Tạp chí Nghề cá sông Cửu Long: Số 09/2017

Tạp chí Nghề cá sông Cửu Long: Số 02/2017 trình bày các nội dung chính sau: Ảnh hưởng của 17α - methyltestosteron lên chất lượng màu sắc của cá bảy màu (Poecilia reticulata), sinh sản nhân tạo cá lăng vàng (Hemibagrus nemurus Valenciennes, 1839) tại Đồng Tháp, thực nghiệm nuôi thâm canh tôm sú (Penaeus monodon) kết hợp cá nâu (Scatophagus argus) ở các mật độ khác nhau,... Mời các bạn cùng tham khảo để nắm nội dung chi tiết.

Ảnh hưởng của 17α - methyltestosteron

lên chất lượng màu sắc của cá bảy màu (Poecilia reticulata)

The effect of 17α - methyltesteosteron on the color quality of guppies (Poecilia reticulata)

NGUYỄN THỊ KIM LIÊN, VŨ CẨM LƯƠNG

3 - 9

Sinh sản nhân tạo cá lăng vàng (Hemibagrus nemurus Valenciennes, 1839) tại Đồng Tháp Induced spawning of nemurus catfish (Hemibagrus nemurus Valenciennes, 1839) in Dong Thap province

NGUYỄN THỊ LONG CHÂU , MAI ĐÌNH BẢNG

HOÀNG THỊ THANH NGA, LÝ VĂN KHÁNH

19 - 25

Nghiên cứu vi khuẩn không thuộc nhóm vibrio

có khả năng kết hợp với vibrio parahaemolyticus

gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng ở Thái Lan

Study of non-vibrio bacteria as potential associates of vibrio parahaemolyticus in causing AHPND in white-leg shrimp in Thailand

TRƯƠNG HỒNG VIỆT, AJAREE NILAWONGSE, KALLAYA

SRITUNYALUCKSANA, TIMOTHY W FLEGEL,

SIRIPONG THITAMADEE

26 - 42

Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn nitrate hóa tuyển chọn và ứng dụng của nó trong nuôi trồng thủy sản

Nitrifying bacteria and application in aquaculture

HOÀNG PHƯƠNG HÀ, ĐỖ THỊ TỐ UYÊN, ĐỖ THỊ LIÊN,

CUNG THỊ NGỌC MAI, VŨ NGỌC HUY, NGUYỄN HỒNG THU, LÊ LỢI, LÊ THỊ NHI CÔNG

43-54

Sàng lọc vi khuẩn lactic có khả năng kháng

vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

Screening of latic acid bacteria for their antimicrobial activity against Aeromonas hydrophila causing hemorrhagic disease in tra catfish (Pangasianodon hypophthalmus)

TRẦN THỊ NGỌC PHƯƠNG, ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

55-66

NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG

TS PHAN THANH LÂM

Thư ký tòa soạn:

ThS HOÀNG THỊ THỦY TIÊN

Email: ria2@ mard.gov.vn

In tại: Công ty In Liên Tường

240/59-61-63 Nguyễn Văn Luông

Quận 6, TP HCM

Đánh giá sự đa dạng sinh học của họ cá bống ở

các thủy vực khác nhau trong vùng rừng ngập

mặn ven biển mỏ Ó, huyện Trần Đề, tỉnh Sóc

Trăng

Diversity of gobiidae and eleotridae families at

different habitats in Mo O’s mangrove, Tran De

district, Soc Trang province

TRANG LÂM NGÂN HÀ, TRẦN XUÂN LỢI

78-88

Nghiên cứu thành phần loài cá ở 2 hồ chứa: hồ

Tây và hồ Đắk R’tang thuộc tỉnh Đắk Nông

Studying of fish species composition in 2 reservoirs

of tay and Dak rtangin Dak Nong province

ĐẶNG NGỌC HẢO, NGÔ THỊ THU HIỀN, LÊ THỊ TUYẾT MAI,

VÕ THỊ THANH NHÀNG, NGUYỄN VÕ THANH THÚY, TRẦN

VĂN PHƯỚC

89-99

Hiện trạng kỹ thuật và tài chính của mô hình

nuôi cá chình (Anguilla marmorata) ở tỉnh

Cà Mau

Status of technical and economical aspects of

ell (Anguilla marmorata) pond culture in Camau

province

LÝ VĂN KHÁNH

100-107

Ảnh hưởng của gluten, tinh bột biến tính, bột

mì đến một số đặc tính của chả cá từ phụ phẩm

cá chẽm

Effect of gluten, wheat flour, modified starch on quality, criteria of the fish cake which is made from barramundi by-product

LÊ HUYỀN TRÂM, PHẠM THỊ HIỀN, PHẠM THỊ ĐAN

PHƯỢNG

119-125

Ảnh hưởng của NH3 lên tăng trưởng, tỷ lệ sống,

và chất lượng của thịt cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

The effects of ammonia (NH 3 ) on growth, survival, and meat quality of striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus)

NGUYỄN THỊ TRÚC LINH, TRƯƠNG QUỐC PHÚ, VÕ LÊ GIA

LINH, TRẦN THỊ NGỌC PHƯƠNG

126-136

I GIỚI THIỆU

Tại thành phố Hồ Chí Minh, cá cảnh được

xem là một trong những đối tượng nuôi chủ lực và

đã trở thành một ngành kinh doanh mang lại hiệu

quả kinh tế cao Trong 9 tháng đầu năm 2013,

thành phố đã xuất khẩu hơn 7 triệu cá cảnh, lượng

cá cảnh xuất khẩu trong 6 tháng đầu năm tăng đột

biến với mức hơn 32% so với cùng kỳ năm 2012

(Trung tâm tư vấn và hỗ trợ nông nghiệp Thành

phố Hồ Chí Minh, 2012) Trong các loài cá cảnh

xuất khẩu, cá cảnh nước ngọt có 60 loài (chiếm

99%), trong đó sản lượng chủ yếu là cá Bảy màu

(Poecilia reticulata), dĩa (Symphysodon spp), ông

tiên (Pterophyllum spp.), hòa lan (Xiphophorus

spp.), hồng kim (Xiphophorus hellerii Heckel,

1848), moly (Poecilia spp.)… Riêng về số

lượng xuất khẩu và tiêu thụ nội địa, cá bảy màu

hiện đang đứng hàng đầu, với lượng xuất khẩu

hơn 2 triệu con/năm (Trung tâm tư vấn và hỗ trợ

Nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, 2012)

Cá bảy màu là một trong những loài cá cảnh

phổ biến nhất ở Việt Nam So với cá cái, cá bảy

màu đực luôn được ưa chuộng và có lợi thế kinh

doanh vì có màu sắc vượt trội, cũng như có các

dạng vây đuôi và lưng thật đa dạng, đẹp mắt

Nếu để cá sinh sản tự nhiên thì tỉ lệ cá đực và

cá cái trung bình là 1:1, điều này không có lợi cho người nuôi và kinh doanh cá bảy màu vì

để nhận diện và loại cá cái thì phải ương nuôi đến 90 ngày tuổi Các nghiên cứu đực hóa cá Bảy màu đã được nghiên cứu từ nhiều năm nay (Pandian và Sheela, 1995;Dzwillo 1962; 1966) tuy nhiên hiện vẫn chưa có nghiên cứu đánh giá

về chất lượng màu sắc của cá bảy màu sử dụng 17α - MT trong quá trình đực hóa Việc nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của 17α - MT lên chất lượng màu sắc của cá bảy màu có thể là gợi ý về tính hiệu quả của giải pháp này

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Chọn cá bố mẹ cho sinh sản là cá có kiểu hình da rắn vì những hoa văn và màu sắc nổi bật của kiểu hình này có thể giúp nâng cao hiệu quả đánh giá chất lượng màu sắc của cá con Cá bố

mẹ được nuôi vỗ riêng đực cái một tháng trước khi tiến hành sinh sản Tỷ lệ cá bố mẹ cho sinh sản được là 1:1, bố trí thành 12 bể kính kích thước 0,5 x 0,5 x 0,3 m, mỗi bể bố trí một cặp

cá bố mẹ

Thí nghiệm gồm có 4 nghiệm thức, mỗi

ẢNH HƯỞNG CỦA 17α - METHYLTESTOSTERON LÊN CHẤT

LƯỢNG MÀU SẮC CỦA CÁ BẢY MÀU (Poecilia reticulata)

Nguyễn Thị Kim Liên1*, Vũ Cẩm Lương2

TÓM TẮT

Sản xuất cá bảy màu toàn đực đã được ứng dụng cho mục đích thương mại, tuy nhiên hiện chưa có nghiên cứu báo cáo về chất lượng màu sắc của cá bảy màu đực được chuyển đổi giới tính Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá ảnh hưởng của 17α - Methyltestosteron (17α - MT) lên chất

lượng màu sắc của cá bảy màu (Poecilia reticulata) Trong nghiên cứu này, cá bảy màu mẹ đang

mang thai được cho ăn thức ăn có chứa 17α- MT với liều 300, 400 và 500 mg/kg thức ăn trong thời gian từ 5 – 9 ngày trước khi đẻ Kết quả sản xuất được 94,9 - 98,8% cá bảy màu đực, trong đó có thể phân biệt được cá đực XX so với cá đực XY ở 90 ngày tuổi thông qua kích thước thân và hình dạng vây đuôi Việc kiểm tra thêm cá đực XX được tiến hành qua giao phối với cá cái XX đã cho kết quả 96,5% cá cái ở 90 ngày tuổi Kết quả cũng chỉ ra rằng 17α – MT đã không thể cải thiện thêm chất lượng màu sắc của cá đực XY so với cá XY đối chứng, trong khi chất lượng màu sắc của cá đực XX được cải thiện tương đương với cá XY đối chứng ở phần thân nhưng kém đẹp hơn cá XY đối chứng ở các vây lưng và đuôi.

Từ khóa: Cá bảy màu, 17α – Methyltestosteron, chất lượng màu sắc.

1 Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao thành phố Hồ Chí Minh

2 Khoa thủy Sản- Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

*Email: lienkimnguyen85@gmail.com

đỏ trứng gà luộc (2 trứng) Cá thí nghiệm được

cho ăn 3 lần/ngày với monia, trùn chỉ và thức ăn

viên, cho ăn vừa đủ, thay nước 1 lần/ngày với

lượng 50%/lần

Thời điểm tiến hành cho cá mẹ mang thai

nghiệm bằng thang điểm ở Bảng 1 Người đánh giá là những người am hiểu về cá cảnh nói chung và có kinh nghiệm nuôi cá bảy màu nói riêng, chọn 5 người để đánh giá độc lập

Bảng 1 Thang điểm đánh giá chất lượng màu sắc cá Bảy màu

Thang điểm (điểm) Độ đậm nhạt của màu sắc Độ sắc nét của hoa văn

Số liệu thu thập sẽ được tính toán bằng

phần mềm Excel và phân tích thống kê bằng

phương pháp ANOVA một yếu tố sử dụng phần

mềm thống kê Minitab 16 Sự khác nhau giữa

các nghiệm thức thí nghiệm được xác định bằng

trắc nghiệm Tukey với mức ý nghĩa 95% và trắc

cá đực ở nghiệm thức đối chứng được giả định là

cá đực XY; nhóm còn lại cá có vi đuôi không xòe rộng trong khi kích thước thân lớn hơn cá đực

XY đối chứng, được giả định là cá đực XX

* Thang điểm do chính cá nhân tự xây dựng để phục vụ cho nghiên cứu này Điểm số màu sắc của

cá ở mỗi thí nghiệm là điểm trung bình cộng của 5 người tham gia đánh giá dựa theo thang điểm từ 1 - 9 điểm, 5 người tham gia đánh giá đã được chúng tôi hướng dẫn cụ thể trước khi cho điểm.

Bảng 2 Tỉ lệ đực cái trong các thế hệ cá con khi cá mẹ được ăn 17α - Methyltestosteron

Tỉ lệ cá đực trung bình (%)

Tỉ lệ sống cá 90 ngày tuổi ở nghiệm thức xử

lý 17α - MT với liều 300 và 400 mg/kg thức ăn

là 96,3 và 95,8% còn tỷ lệ sống ở nghiệm thức

đối chứng là 94,5%, sự khác biệt này không có ý

nghĩa thống kê Nhưng ở nghiệm thức 500 mg/

3.3 Nhận dạng cá đực XY, cá đực XX và

cá cái XX

Cá đực XY: Vi lưng và đuôi của cá đực dài, trên thân và vây đuôi có màu sặc sỡ, thân thuôn dài và có kích thước nhỏ hơn so vớicá cái XX

Cá cái XX: Thân màu xám nâu, vây đuôi màu hồng nhạt, thân hình ống tròn và có kích thước lớn hơn so với cá đực XY

Cá đực XX: Vây đuôi không xòe rộng và kích thước thân lớn hơn cá đực XY ở nghiệm thức đối chứng So với cá cái XX thì cá đực XX

có da rắn xuất hiện trên thân

Hình 1 Cá đực XX, cá đực XY và cá cái XX

Ghi chú: XX * là cá đực XX giả định

3.4 Chất lượng màu sắc của cá đực XX

so với cá đực XY

Dựa vào độ đậm nhạt của màu sắc và độ sắc

nét của hoa văn trên thân và đuôi cá (xem thang

điểm ở phần phương pháp nghiên cứu), nghiên

cứu đã tiến hành đánh giá chất lượng màu sắc

của cá bảy màu đực XX so với cá đực XY ở

nghiệm thức đối chứng Kết quả ở Bảng 5 cho

thấy, điểm số màu sắc trên thân cá ở các nghiệm

thức không có sự khác biệt về thống kê (P >

0,05) Cá đực XX dưới tác dụng của 17α - MT

có màu sắc và hoa văn trên thân khá giống cá đực XY bình thường Với các liều 17α - MT khác nhau thì điểm số màu sắc trên thân và đuôi

cá cũng khác biệt không có ý nghĩa thống kê, điều này chứng minh ở liều 300 mg/kg đủ để cá thể hiện màu sắc Tuy nhiên, màu sắc trên vây đuôi và vây lưng của cá đực XX so với cá đực

XY thì khác biệt có ý nghĩa thống kê Vây đuôi

cá đực XX có đường nét hoa văn không rõ so với cá đực XY

Bảng 5 Đánh giá chất lượng màu sắc của cá đực XX so với cá đực XY

Nghiệm thức Liều lượng 17α - MT

(mg/kg) Điểm số màu sắc trên thân cá Điểm số màu sắc trên vây lưng và vây đuôi cá

Hình 2 Cá đực XX so với cá đực XY

Hình 3 Cá đực XX ở các liều 17α - MT khác nhau 3.5 Chất lượng màu sắc của cá đực XY

ở nghiệm thức xử lý 17α – MT so với cá đực

XY đối chứng

Điểm số màu sắc của cá đực XY được sinh

ra từ cá mẹ ăn 17α - MT khác biệt không có ý

nghĩa thống kê so với cá đực XY ở nghiệm thức

đối chứng Điều này có thể do, bản thân cá đực

XY đã mang nhiễm sắc thể giới tính Y mà tất

cả các gen màu trên Y đều trội (Kirpichnikov, 1987) Những cá đực XY có màu sắc được biểu hiện rõ bởi những gen quy định màu sắc trên nhiễm sắc thể Y Do vậy, dưới tác dụng của 17α

- MT, thì chất lượng màu sắc của cá đực XY khác biệt không có ý nghĩa thống kê

Bảng 6 Điểm số màu sắc của cá đực XY ở nghiệm thức xử lý 17α - MT so với cá đực XY đối chứng

Kết quả ghi nhận qua Bảng 7 thể hiện điểm

số màu sắc ở cá đực XX cao hơn và khác biệt có

ý nghĩa với cá cái XX (P < 0,05).

