Tiểu luận môn công nghệ sinh học Phân tích thực vật chuyển gen

Trong các kỹ thuật ứng dụng côngnghệ sinh học vào nâng cao năng suất, chất lượng giống cây không thể không kểđến kỹ thuật chuyển gen thực vật.. Có nhiều quy trình chuyển gen đã được xây

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM



TIỂU LUẬN

Môn: Công nghệ Sinh học

Đề tài:”Phân tích thực vật chuyển gen”

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Trần Quốc Dung

Học viên thực hiện : Nguyễn Thị Thanh Vinh

Lớp : LL&PPDH bộ môn Sinh học K22

Năm học: 2013-2014

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo – PGS.TS Trần Quốc Dung đã tận tình giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu.

Tuy đã có nhiều cố gắng, nhưng chắc chắn tiểu luận của tôi còn có rất nhiều thiếu sót Rất mong nhận được sự góp ý của thầy giáo và các bạn trong lớp.

Xin chân thành cám ơn!

MỞ ĐẦU

Công nghệ sinh học hiện đại sử dụng kỹ thuật di truyền đã đóng góp đáng kểtrong việc cải tạo năng suất chất lượng cây trồng Hiện nay có rất nhiều cây trồng làsản phẩm của công nghệ sinh học được thương mại trên thế giới đã khẳng định tiềmnăng và khả năng phát triển của lĩnh vực này Trong các kỹ thuật ứng dụng côngnghệ sinh học vào nâng cao năng suất, chất lượng giống cây không thể không kểđến kỹ thuật chuyển gen thực vật

Ngày nay kỹ thuật chuyển gen đã được áp dụng rộng rãi trong việc chuyểncác gen hữu ích vào cây trồng tạo ra các cây trồng có nhiều ưu điểm vượt trộihơn hẳn so với loài ban đầu Trong khoảng thời gian từ năm 1996 đến năm 2005, tỷ

lệ diện tích trồng cây chuyển gen ở các nước đang phát triển đều tăng hàng năm, từ1,7 triệu hecta (1996) lên 90 triệu hecta (2005) chiếm hơn 1/3 diện tích đất trồng câynông nghiệp Điều này cho thấy ngày càng có nhiều nông dân tại các nước phát triển

và đang phát triển chấp nhận và trồng cây chuyển gen Số nước trồng cây biến đổigen đã tăng gấp 3 lần trong vòng 9 năm (từ 6 nước năm 1996 đến 21 nước năm2005) (James, 2007)

Kỹ thuật chuyển gen thực vật cho phép đưa một hoặc nhiều gen có đặc điểm

ưu việt từ những loài có thể rất khác nhau về di truyền vào bộ gen của cây nhậntrong một thời gian ngắn Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật đã đượcthử nghiệm tuy nhiên hiện nay 2 phương pháp được sử dụng rộng rãi hơn cả làchuyển gen bằng súng bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefacien Chuyển gen thông qua vi khuẩn có ưu điểm dễ tiến

hành, khả năng chuyển nạp cao và tiết kiệm chi phí vì vậy nó được tiến hành ở hầukhắp các phòng thí nghiệm Có nhiều quy trình chuyển gen đã được xây dựng cho rấtnhiều các loại cây trồng khác nhau như thuốc lá, cà chua, khoai tây, mía, sắn… Mộtquy trình chuyển gen thực vật bao gồm các bước chính sau: (1) Phân lập gen mongmuốn từ một sinh vật bất kỳ; (2) Tạo dòng và thiết kế vector chuyển gen mang đoạngen mong muốn đó; (3) Biến nạp vector chuyển gen vào thực vật nhận và (4) Chọnlọc, phân tích biểu hiện của gen chuyển

Chuyển gen được hiểu đẩy đủ là: (i) gen ngoại lai (gen chuyển) phải được dunghợp vào hệ gen tế bào chủ; (ii) gen chuyển phải được biểu hiện ở tế bào chủ; (iii) genchuyển phải được di truyền cho các thế hệ sau, trong mỗi thế hệ sản phẩm của genchuyển cũng phải được biểu hiện; và (iv) sản phẩm biểu hiện của gen chuyển phải thểhiện được chức năng sinh học Chính vì vậy quá trình chọn lọc, phân tích cây chuyển

gen trong mỗi thế hệ có thể được thực hiện theo ba nội dung sau:

(1) Xác định sự có mặt của gen chuyển trong tế bào cây chủ (cây mang genchuyển);

