ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu là hoạt chất có trong nấm Lim xanh (Ganoderma lucidium) thu từ sinh khối nuôi cấy tại phòng nuôi cấy mô của Khoa CNSH –
CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
3.1.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
Bảng 3.1: Bảng dụng cụ, thiết bị, hóa chất
STT Danh mục vật tƣ thiết bị
A Dụng cụ Nguồn gốc xuất xứ
1 Bình tam giác Trung Quốc
2 Bình định mức Trung Quốc
6 Đũa thủy tinh Trung Quốc
B Hóa chất Nguồn gốc xuất xứ
1 Cồn thực phẩm Việt Nam
2 DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) Trung Quốc
C Thiết bị Nguồn gốc xuất xứ
2 Cân điện tử Trung Quốc
3 Bể ổn nhiệt Trung Quốc
5 Máy đo UV-VIS Đức
Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 12/2016 đến tháng 5/2017.
Nội dung nghiên cứu
3.3.1 Nuôi cấy sinh khối nấm Lim xanh trong môi trường lỏng PD (Potato Dextro)
Nghiên cứ u ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nhân sinh khối của hê ̣ sợi nấm Lim xanh
Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc đô ̣ lắc đến khả năng nhân sinh khối của hê ̣ sơ ̣i nấm Lim xanh
3.3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả trích ly Polysaccharide từ nấm Lim xanh
Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý bằng sóng siêu âm tới hiệu quả trích polysaccharide trong nấm Lim xanh
Nghiên cứu ảnh hưởng cường độ sóng siêu âm ảnh hưởng đến quá trình trích ly polysacharide từ nấm Lim xanh
Nghiên cứu lựa chọn nồng độ dung môi ethanol trích ly polysaccharide từ nấm Lim xanh
Nghiên cứu lựa chọn tỉ lệ nguyên liệu nấm Linh chi/dung môi trích ly polysaccharide trong nấm Lim xanh
Nghiên cứu lựa chọn thời gian trích ly polysacchảide từ nấm Lim xanh
Nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ trích ly polysaccharide từ nấm Lim xanh
Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa
3.3.3 Nghiên cứu tạo sản phẩm trà hòa tan từ nấm Lim xanh
Lựa chọn công thức phối chế cho phù hợp
Đề xuất quy trình tạo sản phẩm trà hòa tan từ nấm Lim xanh
3.3.4 Phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lý
3.3.4.1 Xác định độ ẩm theo phương pháp sấy đến khối lượng không đổi
Sấy mẫu ở nhiệt độ 45-50 o C trong 36-48 giờ giúp tách nước tự do và nước liên kết trong sản phẩm Trong quá trình này, cần theo dõi và cân khối lượng mẫu cho đến khi khối lượng không thay đổi, lúc đó mới dừng sấy Khi lượng nước trong nguyên liệu đã bay hết, phần còn lại chính là chất khô.
Công thức tính: Độ ẩm (w %) đƣợc tính theo công thức sau:
G 1 : Khối lượng mẫu + chén sứ trước khi sấy (g)
G 2 : Khối lƣợng mẫu + chén sứ sau khi sấy (g)
3.3.5 Phương pháp thu sinh khối nấm Lim xanh từ môi trường nuôi cấy lỏng
Sinh khối nấm Lim xanh nuôi lỏng trong bình trụ sẽ đƣợc đem ly tâm
Quá trình ly tâm được thực hiện ở 4000 vòng/phút tại nhiệt độ 18 oC trong 30 phút, sau đó thu hồi sinh khối kết tủa trong ống phancol Sinh khối này được sấy ở nhiệt độ 45-50 oC cho đến khi khối lượng không thay đổi, từ đó thu được sinh khối nấm khô để tiến hành trích ly dưới các điều kiện thử nghiệm.
3.3.6 Định lượng polysaccharide tổng sau khi trích ly bằng phương pháp phenol
Phương pháp được nghiên cứu kỹ lưỡng bởi Dubois et al (1956) và ít thay đổi qua các nghiên cứu sau đó Mặc dù ban đầu được phát triển để phân tích các loại đường tinh khiết từ sắc ký giấy, nhưng các nhà sinh học hiện nay đã nhận ra rằng phương pháp này cũng có thể áp dụng cho việc phân tích tổng số tế bào vi khuẩn Cả thuốc thử và phương pháp đều mang lại lợi thế về sự đơn giản.
