

- Thạch Hộc Tía (Thiết bì) với đặc trưng vỏ cây có màu xanh tía, là cây thảo bản phụ sinh lâu năm, sống bám vào cây gỗ lớn rừng nguyên sinh có độ ẩm cao hoặc ở vách đá ẩm ướt, ưa khí hậu ẩm và râm mát, có giá trị độc đáo về dược phẩm [33]

- Thạch Hộc Lưu tô (đuôi ngựa) phân bố chủ yếu ở Quý Châu, Vân Nam, Quảng Châu ở độ cao 600 - 1.700 m, phụ sinh trên cây gỗ rừng kín hoặc vách đá ẩm ướt, phân bố ở nhiều nước Ấn Độ, Nê Pan, Xích Kim, Bu Tan, Myanma, Thái Lan, Việt Nam Rất dễ sinh trưởng, mọc nhanh, năng suất cao, cũng có tác dụng nhất định về công năng dược liệu [33]

- Thạch Hộc Kim thoa cũng là cây thảo bản lâu năm, mọc thành bụi, phân bố chủ yếu ở Quý Châu, Tứ Xuyên, Quảng Tây (Trung Quốc), cũng có công dụng làm thuốc chữa một số bệnh [33]

- Thạch Hộc Cầu hoa thân đứng hoặc nghiêng, mọc trên cây gỗ rừng độ cao 540-1.800 m, hoa rất đẹp, thường dùng làm cây cảnh [33]

- Thạch Hộc Cổ chùy là cây thảo bản phụ sinh lâu năm, mọc bám vào cây gỗ

rừng thường xanh hoặc vách đá rừng thưa, độ cao 500 - 1.600 m, phân bố ở Ấn Độ, Myanma, Thái Lan, Lào, Việt Nam [33]

2.1.1.2 Nguồn gốc lan Thạch Hộc

Thuộc lớp một lá mầm:

Theo Huỳnh Văn Thới (2005) [23], tên Dendrobium có nguồn gốc từ chữ Grec Dendron nghĩa là cây gỗ và bios là tôi sống, Dendrobium là giống phụ sinh, sống trên cây gỗ Có người gọi là Hoàng Lan, có người gọi là Đăng Lan, Dendrobium có trên 1.600 loài và chia thành 2 dạng chính:

+ Dạng đứng (Dendrobium phalaenopsis) thường mọc ở xứ nóng, chịu ẩm và rất siêng ra hoa: Nhất điểm hồng, Nhất điểm hoàng, Báo hỉ, Ý thảo, Thủy tiên + Dạng thòng (Dendrobium nobile) chị khí hậu mát mẻ: Giả hạc, Hạc vĩ, Long

tu, Phi điệp vàng

Ở Việt Nam, Dendrobium có đến 100 loài, xếp trong 14 tông được phân biệt

bằng thân (giả hành), lá và hoa [11]

Khu phân bố của lan Thạch Hộc thường ở Nam Trung Quốc, Thái Lan, Lào, Malaixia, Việt Nam và nhiều nước vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, thường gặp mọc trên cây gỗ trong rừng ở độ cao 600-2400 m Thạch Hộc sinh trưởng trong môi trường tự nhiên với độ ẩm khoảng 70%, lượng mưa khoảng 900 – 1.500 mm, nhiệt độ từ 12 – 18ºC Do đó nó thường tập trung ở các phần dốc núi râm mát, độ ẩm cao và các vách đá chua [18]

Hiện nay trên khắp thế giới có khoảng 1400 loài Lan, ở Trung Quốc có khoảng

81 loài Trong chi Thạch Hộc cũng có rất nhiều loài được dùng để chữa bệnh Tại Trung Quốc, chi Thạch Hộc có khoảng 12 loài phụ và 14 loài chính, trong đó có tới

11 loài được xem là dược liệu quý Đặc biệt, Thạch Hộc Tía là loài được đánh giá cao nhất và cũng có giá trị kinh tế lớn nhất Cây Thạch Hộc ở Việt Nam được phát hiện nhiều nhất ở khu vực rừng Quảng Trị, Quảng Nam - Đà Nẵng, Gia Lai, Lâm Đồng [18]

Ở Việt Nam họ lan có nhiều loài, phân bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam, nhiều loài đã bị tuyệt chủng hoặc bị đe dọa tuyệt chủng cần được nhân giống để bảo tồn và phát triển loài lan đó Dendrobium officinale Kimura et Migo loài lan Thạch Hộc Tía

phân bố ở vùng trung du miền núi phía bắc, Việt Nam đang được nghiên cứu nhân giống và nuôi trồng để làm thuốc

2.1.2 Đặc điểm hình thái

Ở Việt Nam các loài lan Thạch Hộc rất đa dạng về hình dáng, tuy nhiên chúng đều mang những đặc điểm hình thái chung như sau:

Cây Thạch Hộc hay hoàng thảo - Dendrobium nobile Lindl là một loài cây phụ sinh trên những cành cây cao, thân mọc thẳng đứng cao độ 0,3 - 0,6m, thân hơi dẹt,

phía trên hơi dày hơn, có đốt dài 2,5-3cm, có vân dọc [21]

Rễ: Thuộc họ sống phụ sinh, treo lơ lửng trên các cây thân gỗ khác Các loại thân

gỗ nạc dài, ngắn, mập hay mảnh mai đưa cơ thể bò đi xa hay chụm lại thành các bụi dày Đặc biệt đối với lan công nghiệp (nuôi cấy mô) người ta thường sử dụng một số giá thể nuôi như: Dớn, than củi, … Rễ làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng, chúng được bao bởi lớp mô hút dày, ẩm Bao gồm: Những lớp tế bào chết chứa đầy không khí,

do đó nó ánh lên màu xám bạc Với lớp mô xốp đó rễ có khả năng hấp thu nước mưa

chảy dọc dài trên vỏ cây, lấy nước lơ lửng trên không khí [27]

Thân: Thân hơi dẹt, có rãnh dọc, phía trên hơi dày hơn, có đốt dài 2,5 - 3,0cm, có vân dọc Thân Thạch Hộc Tía có màu tía, thân các Thạch Hộc khác có màu xanh [27] Lá: Lá hình thuôn dài, phía cuống tù, gần như không cuống, ở đầu hơi cuộn hình nón, dài 12cm, rộng 2-3cm trên có 5 gân dọc [27]