(2) Kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển thông qua xác định sản phẩm biểuhiện là mRNA và protein;

(3) Phân tích chức năng sinh học của gen chuyển

Mỗi nội dung có các phương pháp, kỹ thuật phân tích tương ứng, phù hợp và trong thực tiễn có thể tiến hành các phương pháp trong phòng thí nghiệm, nhà lưới hoặc đồng ruộng Qua các thế hệ, cần phân tích, đánh giá và xác định đặc điểm di truyền của gen chuyển (sự di truyền, sự phân ly), phân tích đặc tính di truyền của cây chuyển gen

Hình 1 Mô tả các bước tiến hành và phương pháp phân tích cây chuyển gen

1 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CÂY CHUY ỂN GEN Ở MỨC

ĐỘ PHÒNG THÍ NGHIỆM

Việc xác định nguyên liệu thu được từ hệ thống tái sinh sau biến nạp gen có phải

là cây chuyển gen hay không là rất cần thiết và phải tiến hành đầu tiên Trước hết,chọn lọc các mô, cây chuyển gen bằng các chỉ thị chọn lọc dựa vào các gen chỉ thịphải được tiến hành Sau đó, sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu của genchuyển để xác định sự có mặt của gen trong tế bào cây chuyển gen Muốn xác định sốbản sao được đưa vào genome cây tái sinh phải thực hiện phép lai phân tử Southern

mà mẫu dò là đoạn gen chuyển được đánh dấu huỳnh quang còn DNA nhân cao phân

tử được tách từ cây chuyển gen Xác định gen chuyển có được phiên mã sangmRNA hay không có thể thực hiện bằng RT- PCR với cặp mồi đặc hiệu của genchuyển và khuôn là cDNA từ RNA tổng số của cây cần kiểm tra hoặc lai Northerngiữa mẫu dò là đoạn DNA của gen đánh dấu huỳnh quang và RNA toàn phần của môcây chuyển gen Và bước cuối cùng là xác định gen chuyển có biểu hiện và tạo sảnphẩm cuối cùng của nó bằng kỹ thuật lai Western giữa protein của cây chuyển gen vàkháng thể đặc hiệu với protein đó được tinh sạch từ nguồn khác

1.1 ĐÁNH GIÁ CÂY CHUYỂN GEN BẰNG TÍNH KHÁNG CHẤT CHỌN LỌC

Hầu hết các vector chuyển gen đều được thiết kế hệ thống gen chọn lọc kèm theogen đích cho phép sàng lọc các mô, cây mang gen ở giai đoạn sớm bằng biểu hiệnkháng của gen đó với các chất chọn lọc Các gen chọn lọc có thể là các gen khángkháng sinh, kháng thuốc diệt cỏ, gen chỉ thị màu hoặc gen chuyển hóa các cơ chấtchọn lọc

Thực chất phân tích tính kháng của chất chọn lọc (kháng sinh, chất diệt cỏ) làchọn dòng tế bào, mô và cây mang tính kháng với chất chọn lọc thông qua hoạt độngcủa gen chuyển Chất chọn lọc có thể là kháng sinh như kanamycine khi dùng gen

nptII hay hygromycine khi dùng gen hpt hoặc thuốc diệt cỏ basta khi dùng gen bar.

Bước phân tích này có thể áp dụng cho mọi giai đoạn sau khi biến nạp từ trạng tháiđơn bào đến mô sẹo, chồi tái sinh cây hoàn chỉnh hay cây non gieo từ hạt Cáchthức tiến hành đơn giản: chỉ bổ sung chất theo nồng độ nhất định vào môi trường

nuôi cấy rồi quan sát ảnh hưởng của chất chọn lọc lên mô hoặc cây Biểu hiệnthường thấy đối với mô không mang gen là mất khả năng tạo lục lạp rồi sau đóchuyển nâu đen và chết (hình 2.1(B)) Còn chồi sẽ không thể tạo rễ nếu không manggen chuyển mặc dù được chuyển sang môi trường có nồng độ chất kích thích ra rễcao vì bộ rễ rất nhạy cảm với chất chọn lọc.

