Bài tiểu luận môn công nghệ enzyme

Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước.. Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy

là thuỷ phân tinh bột về các đường đơn giản Sau đó, chủ yếu trên cơ sở đường đơn nhờ lên men, người ta sẽ nhận được rất nhiều sản phẩm quan trọng như: Rượu cồn, rượu vang, bia, các loại acid hữu cơ, amino acid,…

Quá trình thuỷ phân tinh bột gồm hai công đoạn chủ yếu là giai đoạn hồ hoá và giai đoạn đường hoá Để thực hiện hai công đoạn công nghệ nói trên, trong thực tế sản xuất người ta áp dụng hai cách: Thuỷ phân tinh bột bằng acid và bằng enzym Để thuỷ phân tinh bột từ lâu người ta đã sử dụng acid vô cơ như HCl và H2SO4 Nhưng kết quả cho thấy, thuỷ phân bằng acid rất khó kiểm soát và thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn và không đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm Do vậy, việc thay thế và ứng dụng enzym để thuỷ phân tinh bột là một kết quả tất yếu của lịch sử phát triển

Hiện nay để thủy phân tinh bột thành đường glucose người ta thường sử dụng enzyme amylase thu nhận từ thực vật hoặc các loại vi sinh vật Enzym amylase đã được tìm ra đã góp phần quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến thực phẩm Amylase càng ngày càng được thay thế acid trong sản xuất ở qui mô công nghiệp Hiện nay, các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase có khả năng chịu nhiệt cao mà không bị mất hoạt tính, chẳng hạn amylase được tách chiết từ vi sinh vật, cụ thể là các chủng vi khuẩn chịu nhiệt được phân lập từ những suối nước nóng Ngoài ra, amylase

còn có nhiều ưu điểm hơn khi sử dụng acid để thuỷ phân tinh bột: Năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho quá trình tinh sạch dịch đường

Những năm 1960, glucose được sản xuất bằng phương pháp acid Hiệu suất glucose thu được chỉ đạt 88% bởi các sản phẩm thủy phân do acid Việc thương mại hóa các enzyme glucoamylase đã tạo điều kiện để phát triển các quá trình thủy phân bằng acid- enzyme, giúp hiệu suất thu glucose tăng lên đến 92-94% từ dung dịch sau hóa có DE 10-20 Hiệu suất thu glucose sau đó tăng lên tới 95-97% với quá trình thuỷ phân hoàn toàn bằng enzyme α- amylase dịch hóa và glucoamylase trong quá trình đường hóa

Nguồn amylase có thể lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch ( malt ), hạt bắp nảy mầm, hay từ nấm mốc,… Trong đó amylase được thu nhận từ malt với số lượng nhiều nhất, chủ yếu dùng trong sản xuất bia Nguyên liệu cho sản xuất enzyme thường là gạo, bắp, khoai mì,… đây là những nguồn nguyên liệu rẻ tiền có thể tìm thấy dễ dàng

ở nước ta Cho nên đây là một lợi thế và là hướng phát triển mạnh có thể làm cơ sở cho nhiều ngành khác phát triển

Phần I Tổng quan về enzyme amylase

1.1.Khái niệm Enzyme

Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất Sự trao đổi chất ngừng thì sự sống không còn tồn tại Quá trình trao đổi của một chất là tập hợp của rất nhiều các phản ứng hóa học phức tạp Các phản ứng này có liên quan chặt chẽ với nhau và điều chỉnh lẫn nhau Enzyme là hợp chất protein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định

và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống

Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống Chính do những tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm để phân biệt với các chất xúc tác hóa học Chúng là chất xúc tác sinh học không chỉ có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng, phát triển của mọi mọi sinh vật mà nó còn giữ vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và bảo vệ mội trường

1.2 Enzyme amylase

1.2.1 Khái niêm enzyme amylase

Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước

RR’ + H-OH -> RH + R’OH

Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin hạn chế Các enzyme amylase có trong nước bọt (còn được gọi là ptyalin), trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn Trong nước bọt của người có ptyalin nhưng ở một số loại động vật có vú thì không có như ngựa, chó, mèo Ptyalin bắt đầu thủy phân tinh bột từ miệng và quá trình này hoàn tất ở ruột non nhờ amylase của tuyến tụy (còn được gọi

là amylopsin) Amylase của malt thủy phân tinh bột lúa mạch thành disaccharide làm

cơ chất cho quá trình lên men bởi nấm men

Amylase là một trong những loại enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y tế, và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt là trong ngành công nghiệp thực phẩm