Bảng 7 Điểm số màu sắc cá đực XX so với cá cái XX Nghiệm thức Điểm số màu sắc trên vây lưng và vây đuôi Điểm số màu sắc trên thân cá

Số liệu trình bày trong bảng là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của từng nghiệm thức, số liệu trên cùng cột có các chữ cái khác nhau thể hiện sai khác có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).

Ethynylestradiol để cái hóa cá bảy màu với liều

500 mg/kg thức ăn thì tỉ lệ trung bình cá chết là

67,4%, có trường hợp toàn bộ cá con chết sau

khi được sinh ra

Nhiễm sắc thể định đoạt giới tính ở cá bảy

màu là XY (Winge, 1992; Winge và Ditlevsen,

1947 qua Fernando và Phang, 1989) Nét độc

đáo ở loài cá này là sự tập trung đa số các gen

màu sắc, gen cấu tạo vi trên các nhiễm sắc thể

giới tính: 19 gen màu luôn luôn liên kết với

nhiễm sắc thể Y và trên 16 gen với nhiễm sắc

thể X và Y Tất cả các gen trên Y đều trội, các

gen trội màu sắc ở cá cái không hoạt động vì sự

biểu hiện của các gen màu sắc được kiểm soát

bởi các hormon sinh dục đực (Kirpichnikov,

1987) Dzwillo (1962, 1966); Haskins và ctv

(1970) cho rằng việc thêm testosteron vào nước

hoặc thức ăn cho phép tạo ra những con đực

XX với những gen màu sắc được biểu hiện Kết

luận này đã được khẳng định lại trong kết quả

thí nghiệm Những cá bảy màu đực XX được

sinh ra từ cá mẹ mang thai ăn thức ăn có trộn

17α - MT trong thời gian 5 - 9 ngày trước khi đẻ

ở đuôi cũng do gen trội nằm trên nhiễm sắc

thể Y qui định (gen Sst) Theo dõi quá trình thí

nghiệm, cá bảy màu đực có tính trạng da rắn ở

thân và đuôi, cá bảy màu cái thì không có tính

trạng này, chỉ có màu sắc thể hiện ở vây đuôi

Quan sát thí nghiệm chúng tôi ghi nhận, cá đực

XX được tạo ra từ cá XX di truyền ăn 17α - MT

thì màu sắc và tính trạng da rắn trên thân đã biểu

hiện Điều này có thể do tính trạng da rắn này

hiện của các gen màu sắc được kiểm soát bởi hormon sinh dục đực Vì thế những cá đực XX tạo ra từ cá mẹ ăn 17α - MT trong một thời gian thì tính trạng này được biểu hiện Kết quả ghi nhận qua Bảng 7 thể hiện điểm số màu sắc ở cá đực XX cao hơn và khác biệt có ý nghĩa với cá

cái XX (P < 0,05).

V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Cá cái XX mang thai ăn 17α - MT với liều

300 - 500 mg/kg thức ăn trong thời gian 5 - 9 ngày trước khi cá đẻ có thể sản xuất được tỷ lệ 94,9-98,8% cá bảy màu đực Có thể phân biệt được cá đực XX so với cá đực XY ở 90 ngày tuổi thông qua kích thước thân và hình dạng vây đuôi Việc kiểm tra thêm cá đực XX được tiến hành qua giao phối với cá cái XX đã cho kết quả 96,5% cá cái ở 90 ngày tuổi Kết quả cũng chỉ ra rằng 17α – MT đã không thể cải thiện thêm chất lượng màu sắc của cá đực XY so với cá đực XY đối chứng, trong khi chất lượng màu sắc của cá đực XX được cải thiện tương đương với cá XY đối chứng ở phần thân nhưng kém đẹp hơn cá

XY đối chứng ở các vây lưng và đuôi

Việc tạo cá bảy màu toàn đực bằng17α -

MT đã chưa thể tạo được cá đực XX đẹp tương đương cá đực XY Đề nghị nên có hướng nghiên cứu tạo cá siêu đực YY và cho giao phối cá siêu đực YY với cá cái XX để tạo ra 100% cá đực

XY cung cấp cho thị trường

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Trung tâm tư vấn và hỗ trợ nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, 2012 Xuất khẩu cá cảnh thành phố Hồ Chí Minh, tiềm năng cơ hội và thách thức

Dzwillo M., 1962 Uber kiinstliche Erzeugung funktioneller Mannchen weiblichen

Genotyps bei Lebiates reticuzatus Bioz zentrazbz

81: 575 - 584

Dzwillo M., 1966 Uber den Einfluss von

Methyltestosteron auf primare und sekundare

Geschlechtsmerkmale wahrend verschiedener

phasen der embryonal - entwickiung von lebiates

reticuzatus Zooz Anz., Suppl 29: 471 - 476.

Fernando A.A and Phang V.P.E., 1990 Inheritance

of red and blue caudal fin colourations in two

domesticated varieties of the guppy, Poecilia

reticulata J Aqua Trop 5: 209 - 217.

Fernando A.A and Phang V.P.E., 1989 X - linked

inheritance of red and blue tail colourations of

domesticated varieties of the guppy, Poecilia

reticulate and its implications to the farmer

Singapore J Pri Ind 17 (1): 19 - 28.

Guerrero R.D., 1975 Use of androgens for the

production of all male Tilapia aurea Trans

Am Fish Soc 104: 342 - 348

Haskins C.P., Young P., Hewitt R.E and Haskins E.F., 1970 Stabilizer heterozygosis of supergenes mediating certain Y - linked colour

patterns in population of Lebistes reticulatus Heredity, Vol 25: 575 - 589.

Kavumpurath S and Pandian T.J., 1992

Production of YY male in the Guppy poecilia reticulata by Endocrine sex reversal and progeny testing asi Fish sci 5: 265 - 276 Kirpichnikov V.S., 1987 Di truyền và chọn giống

cá (Nguyễn Tường Anh dịch) Nxb Lêningrad,

98 - 129

Pandian T.J and Sheela S.G., 1995 Hormnal

Induction Of Sex Reversal In Fish Aquaculture

138: 1 – 22

THE EFFECT OF 17α - METHYLTESTEOSTERON ON THE

COLOR QUALITY OF GUPPIES (Poecilia reticulata)

Nguyen Thi Kim Lien1*, Vu Cam Luong2

XY male throughout the body size and caudal fin shape Further test of XX male by mating with

XX female resulting 96.5% of 90-day-old female guppy The results also showed that the 17α - MT can not improve the color quality of XY male guppies comparing with original XY male, while the color quality of XX male guppies was similar with original XY male at the body and less than with the original XY male at the dorsal and caudal fins.

Keywords: Guppy,17α – Methyltestosteron, color quality.

Người phản biện: ThS Nguyễn Thanh Vũ

Ngày nhận bài: 25/11/2016 Ngày thông qua phản biện: 13/12/2016

Ngày duyệt đăng: 05/01/2017

1 Research and Development Center for High Technology Agriculture, HCMC

2 Faculty of Fisheries, Nong Lam University

*Email: lienkimnguyen85@gmail.com

Nghiên cứu sinh sản cá lăng vàng được thực hiện tại trại thực nghiệm Trường Cao đẳng cộng đồng Đồng Tháp và Trường trung cấp nghề - giáo dục thường xuyên Hồng Ngự trong hai năm 2015 và

2016 Cá bố mẹ được thu gom từ tự nhiên khu vực Đồng Tháp Để kích thích sinh sản cá, 2 loại hormon được sử dụng là HCG và LRHa + DOM Kết quả cho thấy, thời gian hiệu ứng kích dục tố dao động từ 344,33 – 458,33 phút Sức sinh sản thực tế cao nhất là 36.125,67 trứng/kg ở nghiệm thức sử dụng (150µg + 5mg) LRHa + DOM Trứng cá sau khi thụ tinh được chuyển sang bình weys

để ấp nở, nhiệt độ trong bể ấp được duy trì ổn định trong khoảng 28 – 30 0 C nhờ hệ thống gia nhiệt

tự động Tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở cao nhất đạt 67,28% và 77,63% Thời gian phát triển phôi cho đến khi cá nở là 18 giờ 26 phút Cá sau khi nở được chuyển sang bể composite thể tích 4m 3 để ương, mật độ ương là 10.000 con/m 3 Thức ăn trong 6 ngày đầu là Moina, từ ngày thứ 7 trở đi tập cho cá

ăn thức ăn công nghiệp 40% đạm Sau 30 ngày ương cá đạt chiều dài là (28,6 – 30,5) mm và trọng lượng tương ứng là (0,26 – 0,32) g Tỷ lệ sống của quá trình ương cá đạt (65,72 – 76,51)%.

Từ khóa: Cá lăng vàng, sinh sản nhân tạo, tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ nở.

I GIỚI THIỆU

Cá lăng vàng (Hemibagrus nemurus)

là một trong những loài thuộc họ cá lăng

Hemibagrus đang được nuôi và mang lại hiệu

quả kinh tế cao cho nghề nuôi cá nước ngọt

(Bùi Anh Tuấn và Nguyễn Tường Anh, 2011)

Cá được nuôi trong ao đất hoặc nuôi trong lồng,

có thể nuôi bán thâm canh hoặc thâm canh ở

nhiều địa phương trong cả nước (http://www

thuysanvietnam.com.vn) Những nghiên cứu về

sinh sản nhân tạo cá lăng vàng được ghi nhận từ

những năm 2003 (Ngô Văn Ngọc và Bùi Minh

Phụng, 2003) Năm 2006, tài liệu kỹ thuật sản

xuất giống và nuôi cá lăng nha, cá lăng vàng

của Nguyễn Chung được xuất bản bởi nhà xuất

bản nông nghiệp Đến năm 2011, Bùi Anh Tuấn

và Nguyễn Tường Anh sử dụng 3 phương thức

dùng hormone khác nhau để kích thích sinh sản

cá lăng vàng Nhìn chung, các tác giả đều đưa ra

được những kết quả tốt để áp dụng vào thực tiễn

sản xuất giống Hiện nay, do sự thay đổi cơ cấu

về giống loài nuôi, nhu cầu con giống cá lăng

vàng phục vụ cho nghề nuôi cá thương phẩm

ngày càng lên cao Do đó nghiên cứu “Sinh sản

nhân tạo cá lăng vàng (Hemibagrus nemurus)

tại Đồng Tháp” đã được thực hiện

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nguồn cá bố mẹ

Cá bố mẹ được thu gom từ tự nhiên ở khu vực Đồng Tháp, cá có khối lượng từ 270 - 480 g/con Tổng khối lượng cá bố mẹ là 40 kg Thời

1 Trường Cao đẳng cộng đồng Đồng Tháp.

2 Trường Trung cấp nghề - giáo dục thường xuyên Hồng Ngự.

* Email: ntlchau.dtcc@gmail.com

điểm thu gom cá trùng với thời điểm cá sinh

sản ngoài tự nhiên Sau đó, cá được đưa về nuôi

thuần dưỡng trong bể composite trong vòng 2

tuần trước khi được đưa vào tham gia sinh sản

Trong quá trình nuôi thuần dưỡng cá được cho

ăn thức ăn là cá tạp băm nhỏ, cho ăn theo nhu cầu, ngày cho ăn một lần Hàng ngày tiến hành siphon thay nước, lượng nước thay khoảng 20%

Hình 1: Cá lăng bố mẹ

Hình 2: Buồng trứng và buồng sẹ cá lăng

2.2.2 Thí nghiệm sinh sản nhân tạo cá lăng

* Chọn cá bố mẹ cho sinh sản

- Cá cái: Cá khỏe mạnh không bị xây xát,

không thương tật, có phần bụng dưới to, mềm

đều, biểu hiện da bụng mỏng, lỗ sinh dục sưng

và ửng hồng

- Cá đực: Thân thon dài, khỏe mạnh, không

bị xây xát, thương tật, gai sinh dục dài và ửng màu trắng hồng ở đầu mút, có nhiều mạch máu vùng da bụng

* Tiêm kích dục tố cho cá sinh sản:

Cá lăng được kích tích sinh sản bằng 2 loại

kích dục tố là HCG và LRHa + DOM được thể hiện cụ thể qua bảng dưới đây

Bảng 1: Bố trí thí nghiệm tiêm kích dục tố cho cá sinh sản

Loại kích dục tố Liều sơ bộ Liều lượng Liều quyết định

Hình 3: Tiêm cá

Sau khi tiêm liều quyết định 6 giờ, cá có

dấu hiệu sinh sản (bụng mềm, khi lật ngược cá

lên bụng chảy qua hai bên) tiến hành kiểm tra

sự rụng trứng bằng cách vuốt nhẹ bụng cá, thấy

trứng chảy ra chứng tỏ trứng đã rụng Sau đó

tiến hành vuốt trứng theo hướng từ đầu xuống

bụng và dùng thau để chứa trứng Đồng thời, tiến hành mổ cá đực lấy buồng sẹ (hình lược, dọc xương sống) rửa bằng nước cất, lau sạch, dung kéo cắt nhỏ và dùng cối nghiền Sau đó tiến hành gieo tinh nhân tạo