Hình 1.1 Mô sẹo của cây cao lương chuyển gen (A) và đối chứng (B) trên

môi trường có chất chọn lọc

Phương pháp thử tính kháng đối với các chất chọn lọc còn được phát triển thànhphương pháp tạo vết cháy trên lá Chất chọn lọc được sử dụng với nồng độ cao hơn

khoảng 2 – 5 lần so với thử in vitro và thường bổ sung thêm Twin 20 để tăng khả

năng bám dính bề mặt sau đó dùng bút lông quét lên lá của cây cần thử, cũng có thểdùng một sợi chỉ bông kích thước lớn hơn chỉ bình thường, thấm dịch thuốc rồivắt sợi chỉ qua nhiều lá của nhiều cây Sau 3 – 5 ngày có thể thấy nơi bôi thuốc hoặcsợi chỉ vắt qua trên các cây không mang gen kháng thuốc hình thành các vết trắnghoặc nâu trên mặt lá do bị mất diệp lục Để đảm bảo chính xác phương pháp nàythường được tiến hành lặp lại 2 – 3 lần

(a) (b)

Hình 1.2 Thử tính kháng kanamycin của bông chuyển gen bằng tạo vết cháy

trên lá (a) bông chuyển gen; (b) đối chứng

Ngoài ra, Việc đưa một gen chỉ thị mã hóa cho một enzyme trong vector chuyểngen cho phép dễ dàng nhận biết mẫu mang gen khi nhuộm bằng chất màu Hệ

thống GUS (gus, gusA và uidA) mã hóa cho protein β-glucuronidase - một phân tử homotetramer lần đầu tiên được phân lập từ E coli (Jefferson et al.1986) β-

glucuronidase thường được sử dụng làm chỉ thị chọn lọc để nhận biết cây chuyểngen bởi ưu điểm dễ nhận biết thông qua nhuộm màu, phản ứng có độ nhạy và ổn địnhcao đồng thời dễ tiến hành định lượng

Ngày nay, việc sử dụng GUS trong chuyển gen thực vật ngày càng được tiếnhành rộng rãi Nhất là trong những thí nghiệm khảo sát quy trình chuyển gen vào

một giống cây mới ( Lopez et al.2004).

Hình 1.3 Biểu hiện gen GUS trong mô bông chuyển gen (A) và đối chứng

không chuyển gen (B)

Ngay sau khi GUS được đưa vào thử nghiệm trong nhận biết cây chuyển gen, nónhanh chóng được phát triển thành hệ thống chỉ thị cho nhiều đối tượng chuyển gen

thực vật (Jefferson et al., 1987) vì ngoài tính nhạy và bền của enzyme nó còn

dễ dàng thực hiện bằng các kỹ thuật khối phổ, so màu và phân tích tế bào học Hơnnữa hầu như không có hoặc rất ít hoạt động của GUS được ghi nhận ở hầu hết mô

thực vật bậc cao (Jefferson et al., 1987, Hu et al., 1990; Kosugi et al., 1990; Muhich,

1998)

Trong thực vật GUS hoạt động như một gen hỗn hợp nhờ một promoter khởi

động quá trình sao mã của trình tự uidA và điều chỉnh biểu hiện gen Sự biểu hiện của

gen sẽ được nhận diện bởi một chất có tên là 5-bromo-4-chloro-3- glucuronide (X-Gluc) hoặc 4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) trong thờigian ngắn Một vài hạn chế đã được ghi nhận trong và sau khi xác định hoạt động

indolyl-β-D-của GUS trong mô chuyển gen đó là: hoạt tính nền (Hu et al., 1990; Thomasset et al., 1996), thường do sự khuếch tán các sản phẩm phản ứng hoặc hoạt động của chất nội sinh; Tính tự phát sáng (Thomasset et al.1996), dập tắt hoặc im lặng (Serres et al., 1997) hoặc sự nhiễm khuẩn.

Gần đây, một hệ thống chọn lọc khác được xem là “tích cực” có thể thay thế hệthống chọn lọc dựa trên kháng sinh, chất diệt cỏ… bởi chất được sử dụng trong chọnlọc bản thân không gây độc cho thực vật và hoàn toàn không có hoạt động sinh học.Trong hệ thống chọn lọc tích cực, gen mã hóa một hoặc một số enzyme sẽ được đưavào vector chuyển gen và cho phép các thực vật chuyển gen sử dụng các hợp chấtchọn lọc trong môi trường để sinh trưởng, những tế bào không mang gen khôngsinh trưởng hoặc sinh trưởng rất chậm trên môi trường có chất chọn lọc Một ví dụ về