Cơ chất sử dụng ở đây là tinh bột: là nhóm Carbohydrate ở thực vật, có chủ yếu trong các loại củ như khoai lang, khoai tây, khoai mì… , trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt và có công thức tổng quát là (C6H12O6)n Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ amylase và amylopectin ( Meyer, 1940 ) Các loại tinh bột đều có 20-30% amylase và 70-80% amylopectin Trong thực vật, tinh bột được xem là chất

dự trữ năng lượng quan trọng

- Amylase có trọng lượng phân tử 50.000 – 160.000 Dal, được cấu tạo từ

200-1000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside tạo thành một mạch xoắn dài không phân nhánh

- Amylopectin có trọng lượng phân tử 400.000 đến hàng chục triệu Dal, được cấu tạo từ 600-6000 phân tử D-glucose, nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside và α-1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng khi hỗn dịch tinh bột bị đun nóng ( 60-850C ) thì tinh bột sẽ bị hồ hóa và được gọi là hồ tinh bột Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucoside bị phân cắt Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo

2 mức độ: Dịch hóa và đường hóa Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi dextrin tiếp tục bị đường hóa thì sản phẩm là maltose và glucose

- Cabohydrate trong thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng quan trọng cho

cơ thể con người Rau và quả cũng là nguồn cung cấp tinh bột và tinh bột này một phần đã được chuyển hóa thành disaccharide và glucose Carbohydrate có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm nhưng nguồn cung cấp chủ yếu là đường và tinh bột

- Năm 1833, Payen và Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu được kết tủa có khả năng phân giải tinh bột thành đường, và đặt tên là diastase (xuất phát từ tiếng Hy Lạp, diastatics, có nghĩa là phân giải, đó là amylase) Sau này theo đề nghị của Duclo, enzyme phân giải tinh bột được gọi là amylase

- Năm 1851, Leuchs đã phát hiện nước bọt cũng có khả năng phân giải tinh bột thành đường Sau đó, các enzyme amylase trong nước bọt, trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn bắt đầu được quan tâm nghiên cứu

- Năm 1862, Danilevxki đã tách được amylase của tuyến tụy bằng phương pháp hấp thụ chọn lọc

- Năm 1949, Schwimmer đã xác định được số chu chuyển của α-amylase là 19000

- Năm 1950, Englard và Singer cho biết số chu chuyển của α-amylase là 250000

- Đến năm 1952, người ta đã thu được 72 enzyme ở trạng thái kết tinh trong đó có 4 enzyme α-mylase

- Năm 1971, Uxtinilov và cộng sự bằng phương pháp điện di trên gel poliacrylamid đã xác định được sự có mặt của một lượng lớn α-amylase và glucoamylase trong canh trường nấm mốc và một lượng nhỏ các phân đoạn có hoạt lực dextrinase và ransglucosilase

Hiện nay các nước trên thế giới sản xuất hàng trăm tấn chế phẩm enzyme, trong đó Nhật là nước có truyền thống lâu đời nhất, sau đó đến Anh, Pháp, Mỹ, Đan Mạch, Thụy Điển, đặc biệt hãng Novo của Đan Mạch là 1 trong những hãng sản xuất enzyme nổi tiếng trên thế giới Bên cạnh đó trong những năm gần đây các nước Đông Âu và Trung Quốc cũng bắt đầu nghiên cứu và sản xuất enzyme.Nếu như ở Tây

Âu mạch nha từ lúa mạch là nguồn enzyme chủ yếu cho việc chuyển hóa tinh bột thành đường, thì ở Viễn Đông emylase thường được sản xuất từ nấm mốc trên môi trường nuôi cấy là các loại ngũ cốc có chứa tinh bột Như hãng Novo đã có nhiều chế phẩm enzyme amylase đang được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp như: công nghiệp sản xuất rượu bia, công nghiệp sản xuất bột giặt, công nghiệp giấy …

- Exoamylase: Đây là những enzyme thủy phân tinh bột tử đầu không khử của chuỗi polysaccharide Nhóm này gồm có:

+ β-amylase (EC 3.2.1.2)

+ Amyloglucosidase (glucoamylase hay γ-amylase) (EC 3.2.1.3)

* Sự khác biệt giữa các loại enzyme amylase:

- Các loại enzyme amylase không chỉ khác nhau ở đặc tính mà còn khác nhau ở pH hoạt động và tính ổn định với nhiệt