Các hóa chất nhƣ sau:
Pha phenol 5%: cân 5g phenol, hòa tan trong bình định mức 100ml bằng nước cất được dung dịch phenol 5%
Chuẩn bị mẫu chuẩn:chất chuẩn là D-glucose
Cân 0,25g D-glucose tinh khiết, hòa tan trong bình định mức 250ml bằng nước cất được dung dịch nồng độ 1mg/ml
Lấy 50ml dung dịch trên vào bình định mức 500ml, định mức bằng nước đến vạch đƣợc dung dịch D-glucose nồng độ 100àg/ml
Lấy lần lượt 25ml, 50ml và 75ml dung dịch D-glucose 100µg/ml, sau đó pha vào mỗi bình định mức 100ml và định mức bằng nước đến vạch để thu được các dung dịch D-glucose có nồng độ tương ứng là 25µg/ml, 50µg/ml và 75µg/ml.
Lấy D-glucose 125ml dung dịch 1mg/ml vào bình định mức 500ml, định mức bằng nước đến vạch được dung dịch D-glucose có nồng độ 250μg/ml
Lần lƣợt lấy 50; 60; 70; 80ml dung dịch 250μg/ml vào bình định mức 100ml, định mức bằng nước đến vạch được các dung dịch D-glucose có nồng độ là 125; 150; 175; 200μg/ml
Các mẫu chuẩn D-glucose pha đƣợc sử dụng cho quá trình phân tích là: 25; 50; 75; 100; 125; 150; 175; 200μg/ml
Mỗi mẫu chuẩn cần lấy 4ml vào ống nghiệm, sau đó thêm vào 4ml dung dịch phenol 5% và 20ml dung dịch H2SO4 96%, lắc đều Các ống nghiệm được đặt trong cốc nước sôi và đun cách thủy trong 2 phút, sau đó làm lạnh ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Mẫu 100µg/ml sẽ được phân tích bằng phương pháp UV-VIS ở chế độ toàn dải, xác định bước sóng hấp thụ cực đại là 486nm Cuối cùng, đo độ hấp thụ quang của các dung dịch chuẩn tại bước sóng 486nm và dựng đường chuẩn.
Phương trình đường chuẩn được xác định là y = 0.9678x, trong đó y đại diện cho độ hấp thụ quang và x là nồng độ mẫu (àg/ml) Đường chuẩn này có hệ số tương quan r² = 0,9799, cho thấy tính chính xác cao Do đó, đường chuẩn này hoàn toàn có thể được sử dụng trong phân tích định lượng nhóm PS.
Cân chính xác từ 0,01-0,06g mẫu cao và hòa tan trong 100ml nước đến vạch định mức Lấy 4ml dung dịch cao cho vào ống nghiệm, thêm 4ml dung dịch phenol 5% và 20ml dung dịch H2SO4 96%, sau đó lắc đều Đun các ống nghiệm trong nước sôi trong 2 phút và để nguội ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Cuối cùng, đo độ hấp thụ quang của các mẫu ở bước sóng 486nm.
3.3.7 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp quét gốc tự do DPPH
Phương pháp quét gốc tự do DPPH là một kỹ thuật đơn giản và dễ thực hiện, được sử dụng để sàng lọc khả năng chống oxy hóa của mẫu nghiên cứu trong các thử nghiệm ban đầu.
DPPH là một gốc tự do ổn định, có màu tím do điện tử N chưa ghép đôi, và không tự kết hợp thành nhị nhân tử Các chất chống oxy hóa sẽ làm giảm màu sắc của DPPH thông qua việc kết hợp với một H, tạo thành DPPH dạng nguyên tử Mức độ mất màu của DPPH tỷ lệ thuận với hoạt tính quét gốc tự do của chất nghiên cứu, được xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 516 nm.