Hoa: Cụm hoa mọc thành chùm 2 - 4 hoa trên những cuống dài 2 – 3cm Hoa đẹp, to, màu hồng hay điểm hồng Cánh môi hình bầu dục nhọn, dài 4 – 5cm, rộng 3cm cuộn thành hình phễu trong hoa, ở nơi họng hoa điểm màu tía [27]

Quả: Quả nang hơi hình thoi, khi khô tự mở theo các rãnh dọc Hạt nhiều Cây ra hoa tháng 3 - 4, có quả vào tháng 5 - 6 Loài này mọc hoang ở khắp các miền rừng núi các tỉnh miền Bắc, thường được trồng để làm cảnh vì dáng cây đẹp, hoa đẹp [27]

2.2 Giới thiệu về giống lan Thạch Hộc Tía

2.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố

có tên gọi khác là Thạch hộc thiết bì, Hắc tiết thảo, Thiết bì lan là cây thảo lâu năm

thuộc chi Thạch Hộc, họ Lan (Orchidaceae) [5] phân bố tự nhiên chủ yếu ở vùng

rừng có độ cao 1.000 - 3.400m so với mực nước biển, thường phụ sinh vào cây gỗ hoặc vách đá có mọc rêu dưới tán rừng

Trong điều kiện môi trường tự nhiên với độ ẩm 70%, nhiệt độ không khí bình quân năm 12 - 18 độ C, lượng mưa 900 - 1.500mm, thường tập trung sống ở phần dốc núi râm mát, độ ẩm cao và vách núi đá Cây Thạch Hộc Tía phân bố ở Việt Nam, Lào, Trung Quốc, Myanmar và nhiều nước nhiệt đới, cận nhiệt đới

Hình 2.1: Hình ảnh cây lan Thạch Hộc Tía

Tại Việt Nam phân bố chủ yếu ở vùng trung du và miền núi phía Bắc, xuất hiện tại các tỉnh như Hòa Bình, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng

2.2.2 Đặc điểm hình thái

Cây Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) là một loài cây

phụ sinh trên những cành cây cao, thân mọc thẳng đứng cao độ 0,3 - 0,6 m, thân hơi dẹt, phía trên hơi dày hơn, có đốt dài 2,5 – 3cm, có vân dọc Theo Trần Văn Bảo (1999) một số Dendrobium lá có ở các mầm non, là loại chóng tàn chúng vàng úa và

rụng vào mùa thu, thân phì to giống như củ không có lá là nơi dự trữ năng lượng Lá hình thuôn dài, phía cuống tù, gần như không cuống, ở đầu hơi cuộn hình nón, dài 12

cm, rộng 2 – 3cm trên có 5 gân dọc [3] Cụm hoa mọc thành chùm 2 - 4 hoa trên những cuống dài 2 – 3cm Hoa đẹp, màu vàng có điểm hồng nhưng nhỏ Cánh môi hình bầu dục nhọn, dài 4 – 5cm, rộng 3 cm cuộn thành hình phễu trong hoa, ở nơi họng hoa điểm màu tía Theo Dương Công Kiên (2006), quả chứa 10.000-100.000 hạt đôi khi đến 3 triệu hạt có kích thước rất nhỏ nên phôi hạt chưa phân hóa Quả nang hơi hình thoi, khi khô tự mở theo các rãnh dọc Hạt nhiều, cây ra hoa tháng 3 -

4, có quả vào tháng 5 - 6 Loại này được nghiên cứu nhân giống nhằm mục đích làm thuốc, làm cảnh vì có dáng cây và hoa rất đẹp [10]

2.2.3 Giá tr ị của lan Thạch Hộc Tía

2.2.3.1 Thành ph ần hóa học

Thạch Hộc Tía làm thuốc có nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học quý Trong

Thạch Hộc (Dendrobium nobile) có chất nhầy và một chất alkaloit gọi là dendrobin

khoảng 0,3%, có công thức thô C16H25O2 Theo báo cáo của Viện nghiên cứu y học, hệ dược học (Bắc Kinh, 1958) thì trong Thạch Hộc Tía giàu polysacarit, alkaloit, các acid amine và nhiều chất khoáng kali, canxi, magie, mangan, đồng, titan và nhiều nguyên tố vi lượng, trong đó polysacarit chiếm 22%, hàm lượng các acid amine như glutamic, asparagic, glucin chiếm tới 35% tổng lượng acid amine Ngoài ra Thạch

các chất nhầy, hợp chất amidon Trong thân Thạch Hộc Tía có hàm lượng alkaloit sinh học chiếm tới 0,3%, trong đó những chất amine đã được giám định cấu trúc gồm dendrobine, dendramine, nobilonine, dendrin, 6-hydroxy-dendroxine, shiunin, shihunidine và muối amoniac N-methyl-dendrobium, 8-epidendrobine, các chất này

có vị hơi đắng [07]

2.2.3.2 Công d ụng dược lý chủ yếu của lan Thạch Hộc Tía

Theo y học cổ truyền Trung Quốc, Thạch Hộc Tía tốt cho bổ âm sinh dịch,

chữa chứng hỏa hư, trị đau dạ dày, đau thượng vị, bồi bổ đôi mắt Ngoài ra, nó còn

có tác dụng chống ung thư, chống lão hóa, tăng sức đề kháng của cơ thể, làm dãn

mạch máu và kháng đông máu, được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng, làm các bài thuốc và đặc biệt là chữa bệnh tiểu đường, cao huyết áp [16]

Các nghiên cứu gần đây khẳng định giá trị dược học của loài dược thảo này về

khả năng kháng khuẩn, chống oxy hóa, tăng cường hệ miễn dịch, ức chế tế bào ung thư …

Những thành phần có tác dụng dược lý tốt của tiên thảo Thạch Hộc bao gồm: polisaccarit, alkaloid, axit amin, nguyên tố vi lượng và các hợp chất phenanthrene Tiên thảo Thạch Hộc có tác dụng dược tính phổ biến: tăng cường sức miễn dịch cơ thể, kháng ưng thư, trống Oxy hóa, chống lão hóa, khống chế ngưng kết tiểu cầu, giúp dãn nở mạch máu, xúc tiến bài tiết dịch tiêu hóa, giảm lipids, giảm đường huyết

và hạ nhiệt, giảm đau Loại dược liệu có tác dụng thần kỳ này đang ngày được sự quan tâm và coi trọng của con người