Hình 4: Vuốt trứng cá lăng

Trứng sau khi được thụ tinh nhân tạo thì

được khử dính bằng dung dịch Tanin 0,1%

Hệ thống sử dụng trong thí nghiệm của

chúng tôi là hệ thống bình weys có gia nhiệt

nhằm nâng cao tỷ lệ nở của cá bột Sơ đồ bố trí

của hệ thống này được mô phỏng như sau:Nhiệt độ trong bể ấp được duy trì trong khoảng 28 – 300C nhờ bộ điều khiển nhiệt độ tự động Thiết bị này có hiển thị nhiệt độ hiện tại trong bể ấp và các nút điều khiển nhiệt độ trong khoảng thích hợp cho sự phát triển của phôi cá Khi nhiệt độ tăng cao hơn mức cài đặt thì máy nước nóng sẽ ngưng hoạt động và khi nhiệt độ xuống thấp dưới mức cài đặt thì máy nước nóng

sẽ hoạt động trở lại để cung cấp nhiệt độ cho

bể ấp

Hình 5: Cấu tạo mô hình hệ thống bình Weys ấp nở trứng cá có gia nhiệt

2.2.3 Ương cá lăng bột

Cá được ương trong bể composite thể tích

4m3, mật độ ương là 10.000 con/m3 Bể trước

khi ương được vệ sinh sạch sẽ Cấp khoảng 0,8

– 1m nước, sau đó bố trí cá bột vào ương

Sau khi cá hết noãn hoàng thì cấp trứng

nước vào bể ương, lượng trứng nước duy trì

khoảng 5 con/mL, nếu kiểm tra thấy ít thì cấp bổ

sung Từ ngày thứ 7 bắt đầu tập cho cá ăn thức

ăn công nghiệp dạng bột, có độ đạm là 40%

Đến ngày thứ 10 thì cá chuyển sang ăn thức ăn

công nghiệp hoàn toàn

Trong quá trình ương từ ngày thứ 9 trở đi

cá có sự phân đàn, tiến hành phân cỡ định kỳ 1

Sức sinh sản tuyệt đối 32.750 trứng

Sức sinh sản tương đối 93.324 trứng/kg cá cái

Qua bảng trên ta thấy cá lăng vào mùa sinh

sản đạt tỷ lệ thành thục khá cao (90%) với hệ

số thành thục là 26,7% Kết quả này cao hơn

so với kết quả của Ngô Văn Ngọc (2003) hệ số

thành thục của cá lăng vàng là 20,8 – 25% Có

thể giải thích cho sự khác biệt này có thể do cá

tự nhiên thành thục tốt hơn so với cá nuôi vỗ

trong ao đất Kết quả này cũng cao hơn cá lăng

nha khi hệ số thành thục của loài này chỉ là 3,6 – 8,5% (Ngô Văn Ngọc, 2003) Nguyên nhân

là cá lăng vàng có kích thước nhỏ nhưng khối lượng buồng trứng lớn

Sức sinh sản của cá lăng vàng rất cao so với các loài cá da trơn khác vì chúng có hệ số thành thục cao và kích thước trứng khá nhỏ, đường kính trứng chín từ 1,17 - 1,32mm (Bộ thủy sản, 2005) Sức sinh sản tương đối và tuyệt đối của

cá lăng vàng kích thước 310 – 450g theo ghi nhận của chúng tôi lần lượt là 93.324 trứng/

kg cá cái và 32.750 trứng Theo Bộ thủy sản (2005), sức sinh sản tuyệt đối của cá cái có khối lượng 774,4 g là 39.079 trứng, kết quả này cao hơn ghi nhận của chúng tôi có thể do sự khác biệt về kích cỡ cá thí nghiệm

Kích thích sinh sản nhân tạo cá lăng vàng bằng 2 loại hormone là HCG và LRHa + DOM kết quả được thể hiện theo bảng sau:

Bảng 3: Kết quả kích thích sinh sản cá lăng vàng

Nghiệm thức T(phút)hiệu ứng SSS thực tế (trứng/kg) Tỷ lệ thụ tinh (%) Tỷ lệ nở (%) Tỷ lệ sống hết noãn

hoàng (%)HCG (UI/Kg)

Từ kết quả trên ta thấy, đối với thời gian

hiệu ứng kích dục tố trong các nghiệm thức

kích thích cá lăng vàng sinh sản cùng một loại

kích dục tố thì không có sự khác biệt giữa các

nồng độ tiêm khác nhau (p>0,05) Tuy nhiên

có sự khác biệt giữa 2 loại kích dục tố, các

nghiệm thức sử dụng HCG có thời gian hiệu

ứng ngắn hơn so với nghiệm thức sử dụng

LRHa + DOM (p<0,05) Kết quả này có sự đối

nghịch so với kết quả trong nghiên cứu của Bùi

Thanh Tuấn và Nguyễn Tường Anh (2011),

nhưng loại tương đồng với kết quả của Vũ Thị

Hậu (2007) Có thể thời gian và địa điểm bố

trí thí nghiệm cũng như liều lượng kích dục tố

khác nhau sẽ ảnh hưởng đến thời gian hiệu ứng

kích dục tố

Sức sinh sản thực tế của cá lăng vàng

trong thí nghiệm này dao động từ 25.442,33 –

36.125,67 trứng/kg, kết quả này cũng tương tự

với kết quả được Bộ thủy sản (2005) công bố

(sức sinh sản thực tế là 20.841 trứng/kg (cá cỡ

327 g) và 87.110 trứng/kg (cá nặng 1,589 kg)

Không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức sử

dụng cùng loại hormone (p>0,05), nhưng lại có

sự khác biệt khi sử dụng các loại hormone khác

nhau, các nghiệm thức sử dụng LRHa+DOM

để kích thích sinh sản cá lăng vàng cho kết quả

sức sinh sản thực tế cao hơn (p<0,05), kết quả

này cũng tương tự nhận định của Bùi Thanh

Tuấn và Nguyễn Tường Anh (2011) Trong

nghiên cứu của Bùi Thanh Tuấn và Nguyễn

Tường Anh (2011), nhóm tác giả này cho

rằng các nghiệm thức sử dụng HCG có sức

sinh sản thực tế thấp (21.124,67 – 24.182,33

trứng /kg) điều này cũng được khẳng định lại

trong nghiên cứu này, khi sức sinh sản thực

tế cao nhất ở nghiệm thức sử dụng HCG đạt

được là 25.818,33 trứng/kg với nồng độ kích

dục tố là 5.000 UI/kg cá cái Đối với nghiệm

thức sử dụng LRHa+DOM, sức sinh sản thực

tế dao động trong khoảng 35.933,67 trứng/kg

đến 36.125,67 trứng/kg, kết quả này thấp hơn

kết quả mà nhóm tác giả Bùi Thanh Tuấn và

Nguyễn Tường Anh (2011) công bố khi cho

cá lăng vàng đẻ chính vụ (46.189 – 47.325,67 trứng/kg) nhưng lại cao hơn so với kết quả của

Vũ Thị Hậu (2007) (21.156 - 24.200 trứng/kg) Như vậy, có thể thấy rằng sức sinh sản thực tế của cá lăng ngoài việc khác nhau do loại và liều lượng kích dục tố còn phụ thuộc vào thời điểm cho sinh sản và nguồn gốc cá bố mẹ Trong khi đó, tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ nở và tỷ lệ sống cho đến khi cá hết noãn hoàng đều không

có sự khác biệt giữa các nghiệm thức (p>0,05)

Tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ nở và tỷ lệ sống cho đến khi

cá hết noãn hoàng cao nhất lần lượt là 67,28%, 77,48% và 96,72% Kết quả này cao hơn nhiều

so với các kết quả mà nhóm tác giả Bùi Thanh Tuấn và Nguyễn Tường Anh (2011), Vũ Thị Hậu (2007) tìm ra Sự khác biệt về tỷ lệ thụ tinh so với các nghiên cứu trước có thể do cá được tuyển chọn từ nguồn cá tự nhiên có trải qua quá trình nuôi thuần dưỡng trước khi cho đẻ hai tuần, trước khi tiến hành sinh sản được tuyển chọn rất kỹ càng, cá bố mẹ thành thục tốt, chất lượng buồng trứng và buồng sẹ cao

do đó tỷ lệ thụ tinh được cải thiện đáng kể Sự khác biệt về tỷ lệ nở có thể đến từ việc cải tiến quy trình kỹ thuật ấp trứng trong bình Weys

có hệ thống gia nhiệt tự động, nhiệt độ trong

bể ấp được duy trì ổn định và tối ưu cho sự phát triển của phôi Theo Nguyễn Văn Kiểm và Phạm Minh Thành (2009) thì nhiệt độ làm ảnh hưởng đến thời gian nở, tỷ lệ nở của trứng và

tỉ lệ dị hình của cá bột Nhiệt độ thích hợp cho quá trình phát triển phôi của những loài cá có xuất xứ ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long là

27 – 310C (Phạm Minh Thành và Nguyễn Văn

Kiểm, 2009) Như vậy, khi ấp nở trứng cá lăng vàng trong hệ thống bình Weys có hệ thống gia nhiệt tự động giúp cải thiện đáng kể tỷ lệ nở và

tỷ lệ sống của cá bột

3.2 Quá trình phát triển phôi của cá lăng

Thời gian phát triển phôi của cá lăng vàng đến lúc trứng nở là phút ở điều kiện nhiệt độ nước là 28 - 300C là 18 giờ 26 phút và được thể hiện ở hình 7

Phôi cá sau 10 phút Phôi cá sau 20 phút Phôi cá sau 0,5 giờ Phôi cá sau 2 giờ

Phôi cá sau 8 giờ Phôi cá sau 10 giờ Phôi cá sau 12 giờ Phôi cá sau 14 giờ

Phôi cá sau 16 giờ Cá nở sau 18 giờ 26 phút

Hình 7: Quá trình phát triển phôi của cá lăng vàng

Kết quả tương tự cũng được ghi nhận bởi

Ngô Văn Ngọc (2004) khi tác giả này cho rằng

thời gian nở của cá lăng vàng từ 28 ÷ 32 giờ

tính từ lúc trứng được thụ tinh Trong điều kiện

ấp trứng bằng bình Weys thời gian phát triển

phôi kéo dài từ 18 ÷ 20 giờ Một số loài khác

như cá mè trắng và cá trôi Ấn Độ thời gian

phát triển phôi cũng tương tự (16 – 18 giờ và

14 – 16 giờ) (Phạm Minh Thành và Nguyễn

Văn Kiểm, 2009)

Qua kết quả này ta thấy rằng, thời gian phát

triển phôi của cá lăng vàng ngắn hơn so với một

số loài cá khác Theo Đỗ Minh Tri (2008) thời

gian phát triển phôi của cá hú ở điều kiện nhiệt

độ nước 28 – 290C là 26 – 28 giờ Ở điều kiện

nhiệt độ 28 – 290C thời gian phát triển phôi của

cá chép là 36 – 38 giờ; cá trê là 26 – 28 giờ (Phạm

Minh Thành và Nguyễn Văn Kiểm, 2009) Như

vậy thời gian phát triển phôi của cá sẽ phụ thuộc

vào loài và nhiệt độ nước trong bể ấp

3.3 Kết quả ương cá lăng.

Cá được ương trong bể composite thể tích 4m3, mật độ ương là 10.000 con/m3 Bể trước khi ương được vệ sinh sạch sẽ Cấp khoảng 0,8 – 1m nước, sau đó bố trí cá bột vào ương Tổng

số bể ương là 2 bể, đến ngày thứ 9 tiến hành san thưa kết hợp với phân cỡ cá Các yếu tố môi trường được theo dõi trong suốt quá trình thí nghiệm và được thể hiện qua bảng 3

Bảng 4: Chỉ tiêu chỉ tiêu chất lượng nước

Trong quá trình ương cá bắt mồi tốt, sau

những ngày đầu sử dụng thức ăn tự nhiên đến

ngày thứ 7 cá đã bắt đầu sử dụng được thức ăn

công nghiệp và đến ngày thứ 10 cá đã sử dụng thức ăn công nghiệp hoàn toàn (Hình 8)

Cá bột 10 ngày tuổi Với thức ăn ở ống tiêu hóa

Hình 8: Cá bột 10 ngày tuổi

Sau thời gian ương 30 ngày tuổi tiến hành

thu hoạch và xác định các chỉ tiêu sản xuất Kết

quả được thể hiện trong bảng 4 dưới đây

Bảng 5: Kết quả quá trình ương cá lăng vàng.

Qua kết quả này ta thấy, cá lăng vàng trong

giai đoạn 30 ngày tuổi tăng trưởng về chiều

dài và trọng lượng khá cao, từ kích cỡ ban đầu

3,18mm sau quá trình ương đạt 30,5mm và

trọng lượng 0,32g Cá đạt tỷ lệ sống tương đối

cao trong quá trình ương Tổng số cá bột thu

được trong quá trình ương nuôi là 56.892 con

IV KẾT LUẬN

Cá lăng vàng sinh sản tốt với cả hai loại

kích dục tố là HCG và LRHa Thời gian hiệu

Trứng nở sau khi thụ tinh 18 giờ 26 phút ở

điều kiện nhiệt độ là 28 - 300C

Sau 30 ngày ương cá đạt chiều dài, trọng

lượng và tỷ lệ sống tương ứng là (28,6 – 30,5)

mm, (0,26 – 0,32)g và (65,72 – 76,51)% Tổng

số cá bột thu được trong quá trình ương nuôi là 56.892 con

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Nguyễn Tường Anh, 1999 Một số vấn đề về nội tiết học sinh sản cá NXB Nông nghiệp Hà Nội 238 trang

Bộ Thủy Sản, 2005 Kỹ thuật nuôi cá lăng vàng

thương phẩm (tài liệu tập huấn dùng cho dự

án chuyển giao công nghệ sản xuất giống cá lăng vàng

Ngô Văn Ngọc, 2002 Kết quả nghiên

cứu sản xuất giống nhân tạo cá lăng vàng (Mystus nemurus Vanlenciennes,

1839)-Tr 104 – 107 Nhà xuất bản Nông nghiệp Tập san khoa học kỹ thuật Nông lâm nghiệp, Số 3/2002

Ngô Văn Ngọc, 2004 Quy trình công nghệ sản xuất giống nhân tạo cá

lăng vàng (Mystus nemurus Vanlenciennes, 1839).