Hình 3.1: Công thức của DPPH
Pha dung dịch DPPH 0,2mM: Cân 0,008g DPPH (dạng bột), sau đó định mức bằng methanol trong bình định mức 100ml thu đƣợc dung dịch DPPH 0,2 mM
Phương pháp này dựa trên khả năng khử DPPH của các chất có thể nhường nguyên tử hydro Khi dung dịch DPPH được kết hợp với dung dịch chứa chất nhường hydro, độ hấp thụ của hỗn hợp sẽ giảm do sự thay đổi màu sắc từ màu tía sang màu vàng nhạt Hiện tượng này xảy ra khi các gốc tự do bị thu gom bởi các chất chống oxy hóa, dẫn đến hình thành dạng DPPH – H bền.
Để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thí nghiệm, cần xác định độ hấp thụ của hỗn hợp Nếu độ hấp thụ giảm nhanh, điều này cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thí nghiệm cao, nhờ vào khả năng nhường hydro hiệu quả.
Chuẩn bị mẫu dịch chiết có hàm lƣợng flavonoid 100ppm
Để tiến hành thí nghiệm, lấy 4ml dịch chiết 100ppm cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 1ml dung dịch DPPH 0.2mM Lắc đều hỗn hợp và để yên trong bóng tối ở nhiệt độ phòng Sau 30 phút, đo độ hấp thụ tại bước sóng 517nm.
Làm mẫu kiểm chứng: Làm tương tự mẫu thí nghiệm trong đó dịch chiết được thay bằng nước cất
Hoạt tính chống oxy hóa, đo bằng % quét gốc tự do DPPH đƣợc tính theo công thức:
% quét DPPH = 100 −OD mẫu thử − OD(mẫu đối chứng)
OD (mẫu thử): độ hấp thụ của mẫu thí nghiệm
OD (mẫu đối chứng): độ hấp thụ của mẫu
3.3.8 Phương pháp đánh giá cảm quan
Chất lượng đánh giá cảm quan được thực hiện bởi hội đồng đánh giá thị hiếu thông qua thang điểm Hedonic từ 1-9, cho phép cho điểm lẻ đến 0,5 Các mức điểm thị hiếu sẽ được xác định dựa trên sự phản hồi của người tiêu dùng.
Cực kỳ không thích 1 điểm
Chỉ tiêu đánh giá: Màu sắc, mùi, vị, trạng thái của sản phẩm [21]
3.3.9 Phương pháp bố trí thí nghiệm
3.3.9.1 Nuôi cấy sinh khối nấm Lim xanh trong môi trường lỏng PD (Potato Dextro) a Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nhân sinh khối của hê ̣ sợi nấm Lim xanh.
Môi trường dinh dưỡng đóng vai trò quan trọng trong việc nuôi trồng sinh khối nấm Lim xanh Để thực hiện, cần chuẩn bị 10 bình trụ 500 ml với 250 ml môi trường lỏng PD đã được hấp khử trùng Tiến hành cấy chuyển sợi nấm từ đĩa thạch PDA sang môi trường lỏng PD, nuôi cấy với tốc độ lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ 22°C trong 3 ngày, theo dõi khối lượng trong 12 ngày và lặp lại thí nghiệm 2 lần Bên cạnh đó, thí nghiệm thứ hai nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng nhân sinh khối của hệ sợi nấm Lim xanh.
Các phương pháp xử lý số liệu
4.1.1 Kết quả nghiên cư ́ u ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nhân sinh khối của hê ̣ sợi nấm Lim xanh Để nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng t ạo sinh khối nấm Lim xanh, chúng tôi thực hiện cấy nấm lên trên 2 môi trường là: PD và CD ở cùng một điều kiện nuôi là 23 o C,cùng tốc độ lắc là 100 vòng/phút không chiếu sáng Chúng tôi thu đƣợc kết quả xác định khối lƣợng sinh khối nấm Lim xanh qua các ngày theo dõi và xây dựng đường cong sinh trưởng như hình 4.1
Bảng 4 1: Sinh khối nấm thu được trên các môi trường khác nhau
Sinh khối nấm sau thu đƣợc sau các ngày nuôi ( g/l )
2 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày 10 ngày 12 ngày
Hình 4.1: Biểu đồ thể hiện đường cong sinh trưởng của sinh khối nấm Lim xanh trên các môi trường khác nhau
Sinh khối nấm thu đƣợc (g/l)