hệ thống chọn lọc tích cực được cung cấp bởi Joersbo và Okkels Nghiên cứu này đãthử nghiệm với cây thuốc lá chuyển gen mã hóa β-glucuronidase bằng biến nạp gen

vào lá thông qua Agrobacterim tumefaciens Chất cytokinin glucuronide được cung

cấp dưới dạng một cơ chất và bổ sung vào môi trường nuôi cấy Chỉ những tế bàobiểu hiện GUS mới có thể chuyển hóa cytokinin glucuronide, những tế bào này cóthể tăng sinh và biệt hóa thành rễ trong khi những tế bào không có hoạt động củaGUS không có hiện tượng này (Joersbo & Okkels, 1996) Rất nhanh sau đó, hệ thốngchọn lọc tích cực trong chuyển gen được phát triển không chỉ sử dụng cơ chất liênquan đến hormone thực vật mà cả những chất như nguồn carbonhydrate và nitơ,những chất cần thiết trong nuôi cấy mô

Hệ thống chọn lọc sử dụng carbonhydrate là một trong những hệ thống chọn lọctích cực phổ biến và dễ dàng nhất bởi vì thực vật sinh trưởng trên môi trường nuôicấy đòi hỏi sự có mặt của nguồn carbon Hơn nữa, hầu hết nguồn carbon thường dễkiếm, rẻ và có thể thu nhận từ nhiều nguồn như sucrose, glucose và maltose Nếu đưamột nguồn carbon thay thế cho carbon thực vật vẫn sử dụng vào trong môi trường,trong phần lớn các trường hợp nghiên cứu, tế bào thực vật sẽ không có khả năng pháttriển và chết do các hợp chất sẽ được chuyển hóa và tạo sản phẩm trung gian làm thựcvật nuôi cấy không thể sử dụng để phát triển Ví dụ khi manose được dùng làm chấtchọn lọc nó sẽ nhanh chóng được chuyển hóa thành manose-6-phosphate (M6P), mộtchất thực vật không thể hấp thụ chuyển hóa, bởi hoạt động của hexokinase Trong

trường hợp này, nếu thực vật có mang gen manA của E.coli mã hóa cho

phosphomanose isomerase (PMI) thì PMI sẽ chuyển hóa M6P thành phosphate Hệ thống chọn lọc PMI đã được triển khai hiệu quả khi tiến hành

fructose-6-chuyển gen vào củ cải đường, ngô, lúa, lúa mì, Arabidopsis (Joersbo et al., 1998; Negrotto et al., 2000; Wang et al., 2000; Wringht et al., 2001; Lucca & Potrykus,

2001) và rất nhiều thực vật hai lá mầm cũng như một lá mầm khác Hiện nay, cả hai

hệ thống chọn lọc tích cực và không tích cực đều được sử dụng trong chuyển genthực vật (Brasileiro & Aragao, 2001)

Phương pháp chọn lọc, phân tích cây chuyển gen bằng các chất chọn lọc mặc dù

dễ thực hiện, chi phí thấp tuy nhiên đây chỉ là phương pháp sử dụng ban đầu để loại

bớt những cây không mang gen trong quần thể cây tái sinh sau nuôi cấy vì phươngpháp này không cho biết các gen cần chuyển đã được đưa vào cây hay chưa, các genđưa vào có hoạt động không… Chính vì vậy cần phải có những phân tích sâu hơn

ở mức độ phân tử

1.2 PHÂN TÍCH CÂY CHUYỂN GEN BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ

Trên nguyên tắc gen ngoại lai khi được biến nạp vào tế bào có thể tồn tại trong tếbào chủ ở 3 trạng thái: (1) Tạm thời ở dạng DNA tự do; (2) Lâu dài dưới dạngmột thể plasmid độc lập tự nhân và (3) ổn định như một đoạn DNA của genometrong tế bào chủ và được nhân lên theo dạng tương hợp hay không tương hợp Đây làtrạng thái mong muốn nhất khi tạo cây chuyển gen vì tính bền vững của thể biến nạp,nhưng nó hoàn toàn phụ thuộc vào quá trình tái tổ hợp Hầu hết các nghiên cứu biếnnạp gen thuộc nhân vẫn có thể phát hiện thấy hiện tượng nhân không tương hợp đốivới gen lạ khi hòa đồng vào DNA nhân do vị trí đoạn gen lạ được ghép nối ảnhhưởng đến biểu hiện của chính nó hay gen chủ gần đó Chính vì thế, các phươngpháp sinh học phân tử nhằm xác định sự có mặt của gen và biểu hiện của gen đótrong tế bào là bước làm rất cần thiết