Từ xa xưa, Thạch Hộc Tía đã trở thành thảo mộc quý của Trung Quốc mà chỉ các gia đình có nhiều tiền mới được dùng Trẻ con mới sinh của nhà giàu được uống bát nước đầu tiên là bát nước Thạch Hộc, người sắp qua đời cũng được uống nước Thạch Hộc, nên nước Thạch Hộc Tía được gọi là nước cứu mệnh Từ thời Đường, Tống về sau, Thạch Hộc được làm cống phẩm đối với nhà vua

Hiện nay, lan Thạch Hộc Tía chỉ có Trung Quốc đang phát triển, tuy nhiên sản lượng đưa ra thị trường còn rất khiêm tốn, sau mấy năm nữa sản lượng có thể tăng lên nhiều, giá bán có thể giảm xuống, nhưng hiệu quả vẫn cao hơn nhiều so với nhiều cây trồng khác Ở Trung Quốc đã có nhiều sản phẩm thuốc từ Thạch Hộc bán ra thị trường trong và ngoài nước, đặc biệt là xưởng thuốc Kim Năng ở Nam Kinh tỉnh Giang Tô, trải qua 15 năm nghiên cứu bào chế, được thuốc tiêm: “Mạch lộ ninh”, từ năm 1982 đến nay được đánh giá là thuốc điều trị có hiệu quả đối với bệnh cứng hóa động mạch, viêm màng não Xưởng thuốc này cũng đã cho ra đời các loại thuốc tiêm, thuốc uống, viên nang đều mang tên “Mạch lộ ninh” Cùng với sản phẩm thảo dược truyền thống làm từ Thạch Hộc là “Phong đấu Thạch Hộc” được coi là tuyệt phẩm của thảo dược [24]

2.2.3.3 Giá tr ị sử dụng của Thạch Hộc Tía

Giá trị của Thạch Hộc có 2 loại công năng chủ yếu:

- Làm thuốc: Thạch Hộc Tía có giá trị độc đáo và công năng bảo vệ sức khỏe, đã trở thành sản phẩm bổ dưỡng từ lâu đời Nghiên cứu về dược lý hiện đại, Thạch

làm dãn mạch máu và kháng đông máu, được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng và làm các bài thuốc, các lang y từ xưa đã sử dụng Thạch Hộc trong các vị thuốc chữa

ho, đầy hơi, hư lao, người gầy mòn … những bài thuốc đó đã được đúc rút từ nhiều kinh nghiệm và được áp dụng để chữa bệnh hiệu quả như: Sử dụng 6g Thạch Hộc

làm một vị chủ đạo trong thang thuốc chữa ho, đầy hơi với liều lượng ngày uống 3 lần; cũng sử dụng 6g Thạch Hộc trong thang thuốc chữa chứng hư lao, người gầy mòn Thanh nhiệt bảo tân thang: Thạch Hộc tươi 12g, sinh địa tươi 12g, mạch đông tươi 12g, thiên hoa phấn 12g, tang diệp 8g, sắc uống Có thể dùng Thạch Hộc 15g,

sắc uống Trị chứng bệnh nhiệt phạm đến tân dịch, môi khô, miệng khát Thạch Hộc 40g, thục địa 50g, khiếm thực 40g, hoài sơn 30g, tang thầm 20g, tỳ giải 20g Mát dạ dày, chống nôn: Trị chứng dạ dày nóng, nôn mửa, chân răng sưng, trong miệng loét, dùng “Thạch Hộc thanh vị thang”: Thạch Hộc 12g, phục linh 12g, quất bì 8g, chỉ xác 8g, biển đậu 12g, hương nhu 8g, đơn bì 12g, xích thược 12g, cam thảo 4g, sắc uống khi nước thuốc còn nóng Trị chứng sốt âm ỉ sau khi lên sởi, nôn mửa Thạch Hộc Tía có thể dùng đơn độc hoặc phối trộn với các dược liệu khác, đã có hơn 100 bài thuốc từ Thạch Hộc được thị trường đón nhận Trong dược điển có đề cập đến nhiều loài Thạch Hộc nhưng tốt nhất vẫn là Thạch Hộc Tía [08]

- Làm thực phẩm: Cách sử dụng làm thực phẩm có nhiều cách như nấu súp với

hồng sâm, với bách sa sâm lợi phổi sinh tân Ngoài ra có thể nấu cháo Thạch Hộc, trà Thạch Hộc và nhiều món ăn khác Những năm gần đây công năng làm thực phẩm chức năng đã được khám phá thêm, là sản phẩm thiên nhiên an toàn và bổ dưỡng Thạch Hộc Tía có vị hơi ngọt hơi đắng vào kinh phế, vị, thận, công năng tư âm, thanh nhiệt, chỉ khát, hư hao, gầy yếu, miệng khô [07]

Trong Thạch Hộc Tía có nhiều hợp chất có giá trị dược lý Sử dụng các phương pháp phân tích hiện đại, trong Thạch Hộc Tía đã phân lập được 72 hợp chất đơn thể, trong đó đã giám định được 63 hợp chất và phát hiện thêm 18 hợp chất mới gồm các loại: Hợp chất loại Bibenzil và các dẫn xuất gồm 27 loại: Thạch Hộc Tía (gọi tắt là THT) A, THT.B, THT.C, THT.D, THT.E, THT.S, THT.G, THT.H, THT.I, THT.J, THT.K, THT.L, THT.M, THT.N, THT.O, THT.P, THT.Q, …v.v Hợp chất Phenol

có 12 loại; hợp chất Lignanoid có 4 loại; hợp chất lacton có 2 loại; hợp chất dihydroflavon có 2 loại; các hợp chất khác có 16 loại và 18 hợp chất mới Giám định hoạt tính kháng oxy hóa và kháng u bướu, đã phát hiện phần lớn các hợp chất loại bibenzil đều có hoạt tính kháng oxy hóa, có 2 loại hợp chất Bibenzil có hoạt tính kháng u bướu [07]