Nguyễn Chung, 2006 Kỹ thuật sản xuất giống & nuôi cá lăng nha, cá lăng vàng NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 94 trang

Vũ Thị Hậu, 2007 Nghiên cứu sinh sản nhân tạo

cá lăng vàng (Mystus nemurus) tại Khánh Hòa.

Phạm Quốc Hùng, Nguyễn Tường Anh và Nguyễn Đình Mão, 2014 Hormon và sự điều khiển sinh sản ở cá NXB Nông nghiệp 107 trang.Phạm Minh Thành và Nguyễn Văn Kiểm, 2009

INDUCED SPAWNING OF NEMURUS CATFISH (Hemibagrus

nemurus Valenciennes, 1839) IN DONG THAP PROVINCE

Nguyen Thi Long Chau1*, Mai Đinh Bang2

ABSTRACT

The research for induced spawning of Nemurus catfish (Hemibagrus nemurus Valenciennes, 1839)

was carried out at the Dong Thap Community College and Hong Ngu Vocational Training and Continuing School between 2015 and 2016 Broodstock was catched from the wild in Dong Thap Inducing agents used including HCG (Human Chorionic Gonadotropin) and LRHa + DOM (Lu- teinising Hormone – Releasing Hormone analogue and Domperidone) The result showed that, the spawning time ranged from 344,33 – 458,33 minutes The highest level of actual relative fecundity was 36.125,67 eggs.kg -1 ((150µg + 5mg) LRHa + DOM) After fertilization, all of eggs were tran- ferred to weys tank system to hatching During the hatching period, the temperature was remained from 28 – 30 0 C by automatic heating system The highest level of fertilization and hatching rate were 67,28% and 77,63% respectively The hatching period took approximately 18 hours and 26 minutes After 3 days of hatching, finished – yolk sac – fry were tranferred to fibre glass tanks for nursing at density of 10.000 inds/m 3 Moina were used to feed the fries in the first 6 days After that, formulate diet were used (40CP) The result showed that, the total length and weight and survival rate were (28,6 – 30,5)mm, (0,26 – 0,32)g and (65,72 – 76,51)% respectively at the day of thirty.

Keywords: Nemurus catfish, maturation, artificial propagation, fertilizition rate, hatching rate.

Người phản biện: TS Nguyễn Tuần

Ngày nhận bài: 5/12/2016Ngày thông qua phản biện: 12/12/2016

Ngày duyệt đăng: 05/01/2017

1 Dong Thap Community College

2 Hong Ngu Vocational Training and Continuing School

* Email: ntlchau.dtcc@gmail.com

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, các mô hình nuôi thủy sản kết hợp

đang được nghiên cứu và phát triển nhằm nâng

cao hiệu quả của mô hình Theo Tạ Văn Phương

và ctv., (2006), nghiên cứu mô hình nuôi kết hợp

sò huyết trong ao nuôi tôm sú cho thấy khả năng

làm sạch môi trường và hấp thu vật chất hữu

cơ rất lớn Nguyễn Thanh Thảo và ctv., (2006),

mô hình nuôi kết hợp cá rô phi trong ao tôm

sú bước đầu cho kết quả tốt hơn về chất lượng

nước so với nuôi đơn, các yếu tố thủy lý hóa ổn

định và sự phát triển của tảo thích hợp cho sinh

trưởng của tôm nuôi Cá nâu được nuôi phổ biến

trong các mô hình quảng canh kết hợp với các

đối tượng khác ở vùng nước lợ (Nguyễn Thanh

Phương và ctv., 2005) Trong các đối tượng nuôi

kết hợp hiện nay thì cá nâu là đối tượng có nhiều

triển vọng trong nuôi ghép với tôm sú ở các mô

hình quảng canh cải tiến và mô hình tôm rừng

Việc đưa cá nâu vào nuôi rộng rãi sẽ góp phần

làm đa dạng đối tượng nuôi, giảm áp lực lên

đối tượng tôm sú, đồng thời làm tăng tính hiệu quả và bền vững cho nuôi trồng thủy sản Chính

vì vậy, nghiên cứu “Thực nghiệm nuôi thâm

canh tôm sú (Penaeus monodon) kết hợp cá nâu (Scatophagus argus) ở các mật độ khác nhau”

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần

- Nghiệm thức 1: 0 cá nâu/m3 kết hợp với

40 tôm sú/m3

- Nghiệm thức 2: 8 cá nâu/m3 kết hợp với

40 tôm sú/m3

THỰC NGHIỆM NUÔI THÂM CANH TÔM SÚ

(Penaeus monodon) KẾT HỢP CÁ NÂU (Scatophagus argus)

m 3 , mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần Bể thí nghiệm có thể tích 0,5m 3 , độ mặn 10‰, khối lượng tôm trung bình ban đầu là 0,39g, cá nâu có khối lượng ban đầu17,1g Sau 90 ngày nuôi, các yếu tố môi trường nước nằm trong khoảng thích hợp cho sự phát triển của tôm sú và cá nâu Kết quả cho thấy, tôm sú đạt kích cỡ trung bình 2,97-5,98g/con, tỷ lệ sống 90-100% và sinh khối 114-239g/m 3 Khối lượng tôm sú ở nghiệm thức đối chứng (không thả cá nâu) là cao nhất (5,98g) nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) so với nghiệm thức 8 cá nâu+40 tôm sú (5,29g) Tỷ lệ sống của tôm ở nghiệm thức 8 cá nâu+40 tôm sú là thấp nhất (90%) Tuy nhiên, khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) so với 2 nghiệm thức còn lại Như vậy, trong nghiên cứu này nuôi kết hợp cá nâu với tôm sú ở mật độ 8 cá nâu+40 tôm sú trên bể 0,5 m 3 cho thấy sự tăng trưởng tốt nhất cho tôm sú lẫn cá nâu.

Từ khóa: nuôi kết hợp, mật độ, tăng trưởng, Penaeus monodon, Scatophagus argus

1 Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ.

* Email: lvkhanh@ctu.edu.vn

Cá nâu được cho ăn trước bằng thức ăn cá dạng

viên nổi hiệu Grobest (28% đạm) với lượng

thức ăn dao động từ 5-15% khối lượng thân,

tôm sú được cho ăn bằng thức ăn tôm sú hiệu

Grobest (40-42 % đạm) Trong suốt quá trình

nuôi siphon đáy và thay nước định kỳ tháng/lần

2.2.2 Các chỉ tiêu theo dõi

Các yếu tố thủy lý hóa gồm: Nhiệt độ và

pH được đo 15 ngày/lần bằng máy hiệu HANA

2 buổi/ngày (lúc 7h00 và 14h00); NO2-, TAN và

độ kiềm được đo bằng test SERA 15 ngày/lần

Khối lượng và chiều dài chuẩn của tôm sú

và cá nâu trước khi bố trí thí nghiệm được cân

và đo ngẫu nhiên 20 con tôm sú và 20 con cá

nâu để tính trung bình cho các nghiệm thức Kết

thúc thí nghiệm tôm sú và cá nâu được cân, đo

từng cá thể trong từng bể của mỗi nghiệm thức

Tỷ lệ sống của tôm sú và cá nâu được xác định

2.3 Phương pháp xử lí số liệu

Các số liệu thu thập ở các nghiệm thức được tính toán giá trị trung bình, độ lệch chuẩn bằng phần mềm Excel phiên bản 2010, so sánh sự khác biệt trung bình giữa các nghiệm thức bằng phép thử Ducan thông qua phần mềm SPSS

16.0 ở mức ý nghĩa (p<0,05)

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Các yếu tố môi trường nước

Từ kết quả Bảng 1 cho thấy, các yếu tố thủy

lý giữa các nghiệm thức ít biến động Trong thí nghiệm này nhiệt độ trung bình buổi sáng và chiều dao động trong khoảng 27,4-29,5oC, pH buổi sáng và chiều dao động trong khoảng 8,36-8,75 ở các nghiệm thức trong suốt quá trình nuôi Theo Boyd và Fast (1992), nhiệt độ thích hợp cho tôm dao động trong khoảng 25-30oC,

pH trong khoảng 7-9 Chanratchakool et al.,

(1995), cho rằng nhiệt độ cao hơn 33oC hay thấp hơn 25oC thì khả năng bắt mồi của tôm giảm 30-50%, tôm sẽ giảm hoạt động tạo điều kiện cho mầm bệnh tấn công Vì thế, các yếu tố thủy

lý trong thí nghiệm này vẫn trong phạm vi thích hợp cho sự phát triển của tôm cá nuôi

Bảng 1 Các yếu tố thủy lý trong thời gian thí nghiệm

hướng tăng dần theo mật độ cá, TAN dao động

trong khoảng 0,12-0,36 mg/L và độ kiềm

118-119 mg CaCO3/L (Bảng 2) Theo Boyd (1998), hàm lượng nitrite cho phép trong ao nuôi thủy

sản không vượt quá 10 mg/L (tốt nhất là nhỏ

hơn 2 mg/L) Chanratchakool (2003) và Boyd

(1998) cho rằng hàm lượng TAN thích hợp cho

ao nuôi tôm là 0,2-2 mg/L Theo Chen et al.,

(1998), chỉ ra rằng nồng độ TAN gây chết 50%

trong 48 giờ ở loài tôm khác nhau nằm trong

khoảng 30-110 mg/L Độ kiềm trong phạm vi

20-400 mg/L là phù hợp cho các ao nuôi thủy sản (Boyd, 1998) Tuy nhiên, theo Vũ Thế Trụ (2001), thì độ kiềm tốt nhất cho tôm sú phát triển trong khoảng 80-150 mg CaCO3/L Nhìn chung, tất cả các yếu tố thủy lý hóa trong thí nghiệm đều nằm trong khoảng giới hạn thuận lợi cho tôm và cá phát triển

Bảng 2 Các yếu tố thủy hóa trong thời gian thí nghiệm

3.2 Tăng trưởng của cá nâu sau 3 tháng nuôi

3.2.1 Tăng trưởng về khối lượng của cá nâu

Cá nâu với kích cỡ cá giống ban đầu trung

bình là 17,1g được thả vào nuôi ghép với tôm

sú ở các mật độ khác nhau Sau 3 tháng nuôi kết

hợp, khối lượng cá tăng rất nhanh ở hầu hết các

nghiệm thức và đạt khối lượng trung bình dao

động 38,9-42,3 g/con Qua kết quả Bảng 3 cho

thấy, nghiệm thức 8 cá nâu+40 tôm sú có khối

lượng 42,3±2,87 g/con và tốc độ tăng trưởng

nhanh nhất (0,280 g/ngày và 1,004 %/ngày) khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) so với nghiệm thức 12 cá nâu+40 tôm sú (0,243 g/ngày và 0,911 %/ngày) Tốc độ tăng trưởng của

cá nâu có xu hướng tăng khi giảm mật độ nuôi Nguyên nhân là do khi mật độ cá tăng lên thì không gian cá sống trong môi trường bị thu hẹp lại đồng thời có sự cạnh tranh thức ăn với nhau, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của

cá dẫn đến tăng trưởng kém hơn

Bảng 3 Tăng trưởng về khối lượng của cá nâu sau 3 tháng nuôi

Nghiệm thức (con/m3) Khối lượng Tốc độ tăng trưởng khối lượng

Ban đầu 3 tháng Tuyệt đối (g/ngày) Đặc biệt (%/ngày)

Tốc độ tăng trưởng về khối lượng của cá ở

thí nghiệm này cao hơn nghiên cứu của Lý Văn

Khánh và ctv., (2010), nuôi cá nâu ở độ mặn

10‰ thì tốc độ tăng trưởng tuyệt đối 0,03g/ngày

và tốc độ tăng trưởng đặc biệt 0,35 %/ngày Tốc

độ tăng trưởng này cũng cao hơn kết quả nghiên

cứu của Hoàng Nghĩa Mạnh (2010), nghiên cứu

ảnh hưởng của thức ăn và mật độ lên sinh trưởng

và tỷ lệ sống của cá nâu tại Thừa Thiên Huế, sau

6 tháng nuôi có tốc độ trung bình 0,078-0,090

g/ngày

3.2.2 Tăng trưởng về chiều dài của cá

Chiều dài trung bình của cá sau 3 tháng nuôi dao động 8,72-8,98 cm (Bảng 4) Nghiệm thức

8 cá nâu+40 tôm sú có chiều dài trung bình cao nhất 8,98 cm và có tốc độ tăng trưởng nhanh nhất (0,009 cm/ngày và 0,105%/ngày) khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) so với nghiệm thức 12 cá nâu+40 tôm sú Tốc độ tăng trưởng về chiều dài của cá nâu sau 3 tháng nuôi ở các nghiệm thức dao dộng 0,006-0,017cm/ngày (0,071-0,192 %/ngày) Tốc độ tăng trưởng về chiều dài thấp nhất là nghiệm thức 12 cá nâu+40 tôm sú (0,006 cm/ngày và 0,071 %/ngày) khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) so với

