nghiên cứu ảnh hưởng của liều chiếu xạ tia gamma (co60) đến tần suất xuất hiện biến dị khi chiếu xạ callus hạt của một số dòng lúa chịu mặn

Một hướng mới trong công tác chọn tạo giống mới đó là sự kết hợp giữa nuôi cấy in vitro và xử lý đột biến bằng phóng xạ, cùng với sự giúp đỡ của các chỉ thị phân tử việc chọn lọc các dò

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VN

-* -

TRẦN HUY DŨNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA LIỀU CHIẾU XẠ

BIẾN DỊ KHI CHIẾU XẠ CALLUS HẠT CỦA

MỘT SỐ DÒNG LÚA CHỊU MẶN

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI, 2015

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VN

- - - *- - -

TRẦN HUY DŨNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA LIỀU CHIẾU XẠ TIA GAMMA

CALLUS HẠT CỦA MỘT SỐ DÒNG LÚA CHỊU MẶN

Chuyên ngành: Khoa học cây trồng

Mã số: 60.62.01.10

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS VÕ THỊ MINH TUYỂN

HÀ NỘI, 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa từng sử dụng cho bảo vệ một học vị nào khác

Mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn đều đã được cảm ơn và các thông tin đều được chú thích một cách cụ thể rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 30 tháng 12 năm 2015

Tác giả luận văn

Trần Huy Dũng

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, để hoàn thành được luận văn thạc sĩ này, ngoài sự nỗ lực phấn đấu của bản thân, tôi đã nhận được nhiều sự giúp

đỡ quý báu của các thầy cô giáo, cá nhân, tập thể, bạn bè và gia đình

Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Võ Thị Minh Tuyển, người đã tận tình giúp đỡ, trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp,

Bộ môn Đột biến và Ưu thế lai đã cho phép, tạo điều kiện cho tôi tham gia học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn Thạc sĩ này Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè đồng nghiệp đã cung cấp những vật liệu cần thiết và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy giáo, cô giáo và tập thể cán bộ Ban đào tạo sau đại học - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình dạy bảo và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Cuối cùng là lòng biết ơn những người thân trong gia đình, bạn bè đã động viên, khích lệ tôi, giúp đỡ công sức trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 30 tháng 12 năm 2015

Tác giả luận văn

Trần Huy Dũng

MỤC LỤC

Trang phụ bìa i

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục các chữ viết tắt viii

Danh mục các bảng ix

Danh mục hình vẽ, đồ thị x

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 2

2.1 Mục tiêu 2

2.2 Yêu cầu 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 3

4.1 Đối tượng nghiên cứu 3

4.2 Phạm vi nghiên cứu 3

4.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Khái quát về chi Oryza và vị trí cây lúa trồng trong chi Oryza 4

1.2 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 5

1.2.1 Định nghĩa 5

1.2.2 Cơ sở sinh học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 6

1.2.2.1 Tính toàn năng của tế bào 6

1.2.2.2 Sự phản phân hoá và phân hoá của tế bào 6

1.2.3 Lịch sử phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 8

1.3 Tác nhân phóng xạ gây đột biến 10

1.3.1 Phân loại 10

1.3.2 Ảnh hưởng của tia gamma (Co 60 ) lên vật chất di truyền 11

1.3.2.1 Tác động của tia gamma lên vật chất di truyền ở cấp độ phân tử 11

1.3.2.2 Tác động của tia gamma (Co 60 ) lên vật chất di truyền ở cấp độ tế bào 12

1.3.2.3 Tác dụng của tia phóng xạ đối với thực vật 13

1.3.3 Lược sử nghiên cứu hiệu quả gây đột biến của tia gamma khi xử lý callus 15

1.3.4 Một số thành tựu về chọn giống lúa bằng đột biến thực nghiệm trên thế giới và ở Việt Nam 16

1.4 Chỉ thị phân tử và ứng dụng trong chọn tạo giống cây trồng 20

1.4.1 Chỉ thị phân tử 20

1.4.2 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng 21

1.4.2.1 Phân tích đa dạng di truyền 21

1.4.2.2 Tìm chỉ thị phân tử liên kết gen và lập bản đồ gen 22

1.4.2.3 Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (Marker-Assisted Selection - MAS) 23 1.5 Tổng quan về chọn tạo giống lúa chịu mặn 26

1.5.1 Tính chống chịu mặn của cây lúa 26

1.5.2 Một số kết quả và thành tựu trong chọn tạo giống lúa chịu mặn trên thế

giới và trong nước 27

1.5.2.1 Kết quả và thành tựu trong chọn tạo giống lúa chịu mặn trên thế giới 27

1.5.2.2 Kết quả và thành tựu trong chọn tạo giống lúa chống chịu mặn ở Việt Nam 29

Chương 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Vật liệu nghiên cứu 32

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 32

2.3 Phương pháp phân tích số liệu 39

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Kết quả tạo callus chiếu xạ và tái sinh cây xanh từ callus chiếu xạ 41

3.1.1 Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ mẫu nhiễm 41

3.1.2 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ tạo callus 43

3.1.3 Kết quả tạo callus hạt và tái sinh cây xanh từ callus chiếu xạ 45

3.2 Nghiên cứu xác định liều lượng chiếu xạ phù hợp khi chiếu xạ callus 46

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến chất lượng callus 46

3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến tỷ lệ tái sinh cây xanh 48

3.2.3 Ảnh hưởng của liều chiếu xạ tia Gamma (Co 60 ) đến tần suất xuất hiện một số biến dị ở cây xanh tái sinh 50

3.3 Kết quả chọn lọc dòng đột biến chịu mặn bằng chỉ thị phân tử và thành lọc mặn nhân tạo 54

3.3.1 Kết quả chọn lọc các dòng mang gen chịu mặn saltol bằng chỉ thị phân tử 54

3.3.2 Kết quả thanh lọc mặn nhân tạo của các dòng lúa thu được từ callus

chiếu xạ 57

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 67

1 Kết luận 67

2 Đề nghị 67

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

2,4D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid

NAA 1-naphthaleneacetic acid

BAP 6-benzylaminopurine

PCR Polymerase Chain Reaction

QTL Quantitative Trait Loci (Tính trạng số lượng)

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

(Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) IRRI International Rice Resarch Institute

(Viện Nghiên cứu Lúa Quốc Tế)

ĐBSCL Đồng bằng Sông Cửu Long

NSLT Năng suất lý thuyết

1.1 Phân tích QTL theo phương pháp cách quãng (interval)

đối với tính trạng hấp thu K, Na và tỉ số Na/Ka ở chồi thân

28

3.1 Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ mẫu nhiễm 41 3.2 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ tạo callus 44 3.3 Kết quả tạo callus hạt và tái sinh cây xanh từ callus chiếu xạ 46 3.4 Tỷ lệ sống sót của callus sau 2 tuần chiếu xạ 47 3.5 Tỷ lệ cây xanh tái sinh ở các liều chiếu xạ khác nhau 49 3.6 Tần suất xuất hiện một số biến dị ở cây xanh tái sinh 51 3.7 Kết quả chọn lọc gen Saltol trên 12 cây xanh hữu dục 56 3.8 Kết quả đánh giá mặn nhân tạo các dòng đột biến 58 3.9 Một số đặc tính nông sinh học chính của các dòng lúa đột biến

(vụ Mùa 2015)

59

3.10 Một số sâu bệnh hại chính (vụ Mùa 2015) 62

3.11 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất lý thuyết của

các dòng lúa đột biến (vụ Mùa 2015)