2.2.3.4 Giá tr ị kinh tế của lan Thạch Hộc Tía

Thạch Hộc Tía trồng một lần có thể thu hoạch 6 năm, đầu tư ban đầu không quá lớn mà đến năm thứ 2 có thể thu hồi vốn, từ năm thứ 3 có lãi Trong điều kiện thâm canh, năng suất tươi khoảng 5 tấn/ha/năm với giá bán khoảng 3 triệu đồng/kg, doanh thu đạt 15 tỷ đồng/ha/năm Thị trường tiêu thụ là khả quan, nếu chế biến sâu,

thị trường càng lớn và hiệu qủa càng cao, bao gồm thị trường nội địa, thị trường Đông Nam Á, Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và châu Âu, châu Mỹ Thạch Hộc chế biến thành phong đấu, giá xuất khẩu vào những năm 80 thế kỷ trước đạt mức 3.000USD/kg Ở Đài Loan giá phong đấu từ 1.000 - 3.000USD/kg Giá phong đấu hảo hạng cực kỳ đắt, ở thị trường Trung Quốc khoảng 30 đến 60 triệu VNĐ/kg Giá

1 cây Thạch Hộc tươi 3 tuổi có giá 25.000 VNĐ – 35.000 VNĐ, 1 ha trồng 1 triệu cây thạch hộc, có thể thu được 25-30 tỷ trong 3 năm Ở thị trường Trung Quốc giá phong đấu Thạch Hộc cao cấp là 60 triệu đồng/kg [6]

2.2.3.5 Th ị trường cây Thạch Hộc Tía

Thạch Hộc Tía đã được sản xuất nhưng với quy mô rất nhỏ, không đáp ứng được nhu cầu của thị trường trong nước Hàng năm các công ty sản xuất dược phẩm nước ta phải nhập hoàn toàn nguyên liệu lan Thạch Hộc Tía từ Trung Quốc với giá thành không hề rẻ Bên cạnh đó một số lượng lớn lan Thạch Hộc Tía cũng được tư

thương đưa vào thị trường tự do nhưng không kiểm soát được chất lượng và nguồn gốc gây thiệt hại cho người tiêu dùng Do đó, nhu cầu của thị trường về lan Thạch

Hộc Tía là rất lớn

Việc trồng lan Thạch Hộc Tía có thể tiến hành ở các vùng sâu, vùng xa Chi phí đầu tư ban đầu không lớn, rủi ro ít mang lại hiệu quả sản xuất khá cao (khoảng 30%), người dân có thể tận dụng lao động lúc nông nhàn, kể cả người già, trẻ em cùng tham gia Cây Thạch Hộc Tía sinh trưởng nhanh, thân to mập, sau trồng 1,5 đến 2 năm có khả năng cho thu hái sản phẩm đạt năng xuất cao và chất lượng tốt Trên thị trường, thân cây tươi lan Thạch Hộc thiết bì có giá bán khoảng 3 triệu đồng/kg và giá bán 1 cây Thạch Hộc Tía tươi 3 tuổi có giá 25.000 VNĐ – 35.000 VNĐ, 1 ha trồng trên 500.000 cây Thạch Hộc thiết bì có thể thu được 15 tỷ đồng/3 năm [6]

2.3 Nhân gi ống lan Thạch Hộc Tía

2.3.1 Phương pháp nhân giống hữu tính

Cơ chế sinh sản hữu tính của lan Thạch Hộc cũng giống như một số loài cây khác, bao gồm: Quá trình hình thành giao tử và thụ tinh khi hạt phấn chín tiếp xúc

với núm nhụy nhờ côn trùng hay con người Núm nhụy tiết ra các hoocmon sinh trưởng nhờ vậy mà hạt phấn có thể nảy mầm được Sau đó, hạt phấn này theo trục hợp nhụy xuống bầu noãn để tinh tử kết hợp với tế bào trứng tạo nên hợp tử Bầu noãn lớn dần lên, cánh hoa và đài hoa héo đi, quả dần dần được lớn từ bầu noãn trương phồng [2]

2.3.2 Phương pháp nhân giống vô tính

Nhân giống vô tính là quá trình nuôi cấy thực vật trong các điều kiện tự nhiên Bao gồm các phương pháp sau:

+ Phương pháp cơ học (chiết ngọn, xiết ngọn)

Khi cây đạt đến một kích thước mong muốn, ta sẽ cắt phần ngọn có rễ đem trồng vào chậu mới Khi cắt, dụng cụ phải được khử trùng bằng nhiệt, sau đó bôi vadolin

có trộn zineb, sơn hoặc vôi vào vết cắt để tránh nhiễm trùng và cuối cùng thay chậu cho cây

+ Phương pháp kích thích tố

Một số loại kích thích tố được dùng có hiệu quả rõ rệt và nhanh chóng tới sự

mọc chồi các loài lan Có thể phun 2 lần cách nhau 5 ngày để có kết quả chắc chắn Chất được dùng thuộc nhóm cytokinin (BAP, Kinetin) với hàm lượng 5ppm

+ Phương pháp tạo cây con trên phát hoa

Sau khi cây lan trổ hoa, cắt bỏ phần ngọn phát hoa chỉ để lại 4 mắt phía gốc rồi bôi Ianilin có bổ sung thêm acid cinnamic 50mg/ml + BAP 5mg/ml Sau 4-8 tuần, cây con sẽ mọc ở vị trí mắt và rễ được tạo ra khi cây con lớn dần Lúc này có thể cắt phát hoa và đem trồng cây con trong chậu

Về mặt lý luận sinh học cơ bản: đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu

sắc về bản chất của sự sống Thực tế đã cho phép chúng ta tách và nuôi cấy trước hết

là mô phân sinh (meristem) rồi từ đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hoá gọi là mô sẹo (callus) và từ mô sẹo thì có thể kích thích tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh

Về mặt thực tiễn sản xuất: Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để phục tráng và nhân nhanh các giống cây trồng quý, có giá trị kinh tế cao Ngoài ra, bằng phương pháp này chỉ sau thời gian ngắn chúng ta có thể tạo được sinh khối lớn có hoạt chất sinh học được tạo ra vẫn giữ nguyên được hoạt tính của mình