- Tốc độ phản ứng của amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, mức độ polyme hóa của

cơ chất Các enzyme amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có tính chất, cơ chế tác dụng

và sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân khác nhau

- Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có thành phần, tính chất, nhiệt độ hoạt động,

pH tối ưu và các đặc điểm thủy phân khác nhau

Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130.000 Dal Đến nay người ta đã biết rất

rõ các chuỗi acid amin của 18 loại α-amylase nhưng chỉ có 2 loại α-amylase là

taka-amylase từ Apergillus orysee và α-taka-amylase của tụy lợn được nghiên cứu kỹ về hình

thể không gian cấu trúc bậc 3 Mới đây các nghiên cứu về tính đồng nhất của chuỗi mạch acid amin và về vùng kị nước cho thấy các chuỗi mạch acid amin của tất cả các enzyme α-amylase đều có cấu trúc bậc 3 tương tự nhau

1.2.4.1.2 Cơ chế tác dụng của α-amylase

α-amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất ( tinh bột hoặc glycogen ) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc độ rất chậm

Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn:

+ Ở giai đoạn đầu ( giai đoạn dextrin hóa ): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh ( các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh )

+ Sang giai đoạn 2 ( giai đoạn đường hóa ): Các dextrin phân tử thấp tạo thành

bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide Dưới tác dụng của α-Amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6 - 7 gốc glucose ( vì vậy, người ta cho rằng α-amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6 - 7 gốc glucopiranose 1 )

+ Sau đó, các poliglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose

và maltose Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên ( 72% maltose và 19% glucose ) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%

Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa

Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-amylase:

+ Giai đoạn dextrin hóa: Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp

+ Giai đoạn đường hóa:

1.2.4.1.3 Đặc tính α-amylase

α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng α-amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme:

+ α-amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine

+ Trọng lượng phân tử của α-amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Dal ( Knir 1956; Fisher, Stein, 1960 )

+ Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng

+ Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline

Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH=4,2 - 5,7 ( Bernfeld P, 1951 )

α-amylase là một metaloenzyme Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1 - 6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào

sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme ( Modolova, 1965 ) Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất α-amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử và nồng độ Mg2+

Tất cả các amylase đều

bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+ Một số kim loại như : Li+,

Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+, không có ảnh hưởng mấy đến α-amylase Một đặc điểm cần lưu ý là hầu hết α-amylase khá bền với tác động của protease như pepsin, trypsin, papain

Thành phần amino acid của α-amylase ở nấm mốc Aspergillus như sau ( g/100

g protein ): alamine = 6,8 ; glycine = 6,6 ; valine = 6,9 ; leucine = 8,3 ; Isoleucine = 5,2 ; prolin = 4,2 ; phenylalanine = 4,2 ; tyrosine = 9,5 ; trytophan = 4,0; xetin = 6,5 ; trionin = 10,7 ; cystein + cystine = 1,6 ; glutamic acid = 6,9 ; amide = 1,5 ( Akabori et

amilose 1954 ) Không giống các α-amylase khác, amylase của Asp.orysee có chứa

phần phi protein là polysaccharide Polyose này bao gồm 8 mol maltose, 1 mol glucose, 2 mol hexosemin trên 1 mol enzyme ( Akabori et amilose, 1965 ) Vai trò của polyose này vẫn chưa rõ, song đã biết được rằng nó không tham gia vào thành phần của trung tâm hoạt động và nằm ở phía trong phân tử enzyme

α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương tổn Sản phẩm cuối cùng của thủy phân amylase là glucose và maltose Đối với nấm sợi tỉ lệ là 1:3,79 ( Hanrahan, Caldwell, 1953 ) Fenikxova và Eromsina (1991) cho biết rằng các maltopentose và maltohexose bị thủy phân theo sơ đồ sau:

G5( G4 + G1; G6 ( G2 + G4 hay 2G3 ( chính ) hoặc G5 + G1 ( ít )

α-amylase của nấm sợi không tấn công liên kết α-1,6 glucoside của amylopectin, nên khi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh Đây là một cấu trúc phân tử tinh bột do enzyme α-amylase phân cắt tạo thành dextrin tới hạn phân nhánh

Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của amylase nấm sợi chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose Nồng độ α-amylase của vi sinh vật tương đối lớn có thể chuyển hóa 70 - 85% tinh bột thành đường lên men Còn các α-amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể lên tới 84 - 87%

Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4,0 - 4,8 ( có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5 - 5,8 ) Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho

hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylase từ Asp.orysee trong vùng

5,6 - 6,2 Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của

nó là 6,0 - 7,0

Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau α-amylase của

Asp.orysee bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn

Bac.subtilis Ở pH= 3,6 và 0oC, α-amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15 - 30 phút; α-amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α-amylase của nấm sợi hình như không giảm bao nhiêu ( Fenilxova, Rmoshinoi 1989 ) Trong dung dịch α-amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH = 5,0 - 5,5 ; α-amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được pH từ 2,5-2,8 Ở 0oC và pH = 2,5 , nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ

Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt Nhiệt độ tối thích của nó là 50 oC và bị vô hoạt ở 70oC ( Kozmina, 1991 )

Trong dung dịch đệm pH = 4,7, α-amylase của Asp.orysee rất nhạy với tác

động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 40 oC trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22 - 29%, hoạt lực đường hóa còn 27 - 85% Ở 50 oC trong 2 giờ, α-amylase của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn ( Miller và cộng sự )

1.2.4.2 Enzyme β-amylase (β-1,4-glucan-maltohydrolase) (EC 3.2.1.2)

1.2.4.2.1 Cấu tạo

β-amylase hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là hạt nảy mầm Ở trong các hạt ngũ cốc nảy mầm, β-amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết 1,4 α-glucan trong tinh bột, glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch Maltose được tạo thành do sự xúc tác của β-amylase có cấu hình β.Ở ngũ cốc, β-amylase tham gia vào sự phân giải của tinh bột trong quá trình nảy mầm của hạt Ở lúa, β-amylase được tổng hợp trong suốt quá trình của hạt và hầu như không được tổng hợp ở hạt khô Ở lúa mạch, enzyme có mặt ở trong hạt khô, nó được tích lũy trong suốt quá trình phát triển của hạt, khi ở dạng liên kết, enzyme này là một

phân tử có trọng lượng phân tử là 64.000 Dal và khi bị phân cắt bởi một protease sẽ được phóng thích dưới dạng tự dovà có khối lượng phân tử là 59.000 Dal

1.2.4.2.2 Cơ chế tác dụng

β-amylase là một enzyme ngoại bào (exoenzyme) Tiến trình phân giải bắt đầu

từ đầukhông khử của các nhánh ngoài cùng cơ chất β-amylase phân cắt các liên kết α-1,4glucoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6glucoside thìnó sẽ ngừng tác dụng Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiềuliên kết α-1,6 glucoside và được gọi là β-dextrin

Tinh bột bị thuỷ phân đồng thời bởi cả α và β-amylase thì lượng tinh bột thuỷ phân tới 95%

1.2.4.2.3 Đặc tính của β-amylase

β-amylase là một albumin, tâm xúc tác có chứa nhóm –SH, nhóm X-COOH

và vòng imidazol của các gốc histidine và là enzyme ngoại bào (exoenzyme)

β-amylase không bền khi có Ca2+

, β-amylase bị kìm hãm bởi Cu2+, Hg2+, urea, iodineoacetamide, iodine, ozon…

amylase chịu nhiệt kém hơn α-amylase nhưng bền hơn với acid

β-amylase bị bất hoạt ở nhiệt độ 70 0C Nhiệt độ tối thích của β-amylase là 55 0 C , pH 5,1 – 5,5

Tham gia vào cơ chế tác dụng của β-amylase thường có một nhóm caboxyl thể hiện tính chất ái nhân và một nhóm imidazol thể hiện tính chất ái electron Sự nghịch đảo hình thể của cacbon anome (C1) được thực hiện nhờ việc tạo thành hợp chất đồng hoá trị trung gian kiểu este axetal giữa cacbon anome và nhóm cacboxyl của tâm hoạt động Sau đó este này bị phân huỷ bởi tác động của 1 phân tử nước lên nhóm cacboxyl để giải phóng ra α-maltose và hoàn nguyên nhóm cacbxyl của enzyme

1.2.4.3 Enzyme γ-amylase (glucoamylase) (EC 3.2.1.3)

1.2.4.3.1 Cấu tạo

γ-amylase (glucoamylase hay α-1,4-glucan-glucohydrolase) là những enzyme

có thể thuỷ phân được cả hai kiểu liên kết của các mạch α-glucan để giải phóng ra ở dạng β

Glucoamylase hay γ-amylase chủ yếu được tạo ra bởi các vi sinh vật Đặc biệt

là kiểu nấm mốc Aspergillus, Penicillium và Rhizopus

Amyloglucosidase từ nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử lượng dao động rất lớn từ 27.000 đến 112.000 Dal tuỳ thuộc vào nguồn gốc của enzyme