3.3 Tăng trưởng của tôm sú sau 3 tháng nuôi

3.3.1 Tăng trưởng về khối lượng của tôm sú

Tốc độ tăng trưởng của tôm sú ở các nghiệm

thức được trình bày ở Bảng 5 Khối lượng PL45

ban đầu là 0,39 g/con, sau 3 tháng nuôi khối

lượng trung bình của tôm dao động 2,97-5,98

g/con Nghiệm thức đối chứng (0 cá nâu+40

tôm sú) có khối lượng trung bình cao nhất 5,98

g/con và đạt tốc độ tăng trưởng nhanh nhất 0,062±0,001 g/ngày (3,033±0,023 %/ngày) khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức 12 cá nâu+40 sú (0,029 g/ngày và 2,248 %/ngày) nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống

kê (p>0,05) so với nghiệm thức 8 cá nâu+40 tôm

sú (0,054 g/ngày và 2,836 %/ngày) Khối lượng trung bình và tốc độ tăng trưởng thấp nhất là nghiệm thức 12 cá nâu+40 tôm sú nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) so với nghiệm thức 8 cá nâu+40 tôm sú

Bảng 5 Tăng trưởng về khối lượng của tôm sú sau 3 tháng nuôi

Theo Yang Yi và Kenvin (2005), trọng

lượng trung bình tôm đạt từ 12,3-16,6 g/con ở

mô hình nuôi ghép cá rô phi với tôm trong ao

thâm canh có nồng độ muối thấp sau khoảng

58-75 ngày nuôi Kết quả nghiên cứu của Tiền

Hải Lý (2006), nuôi tôm sú thâm canh (20 con/

m2) ghép với cá rô phi nuôi trong lồng cho kết

quả khối lượng tôm đạt 29,5 g/con sau 4,5 tháng

nuôi Như vậy, so với các nghiên cứu trên thì

kết quả nghiên cứu này tôm sú có tốc độ tăng

trưởng thấp hơn do điều kiện nuôi trong bể

3.3.2 Tăng trưởng về chiều dài của tôm

Qua Bảng 6 cho thấy, sau 3 tháng nuôi tốc

độ tăng trưởng về chiều dài của tôm dao dộng 0,032-0,052 cm/ngày (0,602-0,860 %/ngày) Trong đó nghiệm thức đối chứng có tốc độ tăng trưởng nhanh nhất (0,052 cm/ngày và 0,860 %/ngày) khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

so với nghiệm thức 12 cá nâu+40 sú (0,032 cm/ngày và 0,602 %/ngày) nhưng khác biệt không

có ý nghĩa thống kê (p>0,05) so với nghiệm thức 8 cá nâu+40 tôm sú Tốc độ tăng trưởng chiều dài tôm nhỏ nhất là ở nghiệm thức 12 cá nâu+40 tôm sú (0,032 cm/ngày và 0,602 %/ngày) khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức 8 cá nâu+40 tôm sú (0,047 cm/ngày và 0,79 %/ngày)

Bảng 6 Tăng trưởng về chiều dài của tôm sú sau 3 tháng nuôi

Nghiệm thức (con/m3) Ban đầuChiều dài3 tháng Tuyệt đối (cm/ngày)Tốc độ tăng trưởng chiều dàiĐặc biệt (%/ngày)

0 cá nâu+40 tôm sú 3,97±0,00a 8,61±0,22b 0,052±0,002b 0,860±0,029b

8 cá nâu+40 tôm sú 3,97±0,00a 8,19±1,15ab 0,047±0,013ab 0,797±0,151b

12 cá nâu+40 tôm sú 3,97±0,00a 6,83±0,33a 0,032±0,004a 0,602±0,054a

Các số liệu trong cùng một hàng có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

3.4 Tỷ lệ sống và sinh khối của cá nâu

sau 3 tháng nuôi

Tỷ lệ sống và sinh khối của cá nâu thu

hoạch ở các nghiệm thức được trình bày ở Bảng

7 Cá nâu nuôi kết hợp với tôm sú trong nghiên

cứu này đạt tỷ lệ sống sau 3 tháng nuôi là 100%

ở tất cả các nghiệm thức Kết quả tỷ lệ sống của

nghiên cứu này cao hơn so với kết quả nghiên

cứu của Lý Văn Khánh (2010), nuôi cá nâu ở

độ mặn 10‰ có tỷ lệ sống 94,6% và nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Anh (2014), sử dụng

rong bún (Enteromopha sp.) làm thức ăn cho cá

nâu đạt tỷ lệ sống 87,5-88,8% Tỷ lệ sống của

cá nâu cao là do cá giống lúc thả nuôi có kích cỡ lớn (17,1 g/con) và điều kiện môi trường nuôi thuận lợi cho sự phát triển của cá nâu

Bảng 7 Tỷ lệ sống và sinh khối của cá nâu sau 3 tháng nuôi

Các số liệu trong cùng một hàng có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

Sinh khối của cá nâu ở các nghiệm thức

trung bình dao động 338-467g/m3 khác biệt có ý

nghĩa thống kê (p<0,05) giữa các nghiệm thức

Nghiệm thức 12 cá nâu+40 tôm sú (467±40,5g/

m3) đạt sinh khối lớn nhất và sinh khối thấp nhất

là ở nghiệm thức 8 cá nâu+40 tôm sú (338±22,9g/

m3) Sinh khối của cá đạt được phụ thuộc vào mật

độ thả cá, tốc độ tăng trưởng, khối lượng của cá

lúc thu hoạch và tỷ lệ sống của cá nuôi

3.5 Tỷ lệ sống và sinh khối của tôm sú

sau 3 tháng nuôi

Tỷ lệ sống trung bình của tôm ở các nghiệm

thức khá cao dao động 90-100% (Bảng 8) Tỷ lệ

sống của tôm sú ở các nghiệm thúc nuôi kết hợp

với tôm sú ở các mật độ thả cá khác nhau khác

biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Tỷ lệ

sống của tôm ở nghiệm thức đối chứng (không

thả cá nâu) cao nhất (100%) cao hơn so với các nghiệm thức có thả cá nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Như vậy, mật độ cá nâu thả ghép khác nhau trong thí nghiệm không làm ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của tôm nuôi Theo kết quả điều tra của Trương

Hoàng Minh và ctv., (2003), trong mô hình nuôi

tôm thực nghiệm với mật độ thấp (1,65 con/

m2) trên ruộng lúa ở huyện Mỹ Xuyên,tỉnh Sóc Trăng tỷ lệ sống của tôm đạt từ 83-94% Theo Nguyễn Văn Vượng (2003), tỷ lệ sống tôm sau 125 ngày nuôi đạt 58,8-65,5% Yang Yi và F.Kevin (2005), nghiên cứu nuôi ghép cá rô phi trong mô hình nuôi tôm sú thâm canh tỷ lệ sống của tôm ở mô hình nuôi ghép cá rô phi và tôm thâm canh (30 con/m2) sau 65-75 ngày nuôi tỷ

lệ sống đạt từ 59-79% So với kết quả trên, tỷ lệ sống ở các nghiệm thức này khá cao

Bảng 8 Tỷ lệ sống và sinh khối của tôm sú sau 3 tháng nuôi

nâu+40 tôm sú (114±23,5g/m3) khác biệt không

có ý nghĩa thống kê (p>0,05) so với nghiệm

thức 8 cá nâu+40 tôm sú Sinh khối của tôm sú

ở các nghiệm thức này khác biệt chủ yếu là do

tốc độ tăng trưởng và cỡ của tôm lúc thu hoạch

ở các nghiệm thức

Từ kết quả này cho thấy có thể nuôi ghép

cá nâu với mật độ 8 con/m3 nhằm tăng thêm thu

nhập trong cùng 1 diện tích mà không làm ảnh

hưởng đến tôm sú

IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

4.1 Kết luận

Các yếu tố thủy lý hóa trong thí nghiệm đều

nằm trong khoảng giới hạn thuận lợi cho tôm sú

và cá nâu phát triển

Tốc độ tăng trưởng của tôm sú ở nghiệm

thức nuôi ghép với 8 con cá nâu/m3 tốt nhất

không khác biệt so với nghiệm thức không nuôi

ghép với cá nâu

Tỷ lệ sống của tôm không khác nhau giữa

các mật độ nuôi ghép cá nâu

Sinh khối của tôm sú ở nghiệm thức nuôi

ghép với 8 con cá nâu/m3 cao nhất không khác

biệt so với nghiệm thức không nuôi ghép với

cá nâu

Cá nâu không ảnh hưởng đến tăng trưởng và

tỷ lệ sống của tôm sú trong mô hình nuôi ghép

Có thể nuôi ghép tôm sú với 8 con cá nâu/m3

nhằm tăng thêm thu nhập trong cùng 1 diện tích

4.2 Đề xuất

Cần bố trí nuôi ghép tôm sú với cá nâu

ngoài ao để kiểm chứng lại kết quả thực nghiệm

trên bể từ đó có thể triển khai ứng dụng rộng rãi

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

Châu Tài Tảo, Huỳnh Hàn Châu và Nguyễn Thanh

Phương, 2006 Ảnh hưởng của chế độ thay nước

học Khoa học Huế

Lý Văn Khánh, Trần Ngọc Hải, Đỗ Thị Thanh Hương và Nguyễn Thanh Phương, 2010.Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý sinh sản của cá nâu

(Scatophagus argus) ở Đồng bằng sông Cửu

Long Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ 186-194

Ngô Thành Toàn, 2003 Khảo sát một số đặc điểm

sinh học cá nâu (Scatophagus argus) Luận văn

tốt nghiệp đại học, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ

Nguyễn Thanh Phương, Dương Nhựt Long và Lý Văn Khánh, 2005 Mô hình nuôi thủy sản kết hợp ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long Tuyển tập hội thảo toàn quốc về nghiên cứu và ứng dụng khoa học công nghệ trong nuôi trồng thủy sản ngày 22-23/12/2004 tại Vũng Tàu Nhà xuất bản Nông Nghiệp TP Hồ Chí Minh, 299-313.Nguyễn Thanh Phương, Võ Thành Tiếm, Trần Thị Thanh Hiền, Phạm Trần Nguyên Thảo và Lý Văn Khánh, 2004 Nghiên cứu đặc điểm sinh

học dinh dưỡng và sinh sản cá nâu (Scatophagus argus) Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần

Thơ 51-59 Phạm Văn Tình, 2003 Kỹ thuật nuôi tôm sú NXB Nông Nghiệp 55 trang

Tạ Văn Phương, Trương Quốc Phú, 2006 Thử

nghiệm nuôi sò huyết (Anadara granosa)

trong ao nước tĩnh Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ.192-200

Tiền Hải Lý, 2006 Thực nghiệm nuôi kết hợp cá

rô phi đỏ đơn tính trong ao nuôi tôm sú thâm canh ở Bạc Liêu Tạp chí Khoa học,Trường Đại học Cần Thơ 2006 (2): 187-191

Trần Ngọc Hải, Lê Quốc Việt, Trần Minh Nhứt, Lý Văn Khánh và Tạ Văn Phương ,2015 Ứng dụng

Biofloc nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) với mật độ khác nhau kết hợp với

cá rô phi (Oreochromis niloticus) Tạp chí Khoa

học, Trường Đại học Cần Thơ, 44-52

Võ Thành Tiếm, 2004 Nghiên cứu đặc điểm sinh

học cá nâu (Scatophagus argus) Luận văn thạc

sĩ, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ

Võ Thị Cầm, 2009 Thực nghiệm nuôi cá nâu

(Scatophagus argus) trong bể ở các độ mặn

khác nhau Luận văn đại học, Khoa Thủy sản,

Trường Đại học Cần Thơ

Vũ Thế Trụ, 1994 Cải tiến kỹ thuật nuôi tôm tại

Việt Nam NXB Nông Nghiệp

Tài liệu tiếng Anh

Boyd, C.E., 1998 Water quality in ponds for aquacuture Research and Development, series

No 43 International Center for aquaculture

& aquatic environment.Alabama agricultural experiment station, Auburn University

THE INTENSIVE FARMING PRACTICE OF BLACK TIGER

SHRIMP (Penaeus monodon) INTEGRATED WITH SPOTTED SCAT (Scatophagus argus) AT DIFFERENT DENSITIES

Hoang Thi Thanh Nga1, Ly Van Khanh1*

in volume, salinity 10‰, while the average shrimp weight was 0.39 g/ind and the initial weight

of spotted scat was 17.1 g/ind After 90 days of culture, the water quality parameters were in the suitable range for the growth of black tiger shrimp and spotted scat Results showed that the aver- age size of shrimp reached 2.97-5.98 g/ind, survival rate was ranged from 90-100% and biomass of 114-239 g/m 3 In which the weight of shrimp in the control treatment (no spotted scat) was highest (5.98 g), but was not statistically significant (p>0.05) compared to the treatments 8 spotted scats+40 black tiger shrimps (5.29 g) Survival rate of black tiger shrimps in treatments 8 spotted scats plus

40 black tiger shrimps was the lowest (90%), but was not statistically significant (p>0.05) compared with 3 other treatments Thus, culture spotted scat integrated with black tiger shrimp in tank of 0.5

m 3 at the density of 8 spotted scats plus 40 black tiger shrimps results in the best growth for both black tiger shrimp and spotted scat.