2.4 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.4.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật

Gottlieb Haberlandt (1902) nhà thực vật học người Đức là người đầu tiên khởi xướng ý tưởng nuôi cấy mô – tế bào thực vật Ông đưa giả thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách “Thực nghiệm về nuôi cấy tế bào tách rời” Theo ông, mỗi tế bất kì của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một

cơ thể hoàn chỉnh [21] Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hoá đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó Khi gặp điều kiện thuận lợi, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Đó là tính toàn năng của tế bào và là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.4.2 Sự phân hoá tế bào

Sự sinh trưởng của tế bào gồm hai giai đoạn: Giai đoạn phân chia tế bào và giai đoạn dãn của tế bào Trong hai giai đoạn này tế bào chưa có những đặc trưng riêng

về cấu trúc và chức năng [21]

Sau đó, các tế bào bắt đầu phân hoá thành các mô chuyên hoá để đảm nhận các chức năng khác nhau, các tế bào trong giai đoạn này có đặc trưng riêng về cấu trúc và chức năng [21]

Có thể nói rằng sự phân hoá tế bào là sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hoá [21]

2.4.3 Sự phản phân hoá tế bào

Sự phản phân hoá tế bào là quá trình ngược lại với sự phân hoá tế bào Các tế bào đã phân hoá trong các mô chức năng không mất đi khả năng phân chia của mình, trong những điều kiện thích hợp, chúng có thể quay lại đóng vai trò như các mô phân sinh và có khả năng phân chia để tạo ra các tế bào mới [21]

2.4.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.4.4.1 Vật liệu nuôi cấy

Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực vật Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô – tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan hay bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá ), các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ lá mầm ), các cơ quan dự trữ (củ, thân, rễ…)

Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau, trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vì vậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi của mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu, mục đích và khả năng nuôi cấy

Mẫu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng Phương pháp phổ biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hoá chất có khả năng tiêu diệt

vi sinh vật Hoá chất được lựa chọn để vô trùng mẫu phải đảm bảo 2 điều kiện: Có khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối với mẫu Hiệu quả vô trùng

tuỳ thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâm nhập để tiêu diệt vi sinh vật của hoá chất Một số hoá chất thường được sử dụng hiện nay để vô trùng mẫu là: Ca(OCl)2-hypoclorit canxi, NaClO-hypoclorit natri, oxy già, HgCl2- thuỷ ngân clorua, chất kháng sinh(gentamicin, ampixilin )

2.4.4.2 Điều kiện nuôi cấy

- Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô – tế bào thực vật, các thao tác với mẫu cấy được tiến hành trong điều kiện vô trùng gồm buồng cấy vô trùng, các dụng cụ cấy vô trùng và môi trường cấy vô trùng nhằm đảm bảo mẫu cấy sẽ không bị nhiễm

vi sinh vật Để tạo điều kiện vô trùng, buồng cấy phải dùng đèn tử ngoại chiếu trong

30 phút sau đó được lau sạch bằng cồn 90°, dụng cụ và môi trường nuôi cấy thường được khử trùng ở 121°C trong 25-30 phút

- Ánh sáng và nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng ổn định về ánh sáng và nhiệt độ

2.4.5 Môi trường dinh dưỡng

Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài, bộ phận, các giai đoạn phát triển, phân hoá khác nhau của mẫu cấy và mục đích nuôi cấy như duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hoặc tái sinh cây hoàn chỉnh [23] Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật bao gồm các thành phần chính sau:

2.4.5.1 Nguồn Cacbon

Mô cấy trong môi trường nuôi cấy in vitro không cón khả năng tự dưỡng do

không tiến hành quang hợp đầy đủ Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc Nguồn Cacbon cung cấp cho môi trường nuôi cấy thường là các loại đường, phổ biến nhất là saccharose với hàm lượng từ 20-30g/l Ngoài ra còn có thể sử dụng các loại đường khác như fructose, rafinose, sorbitol, glucose, maltose, lactose…những loại đường này chỉ dùng trong những trường hợp cá biệt

2.4.5.2 Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng

Các chất vô cơ bao gồm thành phần khoáng đa lượng và khoáng vi lượng có trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật được sử dụng như là thành phần cơ bản để tổng hợp chất hữu cơ [23] Các dạng ion của muối khoáng đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển xuyên màng, điều hoà áp suất thẩm thấu và điện thế màng

- Nguyên tố đa lượng:

Quan trọng nhất là các nguyên tố: N, P, K, Mg, Ca, Na, S [12]

Nitơ: Thường được sử dụng ở dạng NO3- hoặc NH4+, hầu hết các loại thực vật sẽ sử dụng nguồn nitơ này để đồng hoá và tổng hớp nên các sản phẩm hữu cơ

Phospho: Nhu cầu phospho của mô và tế bào nuôi cấy là rất cao, P có tác dụng như hệ thống đệm giúp ổn định pH môi trường

Kali: Thường dùng ở dạng KNO3, KH2PO4, KCl.6H2O

Canxi: Sử dụng chủ yếu là CaNO3.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O

Magie: Sử dụng chủ yếu là MgSO4

Lưu huỳnh: Chủ yếu là SO4

- Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni các nguyên tố vi

lượng bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường nhưng có vai trò quan trọng đối với quá trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bào của mô, tế bào nuôi cấy [12]

2.4.5.3 Vitamin

Hầu hết các tế bào nuôi cấy có khả năng tổng hợp vitamin nhưng không đủ về

lượng nên cần bổ sung, nhất là nhóm vitamin B [12]

- Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môi trường nuôi cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp amino acid [12]

- Vitamin B6 (Pyridocinen): Là coenzzyme quan trọng trong nhiều phản ứng trao đổi chất [12]

- Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp [12

- Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào, tham gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi hyđratcacbon [12]

2.4.5.4 Các chất hữu cơ tự nhiên

- Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid, đường, các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin

- Dịch thuỷ phân casein: Chứa nhiều amino acid

- Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B

- Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, khoai tây, nước ép chuối xanh…