Nói chung thì các amyloglucosidase đều chứa các gốc methioni, tritophan, và một nửa gốc cystein Tuy nhiên mối quan hệ giữa chuỗi acid amin, cấu trúc bậc 3 và hoạt động của enzyme vẫn chưa được làm sáng tỏ tất cả các amyloglucosidase từ nấm mốc đều là glucoprotein chứa từ 5 - 20% gluxit trong đó chủ yếu là các mono saccharid glucose mannose, galactose và glucosamin

Các amyloglucosidase chủ yếu được tạo nên từ hai iso enzyme I và II khác nhau ở khả năng thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn và bởi độ bền của chúng amyloglucosidase I tự hấp thụ và thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn, ngược lại amyloglucosidase II không có cả hai tinh chất này

1.2.4.3.2 Cơ chế hoạt động

Amyloglucosidase có thể giải phóng ra β-D-glucose bằng cách thuỷ phân lặp lại nhiều lần các liên kết α-1,4 của mạch α-glucan từ đầu không khử, chúng cũng thuỷ phân được các liên kết α-1,6 và α-1,3 nhưng rất chậm (10 - 30 lần ) Tốc độ thuỷ phân cũng phụ thuộc vào bản chất của các liên kết kề cận với các liên kết glucozit được thuỷ phân, cũng như kích thuớc và cấu trúc của cơ chất bị thuỷ phân Nhất là với các α-glucan mạch dài (amylose và amylopectin) thì bị thuỷ phân nhanh hơn là với các maltodextrin và các oligosaccharit

1.2.4.3.3 Tính chất

Glucoamylase có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside Khi thuỷ phân liên kết α-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose

Enzyme này có nhiều tên gọi khác nhau: α-1,4; α-1,6-glucan-4;

glucohydrolase; glucoamylase; amyloglucosidase; taka- amylase B; γ-amylase là

enzyme nội bào

Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside , glucoamylase còn có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside

Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin, dextrin, panose, iso maltose và maltose thành glucose, mà không cần có

sự tham gia của các loại enzyme khác Glucoamylase thuỷ giải các polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn sovới các chất có phân tử nhỏ Các polisaccharide có nhánh như amylopectin, glucogen, β-dextrin bị glucoamylase thủy phân khá nhanh

Đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng có pH 3,5 – 5,5 và nhiệt độ

500C Nó bền với acid hơn α-amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone và không được bảo vệ bởi Ca2+

1.2.4.4 Oligo 1,6-glucosidase (dextrinase tới hạn) (EC 3.2.1.10)

Enzyme này có thể thuỷ phân liên kết α-1,6 – glucoside trong isomaltose,

panose vàcác dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được Enzyme này có ở vi

sinh vật nhưng đồng thờicũng có trong các hạt nảy mầm (đại mạch, thóc nảy mầm)

Ngoài oligo–1,6–glucosidase, hệ dextrinase của hạt ngũ cốc, hạt nảy mầm còn có

amylopectin-1,6-glucoside hay amylo-1,6-glucoside hay dextrin-1,6-

glucocanhydrolase Hai loại enzyme này đều thủy phân dextrin triệt để hơn α-amylase

và β- amylase trong đó trong dung dịch thủy phân có nhiều maltose hơn

Nhiệt độ tối thích cho các hoạt động của các dextrinase là 400C và pH tối thích

là 5,1

1.2.4.5 Enzyme pullulanase (α-dextrin6-glucosidase) (EC 3.2.1.41)

- Enzyme này có thể thuỷ phân các liên kết α-1,6 của tinh bột, glucogen, pululan và cácdextrin tới hạn Điều đáng chú ý là sự định vị của các liên kết α-1,6 có ảnh hưởng lớn đến tác động của enzyme Đặc biệt là sự có mặt của hai liên kết α-1,4 nằm liền kề bên liên kết α-1,6 là điều kiện cần thiết cho enzyme phân cắt liên kết này

- Pullulanase phân giải các liên kết α-1,6 glucoside bị bao quanh tứ phía bởi các liên kết α-1,4 Nó còn có khả năng thủy phân cả những dextrin phân tử thấp chỉ gồm có hai gốc maltose nối nhau bằng liên kết α-1,6-glucoside Tác dụng hiệp đồng của α- amylase và pullulanase làm nó thủy phân hoàn toàn

1.2.4.6 α-glucosidase (α-D, glucoside-glucohydrolase) (EC 3.2.1.20)

Nhiều loại nấm sợi sản sinh enzyme này Giống như glucomylase, nó thủy

phân thành glucose nhưng không thủy phân tinh bột Maltase và glucozyltranferase là một enzyme đồng nhất vừa có khả năng thủy phân liên kết α-1,4, trong các

glucopiranoside vừa có khả năng chuyển các gốc glucoside sang đường và rượu