64

1.2 Bản đồ QTL của những tính trạng mục tiêu liên quan đến hiện

tượng chống chịu mặn trên quần thể F8 (RIL) của tổ hợp lai

Tenasai 2/CB

31

3.1 Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ mẫu nhiễm 42 3.2 Số callus sống sót sau 10 ngày ở các liều chiếu xạ khác nhau 48 3.3 Số chồi và số cây xanh tái sinh ở các liều chiếu xạ 49 3.4 Biến dị dạng đơn thân (không đẻ nhánh) 52

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Lúa gạo là nguồn lương thực chính của khoảng 50% dân số thế giới Hơn 90% lúa trồng được phân bố ở Châu Á Trong những năm gần đây Việt Nam đã đạt được những thành tựu to lớn trong sản xuất lúa gạo, luôn là một trong những nước có tỷ trọng xuất khẩu gạo đứng hàng đầu thế giới Kết quả xuất khẩu gạo trong năm 2013 đạt 6,61 triệu tấn, trị giá đạt 2,95 tỷ USD (Tổng cục Thống kê, 2013)[31] Đạt được những thành tựu đó có sự góp phần rất lớn của khoa học công nghệ, đặc biệt là trong công tác chọn tạo giống mới

Việc sử dụng các phương pháp truyền thống để chọn tạo giống lúa mới tốn rất nhiều thời gian, có thể từ 8 đến 10 năm Chi phí cho việc chọn tạo giống mới cũng rất tốn kém Một hướng mới trong công tác chọn tạo

giống mới đó là sự kết hợp giữa nuôi cấy in vitro và xử lý đột biến bằng

phóng xạ, cùng với sự giúp đỡ của các chỉ thị phân tử việc chọn lọc các dòng đột biến có lợi được tiến hành dễ dàng và chính xác hơn

Gây đột biến thực nghiệm là một trong những phương pháp được áp dụng rộng rãi trên Thế giới và ở Việt Nam, cung cấp nguồn nguyên liệu đa dạng và phong phú cho quá trình chọn tạo giống mới Đột biến nhân tạo tạo

ra nguồn vật liệu khởi đầu phong phú, tạo được nhiều biến dị có ích như tăng tính chịu rét, chịu hạn, tính kháng bệnh, năng suất cao,… Ngoài ra, bằng phương pháp gây đột biến nhân tạo, các nhà chọn giống có thể thu được những dạng chưa hề có trong tự nhiên

Năng suất và sản lượng lúa luôn bị đe dọa bởi thiên tai, sâu bệnh và các yếu tố môi trường Trong đó, yếu tố đáng chú ý là hiện tượng đất nhiễm mặn Việt Nam với đường bờ biển dài 3.620 km trải dài từ Bắc vào Nam, hàng năm những vùng trồng lúa ven biển chịu ảnh hưởng rất nhiều

do sự xâm thực của biển Như vậy, đất nhiễm mặn là một trong những yếu

tố chính gây khó khăn cho chiến lược phát triển sản lượng lúa gạo, và ảnh hưởng xa hơn là mục tiêu đảm bảo an ninh lương thực sẽ khó hoàn thành

Để đáp ứng được yêu cầu này, việc chọn tạo các giống lúa chịu mặn là rất cần thiết

Từ cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên, nhằm đánh giá ảnh hưởng của phóng xạ tia gamma (nguồn Co60) khi chiếu xạ ở giai đoạn calus, chúng tôi

tiến hành đề tài "Nghiên cứu ảnh hưởng của liều chiếu xạ tia gamma

(nguồn Co 60 ) đến tần suất xuất hiện biến dị khi chiếu xạ callus hạt của một

số dòng lúa chịu mặn"

2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

2.1 Mục tiêu

- Xác định được liều chiếu xạ thích hợp cho hiệu quả tạo biến dị cao khi chiếu

xạ vào giai đoạn callus hạt lúa

- Tạo được nguồn vật liệu là các dòng lúa chịu mặn mang các biến dị mới

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Tạo được nguồn vật liệu mang các biến dị mới phục vụ cho công tác chọn

tạo giống lúa chịu mặn có năng suất cao và chất lượng tốt

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài

4.1 Đối tượng nghiên cứu:

- Dòng lúa thuần mang gen chịu mặn saltol do bộ môn Đột Biến và Ưu thế lai

chọn tạo: BT.3 (được chọn từ tổ hợp lai Bắc thơm 7/FL478)

4.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm thực hiện các thí nghiệm: Phòng nuôi cấy mô tế bào – Bộ môn Đột biến và Ưu thế lai, Viện Di truyền Nông nghiệp; Khu thí nghiệm xã Thượng Cát – Bắc Từ Liêm – Hà Nội

- Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 6 năm 2014 đến tháng 10 năm 2015

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát về chi Oryza và vị trí cây lúa trồng trong chi Oryza

Chi Oryza lần đầu tiên được Linne mô tả vào năm 1753 Ông chỉ phát hiện ra một loài là O sativa dựa trên các mẫu lúa trồng từ Ethiopia Qua hai thế kỷ sau đó, đã có hơn 100 loài thuộc chi Oryza được các tác giả khác nhau

công bố, điều này cho thấy đây là một chi rất phức tạp về mặt phân loại học

Chi Oryza L thuộc tộc Oryzeae, họ phụ Oryzoideae, họ hòa thảo Poaceae (Gramineae) Chi này gồm có: hai loài lúa trồng là O sativa L., O graberrima

Steud và 22 loài lúa dại phân bố khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới

Lúa trồng ở Châu Á (O sativa) là cây có ý nghĩa kinh tế quan trọng và

bậc nhất vì nó là cây lương thực của hơn một nửa dân số trên thế giới Tất cả

các loài lúa trong chi Oryza, bao gồm cả lúa dại và lúa trồng tạo nên một vốn

gen (genepool) cực kỳ có giá trị trong việc mở rộng nguồn di truyền trong các chương trình chọn tạo giống lúa

Hiện nay trên thế giới có hai loài lúa trồng: O sativa L và O glaberrima Steud Loài lúa O sativa L được trồng ở Châu Á nên được gọi là lúa trồng châu Á Loài O sativa L có hai thứ là O sativa var utitissima A Camus (lúa tẻ) và O sativa var glutinosa Tanka (lúa nếp) Loài lúa trồng châu Á O sativa L có nguồn gốc từ O perennis Moench (hay O rufipogon) Loài O glaberrima được thuần hóa ở châu Phi, được trồng ở Tây Phi, xuất hiện vào khoảng 1500 trước Công nguyên, có nguồn gốc từ O breviligulata

Chev Hai loài lúa trên được thuần hóa thành lúa trồng một cách độc lập với

nhau Năm 1930 Kato đã phân biệt trong loài O.sativa có hai loài phụ: O sativa ssp Indica Kato và O sativa ssp Japonica Kato Hai nhóm này khác

nhau về hình thái, phân bố địa lý, có hiện tượng khó khăn khi lai giữa hai nhóm cũng như tính bất thụ của con lai tùy theo các dạng bố mẹ đem lai Năm

1954, Morinaga lại xác định trong loài O sativa có trong nhóm thứ trong O sativa javanica, được tìm thấy ở Indonesia

Đến nay địa điểm xuất hiện của lúa trồng châu Á được cho là một vết dài từ chân phía Tây Nam và Đông Nam dãy núi Himalaya, qua Assam, tỉnh Yunnan của Trung Quốc, Burma, Lào, biên giới Thái Lan – Myanma và vùng Tây Bắc của Việt Nam Có thể có trung tâm xuất hiện sớm nhất của cây lúa trồng châu Á: trung tâm Assam, trung tâm biên giới Thái Lan – Myanma và trung tâm Tây Bắc Việt Nam Ý kiến này đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới về nguồn gốc vùng trồng lúa và cây lúa trồng tán thành