Keywords: density, integrated culture, growth, Penaeus monodon, Scatophagus argus

Người phản biện: TS Vũ Anh Tuấn

Ngày nhận bài: 25/11/2016Ngày thông qua phản biện: 13/12/2016

Ngày duyệt đăng: 05/01/2017

1 College of Aquaculture and Fisheries, Can Tho University.

* Email: lvkhanh@ctu.edu.vn

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) ở tôm

nuôi đã được tìm thấy lần đầu tiên ở miền Nam

Trung Quốc (NACA-FAO, 2011) vào năm

2009 Sau đó, các trường hợp tương tự được

báo cáo ở Việt Nam năm 2010 (Mooney, 2012),

Malaysia năm 2011 (Lightner & ctv., 2012), và

ở Thái Lan năm 2012 (Flegel, 2012), (Leaño

và Mohan, 2012) Tại Thái Lan, EMS/AHPND

xảy ra đầu tiên ở các trại nuôi tôm ở miền Đông

Thái Lan bao gồm các tỉnh Chonburi, Rayong, Chantaburi, và Trad vào cuối năm 2011 Tuy nhiên, dịch bệnh này được báo cáo chính thức vào đầu năm 2012 bao gồm cả hai tỉnh miền Nam (Surattani và Songkhla) (FAO, 2013) Các dấu hiệu chung của tôm bị AHPND bao gồm vỏ bị mềm, gan tụy bị teo và mất sắc tố (FAO, 2013) Ở mức độ mô bệnh học, gan tụy

có biểu hiện bong tróc hàng loạt của các tế bào biểu mô của ống gan như là tế bào bài tiết (tế

Trương Hồng Việt , Ajaree Nilawongse, Kallaya Sritunyalucksana,

Timothy W Flegel3, Siripong Thitamadee2,3

TÓM TẮT

Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease: AHPND) ở tôm nuôi nước lợ đã được báo cáo ở Thái Lan từ năm 2012 Phân tích đoạn trình tự của gen 16S rRNA thu được từ các mẫu tôm bình thường và tôm bệnh cho thấy có sự hiện diện một số vi khuẩn khác nhóm

Vibrio, bao gồm Ralstonia sp., Delftia sp., Pelomonas sp., Acidovorax sp., Sphingomonas sp., fsonia sp., và Rhodococcus sp ở ao tôm bị AHPND nhiều hơn so với ao tôm bình thường Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chọn Delftiaacidovorans (NCCB 28024) làm chủng tham khảo (RDA) được mua từ Viện CBS của Hà Lan để so sánh với 2 phân lập Delftia giả định (Sh2-4 và So1-40)

Lei-được sàn lọc từ các trại nuôi tôm ở Thái Lan bằng nuôi cấy và phân tích PCR Kết quả phân tích trình tự một phần đoạn gen 16S rRNA cho thấy có sự tương đồng cao giữa phân lập Sh2-4 và RDA

(92,6%), điều này cho thấy rằng phân lập này có thể là loài Delftia mới Ngược lại, So1-40 chỉ có tỷ

lệ tương đồng 78,9%, có thể là một chủng khác Đối với cảm nhiễm kết hợp, tôm được tiêm Sh2-4 với mật độ 10 3 CFU/3g tôm được theo dõi 7 ngày, sau đó được ngâm với Vibrio parahaemolyticus

(VPAHPND) ở mật độ 10 4 CFU/ml (thấp hơn 10 lần so với LC50=10 5 CFU/ml) Kết quả cho thấy phân lập này có thể nhiễm cộng hợp với VPAHPND nhưng gây ra dấu hiệu mô bệnh học khác với AHPND (với biểu hiện bong tróc hàng loạt của các tế bào biểu mô của ống gan tụy) Các dấu hiệu này bao gồm các tế bào biểu mô của ống gan tụy bị tan vỡ, hình thành các không bào trong tế bào E của ống gan tụy và không bào trong tế bào kẻ của cơ quan lymphô, và có sự hiện diện của các thể vùi bắt màu eosin trong tế bào chất của các tế bào thuộc mô tạo máu.

Từ khóa: 16S rRNA, AHPND, EMS, Delftiaacidovorans, Vibrio parahaemolyticus

1 Trung Tâm Quan Trắc Môi Trường & Bệnh Thủy Sản Nam Bộ, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II.

2 Khoa Công Nghệ Sinh học - Đại học Mahidol - Thái Lan

3 Centex Shrimp - Đại học Mahidol - Thái Lan

* Email: truonghongviet@yahoo.com

bào B), tế bào sợi (tế bào F), tế bào hấp thụ và

dự trữ (tế bào R), và tế bào phôi hay tế bào mầm

(tế bào E) (www.enaca.org) Mặc dù chủng phân

lập duy nhất Vibrio parahaemolyticus được

xác định là tác nhân chính của EMS/AHPND

(Tran & ctv., 2013)first reported in 2009, was

initially named early mortality syndrome (EMS,

tuy nhiên kết quả phân tích trình tự 16S rRNA

chỉ ra rằng nhiều chủng vi khuẩn khác như

là Ralstonia sp., Delftia sp., Pelomonas sp.,

Acidovorax sp., Sphingomonas sp., Leifsonia

sp., và Rhodococcus sp hiện diện trong các

mẫu tôm bệnh EMS cao hơn trong các mẫu tôm

bình thường (Prachumwat và ctv., 2012)then

Vietnam since 2010 and more recently in 2011

to the eastern coast of Malaysia and the eastern

coast of the gulf of Thailand So far no potential

causative pathogen has been found and possible

etiologies include toxins (biotic or abiotic Điều

này có thể gợi ý rằng chúng cũng có thể liên

quan đến EMS

Bởi vì Delftia sp chiếm tỷ lệ tương đối

cao khi được so sánh với các vi khuẩn khác

(Prachumwat và ctv., 2012)then Vietnam since

2010 and more recently in 2011 to the eastern

coast of Malaysia and the eastern coast of the

gulf of Thailand So far no potential causative

pathogen has been found and possible

etiologies include toxins (biotic or abiotic,

một chủng chuẩn Delftia acidovorans (NCCB

28024) được mua từ Viện CBS của Hà Lan làm

chủng tham khảo (RDA) để nghiên cứu đặc

tính sâu hơn Kết quả sơ bộ từ gây nhiễm thực

nghiệm bằng phương pháp tiêm vào cơ bụng

của Penaeus vannamei đã chỉ ra rằng RDA có

thể gây ra những thay đổi mô bệnh học ở tôm

thí nghiệm bao gồm sự tan vỡ các tế bào biểu

mô của ống gan tụy, sự xuất hiện các không

bào trong tế bào E của ống gan và không bào

trong các tế bào kẻ của cơ quan lymphô, và

có sự hiện diện của các thể vùi bắt màu eosin

trong tế bào chất của các tế bào thuộc mô

tạo máu Tuy nhiên, chưa có chủng phân lập

Delftia đã từng được phân lập từ các trại tôm

ở Thái Lan mà có dịch bệnh EMS hay AHPND

Vì vậy, nghiên cứu nhóm vi khuẩn mới này có

ý nghĩa quan trọng trong việc xác định các tác

nhân góp phần gây bệnh EMS.

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Chuẩn bị vi khuẩn

Chủng tham khảo Delftia acidovorans

(RDA) được cấy ria trên môi trường TSA (tryptic soy agar) được bổ sung 0,5% NaCl, ủ

ở 30oC, trong 18-20 giờ Một khuẩn lạc đơn được chọn để tăng sinh trong 5 ml môi trường TSB (tryptic soy broth) có bổ sung 0,5% NaCl,

ủ 30oC, lắc 230 rpm trong 18 giờ Dịch vi khuẩn được giữ trong 15% glycerol ở nhiệt độ -80oC đến khi sử dụng Đối với chủng Vibrio parahaemolyticuscũng được nuôi cấy tương tự

Tuy nhiên, môi trường TSA và TSB được bổ sung 1,5% NaCl

2.2 Tách chiết ADN vi khuẩn

Quy trình tách chiết ADN bằng phương pháp phenol-chloroform (Sambrook và ctv., 1989) đối với dịch nuôi cấy vi khuẩn hoặc gan tụy tôm Dịch vi khuẩn được ly tâm 12.000 rpm trong 10 phút để thu hạt vi khuẩn Các hạt vi khuẩn được tái huyền phù trong 1000 μl đệm tách chiết ADN (pH = 8,0) có chứa 10 μl enzym proteinase K Đối với mẫu gan tụy được cố định trong dung dịch RNA-later trước khi chuyển sang đệm tách chiết ADN Hỗn hợp huyền phù được ủ ở 56oC trong 1 giờ Sau đó phenol được thêm vào (1:1) và tiếp tục ủ 56oC trong 1 giờ trước khi ly tâm ở 12.000 rpm trong 15 phút Thu nhận dịch nổi và thêm Chloroform (1:1) vào Hỗn hợp được trộn đều và ly tâm 12.000 rpm trong 15 phút Dịch nổi được thu nhận và tiến hành kết tủa ADN bằng isopropanol lạnh (1:1) Hỗn hợp được làm lạnh ở -20oC trong 20 phút trước khi ly tâm 12.000 rpm ở 4oC trong

15 phút Hạt ADN được rửa với ethanol 75% và

để khô ở nhiệt độ phòng trước khi tái huyền phù trong 30 μl đệm TE (pH = 8,0) Nồng độ ADN được xác định nồng độ bằng máy quang phổ ở bước sóng 260 nm Dung dịch ADN được bảo quản -20oC đến khi sử dụng

2.3 Khuyếch đại ADN bằng PCR

Các mồi xuôi (F) và mồi ngược (R) (Bảng 1) cho phân tích PCR được thiết kế để khuyếch đại ADN của chủng RDA (F1 và R1) và mồi dùng

để xây dựng cây phát sinh loài (F6 và R6) dựa

vào trình tự đoạn gene 16S rRNA của Delftia từ

ngân hàng gene (NCBI) Dựa vào trình tự IGS

F1 Random primer (oligohexamer)

1000 bp R1 CCG AGG CAT TAC TCA CCC G

F2 CTT GCG AGA TTT CGC CGT TT

347 bp R2 GGA GGG AGC GAA AAG AGC AT

598 bp (Sh2-4) R3 AGT CGT AAC AAG GTA GCC GTA TCG

F4 CTT GCG AGA TTT CGC CGT TTC

373 bp R4 TGG TGG CAG CAG CTT GAA AA

F5 CAG ACG CTC AAC AAC TTG AG

360 bp R5 ATG AGC AAG GTC CAC AAA CG

F6 CAC GAC TAC CAG GGT ATC TA

756 bp R6 GCC TAA ACA CAT GCA AGT CG

2.4 Phân lập loài Delftia từ tôm và mẫu

môi trường

Để sàng lọc Delftia sp giả định từ các trại

tôm, môi trường TSA không chứa NaCl được

sử dụng, bởi vì môi trường này thích hợp cho

sự tăng trường của RDA nhưng ức chế sự tăng

trưởng của Vibrio parahaemolyticus Mẫu tôm

và mẫu môi trường từ 2 tỉnh Samutsakorn và

Trad (3 mẫu tôm EMS, 2 mẫu cặn, và 2 mẫu

đất) được cấy ria trực tiếp trên môi trường TSA

không chứa NaCl Đĩa cấy được ủ ở 30oC trong

vòng 24-48 giờ Các khuẩn lạc đơn được chọn

và cấy tăng sinh trong TSB, rồi được giữ trong

glycerol 15% và bảo quản -80oC cho thí nghiệm

sâu hơn

2.5 Thí nghiệm sinh học

- Chuẩn bị tôm

Tôm thẻ SPF (specific-pathogen free) sạch

bệnh có trọng lượng 2-3g được mua từ trại

giống và được nuôi thuần trong bể nhựa chứa

nước biển nhân tạo 20 ppt (Marinium) và có sục

ml TSB+0,5% NaCl mới, ủ cùng điều kiện trên Kiểm tra OD ở bước sóng 600nm bằng máy quang phổ cho đến khi đạt OD600nm = 0,65 (2,01

x 108 CFU/ml) đối với RDA và OD600nm = 0,7 (2,02 x 108 CFU/ml) đối với 5HP

- Xác định nồng độ gây chết 50% (LC 50 )

của V parahaemolyticus

Thí nghiệm được thực hiện như mô tả bởi Joshi và ctv., 2014 Gây nhiễm bằng cách ngâm với các nồng độ vi khuẩn khác nhau bao gồm

103, 104, 105, và 106 CFU/ml trong 15 lít nước biển nhân tạo có độ mặn 20 ppt Mỗi mật độ

vi khuẩn được lặp lại 2 lần với 10 tôm/bể Hai

bể nhóm đối chứng được ngâm với 150 ml TSB+1,5% NaCl vô trùng Tôm sắp chết được

ghi nhận và cố định trong dung dịch Davidson

để phân tích mô bệnh học

- Thí nghiệm gây nhiễm đơn và gây

nhiễm kết hợp

* Thí nghiệm gây nhiễm đơn được chia làm

2 nhóm Nhóm 1 được tiêm với 100 μl RDA với

nồng độ 103 CFU/3g tôm Nhóm 2 được tiêm với

100 μl PBS làm nhóm đối chứng Thí nghiệm

được thực hiện với 3 lần lặp lại và mỗi bể chứa

10 con tôm Tôm sắp chết được cố định trong

dung dịch Davidson để phân tích mô bệnh học

* Thí nghiệm gây nhiễm kết hợp được chia

làm 2 nhóm Nhóm 1 được tiêm với 0,1 ml PBS

làm đối chứng âm; nhóm 2 được tiêm 0,1 ml

Delftia giả định (Sh2-4) với nồng độ 103 CFU/3g

tôm Sau khi tiêm, tôm được nuôi trong 7 ngày

trước khi gây nhiễm ngâm V parahaemolyticus

(5HP) với mật độ 104 CFU/ml Mỗi bể chứa 10

tôm trong 15 lít nước biển nhân tạo có độ mặn 20

ppt Mỗi nhóm thí nghiệm được lặp lại 2 bể Tôm

hấp hối sắp chết được vớt ra và cố định trong

dung dịch Davidson để phân tích mô bệnh học

- Phương pháp mô học

Quy trình được dựa theo phướng pháp

của Bell & Lightner (1998) Tôm hấp hối sắp

chết được cố định trong 24 giờ bằng dung dịch Davidson (Cồn 95%: 330 ml; Formalin 100%:

220 ml; axit acetic 115 ml; và nước cất: 335 ml), rồi chuyển qua cồn 70% để bảo quản lâu hơn

Mô tôm được khử nước, đúc vào khối paraffin, được cắt thành miếng mỏng 5 μm, và được nhuộm với hematoxylin và eosin

2.6 Phân tích thống kê

Số liệu các thí nghiệm được phân tích thống

kê bằng phần mềm SPSS 20.0 Thống kê được thực hiện bao gồm phân tích ANOVA để tìm sự khác nhau về tỷ lệ chết giữa các nồng độ vi khuẩn theo thời gian thí nghiệm và xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính để xác định LC50

III KẾT QUẢ

3.1 Kết quả gây nhiễm Delftia

acidovo-rans (RDA)

Để xác định xem Delftia acidovorans

(NCCB 28024) có thể gây chết tôm hay không,

vi khuẩn này được tiêm vào tôm thẻ với nồng

độ 103 CFU/3g tôm Kết quả thí nghiệm chỉ ra rằng tôm bắt đầu chết sau 2 ngày tiêm và đạt đến tỷ lệ chết tích lũy 100% sau 12 ngày, trong khi nghiệm thức đối chứng chỉ có tỷ lệ chết 10% (Hình 1)

Hình 1 Tỷ lệ chết tích lũy (%) của tôm sau gây nhiễm với D acidovorans

- Kết quả phân tích mô học

Gan tụy của tôm hấp hối sắp chết cho thấy

rằng không có dấu hiệu điển hình của bệnh hoại

tử gan tụy cấp (AHPND) như là sự bong tróc

các tế bào biểu mô của ống gan Thay vào đó,

các tế bào biểu mô của ống gan có biểu hiện

bị tan vỡ, xuất hiện nhiều u hạt trong ống gan

do nhiễm khuẩn, và xuất hiện nhiều không bào trong tế bào E (hình 2A, B, và C) Ngược lại, gan tụy của tôm đối chứng có biểu hiện bình thường (Hình 2D) Nhìn chung, kết quả chỉ ra

rằng D acidovorans có thể gây chết tôm và thay

đổi cấu trúc mô bệnh học

hạt (B), nhiều không bào trong tế bào E (C), gan bình thường của tôm đối chứng (D) Các mũi tên chỉ dấu hiệu mô bệnh học Hình A (độ phóng đại 10X), hình B, C, và D (độ phóng đại 20X).