2.4.5.5 Các thành phần khác

- Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần của agar gồm một số chất hữu cơ như acid hữu cơ, acid béo, cùng một số nguyên tố vô cơ như Cu, Fe, Zn Ngoài tác dụng tạo gel cho môi trường, agar cũng cung cấp một số chất dinh dưỡng cho tế bào,

mô nuôi cấy [12]

- Than hoạt tính: Dùng để hấp thụ chất màu, các hợp chất thứ cấp gây ức chế sinh trưởng của mẫu nuôi cấy Ngoài ra, có thể sử dụng một số chất chống oxy hoá khác như polyvinyl pyrolodon (PVP), acid ascorbic [12]

2.4.5.6 pH của môi trường

Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận chất dinh dưỡng của mẫu từ môi trường nuôi cấy Đa số pH của môi trường được điều chỉnh trong khoảng

từ 5,5-6,0 Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm do mẫu nuôi cấy

sản sinh ra các acid hữu cơ

2.4.5.7 Các chất điều hoà sinh trưởng

Các chất điều hoà sinh trưởng được chia thành 2 nhóm đó là: Nhóm chất kích thích sinh trưởng và nhóm chất ức chế sinh trưởng Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường được sử dụng

- Nhóm Auxin: Auxin có nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và phát triển trên cơ thể thực vật Cụ thể như sau: Auxin có ảnh hưởng tới tính hướng động của thực vật, tiêu biểu là tính hướng sáng và hướng đất Auxin gây ra hiện tượng ưu thế đỉnh (sự sinh trưởng của chồi đỉnh sẽ ức chế chồi nách) Auxin khởi động việc hình thành rễ bên và rễ phụ Ngoài ra, auxin còn tác động đến việc hình thành chồi hoa, sự phát triển của quả và làm chậm sự rụng lá [8]

- Nhóm Cytokinin: Cytokinin kích thích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đỏi chất Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi bên và ức chế ưu thế đỉnh Quá trình sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của cytokinin Ngoài ra cytokinin còn làm chậm sự già hoá [8]

- Nhóm Gibberellin: Giberellin có tác dụng chính trong việc hoạt hoá phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng cây Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kich thước của chồi nuôi cấy [8]

2.5 Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu chất điều tiết sinh trưởng trong nhân

gi ống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật Hiệu quả của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ, hoạt tính của chất điều hoà sinh trưởng và yếu tố nội sinh của mẫu cấy

Dựa vào hoạt tính sinh lý có thể phân chất điều hoà sinh trưởng làm 2 nhóm: Nhóm chất kích thích sinh trưởng và nhóm ức chế sinh trưởng Trong nuôi cấy

mô, tế bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường được sử dụng

- Nhóm Auxin: Được phát hiệ lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con trai là Francis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây yến mạch, Sau đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và dần mở rộng hiểu biết về nhóm chất này Auxin trong

cơ thể thực vật tập trung nhiều ở các chồi, lá non, hạt nảy mầm, trong phấn hoa Auxin có nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và phát triển trên cơ thể thực vật Cụ thể như sau: Auxin có ảnh hưởng tới tính hướng động của thực vật, tiêu biểu là tính hướng sáng và hướng đất Auxin gây ra hiện tượng ưu thế đỉnh (sự sinh trưởng của

chồi đỉnh sẽ ức chế chồi nách) Auxin khởi động việc hình thành rễ bên và rễ phụ do auxin kích thích sự phân chia của tế bào trụ bì – nơi rễ sẽ sinh trưởng xuyên qua vỏ biểu bì, Ngoài ra, auxin còn tác động đến việc hình thành chồi hoa, sự phát triển của quả và làm chậm sự rụng lá [8]

Các auxin thường được sử dụng là: NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân tạo), IAA (các auxin tự nhiên) Hoạt tính của các chất này được xếp theo thứ tự từ yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA, 2,4D IAA nhạy cảm với nhiệt độ và dễ phân huỷ trong quá trình hấp khử trùng do đó không ổn định trong môi trường nuôi cấy môi NAA và 2,4D không bị biến tính ở nhiệt độ cao Tuy nhiên chất 2,4D là chất dễ gây độc nhưng có tác dụng nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus [8]

- Nhóm Cytokinin: Được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX, chất đầu tiên là Kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích Tiếp đó, đến zeatin tách từ nội nhũ của hạt ngô non Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo silic, rêu, dương xỉ, cây lá kim Zeain có nhiều trong thực vật bậc cao và trong một số vi khuẩn Trong thục vật, cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang lớn, mô phân sinh Cytokinin kích thích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đỏi chất Cùng với auxin, cytokinin điều khiển sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích tạo rễ, ngược lại sẽ hình thành chồi Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi bên và ức chế ưu thế đỉnh Quá trình sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của cytokinin Ngoài ra cytokinin còn làm chậm sự già hoá [8]

Trong các chất thuộc nhóm cytokinin thì Kinetin và BAP được sử dụng phổ biến vì hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp cùng auxin vơi tỷ lệ thích hợp có khả năng kích thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền nhiệt), ngoài ra có thể sử dụng TDZ, Diphenylurea

- Nhóm Gibberellin: Được tách chiết lần đầu từ dịch tiết của nâm bởi các nhà khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938 Giberellin được tổng hợp trong các

mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển Giberellin có tác dụng chính trong việc hoạt hoá phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng cây Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kich thước của chồi nuôi cấy GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất [8]

2.6 Công ngh ệ sinh khối tế bào thực vật

2.6.1 M ột số khái niệm cơ bản

Sinh khối tế bào thực vật là kỹ thuật nuôi cấy và tạo khối lượng lớn tế bào thực vật trong môi trường dinh dưỡng phù hợp và điều kiện nuôi cấy vô khuẩn mà không cần thâm canh gieo trồng Các tế bào khi nuôi cấy vẫn giữ nguyên được các đặc tính