Địa điểm xuất hiện cây lúa trồng châu Phi đơn giản hơn nhiều Đó là vùng đồng bằng Mali, cùng một số nơi khác như vùng đất cao Guinec, đồng bằng ven biển Casamance, thượng lưu sông Niger, phần Tây Nam bờ biển Guinea

Hiện nay, lúa đang được trồng trong những điều kiện sinh thái và khí hậu rất khác nhau Có thể nói, hầu hết các vùng trồng lúa trên thế giới đều là địa bàn của cây lúa châu Á, kể cả ở châu Phi, dồn cây lúa thuần hóa ở lục địa

này (O glaberrima Steud) vào Tây Phi và chỉ chiếm một diện tích nhỏ ở

Guyana – Nam Mỹ Điều này đã cho thấy sự đa dạng rất lớn của nguồn gen cây lúa châu Á Đến năm 1995, viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI) đã có một ngân hàng gen lúa của khắp thế giới với hơn 81.000 mẫu giống, trong đó lúa châu Á có 76200 mẫu, lúa châu Phi có 3000 mẫu và lúa dại có 2400 mẫu

1.2 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.1 Định nghĩa

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng [11]

Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm:

- Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành

- Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh

- Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành

- Nuôi cấy mô sẹo (callus)

- Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào)

- Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trong tế bào thực vật tách vỏ, còn gọi là nuôi cấy tế bào trần

1.2.2 Cơ sở sinh học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.2.1 Tính toàn năng của tế bào

Haberlandt (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một

cá thể hoàn chỉnh Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng

rẽ đã phân hoá đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của

cả sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều phát triển thành

một cá thể hoàn chỉnh Đó là tính toàn năng của tế bào (totipotency)

Như vậy, tính toàn năng của tế bào thực vật là khả năng của các tế bào

đã được biệt hóa (trừ một số tế bào đã được biệt hóa sâu như ống mạch, mao dẫn) có khả năng thể hiện toàn bộ hệ thống di truyền và có thể trong điều kiện phù hợp sẽ phát triển theo chu trình giống như sự phát triển phôi dẫn đến sự hình thành cây hoàn chỉnh mới

1.2.2.2 Sự phản phân hoá và phân hoá của tế bào

Cơ thể thực vật trưởng thành là một nhóm chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào

khác nhau Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hoá) Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc biệt cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau

Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào

mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau Ví dụ: Mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô dự trữ làm nhiệm

vụ dự trữ, mô dẫn làm chức năng dẫn nước và dẫn dinh dưỡng

Quá trình phân hoá tế bào có thể biểu thị:

Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt

Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyên hóa, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là phản phân hoá tế bào, ngược lại với sự phân hoá tế bào

Phân hoá tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hoá

Phản phân hoá tế bào

Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá, ức chế các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ra tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra

theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi

tế bào khiến quá trình sinh trưởng và phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hoà

Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của từng khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hoá các gen của

tế bào

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin

1.2.3 Lịch sử phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm nhưng không thành công

Năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, một hoocmon thực vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào

Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá, mô sẹo có khả năng sinh trưởng liên tục

Năm 1955, Miller và cộng sự đã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin – một cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hoá chồi ở mô nuôi cấy

Đến năm 1957, Skoog và Miller đã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chất auxin : cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi) Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin (ví dụ: nồng độ IAA/ nồng độ kinetin) nhỏ hơn 1 và càng nhỏ, mô có xu hướng tạo chồi Ngược lại khi nồng độ IAA/ nồng độ kinetin lớn hơn 1 và càng lớn, mô có xu hướng tạo rễ Tỷ lệ nồng độ auxin và cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hoá cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh

Năm 1960, Morel đã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loại địa lan Cymbidium,

mở đầu công nghiệp vi nhân giống thực vật

Năm 1964, Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt

Năm 1971 Takebe và cộng sự đã tái sinh được cây từ tế bào trần mô thịt lá ở thuốc lá

Năm 1978, Melcher và cộng sự đã tạo được cây lai soma cà chua – thuốc lá bằng dung hợp tế bào trần

Năm 1979, Marton và cộng sự đã xây dựng được quy trình chuyển gen

vào tế bào trần bằng đồng nuôi cấy tế bào trần và Agrobacterium

Từ năm 1980 đến nay, hướng chuyển gen vào tế bào thông qua việc

nuôi cấy mô tế bào và vi khuẩn Agrobacterium được triển khai rộng rãi

1.3 Tác nhân phóng xạ gây đột biến

1.3.1 Phân loại

Dựa vào khả năng ion hóa vật chất bị nhiễm xạ, có thể chia tác nhân phóng xạ gây đột biến thành 2 nhóm:

* Nhóm phóng xạ ion hóa: Là loại phóng xạ gây phản ứng hóa phóng xạ, tạo

ra các cặp ion hóa trong môi trường mà chúng thâm nhập hoặc gây ra sự kích động phân tử Nhóm này được chia làm 2 nhóm phụ:

+ Nhóm bức xạ hạt: Nhóm bức xạ hạt được đặc trưng bởi khối lượng và điện

tích khác nhau Nhóm này gồm các hạt sơ cấp và dòng nguyên tử có vận tốc

không đổi (V = const)

Nhóm bức xạ hạt được chia làm 3 phân nhóm:

- Nhóm hạt mang điện tích: gồm điện tử (e) và positon sinh ra do phản ứng hạt nhân

- Nhóm hạt nặng mang điện: gồm proton, hạt α và các hạt khác

- Nhóm trung tử (nơtron): hạt không mang điện nên có thể thâm nhập vào mọi hạt nhân nguyên tử

+ Nhóm bức xạ sóng điện từ: nhóm này đặc trưng bởi vận tốc, độ dài bước

sóng và được biểu thị bằng công thức:

λ

C h

Nguồn xạ thường dùng để tạo tia gamma là Co60

* Nhóm phóng xạ không gây ion hóa:

Đại diện cho nhóm này là tia tử ngoại (λ= 10-7 – 10-5 A0) Khi xuyên qua các mô của cơ thể sinh vật, nó không gây ion hóa mà chỉ kích động phân tử, do sức xuyên thấu yếu nên nó thường được dùng để xử lý hạt phấn và bào tử

1.3.2 Ảnh hưởng của tia gamma (Co 60 ) lên vật chất di truyền

1.3.2.1 Tác động của tia gamma lên vật chất di truyền ở cấp độ phân tử

Theo Oganhexian (1969), tính đặc thù của sự phát sinh đột biến có liên quan đến đặc điểm của quá trình từ thời điểm bắt đầu xâm nhập của các tác nhân vào tế bào, vận động đến một thời điểm nào đó trên nhiễm sắc thể, rồi gây ra biến đổi cấu trúc phân tử của gen dẫn đến trở thành đột biến

Khi chiếu xạ bằng tia gamma vào dung dịch ADN sẽ gây ra những biến đổi chủ yếu như sau:

- Gây đứt đơn: đứt một mạch đơn của phân tử ADN, làm phân tử ADN biến dạng, tạo cuộn, giảm thể tích phân tử