3.2 Dòng hoá đoạn trình tự của gen 16S

rRNA và vùng IGS của Delftia acidovorans

Để phát triển phương pháp phát hiện D

acidovorans dựa vào PCR, các cặp mồi F1 và

R1 (Bảng 1) được thiết kế để phát hiện đặc

hiệu dựa vào trình tự của gen 16S rRNA và

vùng IGS (đoạn trình tự nằm giữa gen 23S và

16S) Kích thước sản phẩm thu được khoảng 1.000 bp (Hình 3A) Đoạn DNA thu được làm đối tượng để dòng hoá bằng cách nối vào

vector pGEM-T và được chuyển vào chủng E coli (DH5α) Ba dòng được thu nhận và khẳng

định lại bằng PCR với các mồi T7 và SP6 của vector (Hình 3B)

Hình 3 Kết quả điện di trên gel agarose của các sản phẩm PCR (giếng 1) kích thước sản phẩm 1.000

bp; (giếng 2) đối chứng âm; (giếng 3, 4, và 5) sản phẩm PCR sau khi được dòng hoá 1.100 bp Giếng M

là thang chỉ thị phân tử

- Phân tích trình tự

Ba dòng có chứa đoạn ADN với kích thước

khoảng 1100 bp được gửi đến công ty Macrogen

(Hàn Quốc) để giải trình tự Kết quả giải trình

tự thu được 1 đoạn trình tự có kích thước 945

bp Khi so sánh trình tự với ngân hàng gen

(GenBank) bằng Blastn, kết quả chỉ ra rằng có

sự tương đồng với đoạn trình tự chứa một phần trình tự của gen 23S, vùng trình tự IGS, và một

phần gen 16S rRNA của Delftia acidovorans SPH-1 (CP000884.1) và Delftia sp Cs1-4

(CP002735.1) với độ tương đồng 99%, độ phủ đoạn trình tự 98%, và giá trị kỳ vọng E=0,0 (Hình 4 và 5)

GCTCGAACCAACGACCCCCGCCTTATCAAGACGGTGCTCTAACCAGCTGAGCT 636 ACAGACCCAGTCCACCCACCCTGCAACCAGGGCACATGGCTTGTTCCAACAAC 689 CGATAAGTGTGGGCGTTCAACTTGAACAGCAGTTTTCCAGAAAGGAGGTGATC 742

Hình 4 Trình tự 945 bp thu được từ PCR của D acidovorans bao gồm một phần trình tự của gen 23S

(1 gạch dưới), vùng IGS (không gạch dưới), và một phần trình tự của gen 16S (2 gạch dưới)

Hình 5 Kết quả Blastn của đoạn trình tự 945 bp trên GenBank

3.3 Các mồi phát hiện đặc hiệu cho

Delftia acidovorans

Kết quả Blastn của đoạn trình tự ở vị trí 350

đến 450 nucleotide chỉ ra khác biệt với các loài

vi khuẩn khác (Hình 5) Dựa vào vùng này để

thiết kế mồi phát hiện đặc hiệu cho Delftia (F2

và R2) (Bảng 1) bằng PCR Kết quả cho thấy rằng sản phẩm PCR với kích thước 347 bp được

phát hiện đặc hiệu với D acidovorans (Hình 6).

3.4 Tối ưu môi trường nuôi cấy để sàn

lọc Delftia sp ở trại tôm Thái Lan

- Môi trường MacConkey (MAC) và môi

trường phân lập Pseudomonas (PIA)

D acidovorans được cho là quan hệ gần

với nhóm Pseudomonas và có tên trước đây là

Pseudomonas acidovorans hoặc Comamonas

acidovorans (Jong, 1926) MAC và PIA là các

môi trường chọn lọc lần lượt để sàn lọc các vi

khuẩn đường ruột và các vi khuẩn Pseudomonas

Vì vậy, hai môi trường này được sử dụng để sàn

lọc Deftia sp từ trại tôm Tuy nhiên, kết quả chỉ ra rằng V parahaemolyticus có thể mọc cả 2 môi trường, trong khi D acidovorans không thể mọc (Hình 7).

Hình 6 Sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn được điện di trên gel agarose Ảnh trên, Đối chứng âm

(giếng 1), Sản phẩm khếch đại DNA bộ gen của D acidovorans(giếng 2), Leifsonia sp (3), Rhodococcus sp.(4), Shewanella sp (5), V parahaemolyticus (VPAHPND) (6) và Ralstonia sp (lane7) Ảnh dưới chỉ kết

quả PCR của đối chứng nội tại của gen 16S rRNA của vi khuẩn với mồi chung (40F và 802R) Giếng M

là thang chỉ thị phân tử

Hình 7 Sự phát triển của V parahaemolyticus (5HP) và D acidovorans (NCCB 28024)

được nuôi cấy ở 30oC trong 24 giờ trên MAC (A) hoặc PIA (B)

- Môi trường TSA không chứa NaCl

Môi trường TSA không chứa NaCl rõ ràng

thúc đẩy sự phát triển của D acidovorans sau

24 giờ nuôi cấy ở 30oC trong khi sự phát triển

của V parahaemolyticus bị ức chế (Hình 8A)

Ngược lại, TSA bổ sung 1,5% NaCl ức chế sự

phát triển của Delftia khi so sánh với sự phát triển của V parahaemolyticus (Hình 8B).

Hình 8 Sự phát triển của V parahaemolyticus (chủng 5HP) và D.acidovorans (NCCB 28024)

nuôi cấy ở 30oC trong 24 giờ (A) TSA không chứa NaCl, (B) TSA bổ sung 1,5% NaCl

3.5 Phân lập Delftia sp từ ao tôm bị

EMS ở Thái Lan

Môi trường TSA không chứa NaCl được

dùng để sàn lọc Delftia sp từ các mẫu thu được

ở trại tôm bị EMS Các chủng phân lập được

sàn lọc bằng PCR với mồi đặc hiệu cho Delftia

(F2 và R2) Những dòng cho kết quả dương tính

PCR bao gồm 1 chủng phân lập từ mẫu đất 40), một chủng phân lập từ mẫu cặn (Se1-91),

(So1-và một chủng phân lập từ tôm (Sh2-4) (Hình 9) Chủng phân lập Se1-91 bị loại khỏi nghiên cứu bởi vì khuẩn lạc có màu xanh trên môi trường

chứa X-gal thay vì màu vàng như Delftia.

Hình 9 Sàn lọc các Delftia sp giả định dựa vào PCR từ mẫu tôm và môi trường thu được từ các

trại tôm Đối chứng (-) (giếng 1), D acidovorans(+) (2), Sh2-4 (+) (3), Se1-46 (-) (4), So1-87 (-) (5),

Se1-91 (+) (6), So2-108 (-) (7), và So1-40 (+) (8) Chỉ thị phân tử (M)

3.6 Xác định 2 chủng phân lập So1-40 và

Sh2-4 bằng trình tự gen 16S rRNA

Để thực hiện phân loại đối với 2 chủng phân

lập So1-40 và Sh2-4, đoạn gen 16S rRNA được

khuyếch đại bằng PCR và được gửi giải trình tự

với mồi (F6 và R6) (Bảng 1) Chủng RDA được

dùng như là đối chứng Các đoạn khuyếch đại

thu được từ RDA và Sh2-4 có cùng kích thước

756 bp trong khi đoạn khuyếch đại của So1-40

là 770 bp (Hình 10, 11, và 12) So sánh trên NCBI bằng Blastn chỉ ra rằng RDA tương đồng

Hình 10 Đoạn gen 16S rRNA của RDA (756 bp) Các mồi giải trình tự (gạch dưới)

Hình 11 Đoạn gen 16S rRNA của Sh2-4 (756 bp) Các mồi giải trình tự (gạch dưới)

Hình 12 Đoạn gen 16S rRNA của So1-40 (770 bp) Các mồi giải trình tự (gạch dưới)

So sánh đoạn trình tự 16S giữa RDA và Sh2-4 hoặc So1-40 bằng cách sắp thẳng hàng các trình tự bởi phần mềm CLUSTAL 2.1 Kết quả chỉ ra rằng điểm số sắp thẳng hàng lần lượt là 92,6% và 78,9% (Hình ảnh sắp

thẳng hàng của 2 trình tự không trình bày) Điều này gợi ý rằng Sh2-4 có thể là một loài Delftia mới.

- Xây dựng cây phân loài dựa vào trình

tự gen 16S rRNA

Cây phân loài được xây dựng từ các trình tự

đoạn gen 16S rRNA thu được của RDA, Sh2-4,

và So1-40 bằng phần mềm MEGA 6.06 Kết quả

cho thấy rằng RDA là thành viên của nhánh các

loài Delftia được biết bao gồm D acidovorans

Tuy nhiên, chủng phân lập Sh2-4 nằm ở vị trí

giữa nhánh Delftia và Ralstonia Kết quả này gợi

ý rằng Sh2-4 có thể là một loài Delftia thuộc họ

Comamonadaceae, bộ Burkhodariales với chỉ

số bootstrap 86% Ngược lại, So1-40 nằm cùng nhánh với họ Bacillaceae với chỉ số bootstrap 100% (Hình 13) Vì vậy, So1-40 không được tiếp tục nghiên cứu sâu hơn

Hình 13 Cây phân loài của các loài vi khuẩn dựa và trình tự 16S rRNA RDA ở trong nhánh của các

loài Delftia, trong khi Sh2-4 rơi vào giữa nhánh Delftia và Ralstonia Chủng So1-40 ở trong nhánh các loài Bacillus Các số tại các nốt nhánh thể hiện tỷ lệ phần trăm của chỉ số bootstrap Chiều dài thước

(bên dưới cây phân loại) biểu thị số khác biệt nucleotide

3.7 Thiết kế mồi đặc hiệu riêng biệt cho

RDA và Sh2-4 dựa vào vùng IGS

Để kiểm tra vùng IGS có thể dùng để phân

loại giữa các chủng riêng biệt hay không, các trình

tự cả đoạn IGS của RDA và Sh2-4 được khếch đại

bằng PCR với cặp mồi F3 và R3 (Bảng 1) Kết quả

giải trình tự của sản phẩm PCR thu được các trình

tự có độ dài 515 bp đối với RDA (Hình 14) và 598

bp đối với Sh2-4 (Hình 15) Hai trình tự này được dùng để thiết kế mồi đặc hiệu để phát hiện riêng biệt cho RDA với cặp mồi F4 & R4 (Bảng 1) cho kích thước sản phẩm 373 bp (Hình 16) và Sh2-4 với cặp mồi F5 & R5 (Bảng 1) cho kích thước sản phẩm 360 bp (Hình 17)

CTCTTTCCGTCAGCAACGCTGATTTCGACTCTATGAATTTTTAAAGAACAGCCGATTGATAGTTAGATAACTATCAACACTAAAG CAGTCTCACACGAGACTGCTTTAGTGTTGAGTCAAATATTATAGCACGCTTTTTTCGTGCTCTTTTCGCTTCCTCCAGCTGCTTTTTC AAGCTGCTGCCACCAGCGCGATCTTGGTGGAGGATGACGGGATCGAACCGACGACCCCCTGCTTGCAAAGCAGGTGCTCTCCCAGCTG AGCTAATCCCCCGGGATCCTCGACAACCAGATATTGGAATCTTGGTGGGTCTAGTTGGGCTCGAACCAACGACCCCCGCCTTATCAAG ACGGTGCTCTAACCAGCTGAGCTACAGACCCAGTCCACCCACCCTGCAACCAGGGCACATGGCTTGTTCCAACAACCGATAAGTGTGG GCGTTCAACTTGAACAGCAGTTTTCCAGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGCTACCTTGTTACGACT

Hình 14 Trình tự đoạn khuyếch đại của vùng IGS của RDA (515 bp.)

Đoạn trình tự được gạch dưới là trình tự mồi cho cả PCR và giải trình tự

Hình 15 Trình tự đoạn khuyếch đại của vùng IGS của Sh2-4 (598 bp.) Đoạn trình tự được gạch dưới

là trình tự mồi cho cả PCR và giải trình tự

Hình 16 Sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn được điện di trên gel agarose Đối chứng âm (giếng

1), Sản phẩm khuyếch đại ADN bộ gen của Sh2-4 (2), RDA(3), So1-40 (4), V parahaemolyticus gây AHPND (5), Leifsonia sp (6), Rhodococcus sp.(7), Ralstonia sp (8), và Shewanella sp (9) Giếng M

là thang chỉ thị phân tử Kích thước sản phẩm 373 bp

Hình 17 Sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn được điện di trên gel agarose Đối chứng âm (giếng

1), Sản phẩm khuyếch đại ADN bộ gen của Sh2-4 (2), RDA(3), So1-40 (4), V parahaemolyticus gây AHPND (5), Leifsonia sp (6), Rhodococcus sp (7), Ralstonia sp (8), và Shewanella sp (9) Giếng M

là thang chỉ thị phân tử Kích thước sản phẩm 360 bp

3.8 Xác định nồng độ gây chết 50% (LC 50) của Vibrio parahaemolyticus (VPAHPND )

LC50 của VPAHPND được xác định trước khi thực hiện gây nhiễm kết hợp vớ Sh2-4 trong nghiên cứu này Kết quả chỉ ra rằng thời gian chết của tôm thí nghiệm ở 48 giờ có khác biệt ý nghĩa thống

kê (P<0,05) ở các nồng độ vi khuẩn khác nhau (Hình 18)

Hình 18 Tỷ lệ chết tích lũy được theo dõi trong 5 ngày (120 giờ) sau cảm nhiễm với

các nồng độ khác nhau của VPAHPND từ 103 đến 106 CFU/ml

3.9 Gây nhiễm kết hợp giữa VP AHPND và

Sh2-4

Thí nghiệm này được thực hiện bằng cách

tiêm Sh2-4 với nồng độ 103 CFU/3g tôm Tôm

được giữ trong 7 ngày trước khi được ngâm với

104 CFU/ml VPAHPND (5HP) Đây là nồng thấp

hơn LC50 để xác định xem vi khuẩn kết hợp có

khả năng nhiễm cộng hợp với 5HP hay không

Kết quả thí nghiệm cho thấy rằng tỷ lệ chết tích

lũy đạt đến 100% ở ngày thứ 2 sau khi kết hợp Không có tôm bị chết ở nhóm đối chứng Ngược lại, tôm ở nhóm đối chứng dương chỉ ngâm 5HP, tôm bị chết 100% sau 5 ngày thí nghiệm (Hình 20) Kết quả này có thể suy ra rằng Sh2-

4 có khả năng nhiễm cộng hợp với 5HP Thời gian gây chết 50% (LT50) của nhóm kết hợp giữa Sh2-4 và 5HP là 1 ngày, trong khi LT50 của 5HP

là 4 ngày

Hình 20 Thời gian chết trung bình của tôm sau khi gây nhiễm kết hợp giữa Sh2-4 và 5HP.

- Kiểm tra mô học của tôm hấp hối sắp

chết từ thí nghiệm gây nhiễm kết hợp

Tôm hấp hối sắp chết từ các nhóm thí

nghiệm được thu mẫu để kiểm tra mô bệnh học

Các tổn thương chính được tìm thấy trong gan

tôm bao gồm tế bào biểu mô bị tan vỡ (Hình

21B), xuất hiện nhiều không bào trong tế bào

kẻ của cơ quan lymphô (Hình 22B), và sự xuất

hiện của các thể vùi bắt màu eosin trong tế bào

chất của các tế bào thuộc mô tạo máu (Hình

23B) Ngoài ra, Tế bào E bị không bào hoá xuất

hiện trong tất cả các nhóm thí nghiệm, bao gồm

cả nhóm đối chứng âm Tuy nhiên, ở nhóm đối chứng âm có cường độ và tỷ lệ thấp hơn (Hình 24A và 24B) Ở nhóm chỉ ngâm 5HP ở 104 CFU/

ml, gan tụy của tôm hấp hối có dấu hiệu bong tróc các tế bào biểu mô của ống gan (hình 2C),

tế bào E có dấu hiệu của bệnh AHPND (Hình 24C) Tuy nhiên, cơ quan lymphô (Hình 22C)

và mô tạo máu (Hình 23C) có dấu hiệu bình thường

Hình 19 Mô bệnh học của nghiệm thức ngâm 105 CFU/ml5HP Sự bong tróc của các tế bào biểu mô

của ống gan được quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 10X (A) và 40X (B)

Hình 21 Mô học của gan tụy (A) Gan tụy bình thường của tôm không gây nhiễm có nhiều tế bào B và

tế bào R, (B) Nhóm kết hợp giữa Sh2-4 và 5HP có dấu tế bào biểu mô bị tan vỡ, và (C) Nhóm 5HP chỉ

ra tế bào biểu mô bị bong tróc Độ phóng đại 10X

Hình 22 Mô học của cơ quan lymphô (A) Lymphô bình thường ở nhóm không gây nhiễm, (B) Nhóm

kết hợp giữa Sh2-4 và 5HP có nhiều không bào trong tế bào kẻ (mũi tên), và (C) Nhóm 5HP chỉ ra

lymphô bình thường Độ phóng đại 40X

Hình 23 Mô học của mô tạo máu (A) Mô tạo máu bình thường ở nhóm không gây nhiễm, (B) Nhóm

kết hợp giữa Sh2-4 và 5HP có nhiều thể vùi bắt màu eosin trong tế bào chất (mũi tên), và (C) Nhóm 5HP chỉ ra mô tạo máu bình thường Hình A và B (độ phóng đại 40X); hình C (độ phóng đại 100X)

Hình 24 Mô học của vùng tế bào E (A) Tế bào E ở nhóm không gây nhiễm có ít không bào (mũi tên)

(B) Nhóm kết hợp giữa Sh2-4 và 5HP có nhiều không bào (mũi tên), và (C) Nhóm 5HP chỉ ra tế bào E

bị bong tróc (mũi tên) Độ phóng đại 40X

IV THẢO LUẬN

Dữ liệu từ kết quả phân tích gen 16S rRNA

của tôm bị nhiễm AHPND so với tôm khoẻ

khám phá ra rằng khả năng vi khuẩn thuộc bộ

Burkholdeirales có thể liên quan đến AHPND

ở ô tôm nuôi ở Thái Lan (Prachumwat và

ctv., 2012) Tuy nhiên, chưa có báo cáo nào

trước đây trình bày về các vi khuẩn thuộc bộ

Burkholderiales gây bệnh trên tôm

Nghiên cứu này là đầu tiên chỉ ra rằng vi

khuẩn thuộc giống Delftia (bộ Burkholderiales)

có thể gây chết tôm thẻ chân trắng Kiểm tra sơ

bộ với chủng Delftia acidovorans mua từ Viện

CBS của Hà Lan khám phá ra rằng tỷ lệ chết của

tôm có thể bị gây ra bởi vi khuẩn này với nồng

độ tiêm 103CFU/3g tôm Các tôm hấp hối sắp

chết có dấu hiệu mô bệnh học khác với dấu hiệu

mô bệnh học của AHPND như là sự tan vỡ của

các tế bào biểu mô của ống gan tụy và sự không

báo hoá các tế bào E Ngoài ra, những đặc tính

phụ không được mô tả ở tôm bị AHPND bao

gồm sự có sự hiện những không bào bất thường

trong gan tụy và cơ quan lymphô và các thể vùi

trong tế bào chất bắt màu eosin hiện diện ở mô

tạo máu

Bởi vì chủng D acidovorans tham khảo

được mua từ CBS, nó không thể phản ánh bản

chất thực sự của Delftia giả định mà được chỉ ra

trong phân tích PCR từ các trại tôm địa phương

ở Thái Lan Đối với chủng phân lập của tác

nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND),

môi trường TSA được sử dụng để phân lập và

nó mang lại thành công trong phân lập Vibrio

parahaemolytius gây AHPND (VPAHPND) ở Thái

Lan (Joshi và ctv., 2014) Một đặc tính của V

parahaemolyticus là mọc rất mạnh khi được

nuôi cấy trên TSA có bổ sung 1,5% NaCl Sự

phát triển nhanh chóng của V parahaemolyticus

có thể lấn át các loài khác Điều này có thể dẫn

đến thất bại trong việc phân lập các loài vi khuẩn

liên quan khác như là các vi khuẩn đã khám phá

từ phân tích gen 16S rRNA

Để tránh vấn đề như vậy, việc sàn lọc các

chủng Delftia từ các trại tôm được chia thành

hai bước bao gồm sàn lọc bằng môi trường chọn

lọc cho Delftia sp và kết hợp với sàn lọc bằng

PCR Môi trường TSA không chứa NaCl có thể

ức chế tốt đối với V parahaemolyticus trong khi

nó cho phép các vi khuẩn khác phát triển Các vi khuẩn này được tiếp tục sàn lọc bằng PCR với các mồi đặc hiệu để khuyếch đại vùng IGS của

D acidovorans Cường độ vạch sản phẩm PCR

thu được từ các chủng phân lập khi được so sánh

với đối chứng dương (D acidovorans) là tương

đối thấp Giải thích cho điều này thì không rõ ràng nhưng có thể do có sự khác biệt một số nucleotide trong trình tự mồi nên số lượng bản sao của đoạn trình tự đích cho khuyếch đại PCR

bị thấp

Hai chủng phân lập Sh2-4 và So1-40 được chọn cho nghiên cứu sâu hơn Theo phân tích hoá sinh bằng kít API 20 NE, hai chủng này

được xác định là gần nhất với Pseudomonas luteola (kết quả không trình bày) Tuy nhiên,

phân tích trình tự gen 16S rRNA chỉ ra rằng chủng phân lập Sh2-4 tương đồng vi khuẩn không được nuôi cấy, trong khi So1-40 thì

tương đồng với chủng Bacillus Kết quả này cho

thấy sự hạn chế trong phân tích hoá sinh do số vi khuẩn cố định trong cơ sở dữ liệu của API Theo

so sánh trình tự một phần của gen 16S rRNA,

sự giống nhau trình tự giữa D acidovorans và

Sh2-4 (92,6%) cao hơn sự giống nhau trình tự

giữa D acidovorans và So1-40 (78,9%) Kết

quả này có thể đề nghị rằng Sh2-4 có thể là một

thành viên của giống Delftia Xây dựng cây

phát sinh loài dựa vào trình tự một phần của gen 16S rRNA chỉ ra rằng Sh2-4 nằm ở vị trí giữa

nhánh Delftia và Ralstonia Kết quả này gợi ý rằng Sh2-4 có thể là một loài Delftia thuộc họ

Comamonadaceae, bộ Burkhodariales với chỉ

số bootstrap 86% Theo Felsenstein (1985) chỉ

số bootstrap nói lên độ tin cậy của sự quan hệ gần gũi giữa các thành viên của nhóm trong cây phân loài Ngược lại, So1-40 nằm cùng nhánh với họ Bacillaceae Vì vậy, So1-40 không được tiếp tục nghiên cứu sâu hơn

Thí nghiệm sinh học bằng cách sử dụng

chủng tham khảo D acidovorans (RDA)

cho kết quả chết tôm khác nhau ở các lần thí

hơn ở nhóm kết hợp khi so sánh với nhóm chỉ

ngâm 5HP Ở mức độ mô học, tôm hấp hối sắp

chết của nhóm gây nhiễm kết hợp không có biểu

hiện của bong tróc cấp tính của các tế bào biểu

mô của ống gan tụy như đặc tính của AHPND

Thay vào đó, mô tôm có biểu hiện tan vỡ các

tế bào biểu mô cùng với những dấu hiệu mô

bệnh học bao gồm xuất hiện nhiều không bào

trong các tế bào kẻ của cơ quan lymphô và có

sự hình thành các thể vùi bắt màu eosin trong

tế bào chất của các tế bào thuộc mô tạo máu

Cùng với đó, kết quả này cho thấy rằng Sh2-4

có thể nhiễm cộng hợp với V parahaemolyticus

(5HP) Điều này có thể dẫn đến một sự đánh giá

thấp về tần suất xuất hiện AHPND trong việc

chẩn đoán bệnh Những quan sát gần đây cũng

cho thấy rằng mẫu tôm từ các ao bị EMS thường

thiếu các dấu hiệu bong tróc các tế bào trong

ống gan tụy, nhưng thay vào đó nó có dấu hiệu

tan vỡ của tế bào biểu mô

V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

5.1 Kết luận

Các kết quả cho thấy rằng loài Delftia có

thể liên quan đến EMS ở tôm nuôi Chúng tôi đã

thiết lập được phương pháp PCR phát hiện đặc

hiệu cho Delftia sp và Delftia acidovorans dựa

vào trình tự của vùng IGS (intergenic spacer)

Chủng phân lập Delftia giả định mà sàn lọc

từ các trại tôm địa phương được thực hiện thí

nghiệm sinh học bằng phương pháp gây nhiễm

kết hợp với VP(AHPND) (5HP) Kết quả cho thấy

rằng Delftia sp có liên quan đến EMS/AHPND

do nó có tác động bổ trợ đến tỷ lệ chết của tôm

Thời gian gây chết 50% (LT50) của nhóm kết

hợp giữa Sh2-4 và 5HP là 1 ngày, trong khi LT50

của 5HP là 4 ngày Ở mức độ mô học, tôm hấp

hối sắp chết của nhóm gây nhiễm kết hợp không

5.2 Đề xuất

Để hiểu sâu hơn mối tương quan giữa dấu hiệu mô bệnh học riêng biệt và sự hiện diện của

D acidovorans ở trong các mô tương ứng, thì

kỹ thuật lai in situ với mẫu dò phân tử đặc hiệu cho Delftia nên được thực hiện Kế hoạch thí

nghiệm trong tương lai nên thực hiện gây nhiễm kết hợp bằng phương pháp ngâm cả hai vi khuẩn

để khẳng định có tác động bổ trợ hay không Ngoài ra, để nghiên cứu đặc tính sâu hơn đối với Sh2-4, thì cần thiết phải giải trình tự toàn bộ chiều dài của gen 16S rRNA hoặc giải toàn bộ trình tự của bộ gen

LỜI CẢM ƠN

Đề tài này được sự hỗ trợ bởi học bổng Công nghệ Sinh học của Chính Phủ Việt Nam (Số 1254/QĐ-BGDĐT), Trung tâm Quốc gia Công nghệ Di truyền và Công nghệ Sinh học Thái Lan (BIOTECH Thái Lan), và Hội đồng Nghiên cứu Quốc gia Thái Lan

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bell, T A., & Lightner, D V., 1998 Technique

In A Handbook of Normal Penaeid Shrimp Histology Baton Rouge, Louisiana: World Aquaculture Society

Chen, W.-M., Lin, Y.-S., Sheu, D.-S., Sheu, Y., 2011 Delftia litopenaei sp nov., a poly-β-hydroxybutyrate-accumulating bacterium isolated from a freshwater shrimp culture pond International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 62(Pt 10), 2315–