Chuyên đề thụ thể liên hợp protein g

Liên kết của phân tử tín hiệu với thụ thể gây ra hai kiểu đáp ứng tế bào chính: 1 thay đổi hoạt động hoặc chức năng của các enzyme đặc hiệu và các protein khác đã có sản trong tế bào và

MỤC LỤC

Phần 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 3

1 1 Lý do tiếp cận chuyên đề 3

1.2 Mục đích của chuyên đề 4

1.3 Khái quát các nội dung của chuyên đề 4

Phần 2 NỘI DUNG 4

2.1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA SỰ TRUYỀN TÍN HIỆU VÀ THỤ THỂ KẾT CẶP VỚI PROTEIN G 4

2.2.1 Quá trình truyền tín hiệu: Từ tín hiệu ngoại bào tới đáp ứng tế bào 6

2.2.1.1 Phân tử tín hiệu có thể hoạt động ở gần hoặc xa 6

2.2.1.2 Liên kết của phân tử tín hiệu hoạt hóa thụ thể trên tế bào đích 7

2.2.1.3 Protein kinase và phosphatase được sử dụng ở hầu hết mọi con đường tín hiệu 8

2.2.1.4 Protein gắn GTP thường được sử dụng trong quá trình truyền tín hiệu như công tắc bật/tắt 10

2.2.1.5 "Phân tử tín hiệu thứ cấp” nội bào dẫn truyền và khuếch đại tín hiệu từ nhiều thụ thể 11

2.2.2 Nghiên cứu thụ thể bề mặt tế bào và protein truyền tín hiệu 13

2.2.2.1 Hằng số phân ly là số đo ái lực của thụ thể với phối tử của nó 13

2.2.2.2 Thí nghiệm liên kết được sử dụng để phát hiện thụ thể và xác định ái lực cùng độ đặc hiệu của chúng với phối tử 14

2.2.2.3 Đáp ứng cực đại của tế bào với phân tử tín hiệu thường không yêu cầu hoạt hóa tất cả các thụ thể 15

2.2.2.4 Độ nhạy của tế bào với tín hiệu ngoại bào được xác định bằng số lượng thụ thể bề mặt và ái lực của chúng với phối tử 16

2.2.2.5 Thụ thể được tinh sạch bằng kỹ thuật ái lực 17

2.2.2.6 Sử dụng các phản ứng kết tủa miễn dịch và kỹ thuật ái lực để nghiên cứu hoạt động của protein truyền tín hiệu 17

2.2.3 Thụ thể liên kết protein G 20

2.2.3.1 Cấu trúc và cơ chế 20

2.2.3.2 Thụ thể liên hợp protein G điều hòa kênh ion 25

2.2.3.2 Thụ thể acetylcholine trong cơ tim kích hoạt một protein G gây mở kênh K + 25

2.2.3.4 Ánh sáng kích hoạt rhodopsin liên hợp protein G trong tế bào hình que ở mắt 26

2.2.4 Kích hoạt rhodopsin bằng ánh sáng dẫn tới đóng kênh cation cổng cGMP 27

2.2.4.1 Khuếch đại tín hiệu làm con đường truyền tín hiệu rhodopsin cực nhạy 29

2.2.4.2 Tế bào hình que thích ứng với các mức biến đổi của ánh sáng môi trường nhờ trao đổi arrestin và transducin nội bào 31

2.2.5 Thụ thể liên hợp protein G hoạt hóa hoặc ức chế adenylyl cyclase 32

2.2.5.1 Adenylyl cyclase bị kích thích và ức chế bởi các phức hợp thụ thể-phối tử khác nhau 32

2.2.5.2 Các nghiên cứu cấu trúc thiết lập quá trình Gαs.GTP gắn vào và hoạt as hóa adenylyl cyclase 32

2.2.5.3 Các nghiên cứu cấu trúc thiết lập quá trình GGTP gắn vào và hoạt as hóa adenylyl cyclase 33

2.2.5.4 cAMP hoạt hóa protein kinase A nhờ giải phóng các tiểu phần ức chế 34

2.2.5.5 Hoạt hóa protein kinase A nhờ hormone để điều hòa chuyển hóa glycogen 35

2.2.5.6 Hoạt hóa protein kinase A nhờ cAMP tạo nên nhiều đáp ứng đa dạng trong các loại tế bào khác

nhau 36

2.2.5.7 Khuếch đại tín hiệu xảy ra trong con đường cAMP-protein kinase A 37

2.2.5.8 CREB nối CAMP và protein kinase A với kích hoạt biểu hiện gen 37

2.2.5.9 Protein neo tập trung tác động của cAMP đến các vùng đặc hiệu của tế bào 38

2.2.5.10 Nhiều cơ chế điều hòa giảm tín hiệu từ con đường GCPR/cAMP/ PKA 39

2.2.6 Các thụ thể liên hợp protein G làm tăng Ca 2+ trong bào tương 41

2.2.6.1 Phospholipase C bị kích hoạt bởi hai phân tử tín hiệu thứ cấp từ lipit photphattadylinositol màng 41

2.2.6.2 Phức hợp Ca 2+ - camodulin làm trung gian cho nhiều đáp ứng tế bào trước các tín hiệu từ bên ngoài 43

2.2.6.3 Tín hiệu gây giãn cơ trơn được trung gian bằng con đường protein kinase G kích hoạt bởi Ca 2+ “ nitric oxide-cGMP 44

2.2.6.4 Tích hợp của Ca 2+ và phân tử tín hiệu thứ cấp cAMP điều hòa ly giải glycogen 45

2.2.7 Các con đường truyền tín hiệu điều hòa biểu hiện gen 47

2.2.7.1 Các thụ thể hoạt hóa protein kinase tyrosine 47

2.2.7.2 Con đường Ras/MAP Kinase 48

2.2.7.3 Các con đường truyền tín hiệu phosphoinositide 49

2.2.7.4 Các thụ thể kinase serine hoạt hóa Smad 49

2.2.7.5 Các con đường truyền tín hiệu được điều khiển bởi sự ubiquitin hóa: Wnt, Hedgehog, và NF-KB 49

2.2.7.6 Các đáp ứng tích hợp của tế bào với nhiều con đường truyền tín hiệu 50

2.2.8 Khái quát về quá trình truyền tín hiệu và đáp ứng lại tín hiệu của tế bào thực vật 50

2.2.8.1 Tiếp nhận tín hiệu 51

2.2.8.2 Truyền tín hiệu 51

2.2.8.3 Đáp ứng 51

2.2.9 Chết theo chương trình của tế bào (Apoptosis) 51

2.2.9.1 Chết theo chương trình (apoptosis), 51

2.2.9.2 Con đường chết theo chương trình ngoại sinh 52

2.2.9.3 Con đường chết theo chương trình nội sinh 53

2.2 CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP KHAI THÁC CHƯƠNG 11 - SÁCH BIOLOGY CAMPBELL 54

2.2.1 KHAI THÁC THEO CẤP ĐỘ NHẬN THỨC 54

2.1.2 CÂU HỎI TỰ LUẬN ĐỂ KIỂM TRA CÁC KHÁI NIỆM THEO CHƯƠNG 11 57

2.2.3 CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM VẬN DỤNG KIẾN THỨC CHƯƠNG 11 - Biology Campbell 58

2.3 HƯỚNG DẪN KHAI THÁC BÀI TẬP VẬN DỤNG KIẾN THỨC LÝ THUYẾT 73

2.4 CÁC CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP CÓ HƯỚNG DẪN 85

2.5 MỘT SỐ BÀI TẬP VỀ SỰ TRUYỀN TIN Ở THỰC VẬT 107

Phần 3: KẾT LUẬN 109

3.1 Kết luận 109

3.2 Đề xuất 109

TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH 109

mà còn giữa các sinh vật Ví dụ, mùi của quả lê truyền tín hiệu nguồn thức ăn tới chúng ta và các động vật khác Ngược lại, sự tiêu thụ lê bởi động vật giúp phân phối hạt lê Đôi bên cùng có lợi! Tế bào sử dụng các loại tín hiệu gồm: các hợp chất nhỏ và đơn giản, khí, protein, ánh sáng, và vận động cơ học Tế bào có rất nhiều protein thụ thể dành cho việc phát hiện và xây dựng con đường truyền tín hiệu trong tế bào, từ đó tạo ra đáp ứng Tại một thời điểm, tế bào chỉ có thể cảm thụ một số tín hiệu xung quanh và phương thức tế bào đáp ứng với một tín hiệu có thể thay đổi theo thời gian Trong một số trường hợp, tín hiệu truyền đến

có thể mồi tế bào đáp ứng với tín hiệu khác đến sau theo một phương thức nhất định Môi trường thay đổi (ví dụ, biến đổi nồng độ chất dinh dưỡng hoặc cấp độ ánh sáng) và tín hiệu từ tế bào khác đều là thông tin bên ngoài gửi đến cho tế bào xử lý Đáp ứng nhanh nhất với những tín hiệu như vậy thường là các thay đổi trong vị trí hay hoạt tính của protein sẵn có Ví dụ, ngay sau khi dùng bữa giàu carbohydrate thì glucose sẽ dổ vào dòng máu Tế bào B trong tuyến tụy cảm thụ nồng độ glucose tăng lên trong máu và đáp ứng lại bằng cách giải phóng hormone insulin mà chúng tích trữ vào trong máu Tín hiệu insulin lưu thông trong máu làm các protein vận chuyển glucose trong tế bào chất của tế bào cơ và mỡ hướng tới bề mặt tế bào Tại đây chúng hấp thu glucose Trong khi đó, tế bào gan cũng hấp thụ mạnh glucose nhờ một protein vận chuyển glucose khác Trong tế bào gan và Cơ, insulin gắn với thụ thể bề mặt tế bào gây kích hoạt con đường tín hiệu nội bào Con đường này hoạt hóa các enzyme cần thiết để tạo ra glucose polymer lớn gọi glycogen Những đáp ứng tế bào này làm giảm nồng độ glucose trong máu và glucose còn dư được tích trữ dưới dạng glycogen Glycogen trở thành nguồn glucose khả dụng của tế bào khi bạn bỏ ăn

để vùi đầu ôn thi

Khả năng gửi và đáp ứng với tín hiệu là rất quan trọng cho sự phát triển của tế bào Nhiều tín hiệu phát triển quan trọng là protein tiết do các tế bào đặc biệt tạo ra tại những thời điểm và vị trí nhất định trong tiến trình phát triển của sinh vật Thông thường, tế bào cùng lúc nhận nhiều tín hiệu rồi quyết định

sẽ phản ứng như thế nào Các đáp ứng có thể là biệt hóa thành một loại mô nhất định, khuếch đại một quá trình, chết, gửi lại tín hiệu xác nhận hoặc di chuyển

Chức năng của gần một nửa số protein ở người, giun tròn, nấm men, và một số sinh vật nhân chuẩn khác đã được dự đoán dựa trên phân tích trình tự hệ gene Những phân tích như vậy cho thấy 10-15% protein của sinh vật nhân chuẩn đóng vai trò tín hiệu tiết ngoại bào, thụ thế tín hiệu, hoặc protein truyền tín hiệu nội bài Những protein này truyền tín hiệu qua hàng loạt các bước để cuối cùng tạo ra đáp ứng đặc hiệu của tế bào (ví dụ tăng tổng hợp glycogen) Có thể thấy rõ rằng tín hiệu và truyền tín hiệu là các hoạt động chính của tế bào và là trọng tâm của sinh học tế bào

Với khối chuyên sinh của các trường THPT Chuyên, cuốn sách Sinh học (Campbell & Reece) không còn xa lạ, thậm chí còn trở thành “thương hiệu” của các đội tuyển Chương 11, các tác giả đề cập đến “thông tin giữa các tế bào” một cách đầy đủ theo tiến trình từ khi tế bào tiếp nhận tìn hiệu, sau đó truyền tín hiệu và cuối cùng là đáp ứng của tế bào đích Nội dung cuối cùng của chương này đề cập đến cách thức đã được lập trình một cách nghiêm ngặt cho các tế bào chết Như vậy, theo cách tiếp cận này thì dường như nội dung của chuyên đề đã khá chi tiết, đầy đủ và rõ ràng

Bản thân cá nhân tôi thấy đây là chuyên đề khó và còn rất nhiều bí ẩn mà bản thân chưa biết rõ, cách tiếp cận chuyên đề có nhiều cách Hơn nữa, khi khai thác kiến thức của chuyên đề có thể khai thác ở nhiều cấp độ khác nhau (từ phân tử → tế bào → cá thể), rồi khai thác kết nối với tiến hóa… Để hiểu rõ chuyên đề và giúp học sinh của đội tuyển có thêm nguồn tài liệu và rèn cách khai thác kiến thức tôi lựa

chọn cách tiếp cận chuyên đề này ở góc độ “Truyền tín hiệu và thụ thể liên kết protein G”

1.2 Mục đích của chuyên đề

- Biên soạn chuyên đề để nâng cao hiệu quả tự học của cá nhân, cung cấp thêm nguồn tài liệu cho học sinh trong đội tuyển

- Rèn luyện khả năng tự học, tự đọc tài liệu và khai thác kiến thức

1.3 Khái quát các nội dung của chuyên đề

* Về câu hỏi và bài tập

- Giới thiệu các câu hỏi và bài tập khai thác từ chương 11 cuốn Sinh học (Campbell & Reece)

- Giới thiệu và hướng dẫn học sinh khai thác các kiến thức liên quan đến nội dung lý thuyết của chuyên đề

đã viết ở phần đầu (với cách hướng dẫn gồm 3 bước: Trọng tâm kiến thức cần khai thác  Phân tích cơ

sở khoa học liên quan  trả lời câu hỏi)

- Giới thiệu các câu hỏi và bài tập về sự truyền tín hiệu ở thực vật; các câu hỏi và bài tập đã gặp trong các

kỳ thi, hội thi…

Phần 2 NỘI DUNG 2.1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA SỰ TRUYỀN TÍN HIỆU VÀ THỤ THỂ KẾT CẶP VỚI PROTEIN

G

Không có tế bào nào sống ở trạng thái tách biệt Trao đổi thông tin là đặc tính cơ bản của mọi tế bào và hình thành sự phát triển và chức năng của mọi sinh vật sống Thậm chí sinh vật đơn bào như nấm men, nấm nhầy và động vật nguyên sinh cũng giao tiếp thông qua tín hiệu ngoại bào: các phân tử tiết gọi

là pheromone điều phối sự quần tụ của các tế bào sống tự do cho giao phối hữu tính hoặc biệt hóa dưới những điều kiện môi trường nhất định Ở thực vật và động vật, quan trọng hơn là hormone và các phân tử tín hiệu ngoại bào khác hoạt động bên trong cơ thể sinh vật để kiểm soát một loạt các quá trình, bao gồm trao đổi chất của đường, chất béo và axit amin; sinh trưởng và biệt hóa của mô; tổng hợp và tiết của protein; và cấu thành dịch nội và ngoại bào Nhiều loại tế bào cũng đáp ứng với tín hiệu từ môi trường bên ngoài bao gồm ánh sáng, oxy, chất mùi và vị trong thức ăn

Ở bất kỳ hệ thống nào, tín hiệu phải được tiếp nhận để có tác động đến mục tiêu Trong tế bào, một tín hiệu chỉ tạo ra phản ứng đặc hiệu cho tế bào đích có thụ thể (receptor) cho tín hiệu đó Ở vài thụ thể, tín hiệu này là một kích thích vật lý như ánh sáng, va chạm, hoặc nhiệt Ở loại khác, đó là một phân tử hóa học Rất nhiều loại phân tử hóa học được sử dụng như tín hiệu: các tiểu phân tử (ví dụ các dẫn xuất axit amin hoặc lipid, acetylcholine), các chất khí (nitric oxide), peptide (ví dụ ACTH và vasopressin), protein hòa tan (ví dụ insulin và hormone sinh trưởng), và protein đính trên bề mặt tế bào hoặc liên kết với chất nền ngoại bào (extracellular matrix) Rất nhiều các phân tử tín hiệu ngoại bào này được tổng hợp và tiết ra bởi tế bào tín hiệu đặc thù trong sinh vật đa bào Hầu hết các thụ thể gắn với một phân tử đơn lẻ hoặc một nhóm các phân tử có liên quan chặt chẽ

Một số phân tử tín hiệu, đặc biệt phân tử kỵ nước như steroid, retinoid, và thyroxine khuếch tán tự phát qua màng tế bào và liên kết với thụ thể nội bào

Tuy nhiên hầu hết các phân tử tín hiệu đều quá lớn hoặc quá ưa nước để có thể xuyên qua được

màng tế bào chất Vậy làm thế nào để chúng có thể gây ảnh hưởng tới các quá trình nội bào? Những phân

tử tín hiệu này gắn với thụ thể bề mặt tế bào, là protein xuyên màng gắn vào màng tế bào chất Thụ thể bề mặt tế bào thường có ba miền (domain) hoặc phân đoạn (segment) riêng biệt: miền ngoại bào hướng ra dịch ngoại bào, miền xuyên màng đâm ngang qua màng tế bào chất, và miền nội bào hướng vào bào tương Phân tử tín hiệu hoạt động như một phối tử (ligand), gắn với vị trí ăn khớp về mặt cấu trúc trên các miền ngoại bào hoặc miền xuyên màng của thụ thể Phối tử gắn vào vị trí của nó trên thụ thể làm thay đổi

cấu hình của thụ thể Thay đổi này được dẫn truyền qua miền xuyên màng tới miền bào tương, dẫn đến sự tương tác và sau đó là kích hoạt (hoặc bất hoạt) các protein khác trong bào tương hoặc protein đính vào màng tế bào chất Trong nhiều trường hợp, những protein được hoạt hóa này xúc tác cho phản ứng tổng hợp một số phân tử nhỏ nhất định hoặc thay đổi nồng độ ion nội bào như Ca2+

Protein nội bào hoặc phân

tử tín hiệu thứ cấp (second messenger) sau đó mang tín hiệu này tới một hoặc nhiều protein hiệu ứng Toàn bộ quá trình chuyển đổi tín hiệu ngoại bào thành đáp ứng nội bào, cũng như các bước cụ thể trong quá trình này được gọi là quá trình truyền tín hiệu (signal transduction) (Hình 1)

Hình 1 Tổng quan truyền tín hiệu bằng thụ thể bề mặt tế bào

Thông tin liên lạc bởi tín hiệu ngoại bào thường gồm các bước sau: tổng hợp phân tử tín hiệu bởi tế bào tín hiệu và kết hợp chúng vào các túi nhỏ nội bào (bước 1), giải phóng chúng vào không gian ngoại bào bằng xuất bào (bước 2), và vận chuyển tín hiệu đến tế bào đích (bước 3) Sự gắn kết của phân tử tín hiệu vào một protein thụ thể bề mặt tế bào đặc hiệu làm thay đổi cấu hình của thụ thể, và rồi kích hoạt thụ thể

đó (bước 4) Thụ thể được kích hoạt này tiếp tục kích hoạt một hoặc nhiều protein truyền tín hiệu xuôi dòng, hoặc các tiểu phân tử tín hiệu thứ cấp (bước 5), cuối cùng dẫn đến sự kích hoạt của một hoặc nhiều protein hiệu ứng (bước 6) Kết quả sau cùng của quá trình lan tỏa tín hiệu này có thể dẫn đến thay đổi ngắn hạn của chức năng tế bào, chức năng trao đổi chất hoặc vận động (bước 7a), hoặc chuyển đổi dài hạn của biểu hiện gene hoặc phát triển (bước7b) Sự chấm dứt hoặc giảm điều khiển phản ứng tế bào được gây ra do hồi biến âm từ phân tử tín hiệu nội bào (bước 8 ) và do tín hiệu ngoại bào bị xóa bỏ (bước 9)

Trong sinh vật nhân chuẩn, khoảng một chục nhóm thụ thể bề mặt tế bào có chức năng kích hoạt một số loại con đường truyền tín hiệu nội bào Những năm gần đây, kiến thức của chúng ta về quá trình truyền tín hiệu đã tăng lên đáng kể, chủ yếu là bởi những thụ thể và con đường này có tính bảo tồn cao và hoạt động về cơ bản là giống nhau trong các loài sinh vật rất đa dạng như giun, ruồi, chuột và người Nghiên cứu di truyền kết hợp phân tích hóa sinh cho phép các nhà nghiên cứu theo dõi toàn bộ quá trình của nhiều con đường tín hiệu từ gắn kết của phối tử tới đáp ứng cuối cùng của tế bào

Có lẽ lớp thụ thể phổ biến nhất được tìm thấy trong các sinh vật từ nấm men tới người - là thụ thể liên hợp protein G (G protein-coupled receptor, GPCR) Như tên gọi của chúng, thụ thể liên hợp protein G gồm một protein thụ thể xuyên màng kết hợp với một protein G nội bào giúp truyền dẫn tín hiệu vào trong

tế bào Hệ gen người mã hóa cho khoảng 900 thụ thể liên hợp protein G, bao gồm các thụ thể trong hệ thị giác, khứu giác, và vị giác, nhiều thụ thể dẫn truyền xung thần kinh, và hầu hết các thụ thể cho hormone điều khiển quá trình chuyển hóa carbohydrate, axit amin và chất béo, và thậm chí cả hành vi Con đường truyền tín hiệu qua GPCR thường gây ra những thay đổi ngắn hạn trong chức năng tế bào, như thay đổi trong quá trình trao đổi chất hoặc vận động

Ngược lại, hoạt hóa những thụ thể bề mặt tế bào khác chủ yếu sẽ thay đổi một kiểu biểu hiện gene

tế bào, dẫn đến biệt hóa hoặc phân chia tế bào và các hệ quả lâu dài khác Các thụ thể cùng con đường truyền tín hiệu nội bào mà chúng hoạt hóa này được tìm hiểu ở mục B của chuyên đề này

Trước hết chúng ta sẽ thảo luận về nguyên tắc chung của quá trình truyền tín hiệu, như cơ sở phân

tử của liên kết phối tử - thụ thể, và những thành phần được bảo tồn qua tiến hóa của các con đường truyền tín hiệu Tiếp theo chúng ta mô tả phương thức thụ thể bề mặt tế bào và protein truyền tín hiệu được xác định và mô tả đặc trưng hóa sinh Sau đó chúng ta sẽ thảo luận sâu về thụ thể liên hợp protein G, tập trung

đầu tiên vào cấu trúc và cơ chế hoạt động của chúng rồi đến các con đường truyền tín hiệu chúng hoạt hóa Chúng ta cho thấy làm thế nào những con đường này ảnh hưởng tới rất nhiều khía cạnh của chức năng tế bào, bao gồm chuyển hóa glucose, co cơ, nhận biết ánh sáng và biểu hiện gene

2.2.1 Quá trình truyền tín hiệu: Từ tín hiệu ngoại bào tới đáp ứng tế bào

Như thể hiện ở hình1, quá trình truyền tín hiệu bắt đầu khi phân tử tín hiệu ngoại bào gắn với thụ thể bề mặt tế bào Liên kết của phân tử tín hiệu với thụ thể gây ra hai kiểu đáp ứng tế bào chính: (1) thay đổi hoạt động hoặc chức năng của các enzyme đặc hiệu và các protein khác đã có sản trong tế bào và (2) thay đổi lượng protein đặc hiệu mà tế bào sản xuất, phổ biến nhất bằng cách biến đổi các yếu tố phiên mã (transcription factor) gây kích thích hoặc ức chế biểu hiện gene (Hình 2, bước 7a và 7b) Nói chung, kiểu đáp ứng đầu tiên xảy ra nhanh hơn so với kiểu thứ hai Các yếu tố phiên mã được hoạt hóa trong bào tương bởi những con đường này sẽ dịch chuyển vào trong nhân, nơi chúng kích thích (hoặc thỉnh thoảng

ức chế) phiên mã của các gen đích đặc hiệu

Kết nối giữa một thụ thể được hoạt hóa và đáp ứng tế bào thường không trực tiếp mà bao gồm một

số protein trung gian hoặc các phân tử nhỏ Gộp lại, chuỗi các chất trung gian này được gọi là con đường truyền tín hiệu bởi nó chuyển đổi hoặc biến đổi thông tin từ dạng này sang dạng khác trong quá trình tín hiệu được chuyển tiếp từ một thụ thể tới đích của nó Một số con đường truyền tín hiệu chỉ chứa hai hoặc

ba chất trung gian, những con đường khác có thể liên quan tới hơn một chục chất Mặc dù vậy, hầu hết các con đường đều bao gồm thành viên của các lớp protein truyền tín hiệu nhất định được bảo tồn cao qua quá trình tiến hóa

2.2.1.1 Phân tử tín hiệu có thể hoạt động ở gần hoặc xa

Tế bào phản ứng với nhiều loại tín hiệu khác nhau – một số bắt nguồn từ bên ngoài cơ thể, một số được tạo ra từ bên trong Tín hiệu được tạo ra từ bên trong có thể được miêu tả theo phương thức chúng tìm tới đích Một số phân tử tín hiệu được vận chuyển qua quãng đường dài nhờ mạch máu; một số khác

có tác động tại chỗ nhiều hơn Ở động vật, tín hiệu bởi phân tử ngoại bào có thể được chia thành ba dạng nội tiết (endocrine), cận tiết (paracrine) hoặc tự tiết (autocrine) - tùy thuộc vào khoảng cách mà tín hiệu hoạt động (Hình 2 a - c) Thêm vào đó, một số protein màng nhất định trên một tế bào có thể trực tiếp truyền tín hiệu cho tế bào lân cận

Trong truyền tín hiệu nội tiết, phân tử tín hiệu được tổng hợp và tiết ra bởi tế bào tạo tín hiệu (ví

dụ những tế bào được tìm thấy trong tuyến nội tiết), được vận chuyển qua hệ tuần hoàn của cơ thể, và cuối cùng tác động lên tế bào đích ở cách xa so với nơi chúng được tổng hợp Thuật ngữ hormone thường để chỉ những phân tử tín hiệu điều tiết quá trình truyền tín hiệu endocrine Insulin tiết ra bởi tuyến tụy và epinephrine tiết ra bởi tuyến thượng thận là ví dụ về hormone di chuyển qua máu và điều tiết quá trình truyền tín hiệu nội tiết

Trong truyền tín hiệu cận tiết, phân tử tín hiệu giải phóng bởi một tế bào chỉ có thể tác động lên

các tế bào đích cự ly gần Một tế bào thần kinh giải phóng chất dẫn truyền xung thần kinh (ví dụ acetylcholine) tác động lên một tế bào thần kinh lân cận hoặc một tế bào cơ (kích thích hoặc ức chế co cơ)

là ví dụ của truyền tín hiệu cận tiết Ngoài việc dẫn truyền xung thần kinh, rất nhiều yếu tố sinh trưởng (growth factor) là protein điều tiết quá trình phát triển trong sinh vật đa bào và hoạt động ở phạm vi ngắn Một trong số các yếu tố sinh trưởng protein đó liên kết chặt chẽ với các thành phần của chất nền ngoại bào

và không thể truyền tín hiệu tới tế bào lân cận Sự phân hủy sau đó của thành phần chất nền này, gây ra bởi chấn thương hoặc nhiễm trùng, sẽ giải phóng yếu tố sinh trưởng hoạt động và giúp chúng có khả năng truyền thông tin Rất nhiều protein tín hiệu (quan trọng cho sự phát triển) khuếch tán khỏi các tế bào tín hiệu, tạo nên một gradient nồng độ và gây ra các đáp ứng tế bào khác nhau tùy thuộc vào nồng độ của protein tín hiệu

Hình 2 Các dạng tín hiệu ngoại bào

(a-c) Tín hiệu tế bào-tế bào bởi chất hóa học ngoại bào xảy ra ở khoảng cách từ vài micro mét trong tín hiệu autocrine và paracrine tới vài mét ở tín hiệu endocrine

(d) Protein gắn màng của một tế bào có thể tương tác trực tiếp với thụ thể bề mặt tế bào của các thế bào lân cận

Trong truyền tín hiệu tự tiết, tế bào đáp ứng với hợp chất mà chính chúng giải phóng ra Một số

yếu tố sinh trưởng hoạt động theo kiểu này, và tế bào nuôi cấy thường tiết ra các yếu tố sinh trưởng kích thích sự tăng trưởng và tăng sinh của chính bản thân chúng Dạng tín hiệu này là đặc điểm đặc trưng của các tế bào ung thư, nhiều trong số đó sản xuất quá thừa và tiết ra các yếu sinh trưởng kích thích sự tự tăng sinh không phù hợp và mất kiểm soát, một quá trình có thể dẫn tới hình thành khối u

Protein xuyên màng tại màng tế bào cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu (Hình 2d) Trong một vài trường hợp, những phân tử tín hiệu gắn màng trên một tế bào gắn vào thụ thể trên bề mặt một tế bào đích lân cận, gây ra quá trình biệt hóa Trong trường hợp khác, sự phân giải của protein tín hiệu đính màng giải phóng miền ngoại bào có chức năng như một phân tử tín hiệu hòa tan

Một số phân tử tín hiệu có thể hoạt động ở khoảng cách xa lẫn gần Ví dụ epinephrine (cũng được biết đến như adrenaline) hoạt động như một hormone hệ thống (truyền tín hiệu endocrine) và như một chất dẫn truyền xung thần kinh (truyền tín hiệu paracrine) Một ví dụ khác là nhân tố sinh trưởng biểu bì (EGF), được tổng hợp như một protein xuyên màng EGF đính màng có thể gắn với thụ thể của tế bào lân cận Thêm vào đó, phân giải EGF bởi một protease ngoại bào giải phóng EGF hòa tan, có thể truyền tín hiệu theo cả kiểu nội tiết lẫn kiểu cận tiết

2.2.1.2 Liên kết của phân tử tín hiệu hoạt hóa thụ thể trên tế bào đích

Protein thụ thể cho mọi phân tử nhỏ ái nước ngoại bào và phân tử protein tín hiệu đều nằm trên bề mặt của tế bào đích Phân tử tín hiệu, hoặc phối tử, bám vào một vị trí trên miền ngoại bào của thụ thể với

độ đặc hiệu và ái lực cao Mỗi thụ thể thường liên kết với chỉ một phân tử tín hiệu hoặc một nhóm các phân tử có cấu trúc rất giống nhau Tính liên kết đặc hiệu của một thụ thể nói lên khả năng của nó có thể gắn với hoặc không gắn với những hợp chất có quan hệ gần nhau

Liên kết phối tử phụ thuộc vào các lực đa liên kết không cộng hóa trị yếu (tức là các tương tác ion, van der Waals, và tương tác kỵ nước) và độ tương hợp phân tử giữa bề mặt tương tác của thụ thể và phối

tử Ví dụ, thụ thể hormone sinh trưởng (Hình 3) gắn với hormone sinh trưởng nhưng không gắn với các hormone khác có cấu trúc rất giống nó (nhưng không phải giống hệt) Tương tự, thụ thể acetylcholine chỉ gắn với phân tử nhỏ này mà không gắn với các chất khác dù chỉ có khác biệt nhỏ trong cấu trúc hóa học, trong khi đó thụ thể insulin gắn với insulin và các hormone liên quan gọi là yếu tố tăng trưởng tương tự insulin 1 và 2 (IGF-1 và IGF-2), nhưng không gắn với các hormone khác

Liên kết của phối tử với thụ thể gây ra thay đổi hình dạng của thụ thể, khởi đầu cho một chuỗi các phản ứng dẫn đến một đáp ứng đặc hiệu bên trong tế bào Sinh vật đã tiến hóa để có thể sử dụng một phối

tử duy nhất để kích thích các tế bào khác nhau đáp ứng theo các cách khác nhau Ví dụ, các loại tế bào khác nhau có thể có các tổ hợp thụ thể khác nhau cho cùng một phối tử, mỗi một trong số đó gây ra một con đường đáp ứng tín hiệu nội bào khác nhau Ngoài ra, cùng một thụ thể có thể được tìm thấy trên các loại tế bào khác nhau trong cơ thể sinh vật, nhưng tương tác của một phối tử nhất định với thụ thế gây ra đáp ứng khác nhau trên mỗi loại tế bào, do tổ hợp protein biểu hiện ở mỗi tế bào là độc nhất Theo những cách này, cùng một phối tử có thể khiến các tế bào khác nhau đáp ứng theo nhiều cách khác nhau Điều này được biết đến như tính đặc hiệu hiệu ứng (effector specificity) của phức hợp thụ thể - phối tử

Hình 3 Hormone sinh trưởng gắn với thụ thể qua tương hợp phân tử

(molecular complementary)

(a) Như được thể hiện từ cấu trúc lập phương của phức hợp hormone sinh trưởng thụ thể hormone sinh trưởng, 28 axit amin trong hormone được nằm ở giao diện tương tác với một thụ thể Để quyết định axit amin nào là quan trọng trong liên kết phối tử thụ thể, các nhà nghiên cứu đột biến từng axit amin một thành alanine và đánh giá ảnh hưởng tới sự liên kết thụ thể Từ nghiên cứu này, 8 axit amin trên hormone sinh trưởng (màu hồng) được cho là đóng góp 85 phần trăm năng lượng chịu trách nhiệm cho việc liên kết chặt chẽ với thụ thể, những axit amin này cách xa nhau trong trình tự bậc một nhưng lân cận nhau trong protein gấp nếp Những nghiên cứu tương tự chỉ ra hai tryptophan (màu xanh trên thụ thể đóng góp phần lớn năng lượng giúp cho liên kết chặt chẽ với hormone sinh trưởng, mặc dù các axit amin khác trên

bề mặt tương tác với hormone (màu vàng) cũng quan trọng

(b) Tương tác của hormone sinh trưởng với một phân tử thụ thể được tiếp theo bằng

(c) liên kết của thụ thể thứ hai (màu tím) tới mặt đối diện của hormone quá trình này bao gồm tổ hợp các axit amin vàng và xanh tương tự trên thụ thể nhưng các axit amin khác trên hormone

Ví dụ, mỗi bề mặt của các tế bào cơ xương, cơ tim, và các tế bào nang tuyến tụy sản xuất enzyme tiêu hóa thủy phân, đều có các thụ thể acetylcholine khác nhau Trong tế bào cơ xương, sự giải phóng của acetylcholine từ tế bào thần kinh vận động điều khiển nó sẽ kích hoạt co cơ bằng cách hoạt hóa kênh ion

có cổng acetylcholine Trong cơ tim, acetylcholine giải phóng bởi các tế bào thần kinh nhất định hoạt hóa thụ thể liên hợp protein G và làm chậm tốc độ co bóp và theo đó là nhịp tim Kích thích tế bào nang tuyến tụy bằng acetylcholine làm gia tăng nồng độ Ca2+

trong bào tương, gây ra sự xuất bào của enzyme tiêu hóa lưu trữ trong hạt tiết (secretory granule) để giúp tiêu hóa thức ăn Do vậy sự hình thành của các phức hợp thụ thể acetylcholine khác nhau trong các loại tế bào khác nhau dẫn tới các đáp ứng tế bào khác nhau

2.2.1.3 Protein kinase và phosphatase được sử dụng ở hầu hết mọi con đường tín hiệu

Sự hoạt hóa của hầu hết các thụ thể bề mặt tế bào đều trực tiếp hoặc gián tiếp dẫn tới thay đổi quá trình phosphoryl hóa protein thông qua kích hoạt các protein kinase (thêm nhóm phosphate vào các axit amin nhất định của protein đích) Một số thụ thể kích hoạt các protein phosphatase loại bỏ nhóm phosphate khỏi protein đích Phosphatase hoạt động phối hợp với kinase để bật hoặc tắt chức năng của nhiều protein khác nhau (Hình 4)

Hình 4 Điều hòa hoạt động của protein bằng công tắc kinase/phosphatase

Chu trình phosphoryl hóa và phosphoryl hóa của một protein là cơ chế tế bào phổ biến để điều khiển hoạt động của protein Trong ví dụ này, protein đích, hay cơ chất bị bất hoạt (xanh lá cây nhạt) khi không được phosphoryl hóa và hoạt hóa (xanh lá cây đậm) khi được phosphoryl hóa; một vài protein cÓ Cơ chế ngược lại Cả protein kinase và phosphatase đều chỉ hoạt động trên các protein xác định, và hoạt động của chúng thường được kiểm soát chặt chẽ

Theo tính toán gần nhất, bộ gene người mã hóa khoảng 600 protein kinase và 100 phosphatase khác nhau Nhìn chung, mỗi protein kinase phosphoryl hóa các axit amin nhất định trong một tập hợp các protein đích (hoặc cơ chất) thường có mô hình biểu hiện khác nhau trong các loại tế bào khác nhau Tế bào động vật có 2 loại protein kinaza: loại thêm phốt phát vào nhóm hydroxyl trên tyrosine và loại thêm phosphate vào nhóm hydroxyl trên serine hoặc threonine (hoặc cả hai) Tất cả các kinase cũng tương tác với những trình tự axit amin xác định xung quanh axit amin bị phosphoryl hóa, do đó dựa vào trình tự axit amin quanh tyrosine, serine và threonine trên protein có thể dự đoán kinase nào sẽ phosphoryl hóa axit amin này

Trong một số con đường tín hiệu, thụ thể sở hữu hoạt tính kinase nội tại hoặc gắn chặt với một kinase ở bào tương Hình 5 minh họa một con đường tín hiệu đơn giản gồm một kinase kết hợp với thụ thể

và protein đích chủ yếu Khi vắng mặt phối tử, kinase ở trạng thái bất hoạt Liên kết với phối tử kích thích thay đổi cấu hình của thụ thể, dẫn tới hoạt hóa kinase nối với nó Kinase này sau đó phosphoryl hóa một yếu tố phiên mã đặc hiệu đang ở dạng monomer bất hoạt, làm nó hình thành cấu trúc dimer và di chuyển

từ bào tương vào trong nhân để kích hoạt phiên mã các gene đích Một phosphatase trong nhân sau đó loại nhóm phosphate khỏi yếu tố phiên mã, biến nó thành hai monomer bất hoạt và di chuyển trở lại bào tương nơi nó có thể được hoạt hóa trở lại bởi kinase liên kết thụ thể

Như ví dụ này minh họa, hoạt động của mọi protein kinase đối chọi với hoạt động của protein phosphatase, mà bản thân một vài trong số đó cũng bị điều khiển bởi tín hiệu ngoại bào Do đó hoạt động của protein trong một tế bào có thể là hệ quả tổng hợp của các kinase và phosphatase tác động trên nó, trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua phosphoryl hóa một protein khác

Hình 5 Con đường truyền dẫn tín hiệu đơn giản bao gồm một kinase và một protein đích

Thụ thể liên kết chặt chẽ với một protein kinase tới mức, khi vắng mặt một phối tử bám vào, bị giữ ở trạng thái bất hoạt Phối tử bám vào kích thích thay đổi cấu hình trên thụ thể, làm hoạt hóa kinase liên kết với

nó (1) Kinase này sau đó phosphoryl hóa dạng monomer bất hoạt của một yếu tố phiên mã đặc biệt (2),

dẫn tới sự nhị hợp của chúng (3) và di chuyển từ bào tương vào trong nhân (4), nơi nó kích hoạt phiên mã của gene đích Một phosphatase trong nhân sẽ loại bỏ nhóm phosphate khỏi yếu tố phiên mac (5), biến nó thành monomer bất hoạt và chuyển trở lại vào bào tương (6)

Nhiều protein là cơ chất cho nhiều loại kinase, mỗi loại phosphoryl hóa các axit amin khác nhau Mỗi lần phosphoryl hóa có thể biến đổi hoạt động của protein đích nhất định theo các cách khác nhau, một

số kích hoạt chức năng của protein, số khác bất hoạt nó Một ví dụ chúng ta sẽ gặp về sau là glycogen phosphorylase kinase, một enzyme điều hòa chính trong trao đổi chất glucose Trong nhiều trường hợp, thêm nhóm phosphate vào axit amin sẽ tạo bề mặt liên kết cho phép một protein thứ hai bám vào trong chương tiếp theo chúng ta sẽ gặp nhiều ví dụ về sự lắp ghép của phức hệ đa protein điều khiển bởi kinase

Thông thường chính hoạt tính xúc tác của một protein kinase cũng được điều hòa bằng sự phosphoryl hóa bởi các kinase khác, bằng các protein liên kết với nó, hoặc bằng sự thay đổi nồng độ của rất nhiều phân tử tín hiệu nội bào nhỏ và các chất chuyển hóa Kết quả là một chuỗi hoạt động kinase và đây là tính năng chung của nhiều con đường tín hiệu

2.2.1.4 Protein gắn GTP thường được sử dụng trong quá trình truyền tín hiệu như công tắc bật/tắt

Rất nhiều con đường truyền tín hiệu sử dụng công tắc” protein nội bào để bật hoặc tắt protein xuôi dòng Nhóm protein công tắc nội bào quan trọng nhất là siêu họ GTPase Mọi protein công tắc GTPase tồn tại dưới hai dạng (Hình 6): (1) dạng hoạt hóa (mở) liên kết với GTP (guanosine triphosphate) điều khiển hoạt động của các protein đích nhất định và (2) dạng bất hoạt (đóng) kết hợp với GDP (guanosine diphosphate)

Hình 6 Công tắc protein GTPase xoay vòng giữa trạng thái hoạt động và bất hoạt

Công tắc protein ở trạng thái hoạt động khi gắn GTP và ở trạng thái bất hoạt khi gắn GDP Chuyển đổi từ dạng hoạt hóa sang bất hoạt thông qua thủy phân GTP gắn được gia tốc bởi GAPs (protein gia tốc GTPase) và các protein khác Tái kích hoạt được đề thăng bởi GEFs (yếu tố trao đổi nucleotide guanine), xúc tác quá trình phân ly và thay thế GDP bằng GTP

Sự chuyển đổi từ dạng bất hoạt sang hoạt hóa được kích thích bởi một tín hiệu (ví dụ một hormone liên kết với một thụ thể) và được xúc tác bởi yếu tố trao đổi nucleotide guanine guanine nucleotide exchange factor, GEF) làm giải phóng GDP từ protein công tắc Tiếp đến GDP thế vào chỗ GDP, do mặc

dù ái lực kém hơn nhưng bù lại có nồng độ nội bào cao hơn, dẫn đến thay đổi cấu hình thành dạng hoạt hóa Sự thay đổi cấu hình chính bao gồm hai phân đoạn được bảo tồn cao của protein, gọi là công tắc I và công tắc II, cho phép protein liên kết và hoạt hóa các protein tín hiệu xuôi dòng khác (Hình 7) Sự i chuyển đổi của dạng hoạt hóa ngược lại thành dạng bất hoạt được xúc tác bởi GTPase thủy phân dần dần liên kết GTP thành GDP và P, do đó thay đổi cấu hình của phân đoạn công tắc I và công tắc II làm chúng không thể liên kết với protein hiệu ứng GTPase có thể là một phần nội tại của protein G hoặc là một protein riêng biệt

Hình 7 Cơ chế công tắc của protein G

Khả năng của protein G tương tác với các protein khác và do đó truyền dẫn một tín hiệu khác nhau trong trạng thái "bật" gắn-GTP và trạng thái "tắt" gắn-GDP (a) Trong trạng thái "bật" hoạt động, hai miền, gọi là công tắc | (xanh lá) và công tắc II (xanh dương), được gắn với đầu gamma phosphate của GTP thông qua tương tác với nhóm amide ở mạch khung của gốc threonine và glycine được bảo tồn Khi gắn với GTP theo cách này, hai miền công tắc một cấu hình sao cho chúng có thể gắn với và do đó kích hoạt protein hiệu ứng đặc hiệu xuôi dòng (b) Sự giải phóng của gamma phosphate bởi phản ứng thủy phân do GTPase xúc tác làm công tắc và công tắc Il giãn ra tạo thành một cấu hình mới, trạng thái“tắt” bất hoạt; trong trạng thái này chúng không thể gắn với protein hiệu ứng Mô hình vòng đai thể hiện ở đây miêu tả

cả hai cấu hình của Ras, một monomer protein G Một cơ chế lò xo tương tự chuyển đổi tiểu phần alpha của trimer protein G giữa cấu hình hoạt động và bất hoạt bằng sự vận động của ba phân đoạn công tắc

Tốc độ thủy phân GTP điều khiển thời gian protein công tắc tồn tại ở dạng hoạt hóa và khả năng phát tín hiệu cho protein đích xuôi dòng của nó Tốc độ thủy phân GTP càng chậm, protein tồn tại ở trạng thái hoạt hóa càng lâu Tốc độ thủy phân GTP thường được điều chỉnh bởi các protein khác Ví dụ, cả protein hoạt hóa GTPase (GTPase activating protein, GAP) và protein điều hòa tín hiệu protein G (regulator of G đi protein signaling (RGS) protein) đều đẩy nhanh phản ứng thủy phân GTP Rất nhiều chất điều hòa hoạt động protein G cũng được điều khiển bởi tín hiệu ngoại bào

Hai nhóm lớn của protein công tắc GTPase được sử dụng trong truyền tín hiệu Trimer protein G (lớn) liên kết trực tiếp với và được hoạt hóa bởi các thụ thể bề mặt tế bào nhất định Thụ thể liên hợp protein G hoạt động như yếu tố trao đổi nucleotide guanine (GEF) – thúc đẩy sự giải phóng GDP và gắn GTP, do đó hoạt hóa protein G Monomer protein G (nhỏ), như Ras và nhiều protein giống Ras, không liên kết với thụ thể nhưng đóng vai trò quan trọng trong nhiều con đường điều khiển phân chia tế bào và vận động tế bào, như được chứng minh bằng thực tế rằng đột biến các gene mã hóa protein G thường dân tới ung thư Các thành viên khác của cả hai nhóm GTPase, bằng cách chuyển đổi giữa dạng gắn-GTP

“bật" và gắn-GDP “tắt", hoạt động trong tổng hợp protein, vận chuyển protein giữa nhân và bào tương, sự hình thành túi bọc và dung hợp của chúng với màng đích, và quá trình sắp xếp lại khung tế bào actin (actin cytoskeleton)

2.2.1.5 "Phân tử tín hiệu thứ cấp” nội bào dẫn truyền và khuếch đại tín hiệu từ nhiều thụ thể

Liên kết của phối tử ("phân tử tín hiệu sơ cấp, first messenger”) với nhiều thụ thể bề mặt tế bào làm tăng (hoặc giảm) ngắn hạn nồng độ của các phân tử tín hiệu nội bào có trọng lượng phân tử thấp nhất định gọi là phân tử tín hiệu thứ cấp (second messenger) Đến lượt, các phân tử này liên kết với các protein khác và thay đổi hoạt động của chúng

Một phân tử tín hiệu thứ cấp được sử dụng trong hầu hết các tế bào của sinh vật đa bào là ion Canxi Người ta cho rằng nồng độ Ca2+ tự do trong bào tương được giữ rất thấp (<10 M) bởi bơm năng lượng ATP liên tục vận chuyển Ca2+

ra khỏi tế bào hoặc vào trong mạng lưới nội chất (ER) Nồng độ Ca2+bào tương có thể tăng từ 10 tới 100 lần do giải phóng Ca2+

theo tín hiệu kích thích từ các kho dự trữ trong

ER hoặc được nhập vào thông qua các kênh canxi từ môi trường ngoại bào; sự thay đổi này có thể được

phát hiện bằng thuốc nhuộm phát huỳnh quang đưa vào tế bào Trong cơ, sự tăng nồng độ do tín hiệu kích thích của Ca2+

bào tương gây ra co cơ Trong tế bào nội tiết, sự tăng tương tự của Ca2+ gây xuất bào các túi tiết chứa hormone, để rồi được giải phóng vào hệ tuần hoàn Trong tế bào thần kinh, tăng nồng độ Ca2+

bào tương dẫn tới xuất bào các túi chứa chất dẫn truyền xung thần kinh Trong mọi tế bào, sự tăng nồng

độ Ca2+

bào tương này được nhận biết bởi protein liên kết Ca2+ đặc biệt là những protein thuộc họ bàn tay

EF (EF hand family), như calmodulin, tất cả đều chứa mô típ xoắn-vòng-xoắn (helix-loop-helix) Liên kết của Ca2+

với calmodulin và các protein bàn tay EF khác gây thay đổi cấu hình, cho phép những protein này liên kết với các protein đích khác nhau, do đó bật hoặc tắt chức năng của chúng

Một phân tử tín hiệu thứ cấp phổ biến khác là AMP vòng (cAMP) Trong nhiều tế bào nhân chuẩn, tăng cAMP kích thích hoạt hóa một protein kinase đặc biệt, protein kinase A, để rồi nó phosphoryl hóa các protein đích nhất định dẫn tới thay đổi đặc hiệu trong trao đổi chất tế bào Trong một số loại tế bào, cAMP điều khiển hoạt động của các kênh ion nhất định Cấu trúc của cAMP và ba phân tử tín hiệu thứ cấp phổ biến khác được thể hiện ở hình 8 Ở phần sau, chúng ta sẽ xem xét vai trò đặc biệt của phân tử thứ cấp trong các con đường tín hiệu được hoạt hóa bởi các thụ thể liên hợp protein G khác nhau

Hình 8 Bốn phân tử tín hiệu thứ cấp nội bào phổ biến

Ảnh hưởng hoặc các ảnh hướng trực tiếp chính của mỗi hợp chất được chỉ ra ở dưới công thức cấu trúc của chúng lon canxi (Ca 2+ ) và vài dẫn xuất phosphatidylinositol bám màng cũng hoạt động như phân tử tín hiệu thứ cấp

Vì các phân tử tín hiệu thứ cấp như Ca2+

và cAMP khuếch tán qua bào tương nhanh hơn nhiều so với protein, nên chúng được sử dụng trong các con đường nơi đích xuôi dòng nằm trong cơ quan nội bào (như túi tiết hoặc nhân) cách xa thụ thể màng tế bào chất nơi tín hiệu được hình thành

Một ưu thế nữa của tín hiệu thứ cấp là chúng hỗ trợ khuếch đại tín hiệu ngoại bào Sự hoạt hóa của một phân tử thụ thể tế bào đơn lẻ có thể làm tăng hàng nghìn phân tử cAMP hoặc ion Ca2+

trong bào tương Đến lượt, mỗi phân tử này, bằng cách kích hoạt protein đích của chúng, ảnh hưởng tới hoạt động của rất nhiều protein xuôi dòng Trong nhiều con đường truyền tín hiệu, sự khuếch đại là cần thiết vì thụ thể bề mặt tế bào thường là protein có số lượng thấp, chỉ khoảng một nghìn phân tử mỗi tế bào Thế nhưng đáp ứng tế bào gây nên bởi liên kết của một lượng tương đối nhỏ hormone với thụ thể có sẵn thường cần hình thành hàng chục tới trăm nghìn phân tử hiệu ứng hoạt hóa mỗi tế bào Trong trường hợp thụ thể hormone liên hợp protein G, khuếch đại tín hiệu có thể xảy ra phần nào là nhờ một thụ thể đơn lẻ có thể kích hoạt nhiều protein G, mỗi trong số này theo lượt lại hoạt hóa một protein hiệu ứng Ví dụ, một đơn phức hợp epinephrine-GPCR kích hoạt tới 100 phân tử adenylyl cyclase, mỗi trong số chúng lại xúc tác tổng hợp rất nhiều phân tử cAMP trong thời gian chúng tồn tại ở trạng thái hoạt động Hai phân tử cAMP hoạt hóa một phân tử protein kinase A mà theo lượt lại phosphoryl hóa và kích hoạt nhiều phân tử sản phẩm đích (Hình 9) Về sau trong chương này, chúng ta sẽ thấy làm thế nào chuỗi khuếch đại này cho phép nồng độ epinephrine trong máu thấp ở mức 10-10 M mà có thể kích thích quá trình ly giải glycogen glycogenolysis, chuyển hóa glycogen thành glucose) nhờ gan và giải phóng glucose vào trong máu

Hình 9 Khuếch đại tín hiệu ngoại bào

Trong ví dụ này, liên kết của một phân tử epinephrine với phân tử thụ thể liên hợp protein G gây hoạt hóa vài phân tử adenylyl cyclase, enzyme xúc tác cho quá trình tổng hợp AMP vòng, và mỗi enzyme này tổng hợp một lượng lớn phân tử CAMP, tầng đầu tiên của quá trình khuếch đại Hai phân tử CAMP hoạt hóa một phân tử protein kinase A (PKA) nhưng mỗi một PKA hoạt động phosphoryl hóa và kích hoạt nhiều protein dích Tầng thứ hai của quá trình khuếch đại này có thể bao gồm vài phản ứng nối tiếp nhau trong

đó sản phẩm của một phản ứng kích hoạt enzyme xúc tác cho phản ứng tiếp theo Chuỗi phản ứng càng nhiều bước, tín hiệu càng có khả năng khuếch đại hơn

Kết luận quan trọng cần nhớ: Truyền dẫn tín hiệu: từ tín hiệu ngoại bào tới đáp ứng tế bào

(1) Mọi tế bào đều giao tiếp thông qua tín hiệu ngoại bào Trong sinh vật đơn bào, phân tử tín hiệu ngoại bào điều khiển tương tác giữa các cá thể, trong khi ở sinh vật đa bào, chúng điều khiển sinh lý và phát triển

(2) Tín hiệu ngoại bào bao gồm protein hoặc peptide tiết và gắn màng (ví dụ vasopressin và insulin), phân

tử kỵ nước nhỏ (ví dụ hormone steroid và thyroxine), phân tử ưa nước nhỏ (ví dụ epinephrine), chất khí (như oxi, nitric oxide), và tác nhân vật lý (ánh sáng)

(3) Liên kết của phân tử tín hiệu ngoại bào với thụ thể bề mặt tế bào kích thích thay đổi cấu hình thụ thể,

từ đó dẫn tới hoạt hóa các con đường truyền dẫn tín hiệu nội bào, cuối cùng điều chỉnh trao đổi chất, chức năng, hoặc biểu hiện gene của tế bào (xem hình 1)

(4) Protein gắn GTP thuộc siêu họ GTPase hoạt động như những công tắc điều khiển rất nhiều con đường dẫn truyền tín hiệu (xem Hình 6 và 7)

(5) Ca2+, cAMP, và các phân tử nội bào không phải protein và có khối lượng phân tử thấp khác (Hình 8) hoạt động như các “phân tử tín hiệu thứ cấp”, tiếp nhận và khuếch đại tín hiệu từ “phân tử tín hiệu sơ cấp"

là phối tử Liên kết của phối tử với thụ thể bề mặt tế bào thường làm tăng (hoặc thỉnh thoảng giảm) nhanh chóng nồng độ nội bào của các ion hoặc phân tử này

2.2.2 Nghiên cứu thụ thể bề mặt tế bào và protein truyền tín hiệu

Đáp ứng của một tế bào với tín hiệu ngoại bào phụ thuộc vào nhóm thụ thể của tế bào nhận biết tín hiệu và các con đường truyền tín hiệu kích hoạt bởi những thụ thể đó Trong chương này, chúng ta tìm hiểu nền tảng sinh hóa của tính đặc hiệu liên kết thụ thể-phối tử, cũng như việc các nồng độ khác nhau của phối tử có khả năng kích hoạt một con đường tín hiệu Chúng ta cũng xem xét các kỹ thuật thí nghiệm sử dụng để mô tả đặc điểm của protein thụ thể Rất nhiều phương pháp này cũng có thể áp dụng được cho thụ thể chi phối quá trình nhập bào hoặc kết dính tế bào Kết thúc phần này chúng ta thảo luận các kỹ thuật thường được sử dụng để đo hoạt động của các hợp phần truyền dẫn tín hiệu, như kinase và protein "công tắc” gắn GTP

2.2.2.1 Hằng số phân ly là số đo ái lực của thụ thể với phối tử của nó

Liên kết của một thụ thể thường được xem như một phản ứng thuận nghịch đơn giản, trong đó thụ thể được biểu diễn là R, phối tử là L, và phức hợp thụ thể-phối tử là RL Khi cân bằng, tốc độ hình thành phức hợp thụ thể-phối tử bằng với tốc độ phân ly của nó

* Kết nối y học: Thụ thể hormone được đặc trưng bởi ái lực và độ đặc hiệu cao của chúng với phối

tử Bởi ái lực cao và độ đặc hiệu lớn với hormone đích, miền ngoại bào gắn phối tử của thụ thể bề mặt tế

bào có thể được chuyển hóa thành các thuốc có hiệu lực mạnh Hãy xem xét trường hợp của hormone yếu

tố hoại tử khối u alpha (tumor necrosis factor alpha, TNF) được tiết bởi nhiều tế bào của hệ miễn dịch TNF gây phản ứng viêm bằng cách huy động nhiều loại tế bào miễn dịch khác nhau tới vị trí bị thương hoặc nhiễm trùng, nồng độ bất thường của TNFa gây phản ứng viêm quá độ trong bệnh nhân mắc các bệnh tự miễn như bệnh phồng rộp da, bệnh vẩy nến hoặc viêm khớp dạng thấp khớp Những bệnh này đang được chữa trị bằng các protein “dung hợp” thể khảm (chimeric fusion protein), tạo ra bằng kỹ thuật DNA tái tổ hợp chứa miền ngoại bào của thụ thể TNF dung hợp với một vùng hằng định (Fc) của immunoglobulin của người Các thuốc này gắn chặt với TNF tự do và ngăn không cho nó bám vào thụ thể

bề mặt tế bào gây phản ứng viêm; miền Fc dung hợp giúp protein ổn định khi được tiêm vào cơ thể

2.2.2.2 Thí nghiệm liên kết được sử dụng để phát hiện thụ thể và xác định ái lực cùng độ đặc hiệu của chúng với phối tử

Thông thường thụ thể trên tế bào nguyên vẹn hoặc các mảnh tế bào được phát hiện và đo bằng khả năng của chúng gắn phối tử đánh dấu phóng xạ hoặc phát huỳnh quang Hình 10 mô tả thí nghiệm liên kết như vậy cho tương tác của hormone tạo hồng cầu erythropoietin (Epo) với thụ thể Epo được biểu hiện thông qua kỹ thuật DNA tái tổ hợp trong một dòng tế bào nuôi cấy Lượng Epo phóng xạ gắn với thụ thể trên tế bào đang tăng trưởng (trục tung) được đo dưới dạng hàm số của sự tăng nồng độ Epo đánh dấu 125

I thêm vào dịch ngoại bào (trục hoành) Cả số lượng vị trí gắn phối tử mỗi tế bào và giá trị Kd, đều được dễ dàng xác định từ đường cong liên kết đặc hiệu (đường C) Giả sử mỗi thụ thể chỉ gắn với một phân tử phối

tử, tổng số vị trí gắn phối hợp" tử trên một tế bào tương đương với số tạo thụ thể hoạt động mỗi tế bào Trong ví dụ ở Hình 10, giá trị Kd, bằng khoảng 1,1 x 10-10M ở dịch ngoại bào Nói theo của cách khác, Epo nồng độ 1,1 x 10-10

M trong dịch ngoại bào là cần thiết để 50% thụ thể Epo trên một tế bào gắn được với Epo

Thí nghiệm liên kết trực tiếp như Hình 10 có thể thực hiện được với thụ thể có ái lực cao với phối

tử của chúng, như thụ thể erythropoietin và thụ thể insulin của tế bào gan (Kd, = 1,4 x 10-10M) Tuy nhiên rất nhiều phối tử, như epinephrine và các catecholamine khác gắn thụ thể với ái lực thấp hơn nhiều Nếu

Kd, lớn hơn khoảng 1 x 10-7M, trường hợp mà hằng số tốc độ ktắt tương đối lớn so với kbậ , thì trong thời gian vài giây tới vài phút cần thiết để đo lượng phối tử gắn, có thể vài thụ thể gắn phối tử sẽ phân ly và do

đó giá trị liên kết quan sát được của cả hệ thống sẽ quá thấp

Một cách để đo liên kết yếu của phối tử và thụ thể là thực hiện thí nghiệm cạnh tranh với một phối

tử khác có khả năng tương tác với cùng thụ thể với ái lực cao giá trị Kd thấp) Trong kiểu thí nghiệm này, lượng tăng dần của một phối tử ái lực thấp không đánh dấu (chất cạnh tranh) được thêm vào mẫu tế bào với một lượng xác định phối tử ái lực cao đánh dấu phóng xạ (Hìn 11) Liên kết của chất cạnh tranh không đánh dấu với thụ thể ngăn cản liên kết của phối tử đánh dấu phóng xạ với thụ thể Sự phụ thuộc nồng độ của sự cạnh tranh này có thể được sử dụng cùng với giá trị Kd của phối tử đánh dấu phóng xạ để tính toán hằng số ức chế Kd, có giá trị gần bằng với giá trị Kd, của liên kết giữa chất cạnh tranh với thụ thể Có thể

đo chính xác lượng phối tử ái lực cao liên kết trong thí nghiệm này vì rất ít sự phân ly xảy ra trong quá trình thao tác thí nghiệm cần thiết cho đo đạc (k 'tắt’ tương đối thấp)

Hình 10 Thí nghiệm liên kết có thể xác định K d và lượng thụ thể ở tế bào

Ở đây biểu diễn dữ liệu cho thụ thể đặc hiệu erythropoietin trên bề mặt một dòng tế bào chuột nuôi cấy siêu biểu hiện erythropoietin (Epo) người tái tổ hợp so với tế bào đối chứng không biểu hiện thụ thể đó

Dịch huyền phù của tế bào được ủ 1 tiếng ở 4°C với lượng tăng dần của Epo đánh dấu 1251; nhiệt độ thấp được sử dụng để ngăn quá trình thực bào của thụ thể bề mặt tế bào Tế bào được tách khỏi 125L Epo không bám, thường bằng ly tâm, và lượng phóng xạ gắn với chúng được đo Đường tổng thể liên kết A thể hiện Epo liên kết đặc hiệu với thụ thể ái lực cao cũng như Epo liên kết không đặc hiệu với ái lực thấp với các phân tử khác trên bề mặt tế bào Sự góp mặt của liên kết không đặc hiệu trong tổng thể liên kết được xác định bằng cách lặp lại thí nghiệm liên kết với dòng tế bào đối chứng, khi Epo chỉ liên kết với các vị trí không đặc hiệu, tạo nên đường B Đường liên kết đặc hiệu C được tính toán theo sự khác nhau giữa đường A và đường B Như tính bằng độ liên kết cực đại của liên kết đặc hiệu của đường C, số lượng vị trí liên kết đặc hiệu Epo (thụ thể bề mặt) mỗi tế bào bằng khoảng 2200 (3,7 x 10 -15

mol x 6,02x 10 23 phân tử/ mol/10 6 tế bào = 2227 phân tử/tế bào) K d là nồng độ cần thiết của Epo để gắn với 50 phần trăm thụ thể

bề mặt Epo (trong trường hợp này khoảng 1050 thụ thể/tế bào) Do đó K d , bằng khoảng 1,1x 10 -10 M, hoặc 0,1 nM

* Kết nối y học: Liên kết cạnh tranh thường được sử dụng để nghiên cứu chất tổng hợp tương tự (analog)

của các hormone tự nhiên có chức năng kích hoạt hoặc ức chế thụ thể Những chất tương đương này, được

sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu thụ thể bề mặt tế bào và cũng như dược chất tiềm năng, có thể nhóm vào hai loại: loại agonist, có khả năng bắt chước chức năng của một hormone tự nhiên bằng cách liên kết với thụ thể của nó và gây đáp ứng bình thường, và loại antagonist (đối kháng, có khả năng gắn với thụ thể nhưng không gây đáp ứng Bằng cách chiếm lấy vị trí gắn phối tử trên thụ thể, một antagonist có thể ngăn chặn liên kết của hormone tự nhiên (hoặc agonist) và do đó làm giảm hoạt tính sinh lý của hormone Nói theo cách khác, antagonist ức chế tín hiệu thụ thể Ví dụ trường hợp của thuốc isoproterenol, vốn được sử dụng để chữa hen suyễn Isoproterenol được tổng hợp bằng cách thêm hai nhóm methyl vào epinephrine theo con đường hóa học (Hình 11, bên phải) Isoproterenol, một agonist của thụ thể liên hợp protein G đáp ứng epinephrine trên tế bào cơ trơn phế quản, liên kết mạnh hơn khoảng 10 lần (Kd, nhỏ hơn 10 lần) so với epinephrine (xem hình 11, bên trái) Vì sự hoạt hóa các thụ thể này thúc đẩy sự giãn cơ trơn phế quản

và theo đó mở đường cho không khí vào phổi, isoproterenol được sử dụng để chữa hen phế quản, viêm phế quản mãn tính và khí phế thũng Ngược lại, hoạt hóa một loại khác của thụ thể liên hợp protein G đáp ứng epinephrine trên tế bào cơ trơn tim (gọi là thụ thể B-adrenalin) làm tăng tốc độ co bóp tim Các phân

tử đối kháng của thụ thể này, như alprenolol và các hợp chất liên quan, được biết đến dưới tên gọi các thuốc ức chế beta, những chất đối kháng này được sử dụng để giảm co bóp tim trong điều trị rối loạn nhịp tim và đau thắt ngực

2.2.2.3 Đáp ứng cực đại của tế bào với phân tử tín hiệu thường không yêu cầu hoạt hóa tất cả các thụ thể

Mọi hệ thống tín hiệu đã phát triển sao cho mỗi lượng tăng của phân tử tín hiệu ngoại bào đều gây

ra phản ứng tương ứng ở tế bào đáp ứng Để điều này xảy ra, ái lực (giá trị Kd) của một thụ thể bề mặt tế bào đối với phân tử tín hiệu phải lớn hơn mức thông thường (khi không kích thích) của phân tử đó trong dịch ngoại bào hoặc trong máu Chúng ta có thể thấy nguyên tắc này trong thực tế bằng cách so sánh nồng

độ của insulin có mặt trong cơ thể và Kd cho liên kết của insulin với thụ thể của nó trong tế bào gan, 1,4 x

10-10 M Giả sử rằng nồng độ thông thường của insulin trong máu là 5 x 10-12M Bằng cách thay thế nồng

độ này và giá trị Kd chúng ta có thể tính được phần thụ thể insulin liên kết với insulin

Hình 11 Với phối tử ái lực thấp, liên kết có thể được phát hiện bởi thí nghiệm cạnh tranh

Trong thí nghiệm này, phối tử alprenolol tổng hợp, gắn với thụ thể epinephrine trên tế bào gan với ái lực cao (Kd = 3x 10 -9 M), được sử dụng để phát hiện liên kết của hai phối tử có ái lực thấp, hormone epinephrine (EP) tự nhiên và một thụ thể tổng hợp gọi là isoproterenol (IP) Thí nghiệm được thực hiện

theo miêu tả ở hình 10 nhưng trong các phản ứng có chứa một lượng hằng định của [ 3

H] alprenolol và lượng tăng dần không đánh dấu của epinephrine hoặc isoproterenol Ở mỗi nồng độ của chất cạnh tranh, một lượng alprenol đánh dấu liên kết được xác định Trong đồ thị giữa sự ức chế liên kết của [ 3

H] alprenolol và nồng độ epinephrine hoặc isoproterenol, như đồ thị trên, nồng độ của chất cạnh tranh mà

ức chế 50 phần trăm liên kết alprenolol sẽ cho xấp xỉ giá trị Kd, của liên kết của chất cạnh tranh Chú ý rằng nồng độ của các chất cạnh tranh được thể hiện theo bậc logarit Kd cho liên kết của epinephrine với thụ thể của nó trên tế bào gan chỉ khoảng ~5x 10^-5 M, và sẽ không thể đo được bằng thí nghiệm liên kết trực tiếp với [ 3

H] epinephrine Kd cho liên kết của isoproterenol, mà gây ra phản ứng tế bào bình thường, thì thấp hơn nhiều hơn mười lần

Ở trạng thái cân bằng 0,0344; là khoảng 3 phần trăm tổng số thụ thể insulin sẽ liên kết với insulin Nếu nồng độ insulin tăng gấp năm lên 2,5 x 10-11, lượng phức hợp thụ thể-hormone sẽ tăng lên tương ứng, gần năm lần, sao cho khoảng 15 phần trăm tổng số thụ thể sẽ liên kết với insulin Nếu mức độ đáp ứng tế bào được tạo ra tương đương với số lượng phức hợp insulin thụ thể, (RLC), như không thấy, thì các đáp ứng tế bào cũng tăng lên khoảng năm lần Mặt khác, giả sử rằng nồng độ bình thường của insulin trong máu là bằng giá trị Kd khoảng 1,4 x 10-10M; trong trường hợp này, 50 phần trăm tổng số thụ thể sẽ liên kết với insulin Một lượng tăng gấp năm lần của nồng độ insulin lên 7 x 10-10

M sẽ cho kết quả là 83 phần trăm tổng số thụ thể insulin sẽ có insulin gắn vào (tăng 66 phần trăm) Do đó, để nồng độ hormone tăng để gây ra sự tăng tuyến tính của phần thụ thể có phối tử gắn vào, nồng độ bình thường của hormone phải nhỏ hơn rất nhiều giá trị Kd

Thông thường, đáp ứng cực đại của tế bào đối với một phối tử xác định được tạo ra khi một tỉ lệ nhỏ hơn rất nhiều so với 100 phần trăm thụ thể của nó được liên kết với phối tử Hiện tượng này có thể được phát hiện bằng cách xác định mức độ đáp ứng và mức độ liên kết thụ thể-phối tử ở các nồng độ phối

tử khác nhau (Hình 12) Ví dụ, một tế bào tiền hồng cầu điển hình có - 1000 thụ thể bề mặt cho erythropoietin, hormone protein thúc đẩy tăng sinh và biệt hóa của các tế bào này thành tế bào máu Bởi vì chỉ 100 thụ thể này cần gắn với erythropoietin để kích thích sự phân chia của một tiền tế bào, nồng độ phối tử cần thiết để gây 50 phần trăm đáp ứng cực đại của tế bào sẽ thấp hơn theo tỉ lệ thuận so với giá trị

Kd cho liên kết Trong trường hợp như vậy, một đồ thị biểu diễn quan hệ giữa phần trăm liên kết cực đại

và nồng độ phối tử sẽ khác với đồ thị giữa đáp ứng cực đại tế bào và nồng độ phối tử

2.2.2.4 Độ nhạy của tế bào với tín hiệu ngoại bào được xác định bằng số lượng thụ thể bề mặt và ái lực của chúng với phối tử

Bởi vì đáp ứng tế bào với một phân tử tín hiệu nhất định phụ thuộc vào số lượng phức hợp thụ thể-phối tử, lượng thụ thể có mặt trên bề mặt tế bào càng ít, tế bào càng kém mẫn cảm với thụ thể đó Vì vậy nồng độ phối tử cần phải cao hơn để có thể kích thích đáp ứng sinh lý so với trường hợp có nhiều thụ thể Để minh họa mối quan hệ quan trọng giữa lượng thụ thể và độ nhạy với phối tử, hãy tiếp tục với ví dụ của chúng ta

về tế bào tiền hồng cầu Giá trị Kd cho liên kết của erythropoietin (Epo) với thụ thể của nó bằng khoảng

10-10M Như đã nói ở trên, chỉ khoảng 10 phần trăm của khoảng gần 1000 thụ thể erythropoietin trên bề mặt tế bào cần liên kết với phối tử để gây ra đáp ứng cực đại của tế bào Thực nghiệm cho thấy độ nhạy của tế bào với phân tử tín hiệu bị ảnh hưởng rất lớn bởi số lượng thụ thể cho phối tử đó cũng như là Kd

Hình 12 Thực nghiệm đáp ứng sinh lý cực đại tới tín hiệu ngoài xảy ra khi chỉ một phần thụ thể

được chiếm giữ bởi phối tử

Với các con đường tín hiệu thể hiện theo cách này, đô thị giữa mức độ liên kết của phối tử-thụ thể và đáp ứng sinh lý ở nồng độ phối tử khác nhau là khác nhau Trong ví dụ ở đây, 50 phần trăm đáp ứng cực đại đạt được ở nóng độ phối tử mà ở đó chỉ 18 phần trăm thụ thế bị chiếm giữ Tương tự, 80 phần trăm đáp ứng cực đại có được khi nóng đọ phối tử bằng giá trị K, khi 50 phần trăm thụ thể bị chiếm giữ

* Kết nối y học: Yếu tố sinh trưởng biểu mô (epithelial growth factor, EGF), như tên gọi của nó, kích

thích sự sinh trưởng của nhiều loại tế bào biểu mô, bao gồm cả loại lót ống dẫn của tuyến vú Trong khoảng 25 phần trăm trường hợp ung thư vú, tế bào ung thư sản xuất lượng lớn thụ thể EGF đặc biệt gọi là HER2 Sự sản xuất quá mức của HER2 làm cho tế bào quá mẫn với nồng độ EGF ở môi trường xung quanh, vốn bình thường quá thấp để có thể kích thích tế bào sinh trưởng; do đó EGF kích thích sự phát triển của các tế bào ung thư này một cách không hợp lý Chúng ta sẽ thấy trằng hiểu biết về vai trò của HER2 trong ung thư vú giúp phát triển kháng thể đơn dòng gắn với HER2 và do đó ngăn chặn tín hiệu từ EGF; những kháng thể này cho hiệu quả cao trong quá trình điều trị ung thư vú cho bệnh nhân

Mối liên hệ giữa HER2 và ung thư vú đã minh chứng sinh động rằng điều hòa số lượng thụ thể biểu hiện bởi tế bào cho một phân tử tín hiệu nhất định đóng vai trò thiết yếu trong điều hòa các sự kiện sinh lý và phát triển Sự điều hòa này có thể xảy ra ở mức độ phiên mã, dịch mã, và quá trình sau dịch mã hoặc bằng cách kiểm soát mức độ phân rã của thụ thể Cách khác là quá trình nhập bào (endocytosis) thụ thể trên bề mặt tế bào làm giảm đáng kể lượng thụ thể và do đó chấm dứt đáp ứng tế bào Như chúng ta sẽ thảo luận ở các phần sau, những cơ chế khác cũng có thể làm giảm ái lực của thụ thể đối với phối tử và do

đó giảm đáp ứng tế bào với một nồng độ phối tử nhất định Do đó mức giảm độ nhạy của tế bào với một phối tử nhất định, gọi là giảm mẫn (desensitization), là kết quả của nhiều cơ chế và là yếu tố quan trọng cho khả năng đáp ứng phù hợp với tín hiệu bên ngoài của tế bào

2.2.2.5 Thụ thể được tinh sạch bằng kỹ thuật ái lực

Để hiểu được hoàn toàn cách thức hoạt động của thụ thể, ta cần tinh sạch chúng và phân tích đặc điểm sinh hóa Ví dụ, xác định cấu trúc phân tử khi có mặt hoặc vắng mặt phối tử có thể làm rõ sự thay đổi cấu hình của thụ thể khi gắn phối tử hoạt hóa protein dẫn truyền tín hiệu xuôi dòng Nhưng điều này

có thể khá khó Một tế bào động vật có vú điển hình có từ 1000 tới 50000 phiên bản của một loại thụ thể

bề mặt tế bào Con số này có vẻ lớn nhưng nếu xét một tế bào chứa tới 1010

phân tử protein nói chung và khoảng 106

protein trên màng tế bào nói riêng, có thể nhận thấy lượng thụ thể này chiếm chỉ 0,1 đến 5 phần trăm lượng protein trên màng tế bào Lượng protein thấp này làm phức tạp thêm quá trình tách và tinh chế thụ thể bề mặt tế bào Tinh chế thụ thể cũng khó khăn bởi các protein xuyên màng này đầu tiên phải được hòa tan khỏi màng bằng chất tẩy không ion và sau đó tách chúng ra khỏi các protein tế bào khác

Như chúng ta thấy với thụ thể Epo đã thảo luận trước đó, kỹ thuật DNA tái tổ hợp có thể được sử dụng để tạo các tế bào biểu hiện một lượng lớn các protein này Nhưng ngay cả khi kỹ thuật DNA tái tổ hợp được sử dụng để tạo tế bào biểu hiện một lượng lớn thụ thể, vẫn cần các kỹ thuật đặc biệt để tách và tinh chế chúng khỏi các protein màng khác Một kỹ thuật thường được sử dụng trong tinh chế thụ thể bề mặt tế bào (mà vẫn giữ khả năng liên kết phối tử của chúng khi hòa tan trong chất tẩy) có bản chất gần giống với sắc ký ái lực sử dụng kháng thể Để tinh chế một thụ thể bằng phương pháp này, phối tử cho thụ thể được liên kết bằng con đường hóa học vào các hạt để tạo thành một cột Một dịch thô chứa các protein màng tan trong chất tẩy được bơm qua cột; chỉ thụ thể với phối tử đưoc giữ lại, các protein khác sẽ bị rửa trôi Khi bơm một lượng lớn phối tử hòa tan qua cột, thụ thể sẽ bị tách ra khỏi các hạt và giải phóng khỏi cột Ở một số trường hợp, thụ thể có thể được tinh sạch với nồng độ gấp 100000 lần chỉ trong một bước sắc ký ái lực

2.2.2.6 Sử dụng các phản ứng kết tủa miễn dịch và kỹ thuật ái lực để nghiên cứu hoạt động của protein truyền tín hiệu

Sau khi liên kết với phối tử, thụ thể kích hoạt một hoặc nhiều protein truyền tín hiệu mà sau đó chúng có thể ảnh hưởng tới hoạt động của các protein hiệu ứng khác nhau (hình 1) Để hiểu được một chuỗi tín hiệu, người nghiên cứu cần định lượng sự hoạt động của các protein truyền tính hiệu này Kinase

và protein gắn GTP có mặt trong rất nhiều chuỗi tín hiệu, trong phần này chúng ta miêu tả vài thí nghiệm được sử dụng để đo hoạt tính của chúng

Kết tủa miễn dịch kinase: Kinase hoạt động trong hầu hết các con đường tín hiệu, và các tế bào

động vật có vú điển hình chứa hàng trăm loại kinase khác nhau, mỗi một trong số chúng được kiểm soát

nghiêm ngặt và có thể phosphoryl hóa rất nhiều protein đích Các thí nghiệm kết tủa miễn dịch được sử dụng thường xuyên để đo hoạt tính của một kinase cụ thể trong dịch chiết tế bào Trong một phiên bản của phương pháp này, kháng thể đặc hiệu cho kinase mong muốn đầu tiên được phản ứng với các hạt nhỏ phủ protein A, khiến cho kháng thể bám vào các hạt này thông qua phân đoạn Fc của nó Các hạt này sau đó được trộn với dịch bào tương hoặc nhân, được thu lại bằng ly tâm và rửa thật sạch với dung dịch muối để loại bỏ các protein liên kết yếu (thường không bám dính đặc hiệu với kháng thể) Do đó chỉ các protein tế bào liên kết đặc hiệu với kháng thể - là chính kinase và các protein bám vào kinase này là có mặt trên các hạt nhỏ Các hạt này sau đó được ủ trong một dịch đệm với protein cơ chất và Ɣ-[32P] ATP có y phosphate được đánh dấu Lượng [32P] chuyển tới protein cơ chất chính là số đo hoạt tính của kinase và

có thể được định lượng nhờ điện di trên gel polyacrylamide và phóng xạ tự chụp hoặc bằng kết tủa miễn dịch với một kháng thể đặc hiệu với cơ chất rồi đếm hoạt độ phóng xạ trong kết tủa Bằng cách so sánh dịch chiết từ tế bào trước và sau khi thêm phối tử, chúng ta có thể xác định ngay được liệu một kinase đặc hiệu có thể bị hoạt hóa trong con đường truyền tín hiệu kích thích bởi phối tử đó

Chúng ta cần chú ý rằng rất nhiều protein có thể bị phosphoryl hóa bởi một vài kinase khác nhau, thường các vị trí serine, threonine hoặc tyrosine khác nhau Do đó việc đo mức độ phosphoryl hóa của một axit amin mạch bên của nó trước và sau kích thích hormone là rất quan trọng Kháng thể đóng vai trò không thể thay thế để phát hiện các sự kiện phosphoryl hóa này Để tạo ra một kháng thể có thể phát hiện một axit amin đặc hiệu bị phosphoryl hóa trong một protein nhất định, chúng ta cần tổng hợp một đoạn peptide khoảng 15 axit amin có trình tự giống hệt trình tự chứa axit amin bị phosphoryl hóa của protein được nghiên cứu, nhưng có nhóm phosphate được liên kết hóa học với serine, threonine hoặc tyrosine mong muốn Sau khi kết hợp đoạn peptide này với một tá dược để tăng khả năng kích thích miễn dịch, phức hợp này được sử dụng để tổng hợp kháng thể đơn dòng Sau đó lựa chọn một kháng thể đơn dòng đặc hiệu chỉ phản ứng với peptide bị phosphoryl hóa mà không phản ứng với peptide thường: một kháng thể như vậy thường chỉ bám vào protein gốc khi axit amin đặc hiệu này bị phosphoryl hóa Tính đặc hiệu này xảy ra bởi kháng thể liên kết đồng thời với axit amin bị phosphoryl hóa và mạch nhánh gồm các axit amin lân cận Hình 3 cho thấy một ví dụ về tính khả dụng của các kháng thể như vậy Hình chỉ ra ba protein truyền tín hiệu trong tế bào tiền hồng cầu bị phosphoryl hóa ở các axit amin cố định khi bị hormone erythropoietin kích thích ở các nồng độ khác nhau trong vòng 10 phút Phosphoryl hóa tăng khi nồng độ Epo tăng và đây là bước đầu tiên trong quá trình biệt hóa các tế bào này thành hồng cầu

Hình 13 Sự kích hoạt của ba protein truyền tín hiệu bằng quá trình phosphoryl hóa

Tế bào tiền hồng cầu của chuột được xử lý trong 10 phút với nhiều nồng độ khác nhau của hormone tế bào thận erythropoietin (Epo) Dịch chiết tế bào được phân tích bởi Western blot với ba kháng thể khác nhau đặc hiệu cho dạng phosphoryl hóa của ba protein truyền tín hiệu, và ba kháng thể khác có khả năng nhận diện đoạn không phosphoryl hóa của axit amin trong cùng một protein Dữ liệu cho thấy với nồng độ Epo tăng dần, ba proteins này trở nên bị phosphoryl hóa Xử lý với 1 đơn vị/ml Epo đủ để phosphoryl hóa cực đại và do đó kích hoạt tất cả ba đường dẫn Stat 5 = yếu tố phiên mã phosphoryl hóa ở tyrosine 694 Akt = kinase phosphoryl hóa ở serine 473; p42/p44 p42/p44 MAP kinase phosphoryl hóa ở threonine 202 và tyrosine 204

Thí nghiệm lắng (pulldown) protein gắn GTP: Chúng ta đã biết siêu họ GTPase của các protein

công tắc nội bào thay đổi luân phiên giữa các trạng thái hoạt hóa (mở - gắn GTP, thay đổi hoạt động của các protein đích đặc hiệu) và trạng thái bất hoạt (đóng- gắn GDP) Thí nghiệm đặc thù để đo sự hoạt hóa của lớp protein này dựa trên việc chúng chỉ liên kết với protein đích khi chúng đã gắn với GTP; protein đích thường có một miền liên kết đặc hiệu bám vào các phân đoạn công tắc của protein gắn GTP Thí nghiệm lắng được dùng để định lượng sự hoạt hóa của của một protein gắn GTP nhất định và gần giống với kết tủa miễn dịch, chỉ khác là miền liên kết đặc hiệu của protein đích được cố định trên các hạt nhỏ (Hình 14) Các hạt được trộn lẫn với dịch chiết tế bào và được thu hồi bằng ly tâm Lượng protein gắn GTP trên hạt được định lượng bằng Western blot Thí nghiệm hình14 thể hiện phần gắn GTP của GTPase nhỏ Rac1 tăng đáng kể sau khi được kích thích bởi hormone yếu tố sinh trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu (platelet-derived growth factor, PDGF), cho thấy Rac1 là một protein truyền tín hiệu được kích hoạt bởi thụ thể PDGF

Hình14 Thí nghiệm lắng (pull-down assay) cho thấy Rac1, một tiểu protein gắn GTP,

được kích hoạt bằng yếu tố sinh trưởng gốc tiểu cầu (PDGF)

Giống như các tiểu GTPase khác, Rac1 điều khiển các sự kiện ở mức độ phân tử bằng cách quay vòng giữa dạng bất hoạt gắn GDP và dạng hoạt hóa gắn GTP Ở dạng hoạt hóa gắn GTP), Rac1 bám đặc hiệu vào miền gắn p21 (PBD) của protein kinase hoạt hóa bởi p21 (PAK) để điều khiển các lan truyền tín hiệu xuôi dòng (a) Nguyên tắc thí nghiệm: miền gắn Rac PBD được tạo ra bởi các kỹ thuật DNA tái tổ hợp, và được gắn vào các hạt agarose, rồi được trộn với chiết xuất tế bào (bước 1) Các hạt này được thu hồi bằng ly tâm (bước 2) và lượng Rac1 gắn GTP được định lượng bằng phương pháp Western blot với kháng thể cho Rac1 (bước 3) (b) Phương pháp Western blot cho thấy sự kích hoạt của Rac1 sau khi tế bào gốc tạo máu được xử lý trong 1 phút với yếu tố sinh trưởng gốc tiểu cầu (PDGF) Western blot cho actin được

sử dụng để đối chiếu lượng protein tổng cộng được nạp giếng của gel

Kết luận chính: Nghiên cứu thụ thể bể mặt tế bào và protein truyền tín hiệu

Nồng độ của phối tử mà tại đó một nửa lượng thụ thể của phối tử bị chiếm giữ, Kd, có thể được xác định bằng thực nghiệm và là phép đo ái lực của thụ thể với phối tử (hình 10)

(1) Do thụ thể có ái lực cao với phối tử, miền ngoại bào của thụ thể có thể được sử dụng như một loại thuốc để giảm bớt nồng độ hormone tự do

(2) Đáp ứng cực đại của một tế bào với một phối tử nhất định thường xảy ra tại nồng độ phối tử mà lượng thụ thể bám vào chúng nhỏ hơn 100 phần trăm (hình12)

(3) Kỹ thuật sắc ký ái lực được sử dụng để tinh sạch thụ thể dù chúng có mặt với nồng độ thấp

(4) Thí nghiệm kết tủa miễn dịch sử dụng kháng thể đặc hiệu cho protein kinase có thể đo hoạt động của kinase Thí nghiệm kết tủa miễn dịch sử dụng kháng thể đặc hiệu cho peptide được phosphoryl hóa có thể

đo sự phosphoryl hóa của một axit amin nhất định của protein mong muốn trong tế bào (hình 13)

(5) Phản ứng lắng sử dụng miền gắn protein của một protein đích có thể định lượng độ hoạt hóa của protein gắn GTP trong một tế bào (hình14)

2.2.3 Thụ thể liên kết protein G

2.2.3.1 Cấu trúc và cơ chế

Như đã nói ở trên, có lẽ lớp thụ thể phong phú nhất chính là thụ thể liên hợp protein G (GPCR) Ở người, GPCR được sử dụng để phát hiện và đáp ứng nhiều dạng tín hiệu khác nhau, bao gồm chất dẫn truyền xung thần kinh, hormone liên quan tới chuyển hóa chất béo và glycogen, và thậm chí cả photon ánh sáng Mọi con đường dẫn truyền tín hiệu GPCR đều chia sẻ các yếu tố chung sau: (1) một thụ thể gồm bảy chuỗi alpha helix xuyên màng; (2) một trimer protein G liên hợp, hoạt động như một công tắc thay đổi giữa dạng hoạt hóa và bất hoạt; (3) một protein hiệu ứng gắn màng; và (4) các protein tham gia vào quá trình điều hòa hồi biến (feedback regulation) và giảm độ nhạy của con đường tín hiệu Phân tử tín hiệu thứ cấp cũng hay gặp trong nhiều con đường GPCR Con đường GPCR thường có hiệu quả ngắn hạn trong tế bào bằng cách biến đổi mau lẹ các protein có sẵn, là các enzyme hoặc kênh ion Do đó các con đường này cho phép tế bào đáp ứng nhanh chóng với nhiều dạng tín hiệu, chúng là chất kích thích từ môi trường như ánh sáng hay chất kích thích hormone như epinephrine

Trong phần này, chúng ta sẽ thảo luận cấu trúc cơ bản và cơ chế của GPCR cùng trimer protein G liên quan

Mọi thụ thể liên kết với protein G đều có chung cấu trúc cơ bản: Mọi thụ thể liên hợp protein

G đều có cùng hưởng trên màng và gồm bảy vùng alpha helix xuyên màng (H1-H7), bốn phân đoạn ngoại bào, và bốn phân đoạn bào tương (Hình 15) Đầu N luôn nằm trên mặt ngoại bào và đầu C luôn nằm trên mặt bào tương trên màng plasma Vùng đầu C (C4), vòng C3, và ở một số thụ thể, cả vòng C2, tham gia vào tương tác với liên hợp trimer protein G Nhiều phân họ của thụ thể liên hợp protein G được bảo tồn qua tiến hóa; thành viên của các phân họ này có trình tự axit amin và cấu trúc đặc biệt giống nhau

Hình 15 Cấu trúc chung của thụ thể liên hợp protein G

Tất cả các thụ thể loại này có cùng một hướng trên màng và chứa bảy vùng xoắn xuyên màng (H1- H7), bốn đoạn ngoại bào (E1 – E4), và bốn đoạn bào tương (C1 - C4) Đoạn miền đầu C (C4), vòng 3, và một

số thụ thể, vòng C2 đều tham gia vào tương tác với một streamer liên hợp protein G

Thụ thể liên hợp protein G được neo ổn định trong lõi kỵ nước của màng plasma nhờ nhiều axit amin kỵ nước nằm trên mặt ngoài của bảy phân đoạn xuyên màng Thụ thể β-adrenergic là nhóm thụ thể

liên hợp protein G có cấu trúc phân tử chi tiết đã được nhận biết, liên kết với các hormone như epinephrine và norepinephrine (Hình 16) Trong loại thụ thể này và nhiều loại khác, các phân đoạn của chuỗi xoắn alpha gắn màng và vòng ngoại bào tạo thành vị trí gắn phối tử hướng ra mặt ngoài bào tương Phân tử đối kháng (antagonist) cyanopindolol, thể hiện ở hình 16, gắn thụ thể với ái lực cao hơn hầu hết các agonist khác, và phức hợp thụ thể-phối tử này đã được tinh thể hóa và xác định cấu trúc

Mạch nhánh của 15 axit amin trên bốn chuỗi xoắn alpha và vòng 2 ngoại bào hình thành tương tác

ky nước với phối tủ, Các axit amin khác nhau tạo nên vùng phía trong của các thụ thể liên hợp protein G khác nhau, cho phép các thụ thể này gắn với các phân tử nhỏ rất khác biệt, dù chúng ưa nước như epinephrine hay kỵ nước như nhiều chất tạo mùi

Mặc dù các thụ thể liên hợp protein G có chung cấu trúc cơ bản, nhiều lớp phụ của GCPR có thể liên kết với cùng một hormone, nhưng dẫn tới các hiệu ứng tế bào khác nhau Để minh họa cho tính đa năng của các thụ thể này, chúng ta sẽ xem xét tập hợp thụ thể liên hợp protein G cho epinephrine ở các dạng tế bào khác nhau của động vật có vú Hormone epinephrine đặc biệt quan trọng trong quá trình phản ứng của cơ thể với stress, được biết đến như phản ứng “fight-or-flight" (chống hay chạy) Trong thời điểm stress hoặc hoặc tập luyện cường độ nặng, các mô cần gia tăng chuyển hóa glucose và axit béo để sản xuất ATP

(b) Góc nhìn từ mặt ngoài cho thấy cận cảnh một túi gắn phối tử được hình thành từ các axit amin ở xoắn

3, 5, 6 và 7 và vòng ngoại bào 2, có vị trí ở giữa xoắn 4 và 5 Các nguyên tử cyanopondolol được tô màu xám (carbon), xanh (nitro) và đỏ (ôxy) Túi gắn phối tử bao gồm 15 mạch nhánh từ các gốc axit amin trong bốn chuỗi xoắn a xuyên màng và vòng ngoại bào 2 Để ví dụ cho các tương tác gắn đặc hiệu, nguyên tử N tích điện dương trong nhóm amin (được tìm thấy trong cả cyan pindolol và epinephrine) hình thành một liên kết ion với mạch nhánh cacboxyl của aspartate 121 (D121) ở xoắn 3 và mạch nhánh carbonyl của asparagine 329 (N329) trong xoắn 7

Khi đó epinephrine ra tín hiệu phân giải nhanh chóng glycogen thành glucose trong gan và triacylglycerol thành axit béo trong tế bào mỡ (adipose); và chỉ trong vài giây những nguyên liệu trao đổi chất chính này đã được đưa vào máu Ở động vật có vú, sự giải phóng glucose và axit béo được kích hoạt bằng liên kết của epinephrine (hoặc dẫn xuất của nó là norepinephrine) với thụ thế B-adrenergic trên bề mặt của tế bào gan (hepatic) và tế bào mỡ (adipose)

Epinephrine cũng có các hiệu ứng cơ thể khác nhau Ví dụ epinephrine bám vào thụ thể adrenergic trên tế bào cơ tim làm tăng nhịp co bóp, dẫn tới tăng lượng máu cung cấp cho các mô Ngược

β-lại, kích thích của epinephrine lên thụ thể β-adrenergic trên tế bào cơ tron ở ruột lại làm chúng giãn ra Một loại khác của GPCR epinephrine, thụ thể α-adrenergic, được tìm thấy trên các tế bào cơ trơn lót thành mạch máu của mô hệ đường ruột, da, và thận Liên kết của epinephrine với các thụ thể này gây co động mạch, làm giảm tuần hoàn đến các cơ quan này Ảnh hưởng đa dạng của epinephrine giúp hình thành nên các đáp ứng tích hợp khắp nơi trong cơ thể để có chung một mục đích: cung cấp năng lượng cho các cơ vận động chính, cùng lúc đó lấy chúng khỏi các cơ quan khác không quan trọng bằng trong quá trình đáp ứng stress của cơ thể

* Thụ thể liên hợp protein G kích hoạt bởi phối tử xúc tác quá trình trao đổi GTP thành GDP trên tiểu phần a của trimer protein G

Trimer protein G gồm ba tiểu phần gọi là α, β, Ɣ Cả hai tiểu phần Gα và GƔ đều liên kết với màng bằng lipid gắn cộng hóa trị Tiểu phần β và Ɣ luôn gắn với nhau và được biết đến dưới tên tiểu phần

G Khi ở trạng thái nghỉ, không có phối tử liên kết với thụ thể, tiểu phần G gắn GDP và tạo phức hợp với

GβƔ Khi phối tử (ví dụ epinephrine) hoặc một phân tử đối kháng (ví dụ isoproterenol) bám vào, thụ thể liên hợp protein Gα thay đổi cấu hình của các vòng hướng vào bào tương và làm cho thụ thể liên kết với tiểu phần Gα (Hình 17, bước 6) Liên kết này giải phóng GDP, vì thế thụ thể gắn phối tử hoạt hóa hoạt động như một yếu tố trao đổi nucleotide guanine (GEF) cho tiểu phần Gα (bước 6) Sau đó, GTP bám nhanh chóng vào vị trí trống nucleotide guanine trong tiểu phần G, gây nên thay đổi cấu hình của phân đoạn công tắc (hình 7) Những thay đổi này làm yếu liên kết giữa Gα với cả thụ thể và tiểu phần GβƔ

(bước 4)

Trong hầu hết mọi trường hợp, Gα - GTP (vẫn gắn vào màng tế bào) sẽ tương tác với và hoạt hóa protein hiệu ứng, nhu thể hiện ở hình17 (bước 5) Trong một vài trường hợp, Gα – GTP ức chế phân tử hiệu ứng Ngoài ra, phụ thuộc vào từng loại tế bào và protein Gα, tiểu phần Gα không có Gα, thỉnh thoảng

sẽ truyền tín hiệu bằng cách tương tác với một protein hiệu ứng

Trạng thái hoạt động của Gα - GTP tồn tại rất ngắn bởi GTP gắn sẽ bị thủy phân thành GDP trong vài phút dưới sự xúc tác bởi hoạt động GTPase nội tại của tiểu phần G, (hình 17, bước 6) Cấu hình của

Gα do đó sẽ a chuyển về trạng thái bất hoạt Gα - GTP vì vậy sẽ ngăn mọi quá trình kích hoạt tiếp theo của protein hiệu ứng Tốc độ thủy phân GTP đôi khi được tăng lên bởi liên kết của phức hợp Gα - GTP với phân tử hiệu ứng phân tử hiệu ứng lúc đó sẽ có chức năng như protein hoạt hóa GTPase (GTPase-activating protein, GAP) Cơ chế này làm giảm đáng kể thời gian hoạt động của phân tử hiệu ứng và tránh phản ứng quá mức của tế bào Trong nhiều trường hợp, một dạng thứ hai của protein và gọi là phân tử điều hòa tín hiệu protein Gα (regulator of Gα protein signaling, RGS) cũng làm tăng quá trình Gα thủy phân GTP, làm giảm thêm thời gian phân tử hiệu ứng ở trạng thái hoạt động Gα - GTP tạo ra nhanh chóng liên kết trợ lại với Gα, và phức hợp này lại sẵn sàng để tương tác với một thụ thể được hoạt hóa và tiến hành quá trình lại từ đầu

Do đó hệ thống truyền tín hiệu GPCR chứa cơ chế hối ứng nội tại để đảm bảo protein hiệu ứng chỉ hoạt động trong vòng vài giây hoặc vài phút sau khi thụ thể bị kích hoạt Để phân tử hiệu ứng hoạt động trong thời gian dài hơn, thụ thể cần được kích hoạt liên tục thông qua liên kết với phối tử và tiếp đó là hoạt hóa protein G tương ứng

Chứng cứ ban đầu ủng hộ cho mô hình ở hình 17 bắt nguồn từ nghiên cứu với các hợp chất được gọi là GTP analog Chúng có cấu trúc tương tự với GTP và do đó có thể gán tốt với các tiểu phần Gα như GTP nhưng chúng không thể bị thủy phân bởi GTPase nội tại Trong một số hợp chất này, liên kết P-O-P phosphodiester giữa phosphate beta và gamma của GTP bị thay thế bằng liên kết không bị thủy phân P-CH2-P hoặc P-NH-P Khi thêm hợp chất này vào hỗn hợp màng tế bào chất cùng agonist cho một thụ thể nhất định, protein G cùng protein hiệu ứng bị kích hoạt trong thời gian dài hơn nhiều so với dùng GTP Trong phản ứng này, một khi GTP analog thay thế GDP để gắn với G, nó sẽ gắn mãi mãi vào G Bởi hợp chất Gα - GTP analog cũng có chức năng kích hoạt protein hiệu ứng tương tự như hợp chất Gα - GTP thông thường, protein hiệu ứng này sẽ tồn tại ở trạng thái hoạt hóa mãi mãi

Sự phân ly của trimer protein Gα do GPCR làm trung gian xúc tác có thể được phát hiện trong tế bào sống Các nghiên cứu này lợi dụng hiện tượng truyền năng lượng huỳnh quang (fluorescence energy transfer), làm i thay đổi bước sóng phát xạ huỳnh quang khi hai protein huỳnh quang tương tác với nhau Hình 18 diễn tả phương pháp thực nghiệm cho thấy quá trình phân ly của phức hợp Gα.GβƔ xảy ra trong vài giây sau khi thêm phối tử, điều này cũng cung cấp thêm chứng cứ cho mô hình của chu trình protein

G Phương pháp thực nghiệm phổ quát này có thể được sử dụng để theo dõi sự hình thành và phân ly của các phức hợp protein protein khác trong tế bào sống

Hình 17 Cơ chế hoạt hóa chung của các protein hiệu ứng gắn với các thụ thể liên hợp protein G

Các tiểu phần Gα, và GβƔ của các trimer protein G được gần với màng bởi các phân tử lipid gắn cộng hóa trị (đường lượn sang đen) Sau khi phối tử gần vào, GDP được thay bằng GTP, và các tiểu phần protein G phân ly (bước 1-4, Gα.GTP tự do gắn vào và kích hoạt protein hiệu ứng (bước 5) Sự thủy phân của GTP kết thúc quá trình tín hiệu và dẫn đến tái hợp của trimer protein G, đưa hệ thống về trạng thái nghỉ (bước 6 ) Chu trình được lặp lại khi một phối tử khác gắn vào Trong một vài con đường khác, protein hoạt hóa được kích hoạt bởi tiểu phần GβƔ Ký hiệu s trong G s đại diện cho “phân tử kích thích” (stimulatory)

Hình 18 Sự kích hoạt các protein G xảy ra trong vài giây sau khi phối tử bám vào tế bào amip

Ở trong tế bào amip Dictyostelium discoideum, cAMP hoạt động như một phân tử tín hiệu ngoại bào và gắn với một thụ thể liên hợp G; chứ không phải là một phân tử tín hiệu thứ cấp Các tế bào amip được biến nạp với các gene mã hóa hai protein dung hợp: G, dung hợp với protein huỳnh quang lam (CFP), một thể đột biến của protein huỳnh quang xanh (GFP), và G, dung hợp với một biến thể GFP khác, protein huỳnh quang vàng (YFP) CFP thông thường phát quang ở mức sáng 490-nm; YFP là 527-nm (a) Khi CFP và YFP gần nhau, như ở trong phức hợp nghỉ G G năng lượng huỳnh quang có thể truyền giữa CFP và YFP (trái) Do đó, sự chiếu xạ tế bào ở trạng thái nghỉ với mức sáng 440-nm (mức kích thích trực tiếp CFP mà không phải YFP) gây ra bức xạ ánh sáng 527-nm (vàng), đặc trưng của YFP Tuy nhiên, nếu gắn phối tử dẫn đến sự phân ly của các tiểu phần G và G thì sự truyền năng lượng huỳnh quang không thể xảy ra Trong trường hợp này, kích thích tế bào với ánh sáng 440-nm gây bức xạ ánh sáng 490-nm (xanh lam) đặc trưng của CFP (phải) (b) Đo bức xạ ánh sáng vàng (527-nm) của tế bào amip biến nạp trước và sau khi thêm CAMP ngoại bào (mũi tên), phối tử của thụ thể liên hợp G trong các tế bào đó Sự suy giảm của huỳnh quang vàng xảy ra trong vòng vài giây sau khi CAMP được thêm vào, là kết quả sự phân ly của protein dung hợp GFP khỏi G,YFP

Trong rất nhiều năm, người ta không thể xác định được cấu trúc của cùng một GPCR ở trạng thái hoạt hóa và bất hoạt Giờ đây thành tựu này đã đạt được với thụ thể β-adrenergic Bảy chuỗi xoắn alpha gắn màng của thụ thể β-adrenergic bao hoàn toàn lấy một phân đoạn trung tâm liên kết không cộng hóa trị với một agonist hoặc antagonist (Hình 19) Chất agonist gắn vào làm cấu hình thụ thể thay đổi lớn (Hình 19a) trong đó quan trọng nhất là sự di chuyển của chuỗi xoắn xuyên màng 5 và 6 và sự thay đổi cấu trúc

của vòng C3; cùng nhau chúng tạo nên một bề mặt để có thể gắn với một phân đoạn của tiểu phần G (Hình 19b)

Các nghiên cứu tinh thể tia X của phức hợp giữa thụ thể được hoạt hóa cùng G cũng tiết lộ các tiểu phần protein G tương tác với nhau như thế nào và cung cấp đầu mối vì sao khi GTP gắn vào lại làm Gα phân ly khỏi tiểu phần GƔβ Như thể hiện trong mô hình cấu trúc ở hình 19b, một bề mặt lớn của Gα.GDP tương tác với tiểu phần Gα, một phần của mặt này nằm trên chuỗi xoắn alpha αN của phân đoạn đầu N của Gα.GDP Để ý rằng Gα tiếp xúc trực tiếp với Gβ, chứ không phải GƔ Khi các phân đoạn αN và α5 của chuỗi xoắn alpha thuộc Gα gắn với chuỗi xoắn 5 và 6 của thụ thể được hoạt hóa (Hình 19b), tiểu phần

Gα sẽ được mở ra, làm GDP bị trục xuất và thay thế bởi GTP (điều này cũng đúng cho các protein G khác) Tiếp ngay sau đó công tắc I và II sẽ có sự thay đổi cấu hình dẫn tới phá vỡ liên kết phân tử giữa Gα

và GƔβ chúng phân ly khỏi nhau

* Các GPCR khác nhau kích hoạt các protein G khác nhau và theo lượt điều hòa các protein hiệu ứng khác nhau

Mọi protein hiệu ứng trong con đường GPCR đều là các kênh ion gắn màng hoặc là các enzyme gắn màng xúc tác sự hình thành các phân tử thứ cấp được minh họa ở Hình 8 Các biến thể của con đường tín hiệu GPCR là do nhiều protein G được mã hóa bởi bộ gene của sinh vật nhân chuẩn Theo số liệu gần nhất, người có 21 tiểu phần Gα khác nhau được mã hóa bởi 16 gene, một số trong đó trải qua cắt nối có lựa chọn (alternative splicing); cùng 6 tiểu phần Gβ và 12 tiểu phần GƔ Cho tới nay, các tiểu phần GƔβ khác nhau về cơ bản là thay thế được lẫn nhau về mặt chức năng, trong khi đó các tiểu phần Gα khác nhau làm các protein G có độ đặc hiệu riêng Do đó chúng ta có thể dùng tên của tiểu phần alpha thay cho toàn

bộ protein G gồm 3 tiểu phần

Hình 19 Cấu trúc của thụ thể β-adrenergic ở trạng thái hoạt động và bất hoạt cùng trimmer

protein kết hợp với nó, Gαs)

(a) So sánh giữa các cấu trúc 3 chiếu của thụ thể adrenergic hoạt hóa (vàng) gần với một agonist mạnh

và bất hoạt (màu tía) gắn với một phần từ đối kháng

(b) Góc nhìn từ bề mặt bào tương Chủ ý những thay đổi chính trong cấu hình các miền nội bào của màng xoắn 5 (TM5) và 6 (TM6) Trong tình trạng hoạt hóa, TM5 được mở rộng bởi hai vòng xoắn, trong khi TM6 được dịch chuyển ra phía ngoài khoảng 1,4nm

(c) Cấu trúc toàn thế của phức hợp thụ thể hoạt hóa cho thấy thụ thể adrenergic (vàng) gắn với một agonist (mật cầu đen và đỏ), và gắn với toàn bộ tương tác với một đoạn của Gαs (màu tía) Gαs cùng GƔ (xanh) và Gs (đỏ) tạo nên 6 - trimer protein G,

Bảng 1 tổng kết chức năng của các phân nhóm chính của protein G với các tiểu phần Gα khác nhau Ví dụ, các dạng thụ thể epinephrine khác nhau được đề cập trước đây đều liên kết với các tiểu phần

G khác nhau và gây ảnh hưởng khác nhau tới các protein hiệu ứng, do đó có những tác động riêng biệt lên hành vi của tế bào đích Cả hai phân nhóm của thụ thể β-adrenergic, gọi là β1 và β2, đều liên kết với một protein G kích thích (stimulatory Gs protein, Gas) có tiểu phần alpha (Gα) hoạt hóa một protein hiệu ứng gắn màng gọi là adenylyl cyclase Một khi được kích hoạt, enzyme này sẽ xúc tác sự tổng hợp của phân tử tín hiệu thứ cấp cAMP Ngược lại, phân nhóm α, của thụ thể β-adrenergic liên kết với một protein Gi ức chế Inhibitory G protein, Gi) có tiểu phần alpha Gαi ức chế adenylyl cyclase, chính là enzyme hiệu ứng kết hợp với các thụ thể β-adrenergic Tiểu phần liên kết với thụ thể a,-adrenergic và Gaal kích hoạt một enzyme hiệu ứng khác, phospholipase C, dẫn tới tạo ra hai phân tử thứ cấp DAG và IP, hình 8) Ví dụ về các con đường tín hiệu sử dụng các tiểu phần Gα, được liệt kê trong bảng 1 sẽ được miêu tả trong ba phần tiếp theo

* Kết nối y học: Một số độc tố vi khuẩn chứa một tiểu phần có thể xâm nhập vào màng sinh chất của tế

bào đích ở động vật có vú Trong bào tương, tiểu phần này xúc tác một biến đổi hóa học lên các protein

Gα, ngăn chặn thủy phân GTP gắn kết thành GDP Ví dụ, độc tố được sản xuất bởi vi khuẩn Vibrio

cholera gây bệnh tả, hoặc một số chủng nhất định của E coli, gây biến đổi protein Gαs trong các tế bào biểu mô ruột Kết quả là Gαs được giữ ở trạng thái hoạt động và liên tục kích thích phân tử hiệu ứng adenylyl cyclase dù không có sự kích thích của hormone Điều này dẫn tới nồng độ cAMP nội bào tăng quá mức, gây mất nước và điện giải vào trong lòng ruột, chính là đặc trưng của tiêu chảy mất nước khi bị

lây nhiễm các vi khuẩn này Độc tố sản xuất bởi Bordetella pertussis, một vi khuẩn thường lây nhiễm qua

đường hô hấp và gây ho gà, xúc tác gây biến đổi Gαi và ngăn chặn quá trình giải phóng của GDP gắn kết Kết quả là Gαi bị khóa lại ở trạng thái bất hoạt, làm giảm sự ức chế adenylyl cyclase Hậu quả là cAMP tăng lên trong tế bào biểu mô của đường hô hấp, gây mất nước và điện giải và bài tiết chất nhầy

* Kết luận chung: Cấu trúc và cơ chế tác động của thụ thể liên hợp protein G

(1) Thụ thể liên hợp protein G (GPCR) là một họ protein lớn và đa dạng với cấu trúc chung gồm bảy chuỗi xoắn alpha xuyên màng và một túi gắn phối tử nội tại đặc hiệu cho nhiều phối tử (xem hình 15 và 16)

(2) GPCR có thể có một loạt các hiệu ứng tế bào tùy thuộc vào phân nhóm của thụ thể gắn với phối tử Ví

dụ hormone epinephrine xúc tác cho đáp ứng chống-hay-chạy (fight-or- flight), nó gắn vào các phân nhóm của GPCR trong nhiều loại tế bào với tác dụng sinh lý khác nhau

(3) GPCR liên hợp với trimer protein G có chứa ba tiểu phần gọi là α, β và Ɣ Tiểu phần Gα là một protein công tắc GTPase có thể chuyển đổi giữa các trạng thái hoạt động ("bật"), gắn với GTP, và bất hoạt ("tắt") gắn với GDP Dạng "bật" phân ly khỏi tiểu phần B và y, và kích hoạt một phân tử hiệu ứng gắn màng Tiểu phần β và Ɣ vẫn gắn kết với nhau và chỉ thỉnh thoảng mới truyền tín hiệu (hình 17)

(4) Sự gắn kết của phối tử gây thay đổi cấu hình ở một số chuỗi xoắn xuyên màng và vòng nội bào nhất định của GPCR, giúp nó bám vào G và hoạt động như một yếu tố trao đổi nucleotide (GEF), xúc tác cho

sự phân ly của GDP và giúp GTP gắn kết Kết quả là vùng công tắc của Gα bị thay đổi cấu hình, làm nó phân ly khỏi GβƔ và thụ thể rồi tương tác với một protein hiệu ứng (hình 17)

(5) Các thí nghiệm truyền năng lượng huỳnh quang chứng minh sự phân ly của liên hợp Gα và GβƔ qua trung gian thụ thể trong tế bào sống (hình18)

(6) Các protein hiệu ứng bị hoạt hóa (hoặc bất hoạt) bởi trimer protein G là những enzyme tạo phân tử truyền tín hiệu thứ cấp (ví dụ adenylyl cyclase, phospholipase C) hoặc là các kênh ion (bảng 1) Ở mỗi trường hợp, chức năng và độ đặc hiệu của protein G được quyết định bởi tiểu phần Gα của nó

2.2.3.2 Thụ thể liên hợp protein G điều hòa kênh ion

Một trong những đáp ứng đơn giản nhất của tế bào với tín hiệu là mở các kênh ion thiết yếu cho việc chuyển các xung thần kinh Xung thần kinh rất cần thiết cho các giác quan để nhận thức kích thích từ môi trường như ánh sáng và mùi, để truyền tải thông tin đến và đi từ bộ não, và để kích thích vận động cơ bắp Trong quá trình truyền xung thần kinh, các kênh ion đóng và mở gây thay đổi điện thế màng Rất nhiều thụ thể chất dẫn truyền xung thần kinh là những kênh ion có cổng là phối tử, sẽ mở ra khi đáp ứng lại sự gắn kết của phối tử Các thụ thể này bao gồm một số loại thụ thể glutamate, serotonin và acetylcholine, gồm cả thụ thể acetylcholine được tìm thấy trong synap thần kinh-cơ

Tuy nhiên, rất nhiều thụ thể chất dẫn truyền xung thần kinh là thụ thể liên hợp protein G có protein hiệu ứng là kênh Na+

hoặc K+ Chất dẫn truyền xung thần kinh gắn với các thụ thể này gây đóng hoặc mở các kênh ion liên kết, dẫn tới thay đổi điện thế màng Tuy vậy, các thụ thể chất dẫn truyền xung thần kinh khác, cũng như thụ thể mùi ở mũi và thụ thể cảm quang mắt đều là thụ thể liên hợp protein G mà gián tiếp điều chỉnh hoạt động của kênh ion qua hành vi của các phân tử thông tin thứ cấp Trong phần này, chúng

ta xem xét hai thụ thể liên hợp protein G minh họa các cơ chế trực tiếp và gián tiếp để điều hòa các kênh ion: thụ thể muscarinic acetylcholine của tim và protein rhodopsin kích hoạt bởi ánh sáng trong mắt

2.2.3.2 Thụ thể acetylcholine trong cơ tim kích hoạt một protein G gây mở kênh K +

Thụ thể muscarinic acetylcholine là một loại GPCR được tìm thấy ở cơ tim Khi được kích hoạt, các thụ thể này làm chậm tốc độ co cơ tim Vì muscarine là một analog của acetylcholine và cũng hoạt hóa các thụ thể này, chúng được gọi là “muscarinic" Loại thụ thể acetylcholine này liên hợp với một tiểu phần Chi phối tử gắn vào sẽ dẫn tới mở các kênh K+

liên kết (chính là các protein hiệu ứng) trên màng tế bào chất (hình 20) Hệ quả là ion K+

từ chảy ra từ bào tương gây tăng thêm độ âm của điện thế xuyên màng và kéo dài vài giây Trạng thái này của màng được gọi là siêu phân cực, làm giảm tần số co cơ Hiệu ứng này có thể được thể hiện bằng thực nghiệm khi cho thêm acetylcholine vào tế bào cơ tim được tách riêng và đo điện thế màng sử dụng một vi điện cực chèn vào tế bào

Như thể hiện ở hình 20, tín hiệu từ thụ thể muscarinic acetylcholine hoạt hóa được truyền qua kênh protein hiệu ứng nhờ tiểu phần GβƔ đã được giải phóng (chứ không phải Gαi.GTP) Gαi trực tiếp hoạt hóa kênh K+ và được chứng minh qua thí nghiệm kẹp mảng (patch-clamping), cho phép đo lượng ion chảy qua một kênh ion đơn trong một mảng nhỏ trên màng tế bào (hình 22) Khi protein GβƔ tinh chế được cho vào mặt bào tương của một mảng trên màng tế bào cơ tim, kênh K+

lập tức mở ra ngay cả khi không có acetylcholine hay các chất dẫn truyền xung thần kinh khác - điều này chỉ rõ rằng chính GβƔ là protein chịu trách nhiệm mở kênh hiệu ứng K+

mà không phải là Gαi.GTP

Hình 20 Sự kích hoạt của thụ thể muscarinic acetylcholine

và kênh hiệu ứng K + của nó trong cơ tim

Acetylcholine bám vào và gây kích hoạt tiểu phần Gαi cùng với sự phân ly của nó khỏi tiểu phần GβƔ theo con đường thông thường (Hình 17) Trong trường hợp này, tiểu phần được giải phóng GβƔ (thay vì Gα.GTP) gắn vào và mở protein hiệu ứng liên kết, một kênh K+ Sự gia tăng tính thấm của K+ siêu phân cực hóa màng, dẫn đến giảm nhịp co bóp tim Mặc dù không được thể hiện ở đây, sự kích hoạt kết thúc khi GTP gắn với Gαi bị thủy phân (bởi GAP enzyme - là một phần nội tại của tiểu phần G ) thành GDP và Gαi.GTP tái kết hợp với GβƔ

2.2.3.4 Ánh sáng kích hoạt rhodopsin liên hợp protein G trong tế bào hình que ở mắt

Các tế bào võng mạc mất bao gồm hai loại tế bào quang thụ thể, hình que (rod) và hình nón (cone),

là các nhân tố chính tiếp nhận kích thích thị giác Tế bào hình nón tham gia vào thị giác màu sắc, trong khi

đó tế bào hình que bị kích thích bởi ánh sáng yếu như ánh trăng trong một khoảng bước sóng rộng Các thế bào quang thụ thể kết hợp theo nhiều cách và tạo kết nối giữa nhiều lớp neuron trung gian được sắp xếp bởi các quang thụ thể có Tất cả các tính hiệu này được xử lý và giải nghĩa bởi một phần của bộ não gọi là vỏ não thị giác (visual cortex)

Tế bào hình que cảm nhận ánh sáng nhờ sự giúp đỡ của một GPCR nhạy sáng là rhodopsin Rhodopsin bao gồm protein opsin có cấu trúc của một GPCR thông thường, và liên kết cộng hóa trị với một sắc tố hấp thụ ánh sáng gọi là retinal Rhodopsin, thường chỉ được tìm thấy ở tế bào hình que, tập trung hàng nghìn đĩa màng dẹt tạo nên phân đoạn ngoài của các tế bào hình que này (Hình 21) Một tế bào hình que người chứa khoảng 4 x 107

phân tử rhodopsin Trimer protein Gα liên hợp với rhodopsin, gọi là

transducin (Gt), chứa một đơn vị Gα là Gαt cũng nhu rhodopsin, Gαt chỉ được tìm thấy trong các tế bào hình que

Rhodopsin khác các GPCR khác ở chỗ nó không bị kích hoạt bởi phối tử Thay vì đó, photon ánh sáng hấp thụ bởi retinal chính là tín hiệu hoạt hóa Khi hấp thụ photon, phần retinal của rhodopsin ngay lập tức được chuyển hóa từ dạng cis (được biết đến là 11-cis- retinal) sang dạng đồng phân toàn trans (all-trans isomer), gây thay đổi cấu hình của protein opsin (Hình 22) Hiện tượng này tương đương với các thụ thể liên hợp protein G t kích hoạt thay đổi cấu hình khi phối tử gắn vào Thay đổi này cho phép rhodopsin bám với tiều phần G gần kề của liên hợp protein G, kích thích trao đổi GTP cho GDP Rhodopsin hoạt hóa, R, không ổn định và tự tách ra thành các bộ phận, giải phóng opsin gắn đồng hóa trị

mà không thể bám vào tiểu phần G t và đồng phân toàn trans retinal được nữa, do đó kết thúc tín hiệu thị giác Trong bóng tối, đồng phân toàn trans retinal bị chuyển lại thành 11-cis- retinal nhờ đó có thể gắn lại với opsin, tái tạo rhodopsin

Hình 21 Tế bào hình que của người

(a) Biểu đồ giản lược của toàn bộ tế bào hình que Tại thể synapse, tế bào hình que cấu thành các synapse với một hoặc nhiều neuron trung gian Rhodopsin, một thụ thể liên hợp G nhạy sáng, được đặt tại các đĩa màng dẹt của phân đoạn ngoài

(b) Ảnh kính hiển vi điện tử của vùng tế bào hình que chỉ định bởi ngoặc trong hình (a), Vùng này chứa đầu nối của các phân đoạn trong và ngoài

2.2.4 Kích hoạt rhodopsin bằng ánh sáng dẫn tới đóng kênh cation cổng cGMP

Trong bóng tối, điện thế màng của một tế bào hình que là -30 mV, ít hơn đáng kể so với thế năng nghỉ (-60 đến 90 mV) là điển hình của tế bào thần kinh và tế bào hoạt động bằng điện khác Trạng thái này của màng tế bào, gọi là quá trình khử cực, khiến các tế bào hình que trong bóng tối không ngừng tiết ra chất dẫn truyền xung thần kinh, và do đó các tế bào thần kinh mà chúng tiếp xúc luôn bị kích thích Các trạng thái phân cực của màng plasma của tế bào hình que nghỉ là do sự hiện diện của một số lượng lớn các kênh ion không chuyên biệt mở ra để tiếp nhận Na+

và Ca2+ chuyển động của các ion tích điện dường như

Na+ và Ca2+ từ bên ngoài vào bên trong tế bào sẽ làm giảm cường độ của thế năng âm bên trong màng Rhodopsin hấp thụ ánh sáng dẫn đến đóng cửa các kênh này, gây ra thế năng màng bên trong âm hơn

Hình 22 Bước kích thích ánh sáng trong thị giác

Sắc tố hấp thụ ánh sáng 11-cis-retinal gắn cộng hóa trị vào nhóm amin của gốc lysine trong opsin, phần protein của rhodopsin Sự hấp thu ánh sáng nhanh chóng gây ra quá trình quang đồng phân hóa (photoisomerization) làm cis-retinal chuyển hết thành đồng phân trans Điều này kích hoạt sự thay đổi cấu hình trong protein opsin, hình thành hợp chất trung gian không bền meta-rhodopsin II, hoặc opsin hoạt hóa (xem hình 15-23), mà sau đó sẽ kích hoạt các protein G Trong vòng một vài giây, tất cả các trans-retinal phân ly khỏi opsin và được chuyển đổi trở lại thành đồng phân cis bởi một enzyme, và sau đó gắn trở lại vào một phân tử opsin khác

Khi rhodopsin hấp thu càng nhiều photon, càng nhiều kênh bị đóng và càng ít Na+ và Ca2+ từ bên ngoài di chuyển xuyên qua màng, thế năng bên trong màng càng âm, và càng ít chất dẫn truyền xung thần kinh được giải phóng Trạng thái chất dẫn truyền xung thần kinh giải phóng ra giảm sẽ được các tế bào thần kinh thông báo lên não và được não hiểu đó là ánh sáng

Hình 23 Đường dẫn rhodopsin kích hoạt bằng ánh sáng

và sự đóng của các kênh cation trong các tế bào hình que

Trong tế bào hình que thích nghi với bóng tối, một lượng lớn cGMP giữ cho các kênh cation có cồng nucleotide không chọn lọc được mở, dẫn đến khử cực màng tế bào chất và giải phóng chất dẫn truyền xung thần kinh Hấp thụ ánh sáng tạo ra R *

một rhodopsin được kích hoạt (bước ) R * bám vào Gαt protein bất hoạt gắn GDP và xúc tác thay thế GDP với GTP (bước 2) GTP tự do được tạo ra sau đó kích hoạt cGMP phosphodiesterase (PDE) bằng cách bám vào các tiểu phần ức chế y (bước 3) và phân ly chúng khỏi các tiểu phần xúc tác a và B (bước 4) Thoát khỏi sự ức chế các tiểu phần a và B của PDE thủy phân cCu thành GMP (bước 5) Điều này làm giảm CGMP bào tương, dẫn đến phân ly cGMP khỏi các kênh có cổng nucleotide ở màng tế bào chất và làm các kênh này đóng lại (bước 6) Màng trở nên siêu phân cực tạm thời, và sự giải phóng chất dẫn truyền xung thần kinh được giảm xuống Phức hợp GGTP và các tiểu phần PDE Y gắn vào một phức hợp kích hoạt GTPase, có tên là RGS9-GB5 (bước 7); bằng cách thủy phân GTP bám vào, phosphodiesterase bị bất hoạt sinh lý một cách nhanh chóng

Không giống như các thụ thể muscarinic acetylcholine thảo luận trước đó, protein G được kích hoạt bởi rhodopsin không tác động trực tiếp lên các kênh ion Việc đóng cửa các kênh cation trong màng plasma của tế bào hình que đòi hỏi những thay đổi trong nồng độ của các chất dẫn truyền tín hiệu thứ cấp

là cyclic GMP (còn goi là cGMP) (xem hình 15-8) Phân doan bên ngoài tế bào hình que có nồng độ CGMP cao bất thường (-0,07 mM), được hình thành liên tục từ GTP trong một phản ứng được xúc tác bởi guanylyl cyclase Tuy nhiên, sự hấp thụ ánh sáng bởi rhodopsin kích hoạt CGMP phosphodiesterase (PDE), giúp thủy phân cGMP thành 5'-GMP Kết quả là nồng độ cGMP giảm khi chiếu sáng Nồng độ cao của cGMP hiện diện trong pha tối để giữ cho các kênh cation cổng cGMP mở, nồng độ cGMP giảm khi chiếu sáng dẫn đến đóng các kênh, siêu phân cực hóa màng, và giảm sự giải phóng các chất dẫn truyền thần kinh

Như mô tả trong hình 23, cGMP phosphodiesterase là loại protein hiệu ứng cho Gαt, cả hai đều được tập trung màng đĩa của các tế bào hình que Các phức hợp GGT tự do được tạo ra sau khi Rhodopsin hấp thụ ánh sáng liên kết với hai tiểu phần ức chế y của cGMP phosphodiesterase, giải phóng hai tiểu phần hoạt hóa xúc tác α và β, là tác nhân chuyển cGMP thành GMP Đây là một ví dụ điển hình về cách tín hiệu kích hoạt một enzyme nhanh chóng thế nào sau khi loại bỏ các chất ức chế, là một cơ chế chung trong con đường tín hiệu Đổi lại, nồng độ cGMP giảm dẫn đến đóng cửa của các kênh ion cổng GMP trong màng plasma tế bào hình que, do đó làm giảm giải phóng chất dẫn truyền xung thần kinh

Các nghiên cứu kẹp mảng (patch clamping) đã cung cấp bằng chứng trực tiếp cho vai trò của GMP trong hoạt động của tế bào hình que, sử dụng các mảng tinh chế của màng tế bào chất của phân đoạn ngoài

tế bào hình que, chứa một lượng lớn các kênh cation cổng GMP Khi cGMP được thêm vào mặt bào tương của các mảng này, lượng các kênh ion mở được tăng nhanh chóng; cGMP gắn trực tiếp vào một vị trí trên kênh protein để giữ cho chúng mở các kênh protein cổng GMP chứa bốn tiểu phần (hình 20) Trong trường hợp này, mỗi tiểu phần có thể liên kết một phân tử GMP Cần ba hoặc bốn phân tử cGMP bám vào

để giữ cho kênh mở Tương tác dị lập thế này làm kênh đang mở rất nhạy cảm với những thay đổi nhỏ trong nồng độ cGMP

Sự biến đổi G GTP hoạt hóa thành at GDP bất hoạt được tăng tốc nhờ at một protein hoạt hóa GTPase đặc hiệu (GTPase-activating protein, GAP).Ở động vật có vú, G chỉ thường tồn tại ở trạng thái hoạt hóa gắn GTP trong chớp mắt Do đó cGMP phosphodiesterase nhanh chóng bị bất hoạt, và nồng độ cGMP tăng dần tới nồng độ ban đầu khi kích hoạt ánh sáng bị loại bỏ Điều này cho phép mắt phản ứng nhanh với các vật thể di động hoặc thay đổi

2.2.4.1 Khuếch đại tín hiệu làm con đường truyền tín hiệu rhodopsin cực nhạy

Đáng chú ý là khi tế bào hình que ở trạng thái nghỉ hấp thụ một photon, nó tạo ra đáp ứng có thể

đo dược, là một thay đổi âm hon 1mV của điện thế trong màng, có thể kéo dài khoảng một hoặc hai giây ở động vật lưỡng cư Người có thể phát hiện chớp sáng nhỏ tới mức chỉ chứa 5 photon Hệ thống phát hiện ánh sáng nhạy như vậy bởi tín hiệu được khuếch đại trong con đường dẫn truyền tín hiệu Mỗi một protein opsin hoạt hóa trên đĩa màng của tế bào hình que có thể kích hoạt 500 phân tử G, để at' rồi đến lượt mỗi một trong số đó kích hoạt một cGMP phosphodiesterase Mỗi phân tử phosphodiesterase chỉ hoạt động trong một phần nhỏ của giây nhưng thủy phân hàng trăm phân tử cGMP Do đó khi một photon được hấp thụ - tạo ra một phân tử opsin hoạt động - có thể kích thích hàng ngàn kênh ion trên màng tế bào chất đóng lại và tạo một thay đổi đo được trên điện thế màng của tế bào

Kết thúc nhanh chóng của con đường truyền tín hiệu rhodopsin rất cần thiết cho độ chính xác của thị lực Như trong tất cả các con đường dẫntruyền tín hiệu liên hợp protein G, sự chấm dứt kịp thời của con đường tín hiệu rhodopsin đòi hỏi bất hoạt nhanh chóng tất cả các chất trung gian đang hoạt động, đưa hệ thống về trạng thái cơ bản để sẵn sàng cho tín hiệu tiếp theo Như vậy, ba protein trung gian là rhodopsin hoạt hóa (R"), G'GTP, và CGMP phosphodiesterase (PDE) hoat hóa đều cần bị bất hoạt, và nồng độ của chất truyền tín hiệu tế bào chất CGMP cần phải được khôi phục lại mức của nó ở pha tối bởi guanylyl cyclase Trong đáp ứng của tế bào hình que động vật có vú với một photon đơn, toàn bộ quá trình hoạt hóa

và bất hoạt rhodopsin được hoàn tất trong khoảng 50 mili giây, giúp cho mắt có thể phát hiện các chuyển động nhanh hoặc các thay đổi khác của những đối tượng ở xung quanh Nhiều cơ chế hoạt động cùng nhau để thực hiện đáp ứng rất nhanh chóng này

Protein GAP bất hoạt G GTP at Phức hợp của tiểu phần ức chế phosphodiesterase và G GTP thu at hút một phức hợp gồm hai protein, RGS9 và GB5, cùng hoạt động như một protein GAP và thủy phân liên kết GTP thành GDP Điều này giải phóng tiểu phần ức chế Y và kết thúc sự kích hoạt phosphodiesterase Các thí nghiệm trên chuột có gene RGS9 bị knockout (bị loại bỏ) cho thấy protein này rất cần thiết cho quá trình bất hoạt bình thường của chuỗi tín hiệu in vivo Ở tế bào đơn hình que của chuột, thời gian phục hồi thông thường là 0,2s và tăng lên 9s ở thể đột biến, tăng gấp 45 lần, chứng minh cho sự quan trọng của protein GAP này

Protein cảm ứng Ca2+ hoạt hóa guanylate cyclase Kênh Na+ và Caº đóng lại khi bị ánh sáng kích thích và sẽ làm nồng độ Ca?+ bào tương giảm xuống, bởi Ca liên tục được bơm ra khỏi tế bào không phụ thuộc vào trạng thái của các cổng này Nồng độ Ca2+ nội bào giảm được cảm nhận bởi protein liên kết Ca2+ gọi là protein hoạt hóa guanylate cyclase (GCAP) Điều này kích thích nhanh chóng tổng hợp GMP bởi guanylate cyclase, làm mở lại các kênh ion

Phosphoryl hóa rhodopsin và liên kết của arrestin Quá trình điều biến giảm và kết thúc phản ứng thị giác bao gồm sự phosphoryl hóa rhodopsin đang dạng hoạt hóa (R*chứ không phải dạng bất hoạt, hoặc pha tối (R)) bởi rhodopsin kinase, một thành viên của một lớp của GPCR (Hình 15-24) Mỗi phân tử opsin có ba

vị trí phosphoryl hóa serine khởi đầu trên phân đoạn C4 đầu C hướng ra bào tương Càng nhiều vị trí bị phosphoryl hóa thì R' | càng khó có thể kích hoạt G và do đó at làm đóng các kênh cation cổng cGMP Protein arrestin bám vào ba phân tử serine bị phosphoryl hóa trên phân đoạn đầu C của opsin Arrestin liên kết triệt để ngăn không cho G tương tác với R đã phosphoryl hóa, làm sự hình thành của phức hệ G GTP hoàn toàn at bị chặn lại và dừng quá trình hoạt hóa thêm cGMP phosphodiesterase Trong đáp ứng của tế bào hình que động vật có vú với một photon đơn, toàn bộ quá trình đa phosphoryl hóa rhodopsin và gắn kết arrestin được hoàn tất trong khoảng 50 mili giây Nhóm phosphate gắn với rhodopsin liên tục bị loại ra nhờ enzyme phosphodiesterase, làm phân ly arrestin và nhanh chóng phục hồi rhodopsin về trạng thái gốc nguyên bản của nó

HÌNH 24 Ức chế truyền tín hiệu rhodopsin bởi rhodopsin kinase

Rhodopsin kích hoạt bởi ánh sáng (R), chứ không phải rhodopsin thích nghi bóng tối, là một cơ chất cho rhodopsin kinase Quy mô của phosphoryl hóa rhodopsin tỉ lệ với thời lượng mỗi phân tử rhodopsin tồn tại ở trạng thái kích hoạt bởi ánh sáng và giảm khả năng kích hoạt transducin của R Arrestin gắn vào opsin đã được phosphoryl hóa hoàn toàn, tạo nên một phức hợp không thể kích hoạt transducing

2.2.4.2 Tế bào hình que thích ứng với các mức biến đổi của ánh sáng môi trường nhờ trao đổi arrestin và transducin nội bào

Các tế bào hình nón không nhạy với mức chiếu sáng thấp, và hoạt động của tế bào hình que bị ức chế ở mức ánh sáng cao Như vậy khi chuyển từ ánh sáng ban ngày vào phòng tối, lúc đầu chúng ta sẽ bị

mù Tuy nhiên các tế bào hình que chầm chậm sẽ trở nên nhạy cảm với ánh sáng thấp và chúng ta dần dần

có thể nhìn và phân biệt các vật thể Trong khoảng thời gian này, tế bào hình que tự tăng độ nhạy với các chớp sáng, hoặc độ tương phản Thông qua quá trình thích ứng thị giác (visual adaptation), một tế bào hình que có thể cảm nhận được mức ánh sáng môi trường với độ tương phản trên 100.000 lần, từ ánh sáng rất mờ cho tới ánh sáng chói mặt trời Có thể có dải nhạy sáng lớn này là do bộ não cảm nhận được các mức ánh sáng khác nhau của trường thị lực (hơn là lượng ánh sáng tuyệt đối bị hấp thụ) và dùng chúng để tạo các hình ảnh thị giác Một cơ chế điều hòa phụ thuộc ánh sáng của con đường tín hiệu rhodopsin chịu trách nhiệm cho dải nhạy sáng cực lớn này và liên quan đến quá trình trao đổi nội bào của hai protein truyền tín hiệu chính (Hình 25)

Trong tế bào hình que thích nghi với pha tối, khoảng 80-90 phần trăm của các tiểu phần Gat và G transducin là ở phân đoạn ngoài, trong khi chỉ dưới 10 phần trăm của arrestin tập trung ở đó (Hình 25)

Hình 25 Minh họa sơ bộ phân phối của transducin và arrestin trong tế bào hình que thích nghi

bóng tối và tế bào hình que thích nghi ánh sáng

(a) Trong bóng tối, hầu hết transducin tập trung ở phân đoạn ngoài trong khi hầu hết arrestin được tìm thấy ở các phần khác của tế bào, trong điều kiện này thị giác nhạy cảm nhất với các mức ánh sáng yếu (b) Trong ánh sáng mạnh, rất ít transducin được tìm thấy ở phân đoạn ngoài trong khi rất nhiều arrestin được tìm thấy ở đây, trong điều kiện này, thị giác tương đối ít nhạy cảm với các sự thay đổi ánh sáng nhỏ

Di chuyển phối hợp của các protein này đóng góp vào khả năng cảm nhận được hình ảnh của chúng ta trên một phạm vi 100.000 lần các mức độ ánh sáng môi trường xung quanh

Điều này cho phép hoạt hóa tối đa CGMP phosphodiesterase hiệu ứng và do đó tối đa hóa độ nhạy với thay đổi nhỏ của ánh sáng Nhưng khi tiếp xúc với cường độ ánh sáng trung bình ban ngày khoảng 10 phút, các protein này sẽ hoàn toàn bị phân bố lại: hơn 80 phần trăm của các tiểu phần G và G sẽ di chuyển khỏi phân đoạn ngoài tới các phần khác của tế bào, trong khi đó hơn 80 phần trăm chất ức chế arrestin sẽ chuyển tới phân đoạn ngoài Cơ chế làm các protein này dịch chuyển vẫn chưa được biết tới, nhưng có lẽ liên quan đến các động cơ gắn vi ống (microtubule-attached motor) có khả năng dịch chuyển các protein

và bộ phận gắn cùng chúng ra ngoài và vào trong (xem Chương 18) G và G, giảm xuống ở phân đoạn ngoài có nghĩa là protein G không có khả năng gắn với rhodopsin hoạt hóa để kích hoạt CGMP phosphodiesterase Cùng lúc đó, arrestin tăng lên ở phân đoạn ngoài có nghĩa là bất kỳ rhodopsin hoạt hóa nào cũng sẽ bị bất hoạt nhanh chóng hơn Khi transducin giảm cùng với arrestin tăng, khả năng kích hoạt cGMP phosphodiesterase (chất hiệu ứng xuôi chiều) khi ánh sáng tăng nhẹ bị giảm đáng kể Lúc đó tế bào hình que chỉ cảm ứng được thay đổi của một lượng lớn ánh sáng Sự chuyển động của các protein này bị đảo ngược khi cường độ sáng xung quanh bị hạ xuống

Kết luận chung: Thụ thể liên hợp protein G điều hòa kênh ion

(1) Thụ thể muscarinic acetylcholine ở tim là một GPCR trong đó protein hiệu ứng là một kênh K+ Thụ thể được hoạt hóa giải phóng tiểu phần G để rồi nó sẽ gắn vào và mở kênh K* (xem Hình 20) Kết quả màng tế bào siêu phân cực làm chậm nhịp co co tim

(2) Rhodopsin, một GPCR nhạy sáng ở tế bào hình que, gồm protein opsin liên kết với 11-cis-retinal Đồng phân hóa phần 11-cis-retinal tạo nên opsin hoạt động, mà sau đó sẽ hoạt hóa trimer protein G transducin (G) bằng việc xúc tác quá trình trao đổi GTP tự do cho GDP gắn kết trên tiểu phần G

(3) Protein hiệu ứng trong con đường rhodopsin là CGMP phosphodiesterase Protein này

được kích hoạt bằng cách giải phóng các tiểu phần ức chế nhờ trung gian GGTP Nhờ enzyme này, nồng

độ CGMP giảm dẫn tới đóng các kênh Na/K cổng CGMP, siêu phân cực hóa màng và giảm sự giải phóng chất dẫn truyền xung thần kinh

(4) Có một vài cơ chế hoạt động để chấm dứt tín hiệu thị giác: protein GAP bất hoạt Gαt.GTP, protein cảm ứng Ca hoạt hóa guanylate cyclase, và phosphoryl hóa rhodopsin cùng sự gắn kết của arrestin làm ức chế hoạt hóa của transducin

(5) Sự thích ứng cho một dải sáng rộng được trung gian bởi dịch chuyển của transducin và arrestin vào và

ra khỏi phân đoạn ngoài của tế bào hình que Cùng nhau chúng điều chỉnh khả năng kích hoạt cGMP phosphodiesterase (chất hiệu ứng xuôi chiều) khi ánh sáng tăng nhẹ và do đó điều chỉnh độ nhạy của tế bào hình que đối với các mức ánh sáng môi trường khác nhau

2.2.5 Thụ thể liên hợp protein G hoạt hóa hoặc ức chế adenylyl cyclase

Con đường GPCR sử dụng adenylyl cyclase làm protein hiệu ứng và cAMP làm phân tử tín hiệu thứ cấp được tìm thấy ở hầu hết các tế bào động vật có vú, nơi chúng điều hòa các chức năng đa dạng của

tế bào như quá trình chuyển hóa chất béo và đường, tổng hợp và bài tiết hormone, và co cơ Các con đường này tuân theo cơ chế chung của GPCR được nêu trong hình 17: phối tử liên kết với thụ thể và kích hoạt trimer protein G liên hợp để hoạt hóa protein hiệu ứng trong trường hợp này là adenyl cyclase, rồi tổng hợp phân tử tín hiệu thứ cấp cAMP khuếch tán từ ATP (hình 26) Theo lượt, cAMP hoạt hóa protein kinase phụ thuộc cAMP mà sẽ phosphoryl hóa các protein đích đặc hiệu

Để tìm hiểu con đường GPCR cAMP này, chúng ta tập trung vào đường đầu tiên được phát hiện: tổng hợp glucose-1-phosphate từ glucose (một dạng dự trữ polymer của đường glucose) nhờ kích thích hormone Sų phân giải glycogen (glycogenolysis) sảy ra trong tế bào cơ và gan để đáp ứng với kích thích hormone như epinephrine và glucagon Đây là phương thức tạo glucose chủ yếu cho các tế bào cần năng lượng Ví dụ này cho thấy sự hoạt hóa một GPCR có thể kích thích hoạt động của một nhóm các enzyme nội bào, tất cả đều tham gia vào một nhiệm vụ sinh lý quan trọng là chuyển hóa glycogen con

2.2.5.1 Adenylyl cyclase bị kích thích và ức chế bởi các phức hợp thụ thể-phối tử khác nhau

Dưới các điều kiện mà nhu cầu cho glucose tăng cao bởi lượng đường máu thấp, glucagon được giải phóng bởi tế bào alpha ở đảo tụy (pancreatic islet); trong trường hợp stress đột ngột, epinephrine được giải phóng bởi tuyến thượng thận Cả glucagon và epinephrine đều phát tín hiệu cho tế bào gan và cơ để depolymer hóa glycogen, giải phóng các phân từ đường đơn Trong gan, glucagon và epinephrine gắn với với các thụ thể liên hợp protein G khác nhau, nhưng cả hai thụ thể đó đều tương tác với và kích hoạt cùng một protein G, để hoạt hóa adenylyl cyclase Do đó cả hai hormone đều gây ra cùng một phản ứng trao đổi chất Sự kích hoạt adenylyl cyclase và cùng đó là nồng độ cAMP đều tỉ lệ thuận với tổng nồng độ của GGTP tạo ra từ liên kết của cả hai hormone với các thụ thể tương ứng

Điều hòa dương (hoạt hóa) và điều hòa âm (ức chế) hoạt động của adenylyl cyclase xảy ra trong rất nhiều loại tế bào, giúp tinh chỉnh nồng độ CAMP và theo đó là đáp ứng xuôi dòng của tế bào (Hình 27) Ví dụ, ở

tế bào mỡ sự thủy phân triacylglycerol thành axit béo và glycerol quá trình thủy phân chất béo, lipolysis) được thúc đẩy bởi sự gắn kết của epinephrine, glucagon, hoặc hormone adrenocorticotropic (ACTH) vào các thụ thể riêng biệt hoạt hóa adenylyl cyclase Ngược lại, gắn kết của hai hormone khác là prostaglandin

E (PGE) hoặc adenosine vào thụ thể liên hợp protein G của chúng sẽ ức chế adenylyl cyclase Thụ thể của prostaglandin và adenosine kích hoạt protein ức chế G chứa cùng một tiểu phần B và y giống như protein kích thích , nhưng khác tiểu phần a (G) Sau khi phức hệ hoạt hóa GGT phân ai" ly khỏi G, nó gắn vào adenylyl cyclase By' và ức chế enzyme này (chứ không kích hoạt), làm giảm nồng độ cAMP

2.2.5.2 Các nghiên cứu cấu trúc thiết lập quá trình Gαs.GTP gắn vào và hoạt as hóa adenylyl cyclase

Phân tích tinh thể dùng tia X giúp xác định chính xác vùng tương tác của đều gây ra cùng một phản ứng trao đổi chất Sự kích hoạt adenylyl cyclase và cùng đó là nồng độ cAMP đều tỉ lệ thuận với tổng nồng độ của GGTP tạo ra từ liên kết của cả hai hormone với các thụ thể tương ứng

Điều hòa dương (hoạt hóa) và điều hòa âm (ức chế) hoạt động của adenylyl cyclase xảy ra trong rất nhiều loại tế bào, giúp tinh chỉnh nồng độ cAMP và theo đó là đáp ứng xuôi dòng của tế bào (Hình 27)

Ví dụ, ở tế bào mỡ sự thủy phân triacylglycerol thành axit béo và glycerol quá trình thủy phân chất béo, lipolysis) được thúc đẩy bởi sự gắn kết của epinephrine, glucagon, hoặc hormone adrenocorticotropic (ACTH) vào các thụ thể riêng biệt hoạt hóa adenylyl cyclase Ngược lại, gắn kết của hai hormone khác là prostaglandin E (PGE) hoặc adenosine vào thụ thể liên hợp protein G của chúng sẽ ức chế adenylyl cyclase Thụ thể của prostaglandin và adenosine kích hoạt protein ức chế G chứa cùng một tiểu phần B và

y giống như protein kích thích , nhưng khác tiểu phần anpha (G) Sau khi phức hệ hoạt hóa GGT phân ly khỏi Gαs, nó gắn vào adenylyl cyclase và ức chế enzyme này (chứ không kích hoạt), làm giảm nồng độ cAMP

2.2.5.3 Các nghiên cứu cấu trúc thiết lập quá trình GGTP gắn vào và hoạt as hóa adenylyl cyclase

Hình 26 Sự tổng hợp và thủy phân của cAMP bằng adenylyl cyclase và phosphodiesterase cAMP

Các phản ứng tương tự xảy ra khi sản xuất cGMP từ GTP và thủy phân cGMP Phân tích tinh thể dùng tia X giúp xác định chính xác vùng tương tác của Gαi.GTP và adenylyl cyclase Enzyme này là một

protein đa xuyên màng với hai phân đoạn bào tương lớn chứa các miền xúc tác chuyển hóa ATP thành cAMP (Hình 28a) Bởi vì những protein xuyên màng như thế này rất khó kết tinh, các nhà khoa học chuẩn

bị hai phân đoạn protein gồm hai miền xúc tác của adenylyl cyclase, liên kết chặt chẽ với nhau thành một

dị nhị hợp (heterodimer) Khi các đoạn xúc tác này tương tác với nhau dưới sự có mặt của GGT và

forskolin (một chất hóa học từ thực vật gắn với và kích hoạt adenylyl cyclase), chúng được giữ ổn định ở cấu hình hoạt hóa của chúng

Kết quả là phức hợp hòa tan trong nước này (gồm hai miền phân đoạn của adenylyl cyclase/GTP/forskolin) có hoạt độ enzyme tổng hợp cAMP tương tự như adenylyl cyclase nguyên vẹn Trong phức hợp này, hai vùng của Gαi.GTP - công tắc xoắn II và vòng lặp a3 B5 – tiếp xúc với các mảnh của adenylyl cyclase (Hình 15-28b) Các liên kết này được cho là chịu trách nhiệm cho sự kích hoạt của enzyme nhờ G GTP Cần nhắc lại rằng công tắc II là một trong những phân đoạn của tiểu phần G mà có các trạng thái cấu hình khác nhau tùy thuộc GDP hay GDP bám vào (xem Hình 15-7) Cấu hình của G kích thích bởi GTP giúp nó phân ly khỏi G và đó cũng chính là cấu hình cần thiết cho gắn kết của G vào adenylyl cyclase

2.2.5.4 cAMP hoạt hóa protein kinase A nhờ giải phóng các tiểu phần ức chế

Phân tử tín hiệu thứ cấp cAMP được tổng hợp bởi adenylyl cyclase và dẫn truyền một lượng lớn các tín hiệu sinh lý trong các loại tế bào khác nhau ở động vật đa bào Hầu như tất cả các hiệu ứng đa dạng của cAMP được điều tiết thông qua sự hoạt hóa của protein kinase A (PKA), còn được gọi là protein kinase phụ thuộc cAMP, enzyme phosphoryl hóa các protein đích nội bào khác nhau trong nhiều loại tế bào PKA bất hoạt là một tetramer (tổ hợp) gồm hai tiểu phần điều hòa (R) và hai tiểu phần xúc tác (C) (hình 29a) Mỗi tiểu phần R gắn vào một vị trí hoạt động của một miền xúc tác và ức chế hoạt động của tiểu phần xúc tác PKA bất hoạt được kích hoạt nhờ liên kết của cAMP Mỗi tiểu phần R có hai vị trí gắn cAMP riêng biệt, gọi là CNB-A và CNB-B (Hình 29b) cAMP bám vào cả hai vị trí trên một tiểu phần R gây thay đổi cấu hình của nó, dẫn đến giải phóng tiểu phần liên kết C, làm lộ ra vị trí xúc tác của nó

Hình 27 Kích thích và ức chế adenylyl cyclase nhờ hormone trong các tế bào mở (adipose)

Phối tử gần vào các thụ thể liên hợp G làm kích hoạt adenylyl cyclase, trong khi phối tử gắn vào thụ thể liên hợp G ức chế enzyme này, Tiểu phần G trong protein G kich hoạt và ức chế là giống nhau, trong khi các tiểu phẩn G, và thụ thể tương ứng là khác nhau Cơ chế hình thành của các phức hợp G GTP hoạt hóa (nhờ kích thích phá tử) là tương tự cho cả hai protein G và G (hình 17) Tuy nhiên, G GTP và G GTP tương tác khác nhau với adenylyl cyclase, do đó một chất kích thích và chất còn lại ức chế hoạt động xúc tác của nó

Hình 28 Cấu trúc adenylyl cyclase của động vật và tương tác của nó với GGT

(a) Biểu đồ sơ có vú lược adenylyl cyclase của động vật có vú Enzyme gắn màng chứa hai miền xúc tác giống nhau, chuyển ATP thành cAMP trên mặt bào tương của màng, và hai miền xuyên màng, mỗi miền được cho là chứa sáu chuỗi xoắn a xuyên màng

(b) Phân tích tinh thể dùng tia X cho thấy mô hình cấu trúc ba chiều của G -GTP tạo thành phức hợp với hai đoạn tạo thành miền xúc tác của adenylyl cyclase Vòng a3-B5 (xám) và chuỗi xoắn trong vùng công tắc II (xanh da trời) của GGTP tương tác đồng thời với một vùng đặc trưng của adenylyl cyclase Phần tối màu của G là miền gắn GTP với cấu as trúc tương tự như Ras (xem Hình 7); phần sáng màu là miền xoắn Hai đoạn adenylyl cyclase được thể hiện bằng màu cam và màu vàng Forskolin (xanh lục) giữ các

đoạn cyclase trong cấu hình dạng hoạt hóa và kích thích hoạt động kinase (Hình 29c) cAMP gắn vào tiểu phần R của protein kinase A theo kiểu phối hợp; có nghĩa là liên kết của phân tử cAMP đầu tiên vào CNB-B sẽ hạ thấp K của liên kết của cAMP thứ hai vào CNB-A Do đó thay đổi nhỏ nồng độ cAMP bào tương có thể gây ra thay đổi lớn tương ứng của các tiểu phần C phân ly, và theo đó là hoạt động của kinase Hormone gây phân ly tiểu phẩm ức chế để kích hoạt nhanh chóng các enzyme là một tính năng phổ biến của nhiều con đường tín hiệu

2.2.5.5 Hoạt hóa protein kinase A nhờ hormone để điều hòa chuyển hóa glycogen

Glycogen, một polymer lớn của glucose, là dạng dự trữ chính của glucose ở động vật Cũng giống như mọi polymer sinh học, glycogen được tổng hợp bởi một tập hợp các enzyme và phân hủy bởi một loạt các enzyme khác (hình 30) Sự phân hủy glycogen, còn gọi là sự phân giải glycogen (glycogenolysis), bao gồm sự tách rời từng bước các phân tử glucose khỏi một đầu của polymer nhờ phản ứng phân giải-phosphoryl hóa (phosphorolysis) và được xúc tác bởi glycogen phosphorylase, tạo ra glucose-1-phosphate

Ở cả tế bào cơ và gan, glucose 1-phosphate tạo ra từ glycogen được chuyển hóa thành glucose-6- phosphate Ở tế bào cơ, chất này gia nhập vào quá trình đường phân và được chuyển hóa để tạo ATP cung cấp năng lượng cho quá trình có cơ Không giống các tế bào cơ, tế bào gan có chứa một phosphatase thủy phân glucose-6- phosphate thành glucose, để rồi xuất ra khỏi tế bào chủ yếu nhờ chất vận chuyển glucose (GLUT2) nằm ở màng tế bào chất

Do đó glycogen dự trữ ở gan phần lớn bị phân giải thành glucose rồi được giải phóng ngay lập tức vào máu và vận chuyển đến các mô khác, đặc biệt là cơ bắp và não để nuôi dưỡng chúng

Hình 29 Cấu trúc của protein kinase A (PKA) và sự kích hoạt của nó bởi MP

(a) Protein kinase A (PKA) mang hai tiểu phần điều hòa (R - xanh lục) và hai tiểu phần xúc tác (c) Khi CAMP (tam giác đỏ) gắn vào tiểu phần điều hòa, tiểu phần xúc tác được giải phóng do đó kích hoạt PKA (b) Hai tiếu phần điều hòa từ một dimer được kết nối bởi một miền nhị trùng hợp/gần kế và một cầu nối linh hoạt mà protein kích hoạt kinase A có thể gắn vào được (AKAP, xem Hình 15-33) Mỗi tiểu phần R có hai miền gắn CAMP, kí hiệu CNB-A và CNB-B và một vị trí liên kết cho tiểu phần xúc tác (mũi tên) (c) CAMP gắn vào miền CNB-A gây ra biến đối cấu hình nha làm tách tiểu phần xúc tác khỏi R, dẫn đến

sự kích hoạt của nó Khi không có CAMP bám vào, một vòng lặp của miền CNB-A (màu tía) có cấu hình gắn được với tiểu phần xúc tác (C) Gốc glutamate (E200) và arginine (R209) tham gian vào quá trình bám của CAMP (đỏ), quá trình gắn này làm thay đổi cấu hình (xanh lục) trong phần vòng lặp, ngăn vòng này gắn với tiểu phần C

Hoạt hóa adenylyl cyclase nhờ kích thích epinephrine gây tăng CAMP, theo đó kích hoạt protein kinase A (PKA) làm tăng chuyển hóa glycogen thành glucose-1-phosphate theo hai cách: ức chế tổng hợp glycogen và kích thích phân giải glycogen (Hình 31a) PKA phosphoryl hóa và bất hoạt glycogen synthase (GS), một enzyme tổng hợp glycogen PKA gián tiếp thúc đẩy phân giải glycogen nhờ phosphoryl hóa và kích hoạt một kinase trung gian, glycogen phosphorylase kinase (GPK, theo lượt sẽ phosphoryl hóa và kích hoạt glycogen phosphorylase (GP), một enzyme phân giải glycogen Các kinase này mất tác dụng nhờ một phosphatase gọi là phosphoprotein phosphatase (PP) Ở nồng độ CAMP cao,

PKA phosphoryl hóa một chất ức chế của PP (gọi là IP), giữ phosphatase này ở trạng thái bất hoạt (xem hình

Hình 30 Sự tổng hợp và phân hủy của glycogen

Sự kết hợp của glucose từ UDP-glucose thành glycogen được xúc tác bằng glycogen synthase Phân tách các đơn vị glucose từ glycogen được xúc tác bởi glycogen phosphorylase Bởi vì hai enzyme khác nhau xúc tác sự hình thành và phân hủy của glycogen, hai phản ứng này có thể được điều hòa một cách độc lập

Toàn bộ quá trình bị đảo ngược khi epinephrine bị loại bỏ và nồng độ cAMP giảm xuống, làm bất hoạt PKA Khi PKA bị bất hoạt, nó không thể phosphoryl hóa chất ức chế của phosphoprotein phosphatase (IP), do đó phosphatase này trở thành dạng hoạt hóa (Hình 31b) Phosphoprotein phosphatase (PP) loại các gốc phosphate mà trước đó được thêm vào glycogen synthase (GS), glycogen phosphorylase kinase (GPK), và glycogen phosphorylase (GP) bởi PKA Kết quả là sự tổng hợp glycogen bởi GS được tăng cường và sự phân giải glycogen bởi GP bị ức chế

Do vậy, quá trình epinephrine gây phân giải glycogen mang tính điều hòa kép hoạt hóa các enzyme xúc tác phân giải glycogen và ức chế các enzyme thúc đẩy tổng hợp glycogen Tính điều hòa kép này cung cấp một cơ chế hiệu quả để điều tiết một đáp ứng nhất định của tế bào và là một hiện tượng phổ biến trong sinh học tế bào

2.2.5.6 Hoạt hóa protein kinase A nhờ cAMP tạo nên nhiều đáp ứng đa dạng trong các loại tế bào khác nhau

Trong tế bào mỡ, sự hoạt hóa protein kinase A gây bởi epinephrine thúc đẩy phosphoryl hóa và hoạt hóa lipase để thủy phân triglyceride dự trữ nhằm tạo axit béo tự do và glycerol Những axit béo này được giải phóng vào máu và tế bào ở các mô khác như thận, tim, cơ và được sử dụng như một nguồn năng lượng Do đó, sự hoạt hóa PKA nhờ epinephrine ở hai loại tế bào khác nhau, gan và mỡ, có các tác dụng khác nhau Thực vậy, cAMP và PKA làm trung gian cho một loạt các đáp ứng tế bào gây ra bởi hormone trong nhiều loại mô (Bảng 2)

Mặc dù PKA tác động vào các cơ chất khác nhau ở các loại tế bào khác nhau, nó luôn phosphoryl hóa một gốc serine hoặc threonine trên cùng một trình tự có mô típ: X-Arg-(Arg/Lys)-X-(Ser/ Thr)-0, trong đó X

là bất kỳ axit amin nào và ở là một axit amin kỵ nước Các serine/threonine kinase khác sẽ phosphoryl hóa gốc axit amin đích trong các trình tự có mô típ khác

Hình 31 Sự điều hòa trao đổi chất glycogen bằng CAMP và PKA

Các enzyme hoạt động được làm nổi lên bằng các màu tối hơn; dạng bất hoạt bằng màu sáng hơn

(a) Nồng độ cAMP bào tương tang lên làm kích hoạt protein kinase A (PKA), PKA này ức chế trực tiếp

sự tổng hợp glycogen và xúc tiến sự phân hủy glycogen thông qua các một chuỗi các protein kinase Ở nồng độ cAMP cao, PKA cũng đồng thời phosphoryl hóa một chất ức chế của phosphoprotein phosphatase (PP) Chất ức chế được phosphoryl hóa bám vào PP và không cho phosphatase này phosphoryl hóa ngăn glycogen synthase bất hoạt hoặc các enzyme đã được kích hoạt trong các tầng kinase

(b) Nồng độ cAMP giảm gây bất hoạt PKA, làm giải phóng dạng hoạt hóa PP Động thái này của enzyme xúc tiến sự tổng hợp glycogen và ức chế sự phân hủy glycogen

2.2.5.7 Khuếch đại tín hiệu xảy ra trong con đường cAMP-protein kinase A

Chúng ta đã thấy thụ thể như β-adrenergic là protein có mật độ thấp, thường chỉ có vài nghìn phân

tử mỗi tế bào Tuy nhiên đáp ứng tế bào gây ra bởi hormone như epinephrine cần một lượng lớn cAMP và phân tử enzyme hoạt hóa Ví dụ, sau khi các thụ thể liên hợp G_ được kích hoạt, as nông độ cAMP nội bào tăng lên 106 M; nghĩa là ở một tế bào bình thường có dạng khối lập phương kích thước 15 km mỗi chiều, có khoảng 2 triệu phân tử cAMP được sản xuất Do đó sự khuếch đại tín hiệu là cần thiết để hormone có thể gây ra một đáp ứng đáng kể ở tế bào Chúng ta đã biết sự khuếch đại tín hiệu xảy ra như thế nào sau khi một photon được hấp thụ ở tế bào hình que Trong trường hợp các thụ thể hormone liên hợp protein G, khuếch đại tín hiệu xảy ra một phần nhờ cả thụ thể lẫn protein G đều có thể khuếch tán nhanh chóng trong màng tế bào chất Một phức hợp duy nhất epinephrine-GPCR có thể biến đổi tới 100 phân tử G ở dạng bất hoạt thành as dạng hoạt hóa trước khi epinephrine phân ly khỏi thụ thể Mỗi GGT hoạt hóa theo lượt lại kích thích một phân tử adenylyl cyclase đơn xúc tác tổng hợp rất nhiều phân tử CAMP trong thời gian GGTP gắn vào nó

Sự khuếch đại xảy ra trong một tầng truyền tín hiệu như vậy phụ thuộc vào số các bước trong đó

và nồng độ tương đối của của các thành phần khác nhau Ví dụ trong tầng tín hiệu gây ra bởi epinephrine minh họa ở Hình 19 chỉ cần lượng epinephrine trong máu thấp ở mức 1010

M cũng có thể kích thích phân giải glycogen và giải phóng glucose Một kích thích của epinephrine ở cường độ này tạo ra cAMP nội bào

glycogen-2.2.5.8 CREB nối CAMP và protein kinase A với kích hoạt biểu hiện gen

Sự hoạt hóa protein kinase A cũng kích thích sự biểu hiện của rất nhiều gene, dẫn đến ảnh hưởng dài hạn lên tế bào qua đó tăng cường ảnh hưởng ngắn hạn của protein kinase A hoạt hóa Ví dụ ở tế bào gan, protein kinase A gây biểu hiện một số enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp glucose từ các cơ chất carbon không chứa carbohydrate (gluconeogenesis) là quá trình chuyển đổi hợp chất ba carbon như pyruvate glucose – do đó làm tăng nồng độ glucose trong máu

Mọi gene bị điều hòa bởi protein kinase A đều chứa trình tự DNA hoạt động kiểu cis, là một yếu tố đáp ứng cAMP (CAMP-response element, CRE), có thể gắn với dạng đã phosphoryl hóa của một yếu tố phiên mã gọi là protein gån CRE (CRE-binding, CREB), chỉ được tìm thấy ở trong nhân Khi nồng độ

CAMP tăng và tiểu phần xúc tác của protein kinase A hoạt hóa được giải phóng, vài tiểu phần xúc tác sẽ

di chuyển vào trong nhân Ở đó chúng phosphoryl hóa serine-133 trên protein CREB Protein CREB bị phosphoryl hóa gắn với các gene đích chứa trình tự CRE và cũng gắn vào một yếu tố đồng hoạt hóa gọi là CBP/300 CBP/300 nối CRE với RNA polymerase 2 và các protein điều hòa gene khác, từ đó kích thích phiên mã gene (Hình 15-32) Như vậy protein kinase A phosphoryl hóa nhiều loại protein: một số có ảnh hưởng tương đối ngắn hạn lên trao đổi chất tế bào, chỉ kéo dài khoảng vài giây tới vài phút; một số cơ chất khác như CREB, bằng cách kích hoạt biểu hiện các gene đặc hiệu, ảnh hưởng tới trao đổi chất tế bào kéo dài vài tiếng hoặc vài ngày

2.2.5.9 Protein neo tập trung tác động của cAMP đến các vùng đặc hiệu của tế bào

Ở nhiều loại tế bào, nồng độ cAMP tăng lên có thể gây đáp ứng có lợi một phần của tế bào nhưng lại không cần thiết, thậm chí là có hại ở một phần khác Một họ protein neo (anchoring protein) tập trung các đồng phân của protein kinase A (PKA tại các vùng tế bào đặc hiệu, giới hạn đáp ứng phụ thuộc cAMP chỉ tại các vùng này Những protein này gọi là protein liên kết A kinase (A kinase-associated protein, AKAP),

có một cấu trúc hai miền với một miền vươn đến một vị trí đặc biệt dưới tế bào và miền khác gắn với tiểu phần điều hòa (R) của protein kinase A (xem Hình 29b)

HÌNH 32 Sự kích hoạt của yếu tố phiên mã CREB sau khi phối từ gắn vào thụ thể liên hợp protein G

Kích thích thụ thể ( dẫn đến kích hoạt protein kinase A (PKA) 2) Các tiểu phần xúc tác của PKA di chuyển vào trong nhân (B và tại đây phosphoryl hóa và kích hoạt yếu tố phiên mã CREB 2 CREB đã phosphoryl hóa liên kết với yếu tố đồng hoạt hóa CBP/P300 (5 và các protein khác để kích thích phiên mã của các gene địch khác nhau được điều khiển bởi yếu tố điều hòa CRE

Một protein neo như vậy (AKAP15) đính vào mặt bào tương của màng tế bào chất gần kênh cổng Ca2 đặc biệt ở các tế bào cơ tim nhất định Trong tim, sự hoạt hóa của thụ thể B-adrenergic nhờ epinephrine (là một phần của phản ứng stress cấp tính fight-or flight) dẫn tới PKA xúc tác phosphoryl hóa các kênh Caº+, làm chúng mở ra; kết quả là dòng Ca2+ chảy vào qua kênh làm tăng nhịp co bóp cơ tim Liên kết của AKAP15 với protein kinase A tập trung kinase này bên cạnh các kênh, do đó làm giảm thời gian cần thiết để các tiểu phần xúc tác PKA khuếch tán từ nơi được tổng hợp đến vị trí kênh Ca2+ là cơ chất của chúng

Một AKAP khác ở cơ tim neo cả protein kinase A và cAMP phosphodiesterase (PDE) – là enzyme thủy phân cAMP thành AMP (xem Hình 26) – tại mặt ngoài của màng nhân Vì khoảng cách khá gần giữa PDE và protein kinase A, quá trình hồi biến âm (negative feedback) giúp kiểm soát chặt chẽ nồng độ cục

bộ của cAMP và do đó là hoạt động cục bộ của PKA (Hình 33) Khi nồng độ cAMP tăng để đáp ứng kích thích hormone, PKA được kích hoạt PKA phosphoryl hóa PDE, làm nó hoạt động hơn và theo lượt sẽ thủy phân cAMP, làm PKA trở lại trạng thái bất hoạt Sự tập trung protein kinase A gần màng nhân cũng tạo điều kiện cho các tiểu phần xúc tác của nó đi vào trong nhân nơi chúng phosphoryl hóa và kích hoạt yếu tố phiên mã CREB (xem Hình 32)

2.2.5.10 Nhiều cơ chế điều hòa giảm tín hiệu từ con đường GCPR/cAMP/ PKA

Để tế bào phản ứng hiệu quả với thay đổi của môi trường, chúng không những cần phải kích hoạt một con đường tín hiệu mà còn phải điều chỉnh giảm xuống hoặc chấm dứt đáp ứng khi không còn cần thiết; nếu không các con đường truyền tín hiệu sẽ được giữ quá lâu ở trạng thái “bật” hoặc hoạt động quá mức và tế bào sẽ bị kích thích quá độ Sự mất kiểm soát của con đường tín hiệu là rất phổ biến trong các tế bào ung thư, nơi các protein - kích thích tăng sinh tế bào hoặc ngăn chặn sự chết tế bào theo chương trình (programmed cell death) – bị đột biến và giữ ở trạng thái hoạt động ngay cả khi các tín hiệu thông thường kích hoạt chúng vắng mặt

Trước đây chúng ta đã thấy nhiều cơ chế có thể nhanh chóng chấm dứt con đường tín hiệu rhodopsin, bao gồm các protein VÀ kích thích thủy phân GTP gắn vào G các protein cảm ứng at' Ca2+ kích hoạt guanylate cyclase, và phosphoryl hóa của rhodopsin hoạt hóa nhờ rhodopsin kinase cùng với arrestin gắn vào sau đó (xem Hình 15-24) Thật ra, hầu hết các thụ thể liên hop protein G được điều chinh bởi nhiều cơ chế điều hòa giảm hoạt động của chúng, như trong minh họa của các thụ thể B-adrenergic và các thu thể khác liên hợp với G gây kích hoạt adenylyl cyclase

* Đầu tiên, ái lực của thụ thể đối với phối tử của nó giảm khi GDP gắn G bị thay thế bởi GTP K của phức hơp hormone - thụ thể tăng lên làm tăng sự phân ly của phối tử khỏi thụ thể và do đó giới hạn số lượng protein G có thể được kích hoạt

* Thứ hai, hoạt động nội tại GTPase của G biến đổi GTP (đang gắn) thành GDP, gây bất hoạt G và giảm

sự hoạt hóa adenylyl cyclase đích xuôi dòng Quan trọng hơn, tỷ lệ thủy phân GTP gắn vào G được tăng lên khi G gắn vào adenylyl cyclase, làm giảm thời gian sản xuất CAMP, do đó adenylyl cyclase hoạt động như GAP cho G Thông thường, liên kết của hầu hết (nếu không muốn nói là tất cả) các phức hợp G GTP với protein hiệu ứng tương ứng làm tăng tốc độ thủy phân GTP

* Cuối cùng, CAMP phosphodiesterase hoạt động để thủy phân CAMP thành 5'-AMP, chấm dứt đáp ứng

tế bào Do đó, sự có mặt liên tục của hormone ở một nồng độ đủ cao là bắt buộc để kích hoạt liên tục adenylyl cyclase và duy trì CAMP mức cao Một khi nồng độ hormone xuống thấp, đáp ứng tế bào sẽ nhanh chóng kết thúc Phần lớn các GPCR cũng được điều hòa giảm nhờ quá trình ức chế hồi biến (feedback repression), thuật ngữ diễn tả trạng thái trong đó sản phẩm cuối của một con đường tín hiệu ngăn chặn bước ban đầu của con đường đó Ví dụ, khi thụ thể liên hợp protein G bị kích as thích bởi hormone trong vài giờ, nhiều gốc serine và threonine trong miền bào tương của thụ thể sẽ bị phosphoryl hóa bởi protein kinase A (PKA), là sản phẩm cuối của con đường tín hiệu G Thụ thể bị phosphoryl hóa có thể gắn với phối tử của nó nhưng không thể kích hoạt G một cách hiệu quả; do đó phối as tử gắn thụ thể bị phosphoryl hóa làm giảm kích hoạt adenylyl cyclase khi so với thụ thể không bị phosphoryl hóa Vì hoạt động PKA được tăng cường bởi mức cAMP cao (do một hormone bất kỳ kích thích G , hoặc do tiếp xúc kéo dài với một hormone như vậy, ví dụ epinephrine), nó không chỉ làm giảm độ nhạy của thụ thể B-adrenergic mà của cả các thụ thể liên hợp protein G khác mà gắn với nhiều loại phối tử khác nhau (ví dụ như thụ thể glucagon gan) Sự điều hòa chéo này được gọi là khử nhạy dị hóa (heterologous desensitization) Tương tự như việc phosphoryl hóa của rhodopsin hoạt hóa bởi rhodopsin kinase, các gốc nhất định trong miền bào tương của thụ thể B-adrenergic (mà không phải những gốc bị phosphoryl hóa bởi PKA) có thể bị phosphoryl hóa bởi enzyme kinase thụ thể B-adrenergic tương ứng (8-adrenergic receptor kinase, BARK) Việc này chỉ xảy ra khi epinephrine hoặc một agonist gắn vào thụ thể và làm thụ thể có cấu hình ở trạng thái hoạt hóa Tiến trình này được gọi là khử nhạy đồng hóa (homologous desensitization) vì chỉ những thụ thể trong cấu hình hoạt hóa mới bị bất hoạt bởi quá trình phosphoryl hóa

Chúng ta đã biết rằng arrestin gắn vào opsin bị phosphoryl hóa toàn phần sẽ ức chế toàn bộ quá trình kích hoạt liên hợp protein G nhờ opsin hoạt hóa (xem Hình 24) Ở thực tế, một protein liên quan là ß-arrestin đóng vai trò tương tự trong việc khử nhạy các thụ thể liên hợp protein G khác, bao gồm cả thụ thể B-adrenergic Quan sát ban đầu cho thấy biểu hiện quá mức của BARK và ß-arrestin sẽ làm thụ thể B-adrenergic biến mất khỏi bề mặt tế bào khi đáp ứng lại quá trình gắn phối tử Đây cũng là một chức năng khác của B-arrestin trong quá trình điều hòa thụ thể bề mặt tế bào Các nghiên cứu sau đó cho thấy B-arrestin không chỉ gắn vào thụ thể được phosphoryl hóa mà còn vào clathrin và một protein liên quan có tên gọi AP2, hai thành phần chính của các túi bọc (coated vesicles) tham gia vào một dạng nhập nội bào (endocytosis) của màng tế bào chất (Hình 34) Các phản ứng này dẫn đến hình thành các vùng lõm có vỏ (coated pit) và sự nhập nội bào của các thụ thể tương ứng, do đó giảm đi số lượng của thụ thể phơi ra trên

bề mặt tế bào Cuối cùng, vài thụ thể nhập vào sẽ bị phân hủy nội bào, và vài thụ thể khác bị phosphoryl

hóa trong endosome Sau khi B-arrestin phân ly, các thụ thể được tái tạo độ nhạy (phosphoryl hóa) và quay trở lại bề mặt tế bào, tương tự như sự tuần hoàn của thụ thể LDL

Hình 33 Protein kinase A (PKA) di chuyển tới màng nhân trong cơ tim

nhờ protein liên kết kinase A (AKAP)

MAKAP, một thành viên của họ AKAP, neo cả cAMP phosphodiesterase (PDE) và tiểu phần điều hòa (R, xem Hình 15-29b) của PKA vào màng nhân, và giữ chúng trong một vòng lặp hồi biến âm để điều khiển nồng độ cAMP và mức hoạt động cục bộ của PKA Bước 1 Mức hoạt động sàn của PDE khi không có hormone (trạng thái nghi) giữ nóng độ cAMP thấp hơn mức cấn thiết để kích hoạt PKA Bước 2 và 3 Kích hoạt của thụ thể B-adrenergic làm cho nồng độ cAMP tăng cao hơn mức PDE có thể phân hủy Kết quả cAMP gắn vào các tiểu phần điều hòa (R) của PKA, giải phóng các tiều phần xúc tác (C) hoạt động vào bào tương Một vài tiêu phần C đi vào trong nhân, ở đó chúng phosphoryl hóa và do đó kích hoạt các yếu

tố phiên mã nhất định (xem Hình 32) Các tiểu phần C khác phosphoryl hóa PDE, kích thích các hoạt động xúc tác của nó PDE hoạt động thủy phân cAMP, do đó đưa nóng cAMP trở lại các mức sàn và tái tạo phức hợp bất hoạt PKA-R Bước 4 Phosphoryl hóa PDE tiếp theo đưa phức hợp trở về trạng thái nghỉ

Ngoài vai trò điều hòa hoạt động thụ thể, B-arrestin còn hoạt động như một protein chuyển đổi (adapter protein) truyền tín hiệu từ các thụ thể liên hợp protein G vào nhân Phức hợp GPCR-arrestin hoạt động như một khung đỡ để gắn và kích hoạt các kinase bào tương khác (xem Hình 34) Các kinase này gồm c-Src, một protein tyrosine kinase bào tương kích hoạt con đường MAP kinase và các con đường khác, dẫn đến phiên mã các gene cần thiết để phân chia tế bào Một phức hợp của ba protein gån arrestin, bao gồm Jun kinase đầu N UNK-3) khởi động một tầng kinase để cuối cùng kích hoạt yếu tố phiên mã c-Jun Yếu tố phiên mã này gây biểu hiện các enzyme kích thích tăng trưởng nhất định, và các protein khác giúp tế bào đáp ứng lại stress Do đó, con đường BARK-Barrestin, ban đầu được cho là để triệt tiêu tín hiệu từ GPCRs, thực ra hoạt động như một công tắc, đóng các tín hiệu của protein G và mở các con đường tín hiệu khác Các chức năng khác nhau của B-arrestin cho thấy tầm quan trọng của các protein chuyển đổi trong quá trình điều hòa và truyền tín hiệu từ các thụ thể bề mặt tế bào

Hình 34 Vai trò của β-arrestin trong sự giảm nhạy cảm và truyền tín hiệu GPCR

β-arrestin gắn vào các gốc serine và threonine đã phosphoryl hóa ở phân đoạn đầu của thụ thể liên hợp protein G (GPCR) Clathrin và AP2, hai protein khác được B-arrestin bám vào, xúc tiến sự nhập bào của thụ thể B-arrestin cũng hoạt động trong truyền dẫn tín hiệu từ các thụ thể hoạt hóa bằng cách gắn vào và