vốn có ban đầu, đặc biệt là các hoạt chất hay các chất chuyển hóa thứ cấp sinh ra từ các tế bào gần như được giữ nguyên [13] Nguyên tắc của công nghệ sinh khối dựa trên cơ sở tính toàn năng (totipotent) và tính biệt hóa của một số tế bào thực vật Khi được đưa vào môi trường dinh dưỡng và điều kiện thích hợp, các tế bào thực vật có thể phát triển thành một cơ quan, một cây hoàn chỉnh hoặc một khối lượng lớn dòng tế bào đó Dựa trên cơ sở đó, công nghệ nuôi cấy mô thực vật có thể tạo ra cây từ đỉnh sinh trưởng được tách ra Sau đó, cây được nhân nhanh tạo ra nhiều mầm cây con, từ đó có thể kích thích tạo rễ và phát triển thành cây hoàn chỉnh Người ta nuôi cấy tạo mô sẹo (callus) từ một mô bất kì của cây Sau đó, biệt hóa thành mô sinh trưởng, tạo mầm, tạo rễ và cuối cùng cũng phát triển thành một cây mới hoàn chỉnh [15] Khác với nuôi cấy mô, công nghệ sinh khối tế bào thực vật không nuôi cấy tạo

ra cây hoàn chỉnh mà chỉ nuôi các tế bào để tạo ra sinh khối và có thể sử dụng cho chiết tách các hoạt chất sinh học Quá trình này cũng bắt đầu từ việc tạo ra callus từ những mô khác nhau của thực vật Sau đó, chúng được làm mất tính biệt hóa và được thuần hóa trong môi trường dinh dưỡng thích hợp Cuối cùng là tăng khối lượng trên hệ thống bình nuôi cấy (bioreactor) Trong quá trình tạo sinh khối tế bào thực vật, đặc tính của tế bào được giữ nguyên như ban đầu Các quá trình sinh học của tế bào vẫn xảy ra như đối với tế bào khi còn tồn tại trong cây tự nhiên, trong đó có việc tổng hợp và tích lũy hoạt chất [28]

2.6.2 Ưu điểm của công nghệ sinh khối tế bào thực vật

Công nghệ sinh khối tế bào thực vật không chịu tác động của các yếu tố tự nhiên như địa lý, khí hậu, thổ nhưỡng, bệnh dịch, thiên tai do toàn bộ quy trình tạo sinh khối được tiến hành trong phòng thí nghiệm hoặc nhà máy Điều này giúp khắc phục được ảnh hưởng bất lợi của điều kiện tự nhiên tới năng suất, chất lượng sản phẩm và loại bỏ được yếu tố thời vụ như khi gieo trồng nên giúp chủ động được nguồn nguyên liệu phục vụ sản xuất [12] Thời gian sản xuất nguyên liệu theo công nghệ sinh khối tế bào rút ngắn hơn nhiều so với gieo trồng tự nhiên Giai đoạn nghiên cứu từ khi tiến hành tạo callus (giai đoạn đầu tiên của quy trình) đến việc nuôi cấy trong môi trường lỏng phải mất khá nhiều thời gian Tuy nhiên, sau khi đã lựa chọn được điều kiện,

môi trường nuôi cấy thì thời gian cho sản xuất một mẻ sinh khối thường khoảng từ

15 - 50 ngày Như vậy, thời gian đã rút ngắn rất nhiều so với trồng cây ngoài tự nhiên nên chủ động được nguồn nguyên liệu phục vụ sản xuất Theo Guilk và cs (2006) trong nghiên cứu xây dựng quy trình tạo sinh khối dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.Don.) sản xuất alcaloid nhân indole, thời gian cho 1 mẻ nuôi cấy sản phẩm là 20 ngày [28] Trong khi sản xuất sinh khối thông đỏ Châu Âu (Taxus baccata) cần thời gian thích hợp cho 1 chu kỳ nuôi cấy trong môi trường lỏng là 28 ngày [31] Chất lượng của sản phẩm sản xuất theo công nghệ sinh khối tế bào thực vật rất ổn định Vì các yếu tố nhiệt độ, pH, nồng độ oxy hòa tan, thành phần môi trường, cường độ ánh sáng đều được kiểm soát chặt chẽ đảm bảo cho tế bào phát triển tốt, hàm lượng hoạt chất ổn định Do đó, sản phẩm thu được có chất lượng ổn định đáp ứng được yêu cầu sản xuất theo tiêu chuẩn GMP [14], [29] Trong quá trình tạo sinh khối tế bào thực vật, có thể điều khiển quá trình sinh tổng hợp để các hoạt chất có hàm lượng cao hơn

so với nuôi trồng ngoài tự nhiên Khosroushahi [31] khi nuôi cấy tế bào thông đỏ đã tối ưu điều kiện và môi trường nuôi cấy Kết quả hàm lượng paclitaxel đã cải thiện rất nhiều so với ban đầu Đối với các dược liệu quý hiếm sản xuất theo công nghệ này thì giá thành sản xuất sẽ thấp hơn Vì trong thời gian ngắn có thể tạo ra một khối lượng lớn sản phẩm trong khi chi phí cho nuôi cấy thấp [13], [29]

2.6.3 Nh ững khó khăn khi triển khai công nghệ sinh khối tế bào thực vật

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào, đó là thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, ánh sáng, nồng độ oxy hòa tan, pH môi trường và đặc điểm cấu tạo của hệ thống bình nuôi cấy) Chi phí đầu tư dây truyền sản xuất tốn kém do đặc thù của nuôi cấy tế bào thực vật khác với nuôi cấy nấm và vi khuẩn nên hệ thống các bình nuôi cấy (bioreactor) cần phải thiết kế riêng cho phù hợp với từng loại tế bào [30] Hàm lượng các hoạt chất trong sinh khối tế bào còn thấp, đặc biệt là với các tế bào có nhiều nhóm hoạt chất cùng tồn tại thì việc kích thích tăng riêng rẽ hàm lượng từng nhóm chất rất khó khăn [37] Những khó khăn trên đang được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu khắc phục

2.7 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Thạch Hộc Tía

Thông thường Dendrobium officinale Kimura et Migo có thể được nhân giống

bằng gieo trồng hạt hay tách cây con đã trưởng thành ra khỏi cây mẹ Tuy nhiên, các phương pháp này cho hiệu quả nhân giống thấp nên không đáp ứng nhu cầu của thị trường Vì vậy, phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật cho phép tạo ra một lượng lớn cây con trong thời gian ngắn đã trở thành một giả pháp lý tưởng để đáp ứng nhu cầu của thị trường