- Gây đứt kép: phân tử ADN bị giảm chiều dài, giảm độ nhớt của dung dịch

- Tạo cầu giữa các phân tử: Làm tăng khối lượng phân tử, tăng độ nhớt, giảm

độ hòa tan và tạo các búi không tan

- Tạo các phân tử phân nhánh: do sự gắn một số đoạn của phân tử bị đứt vào phân tử khác còn nguyên vẹn

- Tạo liên kết protein-ADN: làm cho phân tử protein bị dính hay liên kết giữa bazơ pirimidin biến tính với các axit amin

- Phá hủy cấu trúc không gian của ADN (làm biến tính ADN)

- Gây hiện tượng nhị trùng phân Timin

- Phá hủy gốc dị vòng chứa nitơ

- Hydrat hóa các bazơ nitơ

- Gây ra hiện tượng hỗ biến: Tia gamma làm thay đổi vị trí của nguyên tử hidro, dẫn tới hình thành các gốc lactim hay imin, hậu quả là sự sao chép sai của ADN, tạo ADN đột biến ở các thế hệ sau

1.3.2.2 Tác động của tia gamma (Co 60 ) lên vật chất di truyền ở cấp độ tế bào

* Tác động của tia gamma (Co 60

) lên cấu trúc nhiễm sắc thể

Theo Xvenson, bức xạ ion hóa có thể gây nên sự phân đoạn của nhiễm sắc thể Có hai kiểu phân đoạn NST là:

sai hình NST Mức độ sai hình NST thể hiện bằng các kiểu cấu trúc lại NST tăng dần theo liều chiếu xạ

* Tác động của tia gamma (Co 60 ) lên quá trình phân chia tế bào

Trong quá trình nguyên phân, tia gamma có thể gây các hiệu quả sau:

- Làm kìm hãm hay tạm dừng quá trình nguyên phân bằng cách kéo dài một pha nào đó trong chu kỳ tế bào

- Làm dừng hoàn toàn quá trình nguyên phân nhưng không gây chết tế bào mà làm mất khả năng phân chia tế bào

- Làm tăng độ nhớt và kết dính NST dẫn đến sự chết tế bào

- Đôi khi chiếu xạ liều thấp lại kích thích sự phân chia tế bào

Trong quá trình giảm phân: Khi dùng tia X gây bức xạ ion hóa ở Longgiforum, Mistra đã thu được kết quả như sau:

- Gây sai hình NST ở diplonem: các bivalent có thể kết dính với nhau tạo vòng NST lớn, phần lớn các vòng này đều do chuyển đoạn phức tạp tạo nên

- Gây sai hình NST ở hậu kỳ I hoặc II Các kiểu sai hình NST thường thấy trong giảm phân là: đứt đoạn NST, tạo 1 hoặc 2 đoạn NST và cầu NST, đứt cầu cromatit tạo ra sự lặp đoạn, tạo cầu cromatit, vòng và hai đoạn do chuyển đoạn, đứt cromatit, tạo nên cầu cromatit, vòng cromatit ở trạng thái kép; tạo NST có 2 tâm

và 2 đoạn, hình thành các đoạn riêng rẽ và cầu cromatit ở kỳ sau I (Mistra 1958, Sutka 1974, Nguyễn Minh Công và cộng sự 1975-1978)

1.3.2.3 Tác dụng của tia phóng xạ đối với thực vật

Khi xử lý phóng xạ có thể tiến hành theo các phương pháp sau:

- Chiếu xạ hạt khô hoặc hạt ướt

- Ngâm hạt trong dung dịch đồng vị phóng xạ

- Trồng cây trên đất có bón chất đồng vị phóng xạ

- Đưa chất đồng vị phóng xạ vào cây

- Phóng xạ thực vật trong quá trình sinh trưởng và phát triển

Ngày nay người ta còn chiếu xạ các cơ quan, bộ phận riêng rẽ của cây như: chồi, nụ hoa, bao phấn, bầu nhụy, hoặc xử lý cây đang trồng trong từng thời kỳ bằng trường Gamma hoặc thiết bị chiếu xạ chuyên dùng của các trung tâm chiếu xạ

Hiệu quả chiếu xạ thực vật ở thế hệ đầu thể hiện ở những biến đổi dương tính, đó là những biến đổi về cấu trúc, hình thái, sinh lý, sinh trưởng, sinh sản và gây chết Người ta phân biệt tác dụng ngay sau khi xử lý phóng xạ (hiệu quả tức thời) với những biến đổi sau khi xử lý phóng xạ (hiệu quả chậm hay hiệu quả kéo dài) Về hiệu quả tức thời có thể kể ra một số hình thức chủ yếu sau:

- Biến đổi hóa sinh và lý hóa sinh

- Biến đổi sinh lý giới hạn ở một số cấu trúc trong vật liệu bị phóng xạ

- Biến đổi vật chất di truyền

Hiệu quả chậm cũng gây ra những biến đổi như trên, nhưng diễn ra trong thời gian dài suốt quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật

Đối với các loài thực vật, chiếu xạ ở liều lượng thấp có tác dụng kích thích sinh trưởng, còn chiếu xạ ở liều lượng cao lại kìm hãm, cao quá giới hạn chịu đựng sẽ gây chết tế bào và cơ thể Ở lúa, khi xử lý hạt khô bằng tia gamma ở các liều lượng 5krad, 10krad nhiều khi kích thích quá trình sinh trưởng và phát triển

Tác dụng của phóng xạ vào hạt có thể gây hiệu quả ở mọi giai đoạn trong quá trình phát triển cá thể, chẳng hạn:

- Tác động trực tiếp đến chiều hướng và tốc độ các phản ứng sinh hóa, chi phối sự nảy mầm

- Tác dụng gây chết phôi mầm, đình chỉ ngay quá trình nguyên phân đầu tiên hoặc ngừng sự sinh trưởng của phôi

- Tác dụng xa hơn, có thể ở các cấp độ khác nhau như: Kìm hãm một pha nào

đó của quá trình nguyên phân, làm suy giảm sức sống của phôi mầm, lá mầm,

rễ mầm, cuối cùng là gây chết ngay ở thời kỳ mạ, hoặc gây chết muộn hơn ở thời kỳ đẻ nhánh, trỗ, chín; cũng có thể không gây chết ở thời kỳ muộn mà lại gây các biến đổi về hình thái, sinh trưởng, phát triển

1.3.3 Lược sử nghiên cứu hiệu quả gây đột biến của tia gamma khi xử lý callus

Các tác giả Kawai (1965 - 1966); Guud, Fushuhara (1967); Janaka và Stamura (1968); Siddig và Swaminathan (1968 - 1969); Vũ Tuyên Hoàng 1972; Satoh và Omura (1979); Phan Phải, Bùi Chi Lăng, Nguyễn Quang Xu (1983); Trần Duy Quý (1981 - 1988) .đã nghiên cứu hiệu quả gây đột biến của tia gamma khi xử lý hạt ướt (hạt thấm nước, hạt ngâm nước bão hòa), đều đi đến một kết luận chung là: Hạt ướt cảm ứng phóng xạ cao hơn, cho tần số đột biến hình thái, sinh trưởng và phát triển cao hơn so với xử lý hạt khô

Một số tác giả chiếu tia gamma trên hạt lúa hút nước bão hòa hoặc hạt nảy mầm để nghiên cứu tần số và phổ đột biến cấu trúc NST (Savin, Swaminathan, Sharma (1968), Trần Duy Quý và cộng sự (1977-1987) ), hoặc là để nghiên cứu so sánh hiệu quả với trường hợp xử lý hạt khô (Siddig

và Swaminathan (1968), Soriano 1971, Siddig và Swaminathan 1971) Các công trình cũng đã rút ra kết luận tương tự về so sánh hiệu quả gây đột biến của tia gamma khi xử lý trên hạt khô so với hạt ướt

Nhiều tác giả đã chiếu xạ các loại thực vật khác nhau và đã xác định được

độ cảm ứng phóng xạ phụ thuộc vào các pha của chu kỳ tế bào xếp theo thứ tự:

G2 > M > S > G1, Boocdanop (1965), Scott và Ewan (1967), Mitrophanop (1969), Demin (1974), Kaznadri (1977), Mitrophanop và Olimpienco (1980)

Các nghiên cứu của Trần Duy Quý (1982 - 1985) khi xử lý tia gamma (Co60) trên hạt ẩm và hạt nứt nanh của lúa IR8, IR22, C4-63, rồi cố định rễ mầm

ở các thời điểm khác nhau, đã xác định được mối quan hệ giữa thời điểm cố định

và tần số, phổ sai hình NST (Phạm Quang Lộc, Nguyễn Minh Công, 1986)

Theo Đào Xuân Tân (1995) [10], nghiên cứu sự phát sinh các đột biến lặn ở M2 khi xử lý tia gamma vào các thời điểm khác nhau của hạt nảy mầm ở 6 giống lúa nếp đã đi đến kết luận rằng: Phóng xạ vào thời điểm 72h hoặc 75h cho tổng tần số đột biến diệp lục cao nhất, tần số đột biến lặn về hình thái (hình dạng, màu sắc, kích thước của thân, lá, bông, hạt), về sinh trưởng và phát triển cao nhất, đặc biệt là các đột biến có ý nghĩa về chọn giống

1.3.4 Một số thành tựu về chọn giống lúa bằng đột biến thực nghiệm trên thế giới và ở Việt Nam

Bằng phương pháp cổ điển, muốn tạo được một giống cây trồng mới, năng suất cao, phẩm chất tốt và ổn định, phải cần từ 6 – 10 thế hệ Với phương pháp chọn giống bằng đột biến thực nghiệm, một số giống mới được tạo ra chỉ trong vòng 6 thế hệ Việc chọn giống cổ truyền chủ yếu dựa vào nguồn biến dị tự nhiên, nguồn gen hoang dã hoặc những biến dị tổ hợp qua lai hữu tính, cả 3 nguồn biến dị này đều có những giới hạn Thêm vào đó, chọn giống cổ truyền không có được những đột phá cần thiết Với phương pháp đột biến thực nghiệm kết hợp với lai tạo và chọn lọc (hoặc lai tạo kết hợp với đột biến thực nghiệm), đã tạo ra nguồn biến dị phong phú Sự sai khác di truyền trong lòng quần thể đã tạo nên vốn gen dồi dào cho việc chọn tạo, cải tiến

giống hoặc phục vụ những mục đích nghiên cứu khác Ngày nay, chọn giống bằng phương pháp đột biến thực nghiệm ngày càng trở thành một trong những phương pháp được ứng dụng rộng rãi trên thế giới và cả ở Việt Nam

kê của FAO/IAEA (dẫn theo Maluszynski và cộng sự 1998), có 1847 giống (ngũ cốc chiếm 1357 giống) Sáu nước đứng đầu thế giới về số lượng giống cây trồng tạo ra bằng phương pháp đột biến thực nghiệm là: Trung Quốc (306 giống) chiếm 16,56%, Ấn Độ (249 giống) chiếm 13,48%, Liên Xô cũ và Nga (210 giống) chiếm 11,36%, Hà Lan (176 giống) chiếm 9,52%, Nhật Bản (118 giống) chiếm 6,39%, Mỹ (100 giống) chiếm 5,4% Trong số 1357 giống ngũ cốc có 333 giống lúa và trong đó có 225 giống (chiếm 67,6%) được nhân trực tiếp từ các thể đột biến, số còn lại là do kết hợp với phương pháp lai tạo Bảy nước đứng hàng đầu về số lượng giống lúa đột biến là: Trung Quốc (117 giống) chiếm 35,1%, Nhật Bản (46 giống) chiếm 13,8 %, Ấn Độ (31 giống) chiếm 9,3%, Guana (26 giống) chiếm 7,8%, Cot-di-voa (25 giống) chiếm 7,5%, Mỹ (23 giống) chiếm 6,9%, Việt Nam (14 giống) chiếm 4,2% (dẫn theo Maluszynski và cộng sự 1998) Hiện nay, theo thống kê của FAO/IAEA, đã

có trên 4.000 giống cây trồng mới được tạo ra bằng phương pháp đột biến;

trong đó có trên 600 giống lúa và Trung Quốc đang là nước dẫn đầu thế giới trong lĩnh vực trồng giống lúa đột biến có những tính trạng đặc sắc Việc ứng dụng kỹ thuật hạt nhân để cải tiến cây trồng đã mang lại hiệu quả cực kỳ to lớn về mặt kinh tế

Chọn giống bằng phương pháp đột biến thực nghiệm đã tạo ra những giống lúa mới mang những đặc điểm hình thái và một số tính trạng nông học quý giá và làm tăng tính đa hình di truyền của lúa trồng: các giống lúa nửa lùn (129 giống), chín sớm (117 giống), đẻ nhánh khỏe (44 giống), chống bệnh tàn lụi lá (28 giống), cây cao (25 giống), chất lượng hạt tốt (18 giống), thích ứng rộng (13 giống), chịu lạnh (13 giống), nội nhũ dẻo (8 giống), chịu mặn (6 giống), cảm ứng quang chu kỳ (3 giống) (theo thống kê của FAO/IAEA

1998 - Maluszynski và cộng sự 1998) Những giống có đặc tính nông học quý rất được ưa chuộng nên đã được gieo trồng trên diện tích rộng

* Việt Nam:

Chọn giống cây trồng bằng phương pháp đột biến thực nghiệm ở Việt Nam đã có những đóng góp đáng kể trong việc nâng cao sản lượng lương thực, trong đó đặc biệt là sản lượng lúa Các nghiên cứu đột biến thực nghiệm hiện nay tập trung vào hướng chiếu xạ hạt khô, hạt nảy mầm, chiếu xạ hạt phấn, chiếu xạ hợp tử Để tạo ra những đột biến có lợi như: thấp cây, đẻ nhánh khỏe, chống đổ, chín sớm, năng suất cao, không cảm ứng quang chu kỳ, chống chịu với sâu bệnh và điều kiện bất lợi khác, hàm lượng protein cao, cơm dẻo, thơm Những đột biến này có thể nhân trực tiếp thành giống hoặc sử dụng trong lai tạo giống hoặc trong nghiên cứu sự di truyền các tính trạng cây lúa Trong số các giống mới được tạo ra tại Việt Nam thì số lượng giống được tạo

ra bằng đột biến thực nghiệm hoặc bằng phương pháp xử lý đột biến kết hợp với lai giống chiếm một tỷ lệ đáng kể

Viện Di truyền Nông nghiệp là cơ quan đầu tiên ứng dụng kỹ thuật nguyên tử để chọn tạo các giống cây trồng đột biến mới bằng tia gamma, tia Rơghen, các tác nhân đột biến hóa học khác và đã có nhiều thành công trong lĩnh vực này Các phương pháp chính được sử dụng trong cải tiến giống cây trồng trên cơ sở khai thác và sử dụng nguồn gen là phương pháp lai tạo, phương pháp đột biến và phương pháp chuyển gen để tạo ra các giống cây trồng năng suất cao, chất lượng tốt, chống chịu bệnh hại và điều kiện thời tiết bất thuận

Tính tới năm 2010, theo số liệu thống kê sơ bộ, Viện Di truyền Nông nghiệp có khoảng 21 giống lúa được tạo ra bằng phương pháp gây đột biến trực tiếp (15 giống) và chọn tạo từ con lai của các dòng/giống đột biến (6 giống) Các giống lúa này đều đã được công nhận giống quốc gia, giống sản thử hoặc đang gửi khảo nghiệm 2-3 vụ Các giống lúa trên đã được triển khai ra sản xuất với diện tích rất rộng (hàng triệu héc ta) và đã mang lại nguồn lợi kinh tế to lớn cho bà con nông dân (M.Q Vinh et al., 2009)

Từ năm 1995 đến nay, có khoảng hơn 10 giống lúa đột biến được tạo ra

ở miền Nam Việt Nam Nguồn vật liệu được sử dụng là: IR64, IR50404, IR59606, Jamin85, các giống lúa địa phương: Nàng hương, Tám soan, Tài nguyên Các nhà khoa học đã sử dụng nguồn chiếu xạ 60Co, liều lượng 150,

200, 250, 300 Gy Hiện nay diện tích trồng các giống lúa đột biến chiếm 11% tổng diện tích lúa ở miền Nam Việt Nam Nhiều giống lúa đột biến triển vọng kháng bệnh rầy nâu, đạo ôn, chịu phèn mặn đã được tạo ra như: VND95, OM2717, OM2496 (Đ.K.Thinh et al., 2004)

Viện cây lương thực và Cây thực phẩm đã tạo được nhiều giống quốc gia và nhiều giống khu vực hóa bằng phương pháp đột biến thực nghiệm hoặc kết hợp với lai tạo: Xuân số 4, Xuân số 5, Xuân số 6 (1991), Xuân số 10

(1996), Xuân số 11 và N29 (1998) của tập thể tác giả Vũ Tuyên Hoàng, Trương Văn Kính và cộng sự Từ năm 1989 – 2000, Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam đã công bố 6 giống quốc gia: DT10, DT11 (1989, 1990); DT13, DT33 (1991 - 1993), DT16 và Nếp thơm DT21 (2000)

Trường Đại học sư phạm Hà Nội, Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam và Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long đã phối hợp nghiên cứu tạo ra hai giống quốc gia: Tài nguyên đột biến-100 (1997), Tép hành đột biến (1999), Tám thơm đột biến (2000)

Trường Đại học tổng hợp Hồ Chí Minh và Viện Di truyền nông nghiệp

đã tạo ra giống lúa A20, được công nhận giống Quốc gia năm 1991

Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam chiếu xạ hạt khô của giống lúa IR64 bằng tia gamma (Co60) đã tạo ra hai giống lúa quốc gia: VND95-

19 và VND95-20 (năm 2000)

Ngoài ra, các đề tài cấp Nhà nước, cấp Bộ và các đề tài nghiên cứu sinh

đã và đang tạo ra nhiều dòng lúa đột biến có triển vọng trong sản xuất, trong cải tạo giống và nghiên cứu di truyền

1.4 Chỉ thị phân tử và ứng dụng trong chọn tạo giống cây trồng

1.4.1 Chỉ thị phân tử

Chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị có bản chất là đa hình ADN Nó

có thể là những dòng phân tử ADN được lưu trữ (đoạn ADN đứng riêng hoặc nằm trong plasmid, thư viện λ, BAC, YAC ) hay dưới dạng thông tin về trình tự được lưu giữ trong máy tính hay trên mạng internet (ví dụ như trình tự các mồi SSR, STS, RAPD, AFLP )

Chỉ thị phân tử được chia làm 4 loại chính:

- Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN

- Chỉ thị dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR

- Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại Nhóm chỉ thị này thực

ra cũng dựa trên cơ sở nhân bội ADN nhưng do chúng có bản chất là chuỗi lặp lại nên có thể xếp vào một nhóm riêng

- Các chỉ thị phân tử khác

1.4.2 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng

1.4.2.1 Phân tích đa dạng di truyền

Sự ra đời của các loại chỉ thị phân tử đã cung cấp cho các nhà khoa học một công cụ hữu ích trong việc nghiên cứu di truyền thực vật nói chung cũng như trong nghiên cứu đa dạng di truyền, chọn tạo giống thực vật nói riêng Ưu điểm của chỉ thị di truyền trong phân tích đa dạng di truyền là rút ngắn thời gian nghiên cứu, thời gian chọn lọc đối với các tính trạng không hoặc khó đánh giá thông qua kiểu hình Các chỉ thị phân tử thường được sử dụng để nghiên cứu, xác định mối quan hệ di truyền giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài, là cơ sở cho việc phân loại dưới loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hoá giữa loài (Bùi Chí Bửu và cộng sự, 2004) [2]

Những kỹ thuật phân tử khác nhau đã và đang được ứng dụng trong nghiên cứu đa hình ADN như: kỹ thuật đa hình độ dài mảnh phân cắt giới hạn (RFLP), đa hình AND nhân bội ngẫu nhiên (RAPD) và vi vệ tinh, gần đây là

đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn được nhân bội (AFLP)

Tại Việt Nam cũng có một số nghiên cứu về da dạng di truyền trên đối tượng nấm đạo ôn lúa, sử dụng kỹ thuật Pot2-Rep PCR, RGA, RAPD (Trần Duy Dương và cộng sự, 1999) [4], (Lã Tuấn Nghĩa và cộng sự, 1999 [7], Trần Duy Quý, 1999 [9] Viện nghiên cứu Lúa Đồng bằng sông Cửu Long đã tiến hành phân tích đa dạng di truyền của 90 giống lúa mùa địa phương (những

giống lúa thơm ở Việt Nam có năng suất cao) bằng phương pháp marker phân

tử và phương pháp đánh giá hình thái, đồng thời phân tích mối tương quan giữa các tính trạng để áp dụng cho việc chọn giống (Phạm Thị Bé và cộng sự, 2008) [1]

1.4.2.2 Tìm chỉ thị phân tử liên kết gen và lập bản đồ gen

Chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị tốt cho nghiên cứu lập bản đồ liên kết gen, đặc biệt đối với trường hợp các chỉ thị RFLP, STS và SSR đã được xác định vị trí trên NST Vì vậy khi sử dụng chúng trong nghiên cứu sẽ cho biết vị trí của gen liên kết nằm trên NST nào của đối tượng

Bản đồ di truyền lúa đầu tiên được thiết lập bởi Nagao và Takashuki năm 1963, gồm 12 nhóm liên kết Vào những năm 70 của thế kỷ XX, nhiều nhà di truyền chọn giống đã đề xuất bản đồ di truyền của lúa thiết lập nhờ các thể ba (trisomic) Sau đó bản đồ di truyền liên kết ở lúa được thiết lập trên cơ sở các chỉ thị đột biến hình thái và các chỉ thị izozym Bản đồ di truyền lúa thứ hai

do các nhà nghiên cứu Nhật Bản (thuộc chương trình Rice Genome Project) thiết kế gồm trên 3.000 chỉ thị, chủ yếu là các chỉ thị RFLP từ các dòng ADN

hệ gen và ADN bổ trợ (cDNA) (Caldo et al., 1998) [12]

Cùng với sự ra đời của chỉ thị phân tử là sự xuất hiện của những phương pháp toán xác suất thống kê trên cơ sở chỉ thị phân tử để lập bản đồ QTL Bên cạnh đó là sự hỗ trợ của các chương trình máy tính như: chương trình “MapMaker”, “JoinMap”, các kỹ thuật chỉ thị phân tử đã cho phép lập bản đồ hàng loạt các gen và các locus kiểm soát các tính trạng số lượng có ý nghĩa nông học ở cây trồng và vật nuôi (Yan et al., 2009) [13]

Nhờ chỉ thị phân tử, người ta đã lập được bản đồ gen kháng bệnh bạc lá, rầy nâu, đạo ôn ở lúa Các gen bất dục đực nhân mẫn cảm với nhiệt độ cũng

đã được lập bản đồ như: tms2 (Trung Quôc) nằm trên NST số 7 của lúa, tms3

(IRRI) nằm trên NST , tms4 (Việt Nam) nằm trên nhiễm sắc thể số 2, tms5 (Ấn Độ) nằm trên nhiễm sắc thể số 9…(Dong et al., 2000) [15] Gần đây, 2008, các

nhà khoa học đã thành công trong việc lập bản đồ 2 gen bất dục phản ứng với

quang chu kỳ rpms1và rpms2) ở lúa ( Peng et al., 2008) [27]

Với sự thuận lợi của những chỉ thị trên cơ sở kỹ thuật PCR, chúng ta đã giảm rất nhiều chi phí nghiên cứu so với sử dụng RFLP Tuy nhiên để chọn lựa chỉ thị nào liên kết với một gen kháng bệnh, thì trước tiên bản đồ di truyền của gen đó phải được thiết lập Chính vì vậy lập bản đồ gen rất quan trọng trong công tác chọn tạo giống lúa

1.4.2.3 Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (Marker-Assisted Selection - MAS)

Từ lâu, các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết với một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng như một phương tiện hữu ích trong quy trình tạo giống mới Với chỉ thị hình thái các nhà chọn giống phải đánh giá kiểu hình của cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong muốn Mặt khác, chỉ thị hình thái vốn có số lượng không nhiều còn những chỉ thị may mắn (liên kết với gen quan tâm) lại càng hiếm gặp vì thế giá trị thực tiễn của chỉ thị hình thái trong chọn giống gặp nhiều hạn chế Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ CTPT các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm đến vấn đề “chọn giống nhờ chỉ thị phân tử” (Marker-Assisted Selection) (MAS) với ý đồ sử dụng các chỉ thị phân tử liên

kết với các gen mong muốn trong chọn tạo giống mới (Chen et al., 2000)

[14]

Thông thường, trong quy trình chọn tạo giống truyền thống, người ta đưa nguồn gen mới có tính trạng mong muốn vào 1 giống khác bằng phương pháp hồi giao liên tục qua nhiều thế hệ, hoặc chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly từ thế hệ F2 đến các thế hệ tiếp theo Mỗi gen chính thường chỉ kháng được với 1 chủng gây bệnh hoặc nòi gây hại nào đó, do vậy nếu quy tụ được

vài gen kháng vào một dòng hoặc giống lúa thì sẽ tạo ra được 1 dòng lúa kháng được với nhiều chủng gây bệnh hoặc nhiều nòi gây hại Như vậy muốn tạo ra giống lúa kháng bền vững đối với dịch hại, người ta phải đưa được vài gen kháng hiệu quả cao vào “genom đích” Bằng phương pháp chọn giống truyền thống, việc đưa gen lặn vào tổ hợp lai, hoặc cùng một lúc chuyển vài gen mong muốn vào “genom đích” (quy tụ nhiều gen vào 1 giống ưu việt) thường gặp rất nhiều khó khăn hoặc đôi khi không thể thực hiện được Còn đối với quy trình MAS, thay vì đánh giá kiểu hình các cá thể con lai để chọn

ra cá thể mang gen mới chuyển, người ta xác định các cá thể mang gen mới

một cách gián tiếp, thông qua chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen đó (Chen et

+ Rất quan trọng với một số tính trạng như chất lượng hạt

+ Có thể chọn lọc sớm, trước khi gieo trồng, có thể chọn ngay ở thế hệ phân

ly F2 hoặc F3

+ Không bị ảnh hưởng của môi trường

+ Có thể phân biệt giữa đồng hợp và dị hợp và chọn lọc từng cây

Theo IRRI có 4 phương pháp tiếp cận MAS:

+ Lai lại dựa trên chỉ thị phân tử (Marker-assisted backcrossing)

+ Quy tụ gen (Pyramiding)

+ Chọn lọc những thế hệ đầu (Early generation selection)

+ Tiếp cận phối hợp (‘Combined’ approaches)

Koebner (2003) [20] đã có một bài tổng quan về các thành tựu chọn giống nhờ chỉ thị phân tử đối với tính kháng sâu, bệnh và cải tiến một số đặc điểm nông sinh học ở lúa mì, lúa mạch, ngô và lúa Để đánh giá các giống lúa

có mùi thơm, Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang đã nghiên cứu di truyền mùi thơm trên lúa và nhận thấy rằng gen mùi thơm được kiểm soát bởi một gen lặn và chỉ thị ADN liên kết với gen mùi thơm Nhờ chỉ thị phân tử liên kết chặt với mùi thơm từ đó có thể phát hiện thể đồng hợp tử và dị hợp tử ngay từ giai đoạn thế hệ ban đầu từ đó đã rút ngắn thời gian cải tiến giống (Nguyễn thị Lang và cộng sự, 2004) [2]

MAS tỏ ra có hiệu quả đối với các tính trạng đơn giản được điều khiển bởi một số lượng hạn chế các gen như các tính kháng sâu, bệnh Đến nay, nhiều chương trình trong chiến lược chọn giống bằng MAS ở lúa tập trung vào quy

tụ gen kháng bệnh: bạc lá, rầy nâu, đạo ôn (Koebner, 2003) [20]

Trong những năm gần đây, một vài mô hình MAS đã được các nhà khoa học đưa ra và phân tích cặn kẽ Theo một số mô hình thì chỉ cần tiến hành lai trở lại qua 4 thế hệ, chứ không cần đến 6 thế hệ, ngay cả khi quần thể chọn giống có kích thước nhỏ và các dữ liệu về chỉ thị phân tử bị hạn chế Trong một số trường hợp thuận lợi, đôi khi các nhà chọn giống chỉ cần lai trở lại 3 thế hệ là có thể đạt được mục tiêu của mình Hơn thế nữa, Frisch

và cộng sự (1999) đã thiết kế chiến lược “chọn giống 2 giai đoạn” để áp dụng trong trường hợp chưa biết các thông tin về bản đồ liên kết của các chỉ thị phân tử Điều này chứng tỏ công nghệ chỉ thị phân tử có một lợi thế lớn khi ứng dụng trong chương trình chọn giống ngay cả khi tài nguyên chọn giống bị hạn chế Như vậy chọn giống nhờ chỉ thị phân tử, khi phối hợp với chọn giống truyền thống, tỏ ra rất hiệu quả, tiết kiệm công sức và rút ngắn đáng kể

thời gian tạo giống (Chen et al., 2000) [14]

1.5 Tổng quan về chọn tạo giống lúa chịu mặn

1.5.1 Tính chống chịu mặn của cây lúa

Đối với cây lúa, tính chống chịu mặn là một tiến trình sinh lý phức tạp, thay đổi theo các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của cây (N.T.T Hoai at al., 2003) [24] Tính trạng bất thụ của bông lúa khi bị stress do mặn được điều khiển bởi một số gen trội, nhưng các gen này không tiếp tục thể hiện ở các thế

hệ sau Phân tích diallele về tính trạng chống chịu mặn, người ta ghi nhận cả hai hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính với hệ số di truyền thấp (19,18%) và ảnh hưởng của môi trường rất lớn (Roberto Tuberosa và Silvio Salvi, 2007) [28]

Rất nhiều nghiên cứu cho rằng, yếu tố di truyền tính chống chịu mặn biến động rất khác nhau giữa các giống lúa Vì vậy, muốn chọn giống lúa chống chịu mặn có hiệu quả, cần nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền tính chống chịu mặn, từ đó loại bỏ ngay từ những thế hệ đầu những dòng không đáp ứng được yêu cầu của nhà chọn giống Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn cho thấy, cả hai ảnh hưởng hoạt động của gen cộng tính

và gen không cộng tính đều có ý nghĩa trong di truyền tính chống chịu mặn (Greenway và Munns, 1980) [18]

Hiện chúng ta có rất ít thông tin về kiểu hình chống chịu mặn ở giai đoạn trưởng thành của cây lúa Hầu hết các thí nghiệm đều được tiến hành trên giai đoạn mạ với quy mô quần thể hạn chế và chỉ số Na/K thường được dùng như một giá trị chỉ thị (Muhammad S., Akbar M., and Neue H.U, 1987) [21], (N.T.T Hoai at al., 2003) [24] Cây lúa nhiễm mặn có xu hướng hấp thu

Na nhiều hơn cây chống chịu Ngược lại, cây chống chịu mặn hấp thu K nhiều hơn cây nhiễm Ngưỡng chống chịu NaCl của cây lúa là EC = 4 dS/m

[21] Trong quá trình bị nhiễm mặn, nồng độ ion K+ trong tế bào được điều tiết tương thích với cơ chế điều tiết áp suất thẩm thấu và khả năng tăng trưởng

tế bào Nhiều loài thực vật thuộc nhóm halophyte và một phần của nhóm glycophyte thực hiện hoạt động điều tiết áp suất thẩm thấu làm cản trở ảnh hưởng gây hại của mặn Hoạt động này sẽ giúp cây duy trì một lượng lớn K+

và hạn chế hấp thu Na+ (Munns R., 2002) [22]

1.5.2 Một số kết quả và thành tựu trong chọn tạo giống lúa chịu mặn trên thế giới và trong nước

1.5.2.1 Kết quả và thành tựu trong chọn tạo giống lúa chịu mặn trên thế giới

a) Sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống lúa chịu mặn

Chọn giống lúa chịu mặn bằng chỉ thị phân tử (MAS) là một quá trình

sử dụng một marker để lựa chọn gián tiếp các gen mục tiêu Việc sử dụng MAS chọn giống thay vì sử dụng chọn lọc kiểu hình thông thường đem lại một số lợi thế lớn như tiết kiệm thời gian, giảm chi phí chọn giống và đáng tin cậy hơn do không bị ảnh hưởng của các yếu tố môi trường Nhiều loại chỉ thị bao gồm RFLP, RAPD, SSR, SCAR và STS đã được các nhà khoa học trên thế giới phát triển

b) Chọn giống lúa chịu mặn bằng QTL

Bản đồ QTL (phân tích dựa trên AFLP và STS marker) cho thấy gen chủ lực điều khiển tính trạng chống chịu mặn định vị trên nhiễm sắc thể số 1

(saltol) Bên cạnh gen chủ lực, 3 QTL được ghi nhận có liên quan với tính

trạng hấp thu K cao, 4 QTL có liên quan với tính trạng hấp thu Na thấp và 3 QTL có liên quan với tính trạng tỷ số Na/K thấp Những QTL này định vị trên nhiễm sắc thể số 1, 3, 4, 10 và 12 (F.A.O., AGL, 2000) [16], (Ohta M at al., 2002) [25]

Bảng 1.1: Phân tích QTL theo phương pháp cách quãng (interval) đối với tính trạng hấp thu K, Na và tỉ số Na/Ka ở chồi thân

QTL được khám phá có ảnh hưởng điều khiển tính trạng hấp thụ K ở chồi, định vị trên nhiễm sắc thể số 1, số 4 và số 12 (bảng 3), với phương sai kiểu hình được giải thích là 80,2%, 83,5% và 21,2%, theo thứ tự QTL có ảnh hưởng đến hoạt động điều khiển tính trạng hấp thu Na, định vị trên nhiễm thể

số 1, 3, và 10 Đối với tỉ số Na/K, có 3 QTL định vị trên nhiễm thể số 1, 10 và

12 được giả định là gen điều khiển tính trạng này, với biến dị kiểu hình được giải thích là 64,3%, 86,1% và 18,5%, theo thứ tự (bảng 3) QTL được quan sát trên nhiễm thể số 1 đối với 3 tính trạng: Na thấp, K cao, tỉ số Na/K thấp với giả định có liên quan đến chống chịu mặn

Các nghiên cứu của Gregorio (1997) và Niones (2004) đã lập được bản

đồ gen rất chi tiết cho QTL “Saltol” hiện diện trên nhiễm sắc thể số 1, quyết

định tới khoảng 40 - 65% tính chống chịu mặn của lúa (Gregorio G.B, 1997) [19], (Niones J.M., 2004) [23] M R Islam và cộng sự lập bản đồ chi tiết

QTL “Saltol” trên nhiễm sắc thể số 1, 8 quyết định tới 20 - 20% tính chống

chịu mặn

1.5.2.2 Kết quả và thành tựu trong chọn tạo giống lúa chống chịu mặn ở Việt Nam

* Sử dụng các chỉ thị SSR liên kết chặt với QTL chịu mặn saltol trong

chọn tạo lúa chịu mặn

Xác định gen kháng bằng chỉ thị phân tử nghĩa là sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết chặt với các gen kháng và các QTLs để chọn được các cá thể mang gen kháng trong quần thể phân li Độ chính xác của phương pháp này

có thể lớn hơn 99,75% khi gen kháng kẹp giữa hai chỉ thị liên kết với gen kháng đó và khoảng cách di truyền từ chỉ thị phân tử đến gen kháng nhỏ hơn 5cM Bằng cách chọn lọc này, các tổ hợp gen kháng khác nhau được chọn lọc

là dựa trên kiểu gen thay vì dựa trên kiểu hình (Zeng L et al., 2004) [30]

Về cơ bản các loại chỉ thị trên đều có thể được ứng dụng để lập bản đồ

di truyền hoặc nghiên cứu sự đa dạng di truyền hoặc phân lập gen, hoặc xác định gen, Tuy nhiên, mỗi loại chỉ thị có ưu nhược điểm riêng vì thế tuỳ vào mục đích, yêu cầu và điều kiện cụ thể của mỗi nghiên cứu mà lựa chọn sử dụng chỉ thị nào cho thích hợp

Trong số các chỉ thị phân tử thì SSR có nhiều ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, nhanh, chính xác, độ đa hình cao và kinh tế Sự phát triển của marker phân tử và bản đồ gen cây lúa trong những năm gần đây đã được ứng dụng vào mục đích xác định các QTL điều khiển tính chống chịu mặn của cây, hiện diện trên các nhiễm sắc thể khác nhau Các nghiên cứu của Gregorio

(1997) và Niones (2004) đã lập được bản đồ gen rất chi tiết cho QTL “Saltol”

hiện diện trên nhiễm sắc thể số 1, quyết định tới khoảng 40 - 65% tính chống chịu mặn của lúa (Gregorio G.B, 1997) [19], (Niones J.M, 2004) [23]