1.2.1 Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR

PCR (Polymerase chain reaction) được Kary B Mullis phát hiện ra năm 1983.Đây là phương pháp trong ống nghiệm để tổng hợp các trình tự DNA đặc hiệu nhờenzyme, sử dụng hai mồi oligonucleotide để khuếch đại vùng DNA quan tâm nằmgiữa hai mồi bằng cách lặp lại nhiều chu kỳ với các bước biến tính 2 mạch DNAkhuôn, bắt cặp các mồi và kéo dài các sợi Kỹ thuật PCR đơn giản dễ thực hiện vớihầu hết các phòng thí nghiệm được trang bị máy PCR Trong phân tích cây chuyểngen, gen chuyển đã được biết trình tự vì vậy chỉ cần sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen

đó và tách chiết DNA từ mẫu thực vật cần xác định làm khuôn là có thể tiến hànhPCR Sử dụng plasmid mang gen chuyển làm đối chứng, nếu sản phẩm PCR khi điện

di có kích thước đúng như dự kiến và bằng với đối chứng thì mẫu phân tíc được coi

là dương tính Tuy nhiên, PCR dương tính không đồng nghĩa với chuyển gen thànhcông vì có nhiều cách để giải thích sự có mặt của DNA trong mẫu phân tích: (1) Vi

khuẩn A tumefaciens mang gen chuyển có thể còn tồn tại trong khối mô hay trong

các gian bào của mẫu phân tích Hiện tượng này xuất hiện ở nhiều loại đối tượng vàđược gọi là dương tính giả Nếu mẫu phân tích của thực vật đã qua nhân giống hữutính tức đã qua một vài thế hệ thì hiện tượng này được loại trừ (2) Gen chuyển tồn tại

tự do trong tế bào chất (có thể biến mất qua sinh sản hữu tính) (3) Gen chuyển khônghoạt động, tức không được phiên mã và biểu hiện ra protein có chức năng sinh học.Chính vì những lý do trên mà kết quả PCR mới chỉ có giá trị định hướng ban đầu

khi phân tích cây chuyển gen.

Tuy nhiên, kỹ thuật PCR lại tỏ ra hữu dụng đối với việc phân tích phát hiệncác mẫu lương thực phực phẩm biến đổi gen (genetic modify origanism- GMO) Đểphục vụ việc xác định GMO, PCR còn được phát triển còn thành kỹ thuật multiplex

PCR (MPCR) (Matsuoka et al., 2001) Với việc sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi

nhận biết các gen khác nhau (promoter, terminator, gen chọn lọc, gen đích…) trongmột phản ứng, MPCR cho phép phát hiện đồng thời nhiều trình tự đích nếu mẫu cómang các gen đó Thông thường các cặp mồi được sử dụng trong multiplex PCR làmồi P35S, TNOS, NPT-II, GUS, EPSPS Nếu kết quả dương tính với bất cứ cặp mồinào thì mẫu cần xác định rất có thể đã được chuyển gen

1.2.2 Phương pháp xác định số bản sao trong cây chuyển gen

Lai Southern để xác định số bản sao trong cây chuyển gen là phương pháp tin

cậy và thông dụng nhất Ngoài việc khẳng định sự tồn tại của gen chuyển tronggenome cây nhận thông qua lai DNA tổng số của mẫu phân tích với DNA mẫu dò

nó còn cho biết số lượng bản sao đã được đưa vào cây Mẫu dò chính là một đoạncủa gen chuyển có kích thước từ 100 – 300 bp được đánh dấu phóng xạ hayhuỳnh quang Các bước chính trong kỹ thuật Southern bao gồm: (1) tách chiếtDNA tổng số của mẫu cần phân tích; (2) Xử lý DNA tổng số với 1 – 2 enzyme giớihạn mà điểm cắt không nằm trên gen; (3) Điện di trên gel agarose; (4) chuyển lênmàng nitrosocellulose hay còn gọi là blotting; (5) Tổng hợp sợi DNA mẫu dò cóđánh dấu phóng xạ hay huỳnh quang bằng PCR với mồi ngẫu nhiên; (6) Lai mẫu dòvới màng DNA và (7) Hiển thị trên phim X quang và phân tích kết quả

Hình 1.4 Mô tả các bước trong kỹ thuật lai southern