Năm 1999, Mai Thị Tâm và cs nghiên cứu trên giống lan Dendrobium E.R Đối tượng nghiên cứu là chồi và quả của giống Dendrobium E.R, tạo ra nguồn vật liệu

khởi đầu là protocorm Môi trường cơ bản là VW có cải tiến với 1% sacarose, 15% nước dừa và các hàm lượng khác nhau của BA Kết quả cuối cùng tìm ra được các môi trường thích hợp cho quá trình tạo nguồn vật liệu khởi đầu, quá trình nhân nhanh tạo cây hoàn chỉnh [15]

Theo Hoàng Thị Nga và cs (2008) [17], xây dựng quy trình nhân nhanh giống

địa lan Hồng Hoàng (Cymbidium iridioides) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào đã cho

kết quả các chồi non có kích thước từ 4-6cm hoặc hạt được sử dụng làm mẫu cấy, môi trường để khởi động mẫu cấy là: MS + saccarose 20g/l + agar 0,65g + BA 1,5ppm (hoặc 2 ppm Kinitine/l), để gieo hạt là: MS + sacarose 10g/l + pepton 1g + than hoạt tính 1g/l + agar 6,5g/l Môi trường thích hợp để nuôi cấy lát mỏng đã xác định là: MS + 1 ppm K + sacarose 20g/l + Kinitine 1 ppm (hoặc BA 0,5 ppm) + agar 6,5g/l Nghiên cứu đã xác định được môi trường tối thích để tạo cây hoàn chỉnh là MS + than hoạt tính 0,1g/l+ sacarose 25g/l

Năm 2013, Vũ Ngọc Lan và cs, nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan bản địa

Dendrobium nobile Lindl (Thạch hộc) nhằm bảo tồn và phát triển loài lan quý thuộc

chi Hoàng thảo, có giá trị thẩm mỹ dược liệu cao, đang có nguy cơ tuyệt chủng Kết

quả cho thấy nguyên liệu sử dụng thích hợp là quả lan 5 tháng tuổi, môi trường gieo hạt là MS + ND 100 ml + saccarose 10 g/l + agar 6,0 g/l môi trường Trong nhân in vitro, môi trường nhân nhanh protocom tối ưu là KC + ND 100 ml + sacarose 10 g/l + agar 6,0 g/l môi trường; nhân nhanh cụm chồi tốt nhất là MS + ND 100ml/l + sacarose 10 g/l +

agar 6,0 g/l môi trường Môi trường tối ưu tạo cây hoàn chỉnh là RE + sacarose 10g/l + THT 0,6 g/l, cường độ chiếu sáng 2300 lux [11]

Nguyễn Thị Sơn và cs (2014) [10], đã nghiên cứu và nhân giống in-vitro Lan

kết quả sau:

Kết quả nhân giống bằng gieo hạt Nguyễn Thị Sơn và cs đã nghiên cứu và đưa

ra kết luận rằng môi trường W + 10g sucrose/lít môi trường + 6g agar/lít môi trường

+ 10% ND là môi trường thích hợp nhất cho sự nảy mầm của hạt lan D officinale Kimuraet Migo

Kết quả nhân giống bằng phương pháp nhân nhanh cụm chồi qua nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh cụm chồi các tác giả đã đưa ra môi trường nuôi cấy được lựa chọn trong nhân nhanh cụm chồi Lan D

agar/lít môi trường

Theo Trịnh Thị Thúy An và Đtg (2017) đã nghiên cứu môi trường cơ bản MS + sucrose 30 g/l + agar 9 g/l + nước dừa 100 ml/l và bổ sung BAP 0,25 mg/l thích hợp cho khả năng tạo protocorm và phát sinh chồi của lan Thạch Hộc Tía Môi trường

cơ bản MS + sucrose 30 g/l + agar 9 g/l + nước dừa 100 ml/l và bổ sung NAA 0,9 mg/l thích hợp cho khả năng tạo rễ của lan Thạch Hộc Tía [1]

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng, hoá chất và thiết bị nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Giống lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) được thu thập từ rừng tự nhiên của tỉnh Cao Bằng

- Vật liệu: Chồi lan Thạch Hộc Tía được tái sinh từ hạt

3.1.2 Hoá chất sử dụng

- Môi trường MS

- Các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy gồm: Đường sucrose, agar

- Một số chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm Auxin (NAA), nhóm Cytokinin (BAP, Kinetin ) và nhóm Gibberellin (GA3)

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

B ảng 3.1 Thiết bị,dụng cụ nghiên cứu

Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của Phòng Công nghệ Tế bào, Viện Khoa học Sự sống

3.2 Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.2.1 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu được tiến hành với một số một số chất điều tiết sinh trưởng sinh trưởng (BAP, Kinetin, NAA, GA3) nhằm xác định ảnh hưởng của chúng đến khả năng

sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía

3.2.2 Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào của Viện Khoa học Sự sống

3.2.2 Thời gian nghiên cứu

- Thời gian: từ 2/2020– 7/2020

3.3 Nội dung nghiên cứu

3.3.1 N ội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số loại Cytokinin đến quá

trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến quá trình sinh trưởng và tích

lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với Kinetin đến quá trình

sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

3.3.2 N ội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp Cytokinin và Auxin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với NAA đến quá trình sinh

trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin kết hợp với NAA đến quá trình

sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin (khi sử dụng phối hợp) kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

3.3.3 N ội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp Cytokinin và Gibberellin

(GA3) đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với GA3 đến quá trình sinh

trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin kết hợp với GA3 đến quá trình

sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin (khi sử dụng phối hợp) kết hợp với GA3 đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro

Sử dụng các môi trường Murashige and Skoog, 1962 (MS) có bổ sung 30g/l Sucarose + 5g/l agar, các chất BAP, Kinetin, NAA, GA3 (mg/l) có hàm lượng thay đổi tùy theo từng thí nghiệm, pH=5,6-5,8

Môi trường nền = MS + 30g/l Sucarose + 5g/l agar

Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng bổ sung vào môi trường (MT) nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tùy từng thí nghiệm

Bình tam giác, dung tích 250ml

Thể tích MT nuôi cấy trong mỗi bình nuôi cấy là 75 ml/bình Môi trường được

hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1atm trong 15 phút

3.4.2 Phương pháp nghiên cứu

Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía 3.4.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm