Nuôi cấy mô thực vật tài liệu giảng dạy

Tài liệu giảng dạy “Nuôi cấy mô thực vật” trang bị cho sinh viên ngành Công nghệ Sinh học những hiểu được các kiến thức cơ bản về thực trạng và giải pháp của ngành nuôi cấy mô, giúp cho

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

TÀI LIỆU GIẢNG DẠY NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Giảng viên: Nguyễn Thị Mỹ Duyên

An Giang, tháng 6 năm 2016

CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG

Giáo trình và tài liệu giảng dạy “Nuôi cấy mô thực vật” do tác giả

Nguyễn Thị Mỹ Duyên, công tác tại Khoa Nông nghiệp và Tài nguyên thiên

nhiên thực hiện Tác giả đã báo cáo nội dung và được Hội đồng Khoa học và Đào tạo Khoa thông qua ngày 21/01/2016

Tác giả biên soạn

LỜI CẢM TẠ

Tài liệu giảng dạy “Nuôi cấy mô thực vật” được soạn thảo dựa trên nhiều nguồn tài liệu tham khảo Đặc biệt, xin chân thành cảm ơn Cô Ths Đặng Phương Trâm và Thầy PGS.TS Nguyễn Bảo Toàn đã giảng dạy và hỗ trợ rất nhiều nguồn tham khảo cho quyển tài liệu này Đồng thời, cũng xin chân thành gởi lời biết ơn xâu sắc đến Thầy Debergh Pierre và ThS Võ Tòng Anh đã cung cấp rất nhiều sách

và tài liệu điện tử về nuôi cấy mô thực vật cho tài liệu này được phong phú hơn Xin chân thành cảm ơn BGH Trường cùng với BCN Khoa Nông nghiệp & TNTN Trường Đại học An Giang đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tài liệu giảng dạy “Nuôi cấy mô thực vật” Cám ơn Quý đồng nghiệp Bộ môn Công nghệ Sinh học đã có nhiều chia sẽ và đóng góp cho tôi hoàn thiện hơn tài liệu giảng dạy này Đây sẽ là nguồn tài liệu giảng dạy hữu ích cho sinh viên ngành Công nghệ sinh học học tập và sinh viên các ngành liên quan tham khảo

Xin trân trọng kính chào

An Giang, ngày 14 tháng 6 năm 2016

Người thực hiện

Nguyễn Thị Mỹ Duyên

LỜI CAM KẾT

Tôi xin cam đoan đây là tài liệu giảng dạy của riêng tôi Nội dung tài liệu giảng dạy có xuất xứ rõ ràng

An Giang, ngày 14 tháng 6 năm 2016

Người biên soạn

Nguyễn Thị Mỹ Duyên

LỜI GIỚI THIỆU

Học phần “Nuôi cấy mô thực vật” là một trong những học phần quan trọng trong Chương trình đào tạo của ngành Công nghệ Sinh học tại Trường Đại học An Giang Bên cạnh đó, học phần này cũng đóng góp quan trọng cho việc đào tạo các

cữ nhân trẻ, cán bộ vùng Đồng bằng Sông cửu Long về chuyên môn trong lĩnh vực nhân và chọn tạo giống cây trồng bằng công nghệ cao Góp phần ứng dụng trong công tác nhân giống cây trồng quí phục vụ cho nhu cầu sản xuất của người dân trong khu vực

Tài liệu giảng dạy “Nuôi cấy mô thực vật” trang bị cho sinh viên ngành Công nghệ Sinh học những hiểu được các kiến thức cơ bản về thực trạng và giải pháp của ngành nuôi cấy mô, giúp cho các em nắm vững các nguyên lý - kỹ thuật cần thiết trong nuôi cấy mô và các ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô trong nhân giống, chọn và tạo giống cây trồng

Nội dung tài liệu giảng dạy “Nuôi cấy mô thực vật” bao gồm 7 chương: Chương 1: GIỚI THIỆU CHUNG

Chương 2: NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY

MÔ THỰC VẬT

Chương 3 THIẾT KẾ PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Chương 4 NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ Chương 5 CÁC ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TRONG TẠO GIỐNG

Chương 6 MỘT SỐ ỨNG DỤNG KHÁC CỦA KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ Chương 7 MỘT SỐ HẠN CHẾ CỦA NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG BẰNG NUÔI CẤY MÔ

Tác giả hy vọng Tài liệu giảng dạy này sẽ là tài liệu học tập hữu ích cho sinh viên ngành Công nghệ Sinh học trình độ Đại học và Cao đẳng

Xin chân thành cám ơn

Tác giả

ThS Nguyễn Thị Mỹ Duyên

MỤC LỤC

CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG i

LỜI CẢM TẠ ii

LỜI CAM KẾT iii

LỜI GIỚI THIỆU iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH BẢNG ix

DANH SÁCH HÌNH x

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xiv

Chương 1: GIỚI THIỆU CHUNG 1

1.1 Một số khái niệm về công nghệ nuôi cấy mô thực vật 1

1.2 Lịch sử phát triển của công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật trên thế giới 4

1.3 Hiện trạng nuôi cấy mô ở Việt Nam 7

Chương 2: NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 11

2.1 Cơ sở của nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

2.1.1 Định nghĩa 11

2.1.2 Kiến thức sinh học cần thiết cho nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

2.1.3 Các kiểu nuôi cấy 13

2.2 Chọn mẫu cấy 13

2.3 Sự vô trùng 16

2.3.1 Khử trùng bề mặt mẫu cấy 17

2.3.2 Khử trùng môi trường và dụng cụ cấy 22

2.4 Môi trường nuôi cấy 24

2.4.1 Nước 25

2.4.2 Các nguyên tố khoáng đa, vi lượng 25

2.4.3 Nguồn carbonhydrate 27

2.4.4 Vitamin 28

2.4.5 Chất tạo gel 28

2.4.6 Chất điều hòa sinh trưởng 29

2.4.7 Chelate 33

2.4.8 Tính thẩm thấu của môi trường 33

2.4.9 Than hoạt tính 33

2.4.10 pH 34

2.4.11 Acid hữu cơ 34

2.4.12 Thành phần bổ sung không xác định 34

2.5 Các kiểu bình chứa và nắp đậy sử dụng trong nuôi cấy 36

2.6 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 36

2.6.1 Chuẩn bị hóa chất 36

2.6.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 37

2.6.3 Chuẩn bị dung dịch mẹ 37

2.7 Điều kiện nuôi cấy 38

2.7.1 Nhiệt độ 38

2.7.2 Ánh sáng 39

2.7.3 Ẩm độ 39

Chương 3 THIẾT KẾ PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ 41

3.1 Nguyên tắc thiết kế phòng thí nghiệm nuôi cấy mô 41

3.2 Tổ chức phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật 41

3.2.1 (a) Phòng sinh trưởng 41

3.2.1 (b) Phòng cấy vô trùng 43

3.2.2 Phòng rửa dụng cụ và sản xuất nước cất 44

3.2.3 (a) Phòng sấy, hấp và kho đựng dụng cụ 44

3.2.3 (b) Phòng chuẩn bị môi trường, chuẩn bị mẫu 44

3.2.4 Phòng sinh hóa và để hóa chất 45

3.2.5 Văn phòng làm việc và nơi tiếp khách 45

3.2.6 Vườn ươm 45

3.3 Trang thiết bị và hóa chất phòng nuôi cấy 45

3.3.1 Dụng cụ thuỷ tinh 45

3.3.2 Trang thiết bị và hóa chất phòng nuôi cấy 45

3.3.3 Hóa chất và thành phần cơ bản 46

Chương 4 NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ 47

4.1 Nhân giống hữu tính – Gieo hạt trong ống nghiệm 47

4.1.1 Chuẩn bị môi trường gieo hạt 47

4.1.2 Khử trùng trái lan 48

4.1.3 Gieo hạt lan 49

4.2 Nhân giống vô tính – Vi nhân giống 50

4.2.1 Kỹ thuật vi nhân giống 50

4.2.2 Các giai đoạn vi nhân giống 51

4.3 Sự thuần dưỡng cây cấy mô 57

4.3.1 Cấu trúc hình thái và giải phẩu của cây con cấy mô 57

4.3.2 Quang hợp 59

4.3.3 Kỹ thuật thuần dưỡng 60

4.4 Một số kỹ thuật giúp gia tăng sự sinh trưởng 63

4.4.1 Kỹ thuật hai lớp 63

4.4.2 Kỹ thuật gia tăng sinh khối bằng cách sử dụng bình phản ứng sinh học 63

4.5 Nhân giống từ phôi vô tính 66

4.5.1 Phôi vô tính 66

4.5.2 Sự thành lập phôi vô tính 67

4.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hình thành phôi vô tính 69

4.5.4 Ứng dụng của phôi vô tính trong việc tạo hạt giống tổng hợp 72

Chương 5 CÁC ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO TRONG CHỌN TẠO GIỐNG 75

5.1 Nuôi cấy giao tử 75

5.1.1 Giới thiệu về gen và thể bội 75

5.1.2 Mục đích và ứng dụng của việc nuôi cấy tế bào đơn bội 75

5.1.3 Kỹ thuật cấy tế bào đơn bội 77

5.1.4 Lợi và bất lợi của nuôi cấy hạt phấn 86

5.2 Nuôi cấy phôi nhũ 87

5.3 Cấy phôi và sự cứu phôi 89

5.4 Thụ tinh trong ống nghiệm 91

5.5 Chọn lọc in vitro các tế bào thực vật có đặc tính kháng 94

5.6 Nuôi cấy tế bào trần 97

5.7 Biến đổi gen 107

5.7.1 Các điều kiện cần cho chuyển gen ở thực vật 108

5.7.2 Các phương pháp chuyển gen ở thực vật 108

5.7.3 Phân tích thực vật biến đổi gen 115

5.7.4 Hiệu quả của kiểu gen thay đổi trên quần thể xảy ra tự nhiên của thực vật 119

Chương 6 MỘT SỐ ỨNG DỤNG KHÁC CỦA KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ, TẾ BÀO THỰC VẬT 121

6.1 Ra hoa trong ống nghiệm 121

6.2 Tạo cây sạch bệnh và phục hồi cây nhiễm virus 122

6.2.1 Cấy đỉnh sinh trưởng (mô phân sinh chồi) 122

6.2.2 Xử lý nhiệt 125

6.2.3 Kỹ thuật vi ghép 127

6.2.4 Tạo chồi bất định, sau đó nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 129

6.3 Cấy tế bào, callus 130

6.4 Sản xuất các chất biến dưỡng thứ cấp bằng phương pháp nuôi cấy tế bào 133

6.4.1 Chất biến dưỡng thứ cấp 133

6.4.2 Sản phẩm của chất biến dưỡng thứ cấp 134

Chương 7 MỘT SỐ HẠN CHẾ CỦA NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG BẰNG NUÔI CẤY MÔ 137

7.1 Sự nhiễm mẫu 137

7.2 Ảnh hưởng của sinh lý sinh thái đến mẫu cấy 142

7.3 Biến dị tế bào sô ma 146

7.4 Cấu trúc bất thường 147

7.5 Các dạng thể khảm 147

TÀI LIỆU THAM KHẢO 151

THỰC TẬP MÔN HỌC 155

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1.1 Khả năng sử dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vật vào công tác

chọn tạo giống cây trồng

1

Bảng 2.1 Các hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng 20

Bảng 2.5 Thành phần các nguyên tố khoáng trong môi trường nuôi cấy 25 Bảng 2.6 Tác dụng chính của các chất điều hòa sinh trưởng trong cấy mô 32

Bảng 5.1 Một số môi trường (MT) được sử dụng trong nuôi cấy tế bào

trần

102

Hình 2.5 Bộ vi lọc, các phần cấu thành và các thao tác lọc dung dịch 23

Hình 2.8 Hiệu quả của sự tương tác NAA và BA trên cây Bowiea

volubilis

31

Hình 3.1 (a) Máy quay dùng cấy môi trường lỏng; (b) Máy lắc 42 Hình 3.2 (a) Kính loup có gắn máy chụp hình; (b) Súng bắn gen 42

Hình 3.4 (a) Tủ sấy dụng cụ; (b) Nồi hấp thanh trùng 44

Hình 4.3 Qui trình gieo hạt và nhân giống hoa lan Dendrobium sonia 49 Hình 4.4 Sự tạo thành chồi ngang (a) và chồi bất định (b) 51

Hình 4.9 Cấu trúc khí khẩu của cây cấy trồng trong nhà lưới (a) và cây

cấy mô (b)

58

Hình 4.13 Kỹ thuật hai lớp (Double layer technique) 63 Hình 4.14 Các kiểu Bioreactor (a) kiểu đơn giản là cho luồng khí sạch đã

được qua màng lọc và đi vào môi trường nuôi cấy, (b) kiểu không khí được nâng lên, (c) kiểu cơ học, (d) kiểu rung động khuếch tán khí

64

Hình 4.15 Hệ thống RITA (a); Hệ thống bình đôi BIT (b) 65

Hình 4.19 Các giai đoạn hình thái tiêu biểu trong quá trình phát triển phôi

vô tính

67

Hình 4.20 Các giai đoạn phát triển phôi vô tính của cây 1 lá mầm 69 Hình 4.21 Các giai đoạn phát triển phôi vô tính của cây 2 lá mầm 69 Hình 4.22 Các con đường thành lập phôi vô tính trực tiếp và gián tiếp

được điều hoà bởi auxin

70

Hình 4.23 Ba quy trình thông thường phát triển phôi vô tính 71

Hình 5.3 Quy trình tạo cây đơn bội từ kỹ thuật nuôi cấy bao phấn 79 Hình 5.4 Quy trình tạo cây đơn bội từ kỹ thuật nuôi cấy hạt phấn 80 Hình 5.5 Giai đoạn 2 là giai đoạn tốt nhất của sự phát triển để cấy bao

phấn cây thuốc lá

82

Hình 5.6 Phương pháp cơ bản để tạo cây đơn bội từ cấy bao phấn 85

Hình 5.8 Cây con phát sinh từ nuôi cấy phôi nhủ cây cam Dweet tangor

Hình 5.9 Các mô sẹo từ nuôi cấy noãn của cam hình thành phôi trên

môi trường có bổ sung đường Galactose 30mg/l

88

Hình 5.10 Bầu noãn chứa phôi tâm màu vàng kem (mũi tên chỉ) trên trái

xoài non

89

Hình 5.12 Nuôi cấy phôi lai tạo cây hoàn chỉnh trong phép lai giữa LPI x

BRO

90

Hình 5.15 Quy trình chọn lọc tính kháng 96

Hình 5.18 Các bước chủ yếu trong việc tách tế bào trần bằng enzyme 99 Hình 5.19 Làm tinh khiết các tế bào trần được tách 101 Hình 5.20 Các hình thức nuôi cấy tế bào trần đã phát triển 104

Hình 5.23 Một khối u lớn hình thành ở đáy cây hoa Hồng (A) Một loạt

khối u hình thành ở nhánh cây Nho (B)

109

Hình 5.24 Quá trình xâm nhập của vi khuẩn (Agrobacterium

tumefaciens) gây khối u trên cây

Hình 5.29 Ba phương pháp chuyển gen trong nuôi cấy mô 117

Hình 6.3 Quy trình phục hồi cây nhiễm virus bằng cách cấy phân sinh

Hình 7.1 Phương pháp xét nghiệm ELISA sandwich kháng thể đối với

virus

139

Hình 7.2 Sự nhiễm một số loại nấm thường gặp trong nuôi cấy 141

Hình 7.3 Nhiễm do nhện - Mites 142

Hình 7.7 Sự ảnh hưởng của than hoạt tính trong nuôi cấy 146

Chương 1 GIỚI THIỆU CHUNG 1.1 MỘT SỐ KHÁI NIỆM VỀ CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là một phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nguyên liệu nuôi cấy (Bảng 1.1) hoàn toàn sạch các loại vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật còn được gọi là nuôi cấy thực vật in vitro (nuôi

cấy trong ống nghiệm) để phân biệt với quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên

bên ngoài được gọi là nuôi cấy in vivo

Bảng 1.1 Khả năng sử dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vật vào công tác chọn tạo giống cây trồng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010; Nguyễn Quang Thạch, 2009)

- Nghiên cứu sinh lý phát triển

Hoa cái (bầu nhụy và noãn) - Thụ phấn trong ống nghiệm phục vụ lai xa

- Tạo cây đơn bội

- Tạo thể đa bội

Hoa đực - Tạo mô sẹo và cây đơn bội

- Tạo đột biến ở mức độ đơn bội

- Tạo dòng đồng hợp tử (sản xuất dòng nhị bội đồng nhất thông qua đa bội hóa)

Hạt Tăng hiệu quả nẩy mầm đối với những hạt khó nẩy mầm

trong tự nhiên

Phôi - Nuôi cấy cứu phôi trong lai xa (vượt qua sự chết phôi

do không tương thích)

- Nhân các dòng lai xa

- Rút ngắn chu trình lai tạo

- Phá ngủ nghỉ của hạt

Mô sẹo (callus) - Sản xuất số lượng lớn cây con thông qua tạo phôi soma

và tạo cơ quan

- Đạt được các cây sạch virus

- Tạo phôi vô tính; sản xuất hạt tổng hợp

- Tạo nguyên liệu phục vụ nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần

- Tạo nguồn vật liệu cho chuyển gen

- Nghiên cứu sự tạo đột biến thông qua tạo biến dị soma

- Sản xuất các chất biến dưỡng sơ cấp và thứ cấp hữu ích (thuốc trị bệnh, chất thơm, sắc tố, )

- Chọn lọc tế bào có đặc tính kháng bệnh, kháng với môi trường bất lợi

Tế bào - Tạo đột biến ở mức độ tế bào

- Tạo tế bào trần phục vụ chuyển gen và dung hợp tế bào (lai vô tính tế bào)

- Nuôi cấy tế bào đơn

Cấy cơ quan và chồi bên - Nhân số lượng lớn các dòng ưu tú

- Sản xuất callus, chồi và rễ để sản xuất các chất biến dưỡng thứ cấp

- Tạo nguồn vật liệu cho nghiên cứu chuyển gen, tế bào trần và vi ghép

Bảng 1.2 Một số thuật ngữ trong nuôi cấy mô thực vật

Thuật ngữ Ý nghĩa

Đột biến (Mutation) Biểu thị sự thay đổi nào đó ở mức độ nhiễm sắc thể hay

phân tử DNA do tác nhân vật lý hoặc hóa học tạo ra kiểu hình khác với kiểu hình nguyên thủy

Biến dị di truyền

(Variation)

Sự xuất hiện khác nhau của cá thể do sự khác biệt về thành phần di truyền của nó, hay sự khác biệt do môi trường mà nó đang phát triển

Dòng vô tính (Clone) Là một quần thể tế bào đồng nhất về mặt di truyền

Chuyển gen Du nhập DNA ngoại lai để tạo ra sự kết hợp di truyền

Chuyển các gen mong muốn vào thực vật (cây mới) Nuôi cấy mô thực vật

(Plant Tissue Culture)

Là sự nuôi cấy vô trùng các cơ quan, mô và tế bào thực vật trên môi trường nuôi cấy được xác định rõ, việc nuôi cấy được duy trì dưới các điều kiện được kiểm soát

Vi ghép Ghép cây trong ống nghiệp Giúp khắc phục sự không

tương thích khi ghép cây ngoài vườn

Mô sẹo (Callus) Một khối các tế bào mô mềm chưa phân hoá (chưa biệt

hóa về chức năng) được hình thành do tầng phát sinh gỗ (tượng tầng) trong phản ứng với sự thương tổn của mô mạch

Huyền phù tế bào Trong môi trường l ng, t mô sẹo có thể phóng thích ra

những tế bào riêng lẻ hay những cụm tế bào t vài chục đến cả trăm tế bào giúp tăng diện tích hấp thu các chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy

Một huyền phù tế bào được cho là lý tưởng khi nó là một dịch mịn, hầu như gồm những yếu tố có khả năng sinh phôi (có khả năng duy trì tính toàn năng và tiến hóa thành phôi soma trên môi trường tái sinh trong điều kiện thích hợp)

Tế bào trần (Protoplast) Tế bào đã loại b vách tế bào bằng các enzym thích hợp

Tế bào soma Là loại tế bào sinh dưỡng đã biệt hóa cao đảm nhiệm một

chức năng nhất định của cơ thể

In vitro Xảy ra trong ống nghiệm

In vivo Trong trạng thái sinh lý bình thường của sinh vật sống

Ex vivo Bên ngoài cơ thể sống (tiến hành trên những bộ phận hay

cơ quan được lấy ra kh i sinh vật) Phôi mầm (Embryo) Là hợp tử do kết quả của sự thụ tinh

Sự thụ tinh (Fertilization) Là kết quả của giao tử đực và cái phối hợp nhau để cho

ra hợp tử Buồng trứng (Ovary) Là bộ phận mà ở đó hạt giống được tạo nên

Noãn (Ovule) Là cấu trúc mang giao tử cái, sẽ trở thành hạt sau khi thụ

tinh Hạt phấn (Pollen grain) Là giao tử đực xuất phát t microspore

Túi phấn (Aanther) Là cơ quan chứa các hạt phấn

Ống phấn (Pollen tube) Được phát triển khi hạt phấn nẩy mầm trên nuốm nhụy

cái, tế bào tinh trùng chạy vào tế bào noãn thông qua ống phấn

Nhị đực (Stamen) Bao gồm túi phấn chứa hạt phấn và vòi nhị đực

(filament) Thụ phấn (Pollination) Hiện tượng chuyển hạt phấn t túi phấn đến nướm nhụy

cái

Polyploid Đa bội thể: là hiện tượng sinh vật mang bộ nhiễm sắc thể

lớn hơn hai bộ nhiễm bình thường (2n)

Lưỡng bội (Diploid) Biểu thị 2n nhiễm sắc thể trong genome

1.2 LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ - TẾ BÀO THỰC VẬT TRÊN THẾ GIỚI

Theo Nguyễn Quang Thạch và cs (2009), công nghệ tế bào thực vật đã trải qua hơn 100 năm phát triển, có thể chia thành 4 giai đoạn như sau:

1.2.1 Giai đoạn khởi sướng (1902 – 1930)

Đây là giai đoạn phát triển ban đầu của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật

Các nghiên cứu cơ bản về Thực vật học và Sinh lý thực vật đã chứng minh được cơ sở

khoa học của nuôi cấy mô, tế bào thực vật là tính toàn năng của tế bào Haberlandt (1902) (Hình 1.1), nhà thực vật học người Đức – lần đầu tiên đã tiến hành thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật nhưng chưa thu được kết quả, các mẫu nuôi cấy không có sự tái

sinh Cùng với Haberlant, Winkler (1902), Thielmann (1924) và Kuster (1928) cũng

đã tiến hành thí nghiệm tương tự nhưng không nhận được tế bào phân chia nào

Winkler lúc bấy giờ đã có những quan sát rất tinh tế, ông nhận thấy tế bào noãn trương lên khi hạt nẩy mầm và để nghị có thể nuôi cấy các mô, tế bào soma tách rời trong một giọt dung dịch cùng với ống phấn để lợi dụng chất tiết ra của ống phấn

để kích thích tế bào nuôi cấy phân chia

Hình 1.1 Gottlieb Haberlandt (1854 - 1945) (Debergh, 2006)

Phải đến những năm 30 của thế kỷ XX người ta mới đạt được những tiến bộ thực sự khi phát hiện ra chất kích thích sinh trưởng thực vật Việc bổ sung chất điều hòa sinh trưởng cùng nhóm vitamin B1 vào thành phần môi trường được xem là một cải tiến có tính quyết định góp phần đặt nền móng cho sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật

1.2.2 Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930 – 1950)

Năm 1934, White và Gautheret đã sử dụng môi trường nuôi cấy có bổ sung thêm vitamin nhóm B và chất điều hòa sinh trưởng thực vật là auxin (IAA – Indoleacetic axit) vào môi trường nuôi cấy Knop Kết quả thu được rất đáng kích lệ trong việc nuôi cấy hệ rễ cây cà chua và sự phân chia, tái sinh của mô cây liễu

Năm 1934, Went và Thimann xác định được indole-acetic acid (IAA) như là một chất điều hoà sinh trưởng Bonner (1937) khám phá thành phần quan trọng trong yeast extract là thiamin (Vit B1)

Năm 1935, Snow chứng minh sự kích thích hoạt động của tượng tầng bằng cách thêm IAA và vitamine B trong môi trường nuôi cấy

Năm 1941, Van Overbeck sử dụng nước d a để cấy phôi cây thuộc họ cà

(Datura) Caplin và Steward (1948) chứng minh nước d a kích thích sự nuôi cấy

carrot nhanh hơn auxin (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Năm 1946, Ball thành công với việc tái sinh được chồi t phân sinh mô và vì thế công việc vi nhân giống được bắt đầu

Năm 1947, LaRue cấy cây một lá mầm t phôi nhũ bắp

Năm 1949, Limaset và Cornuet chứng minh phân sinh mô chồi của các cây nhiễm virus thì sạch bệnh Morel và Martin (1952) phục hồi các cây khoẻ mạnh t nuôi cấy phân sinh mô của cây hoa thược dược

White (1943, 1954), Heller (1953), Gautheret (1959) và Nitsch (1951) là những người tiên phong phát triển các công thức môi trường dinh dưỡng thích hợp cho t ng loại mô khác nhau

Tiếp theo đến năm 1957, Skoog và Miller đã chỉ ra rằng tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích sự tạo rễ, ngược lại khi tỷ lệ auxin/cytokinin thấp sẽ kích thích sự tạo chồi Kết quả này đã khẳng định có thể điều khiển sự phát sinh hình thái mô nuôi cấy thông qua việc điều chỉnh môi trường nuôi cấy với sự bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thuộc 2 nhóm auxin và cytokinin ở những tỷ lệ khác nhau T đây, các nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào được tập trung vào việc nghiên cứu các loại môi trường nuôi cấy và sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

1.2.3 Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái (1950 – 1980)

Năm 1958, Reinert và Stewward nuôi cấy tạo cây thành công t mô sẹo và huyền phù tế bào cà rốt, kết quả nghiên cứu đã chứng minh và khẳng định được tính toàn năng của tế bào thực vật

Năm 1963, Letham xác định cytokinin tự nhiên ở trong phôi nhũ cây Bắp Năm 1962, T Murashige và F Skoog đề xuất môi trường nuôi cấy MS và môi trường này sau đó trở thành môi trường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Cùng với sự ra đời của môi trường MS và nhiều loại môi trường mới, sự khẳng định vai trò của tỷ lệ các chất điều hòa sinh trưởng trong việc điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy T đó, hàng loạt các công trình nghiên cứu vi nhân giống (micropropagation) trên nhiều loại đối tượng khác nhau đã được tiến hành

Hướng nghiên cứu tạo các dòng thuần thông qua nuôi cấy hạt phấn, noãn chưa thụ tinh và phôi chưa thành thục cũng được quan tâm phát triển Vasil (1957) là người đầu tiên tiến hành nghiên cứu nuôi cấy hạt phấn cây t i tây Năm 1964, Guha và Maheshwari chứng minh rằng có thể cấy hạt phấn và có khả năng tạo ra nhiều phôi

đơn bội (haploid) Sau đó, Bourgin và Nitsch (1976) đã nuôi cấy in vitro hạt phấn cây

thuốc lá và cũng tạo được cây đơn bội Và đến nay, đã có nhiều hạt phấn hoặc bao phấn, noãn chưa thụ tinh của nhiều đối tượng cây trồng đã được nuôi cấy tạo cây đơn bội thể, và mang lại hiệu quả kinh tế cao trong sản xuất

Năm 1975, Chu Chí Thanh đã xây dựng được môi trường nuôi cấy N6 thích hợp cho việc nuôi cấy bao phấn cây lúa nước và cây họ Lúa khác Môi trường N6 đã được áp dụng rộng rãi trong việc nuôi cấy bao phấn, hạt phấn tạo cây đơn bội phục vụ cho việc tạo dòng thuần (đơn bội kép) đặc biệt trên lúa, góp phần tích cực trong công tác chọn tạo giống lúa

Năm 1960, Cocking đã sử dụng enzym xellulase và pectinase để phá huỷ vách

tế bào thực vật và thu được tế bào trần (protoplast) – là các tế bào không có cấu trúc vách Tế bào trần được xem là công cụ lý tưởng cho việc lai vô tính thực vật (dung hợp tế bào trần) trong công tác tạo giống Năm 1971, Takebe và cs đã nuôi cấy protoplast lá cây thuốc lá và tái sinh thành cây hoàn chỉnh

Trên cơ sở đó, năm 1972, Carlson và cs đã thu được cây lai tế bào chất giữa

Nicotiana glauca và N Langsdorffii Melchers và cs (1978) đã tạo ra một cây lai t sự

dung hợp tế bào trần của khoai tây và thuốc lá, cho phép chuyển thông tin di truyền t hai loài khác nhau Phương pháp này cung cấp cơ hội tạo ra các cây lai giữa các loài không tương thích về giới tính

Năm 1973, Nallin và cs., Kao và cs đã mô tả một phương pháp hiệu quả cho

sự dung hợp tế bào trần trên cơ sở thêm polyethylen glycol (PEG) vào trong dung dịch chứa tế bào trần

Năm 1976, Seibert kích thích sự tái sinh chồi t chồi hoa Cẩm chướng được trữ lạnh

Hướng nghiên cứu tạo các hợp chất thứ cấp thông qua nuôi cấy mô tế bào đã được Gautheret đề xuất t năm 1942 khi phát hiện thấy các hợp chất trao đổi thứ cấp trong môi trường nuôi cấy Đến năm 1967, Kaul và Staba mới khẳng định được sự có

mặt của chất trao đổi thứ cấp đặc trưng khi nuôi cấy tế bào Ammi visnaga T đây đã

phát triển công nghệ sản xuất hợp chất thứ cấp thông qua nuôi cấy mô tế bào ở quy

mô công nghiệp Năm 1977, Zenk và cs., Akasu và cs chứng minh rằng các tế bào nuôi cấy có thể chứa nhiều chất biến dưỡng thứ cấp hơn các mô cây bình thường

1.2.4 Giai đoạn phát triển của công nghệ gen thực vật (1980 đến nay)

Công trình nghiên cứu của Waston và Crick (1953) về cấu trúc xoắn kép của DNA đã làm sáng t mọi sinh vật t phức tạp nhất như con người đến sinh vật đơn giản nhất như virus thì vật chất di truyền (DNA) đều được cấu tạo t 4 loại nucleotit

cơ bản Tư đó, mầm mống của thời kỳ công nghệ sinh học phân tử bắt đầu

Trước đó, năm 1907, Smith và Townshend đã xác định vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens như là tác nhân gây bệnh khối u trên thực vật Braun

(1970) thành công trong việc nuôi cấy mô khối u không có vi khuẩn trên môi trường chứa đường và khoáng vô cơ Ông ta đề nghị rằng vi khuẩn xâm nhập vào tế bào thực vật tạo ra khối u gọi là nguyên lý kích thích khối u (tumor-inducing principle=TIP) Morel và cs (1960) đã chứng minh rằng các tế bào tạo ra opine là do TIP (DNA) điều hành

Đến năm 1972, Herbert Boyer và Stanley Cohen lần đầu tiên chứng minh được thông tin di truyền t các nguồn khác nhau có thể kết hợp lại để tạo ra một cấu trúc di truyền mới có khả năng tái bản và thể hiện Hai ông đã gắn được các gen ngoại lai vào plasmit của vi khuẩn rồi đưa thể tái tổ hợp này trở lại vi khuẩn Thể DNA tái tổ hợp trên đã được tái bản và biểu hiện ở vi khuẩn Công nghệ này được gọi là công nghệ

DNA tái tổ hợp Nhờ đó, con người có thể tạo ra các sản phẩm mới theo hướng chủ động,… điều mà các phương pháp đột biến, chọn lọc lai tạo không thể làm được

Cùng với sự thay đổi đó, công nghệ tế bào thực vật chuyển sang giai đoạn mới, giai đoạn mà công nghệ tế bào là nền tảng cho công nghệ gen thực vật

Năm 1974, Schell và Van Montagu tìm thấy các plasmid rất lớn ở tất cả các dòng gây độc không có trong các dòng không gây độc Năm 1977, Nestor, Gordon và Chilton chứng minh một mảnh nh của plasmid DNA được chuyển vào trong tế bào

thực vật (T-DNA) và chứng minh Agrobacterium có hiệu quả trong việc chuyển đoạn

này

Năm 1980, Davey và cs., Kreus và cs chứng minh sự hấp thu trực tiếp plasmid

của vi khuẩn Agrobacterium

Năm 1986, Powell Abel và cs lần đầu tiên tạo được cây thuốc lá chuyển gen có

khả năng chống được bệnh virus hại lá (TMV)

Năm 1990 và 1991, Vasil và cs đã tái sinh cây lúa mì hoàn chỉnh t nuôi cấy

tế bào trần, và báo cáo về tạo cây lúa mì chuyển gen bằng súng bắn gen vào các phôi non

Năm 1994, giống cà chua chuyển gen Flavrsavr được chấp nhận cho tiêu thụ

trên thị trường Mỹ

Năm 1995-1996, chuyển gen của cây lúa và cây bắp thông qua vi khuẩn

Agrobacterium được báo cáo

Năm 2003, Tran Thi Cuc Hoa và cs đã nghiên cứu chuyển gen tạo ra giống

lúa chứa VTM A (GoldenRice) bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên 3

giống lúa là IR64 và MTL250 và Đài Bắc 309

Năm 2006 là năm đánh dấu một bước ngoặc quan trọng của cây trồng chuyển gen với diện tích trồng đã vượt quá con số 100 triệu ha

Chuyển gen lan Hồ điệp Phalaenopsis (P amabilis var formosa và P Sogo

Musadium) được trồng ở Đài loan bằng vectơ CymMV-based VIGS, tạo ra giống Hồ điệp kháng bệnh virus (Hsiang-Chia Lu, et al., 2006)

Năm 2011, Anna-Lisa Paul và Robert J Ferl đã sử dụng gen chỉ thị là Protein phát huỳnh quang (Green Fluorescent Protein - GFP) chuyển vào RNAlaterTM

1.3 HIỆN TRẠNG NUÔI CẤY MÔ Ở VIỆT NAM

Ở Việt Nam, công việc nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào bắt đầu thực hiện trong khoảng năm 1977 ở Phân Viện Khoa Học thành phố Hồ Chí Minh Hiện nay, có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô ở các Trường Đại học, các Viện nghiên cứu, các

Sở Khoa học và Công nghệ các Tỉnh, Thành Đà lạt là nơi có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tư nhân phục vụ cho công tác nhân giống hoa cảnh và rau củ

Các phòng thí nghiệm cấp nhà nước đã có rất nhiều thành quả trong các lãnh vực nghiên cứu cơ bản, có thể nói phần nào không bị lạc hậu so với mặt bằng nghiên cứu chung trên thế giới Trong khi các phòng nuôi cấy mô tư nhân thì chủ yếu nghiên cứu ứng dụng mà phổ biến nhất là tạo cây sạch bệnh, hoặc chọn dòng có đặc tính tốt, nhân giống trong ống nghiệm,

Tuy nhiên, vấn đề đáng quan tâm hiện nay là có rất nhiều nơi, nhiều cơ sở có phòng nuôi cấy mô nhưng không phát triển được, dù bên ngoài thị trường Việt Nam vẫn cần lượng cây giống rất lớn Nếu quan sát dễ dàng nhận ra toàn bộ cây lan giống bán ngoài thị trường đều là nhập t các nước Thái Lan, Đài Loan, Singapo,… Nghịch

lý này do đâu?

Theo báo cáo của Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh, trong

cuộc khảo sát tình hình nuôi cấy mô in vitro tại khu vực thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận (Đặng Quỳnh Chi, 2006), cho thấy “Nhìn chung, việc nhân giống in vitro vẫn còn ở quy mô nh , chưa tạo ra được các sản phẩm thương mại, đủ sức cạnh

tranh trên thị trường nội địa và xuất khẩu Quy trình nhân giống các loại cây trồng tuy

đã hoàn chỉnh nhưng chỉ phù hợp việc nhân giống ở quy mô nh Nguyên nhân chủ yếu của những vấn đề trên là do thiếu vốn đầu tư ban đầu cũng như công nghệ và quy

mô sản xuất chưa theo quy trình công nghiệp, dẫn đến hiệu quả kinh tế không cao”

Một số công trình nghiên cứu ở Việt Nam

- Theo Nguyễn Văn Uyển và các tác giả (1984), đã có các nghiên cứu sau: + Ứng dụng phương pháp nuôi cấy túi phấn trong công tác chọn tạo giống lúa + Nuôi cấy tế bào đơn và protoplast phục vụ công tác giống cây trồng

+ Tái sinh cây mía t tế bào đơn

+ Phục tráng và nhân giống khoai tây bằng phương pháp xử lý nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

+ Nhân giống vô tính dưa hấu không hạt bằng kỹ thuật cấy hạt dưa hấu tam bội

là tổ hợp lai giữa dưa hấu tứ bội (cái) và dưa hấu nhị bội (đực) v vàng V hạt được tách b mầm, lá mầm và khử trùng bằng HgCl2 0,1% thời gian t 5 – 15 phút

+ Nhân giống lan Cymbidium bằng kỹ thuật tách đỉnh sinh trưởng

- Nuôi cấy lắc và nuôi cấy Bioreactor trong nhân giống cây hoa Thu Hải

Đường (Begonia tuberous) (Dương Tấn Nhựt và cs., 2005); sản xuất củ giống Lily (Lilium spp.) bằng hệ thống Bioreactor (Dương Tấn Nhựt và cs., 2005)

- T năm 2005 – 2010 đã có nhiều nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy lát m ng tế

bào (TCL) trong nhân giống cây hoa Thu Hải Đường (Begonia tuberous) (Mai Xuân

Phán và cs., 2005), và cây Artisô (Nguyễn Thị Thanh Hằng và cs., 2005)

- Năm 2006, Nguyễn Hữu Hồ và cs thuộc Viện sinh học nhiệt đới kết hợp với

Tổ chức Campus International de Baillar-guet (France) đã cấy thành công gen độc tố

Bt t vi khuẩn đất Bacillus thuringiensis vào cây lúa, giúp lúa kháng lại sâu đục thân

màu vàng

Đối với cây lúa Việt Nam (Oryza sativa), các biện pháp kiểm soát sâu bệnh

như phun thuốc tr sâu hầu như không có hiệu quả do ấu trùng sâu bệnh tấn công ở trong thân cây Các nhà khoa học đã sử dụng một gen hợp nhất Bt và đưa gien chuyển đổi này vào các tế bào cây mầm Gen dung nạp Bt tiêu diệt 100% ấu trùng sâu đục thân màu vàng và sọc nâu trong vòng 1 tuần bị nhiễm mà không gây bất cứ ảnh hưởng nào tới sản lượng

- Năm 2007, Cung Hoàng Phi Phượng và cs bước đầu ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống lan Hồ điệp của Trung tâm CNSH Tp Hồ Chí Minh (Dương Tấn Nhựt, 2007)

- Năm 2007, Lê Văn Hòa và cs đã công bố khả năng gây đột biến nhân tạo

hoa lan cắt cành Dendrobium bằng tia gamma (Dương Tấn Nhựt, 2007)

- Chuyển gen hoa đồng tiền Gerbera jamesonii "FERRARI" nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens của Viện Sinh học Nông nghiệp (Trường ĐH NN I Hà

Nội) với Viện lúa ĐBSCL (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009)

- Nghiên cứu tái sinh in vitro và chuyển gen phát sáng GFP (Green Flourescent Protein) vào cây hoa loa kèn (Lilium longgiflorum) nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens của Viện Sinh học Nông nghiệp - Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội

(Nguyễn Thị Lý Anh và cs, 2009)

- Năm 2010, nhiều công trình nghiên cứu về chuyển gen được công bố tại tạp chí Công nghệ sinh học toàn quốc như: nghiên cứu tái sinh và chuyển gen cho giống

khoai tây Diamant thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (Chu Hoàng Lan

và cs., 2010); chuyển gen ipt vào giống hoa phong lan Dendrobium Sonia Earsakul nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (Tôn Thất Huân và Nguyễn Thị Thanh, 2010); tạo cây thuốc lá chuyển gen vào lục lạp bằng súng bắn gen (Nguyễn Thị Thanh

và cs., 2010)

- Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào trong lai tạo giống dưa hấu không hạt

(Citrullus vulgaris Schrad) (Lâm Ngọc Phương và cs., 2010)

- Dương Tấn Nhựt và cs (2011), một số yếu tố ảnh hưởng ảnh hưởng đến quá trình ra hoa

- Khảo sát mức độ đa bội thể 107 mẫu cây tự nhiên thuộc 4 nhóm chính: nhóm

bưởi (Citrus maxima); nhóm quýt (Citrus reticulata); nhóm cam (Citrus sinensis); và nhóm chanh (Citrus aurantifolia), hạnh (Citrofortunella microcarpa), cần thăng (Limonia acidissima) trong tập đoàn cây có múi ở Việt Nam bằng phương pháp phân

tích dòng chảy tế bào (flow cytometry) bằng máy đo đa bội thể (Nguyễn Vũ Linh, 2011)

- Năm 2012, Công ty TNHH Dekalb Việt Nam đã báo cáo kết quả khảo nghiệm đánh giá rủi ro đối với môi trường và đa dạng sinh học của ngô kháng thuốc

tr c Roundup (NK603) Kết quả sau 2 năm khảo nghiệm (2010 – 2011) tại 4 vùng sinh thái là Vĩnh Phúc, Daklak, Sơn La và Vũng Tàu đã khẳng định tính an toàn của dòng ngô NK603 đối với môi trường và đa dạng sinh học không khác biệt so với ngô truyền thống (Nguyễn Hồng Chính, 2012)

- Qui trình nhân giống nghệ xà c (Curcuma xanthorhiza Roxb.) bằng phương

pháp nuôi cấy lát m ng và kỹ thuật trồng nghệ xà c cấy mô (Nguyễn Thị Mỹ Duyên

và cs., 2013)

- Khảo sát khả năng tạo mô sẹo t cuống lá, phiến lá và nụ hoa non phục vụ

cho vi nhân giống hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii Bolus) (Nguyễn Thị Mỹ Duyên

và cs., 2014)

Câu hỏi ôn tập

Câu 1: Những thành tựu nổi bậc của lĩnh vực nuôi cấy mô trên thế giới các giai đoạn

là gì?

Câu 2: Những thành tựu nổi bậc của lĩnh vực nuôi cấy mô trên thế giới thế kỉ 21 là gì? Câu 3: Hiện trạng nuôi cấy mô ở Việt Nam như thế nào? Các thành tựu nổi bậc? Câu 4: Ứng dụng nổi bậc của nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam thế kỉ 21 là gì?

Chương 2 NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN CÔNG NGHỆ

NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

2.1 CƠ SỞ CỦA NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

2.1.1 Định nghĩa

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là sự nuôi cấy vô trùng các cơ quan, mô, tế bào

thực vật trên môi trường dinh dưỡng được xác định rõ Việc nuôi cấy được duy trì

dưới các điều kiện được kiểm soát (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Sau đó, các mô cấy được cho tái sinh thành cây hoàn chỉnh Người ta đã xây

dựng được các quy trình tương đối hoàn chỉnh để tái sinh cây cho một số loài như

thuốc lá, khoai tây, mía, hoa lan, một số cây ăn quả v.v

2.1.2 Kiến thức sinh học cần thiết cho nuôi cấy mô tế bào thực vật

Trong lĩnh vực nuôi cấy mô và tế bào thực vật, sự hiểu biết các kiến thức cơ

bản về thực vật sẽ giúp ích rất nhiều cho những người nghiên cứu về lĩnh vực này

Sự sinh trưởng và phân hóa của tế bào thực vật

Sinh trưởng và phát triển của cơ thể thực vật cũng như của các cơ quan, mô là

kết quả của sinh trưởng và phát triển của mỗi tế bào Các tế bào thực vật được hình

thành trong những cấu trúc mô chuyên hóa thường có ở chồi đỉnh, chồi bên, đầu rễ,

gọi là mô phân sinh (meristem) Sau đó, các tế bào tăng dần kích thước, thể tích, sinh

tổng hợp các cấu trúc mới trong các vùng giãn và cuối cùng chúng được phân hóa

thành các tế bào của những mô chức năng khác nhau Sự phân hóa này liên quan chặt

chẽ đến những thay đổi cấu trúc của tế bào, đặc trưng riêng cho từng loại mô và cơ

quan (Đặng Phương Trâm, 2005)

Mỗi tế bào thực vật ở trạng thái bình thường đều đã trải qua 3 giai đoạn (Đặng

Phương Trâm, 2005):

- Giai đoạn phân bào (giai đoạn phôi sinh)

- Giai đoạn giãn (giai đoạn tăng sinh)

- Giai đoạn phân hóa (giai đoạn biệt hóa)

 Giai đoạn phân bào

Tế bào của sinh vật đơn bào cũng như tế bào có trong cơ thể đa bào luôn sinh

sản bằng cách phân đôi, để tạo nên hai tế bào con mang đặc tính sinh lý giống tế bào

mẹ Bằng con đường trao đổi chất, tế bào con tăng trưởng khối lượng tế bào chất và

nhân đáp ứng các hoạt động sống Tế bào tăng trưởng đến mức độ nào đó thì tế bào

phân chia thành các tế bào mới

Giai đoạn phân bào của tế bào thực vật bao gồm một chu trình gọi là chu trình phân bào Chu trình phân bào gồm có 4 pha: G1, S, G2 và M

- Pha G1: ADN duỗi xoắn chuẩn bị cho sao chép

- Pha S: xảy ra tổng hợp ADN (nhân đôi hay sao chép ADN)

- Pha G2: chuẩn bị phân bào

- Pha M: phân chia nhân và phân chia tế bào chất

Tế bào thực vật ở giai đoạn này có đặc điểm:

+ Tế bào nhỏ, có kích thước sấp xỉ nhau

+ Thành tế bào mỏng

+ Chất nguyên sinh đậm đặc và nhân khá to

+ Chưa xuất hiện không bào

Sau khi phân chia, một số tế bào con sẽ lớn dần lên về kích thước và thể tích

và khi đạt thể tích gấp đôi, chúng lại tiến hành phân chia Một số tế bào khác thì rời bỏ chu kỳ phân bào, chúng cũng tăng trưởng về kích thước và tiếp theo chuyển sang phân hóa về chức năng

Để thúc đẩy phân bào, cần có sự tham gia của một số chất:

+ Các enzym protein kinaza, chúng chuyển các pha từ G1 sang S, từ S sang G2

và G2 sang M Nếu ức chế các protein kinaza thì quá trình phân bào không thực hiện được

+ Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, đặc biệt là những chất nhóm auxin, cytokinin Ngoài ra còn cần đến các điều kiện ngoại cảnh thuận lợi về nhiệt độ, nước, nguồn chất dinh dưỡng,

 Giai đoạn giãn

Đặc trưng của giai đoạn này là tế bào tăng rất nhanh về thể tích Đầu tiên trong

tế bào xuất hiện rất nhiều không bào nhỏ gọi là tiền không bào

Trong quá trình sinh trưởng giãn, tiền không bào dung hợp với nhau tạo ra không bào lớn hơn và cuối cùng là một không bào trung tâm duy nhất chiếm thể tích rất lớn trong tế bào

Sự tăng thể tích của tế bào trong giai đọan giãn là kết quả của sự giãn thành tế bào và tăng thể tích của không bào, của chất nguyên sinh, gắn liền với sinh tổng hợp các vật liệu mới cần thiết cho xây dựng thành tế bào và chất nguyên sinh

Nhiều nghiên cứu cho thấy quá trình giãn cần có sự tham gia của các chất điều hòa sinh trưởng, đặc biệt là các auxin vì chúng đã hoạt hóa các enzym của thành tế bào

 Giai đoạn phân hóa

Để chuyển sang giai đoạn phân hóa, các tế bào thực vật phải hoàn thành giai đoạn giãn, nghĩa là đã kết thúc sự tăng trưởng về kích thước Nhiều nghiên cứu đã cho thấy bản chất của phân hóa theo nhiều hướng khác nhau là do sự hoạt hóa các gen chức năng mà trước đây ở giai đoạn phôi sinh chúng không hoạt động Các gen này sẽ chịu trách nhiệm tổng hợp các enzyme, protein, cần thiết cho sự phân hóa theo một hướng nào đó Mỗi hướng phân hóa sẽ có những gen khác nhau hoạt động Như vậy, bản chất của phân hóa tế bào là hoạt hóa các gen chức năng nhất định có trong tế bào

2.1.3 Các kiểu nuôi cấy

2.1.3.1 Nuôi cấy cơ quan (organ culture)

Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010), có các kiểu cơ quan được nuôi cấy:

- Các cơ quan xác định (determinate organs) là những cơ quan có cấu trúc, hình dạng và kích thước rõ ràng ví dụ như lá, hoa, trái …

- Các cơ quan chưa xác định (indeterminate organs) là những cơ quan chưa hình thành cấu trúc, hình dạng rõ ràng như phân sinh mô chồi, phân sinh mô rễ

- Cấy các tế bào chưa có tổ chức (unorganised cells): callus (mô sẹo) là một khối tế bào vô định hình chưa có tổ chức, nuôi cấy tế bào (huyền phù tế bào), nuôi cấy

tế bào trần (protoplast)

2.1.3.2 Sự phát sinh hình thái (morphogenesis)

Sự phát sinh hình thái có nghĩa là biến đổi các cấu trúc của mô cấy thành một cây hoàn chỉnh với đầy đủ cấu trúc (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

- Tính chất và sự kích thích: các cơ quan mới như chồi, rễ có thể được kích thích để thành lập từ các mô được nuôi cấy Các cơ quan mới như thế được gọi là các

mô hoặc chồi bất định (adventitious) Đến nay, người ta có thể biến đổi các bộ phận nuôi cấy để tạo ra chồi (caulogenesis) và rễ (rhizogenesis) hoặc tạo phôi vô tính có cấu trúc tương tự như phôi hữu tính Các cấu trúc thành lập chồi rễ hoặc phôi vô tính rất quan trọng trong công việc nhân giống vô tính

- Sự phát sinh hình thái có thể trực tiếp hoặc gián tiếp: sự tạo trực tiếp là sự hình thành các cơ quan mới như chồi rễ từ mẫu cấy không thông qua giai đoạn callus

Sự hình thành gián tiếp là sự hình thành các cơ quan mới thông qua giai đoạn callus

2.2 CHỌN MẪU CẤY

2.2.1 Chọn cây và thời gian lấy mẫu cấy

Cây sử dụng để lấy mẫu cấy được gọi là cây mẹ hay cây gốc là cây được sử dụng như một nguồn cung cấp mẫu nuôi cấy và được chọn theo các kiểu hình mong muốn Cây lấy mẫu nuôi cấy muốn đạt được kết quả cần lưu ý đến các đều kiện sau:

- Chất lượng của cây mẹ: lấy mẫu từ những cây mẹ có nhiều đặc điểm ưu việt

mà ta quan tâm như sinh trưởng và phát triển mạnh, chống chịu tốt với các điều kiện

bất lợi (hạn, lạnh, mặn) hoặc sâu bệnh, cho sản lượng và chất lượng ngon của quả, hạt,

- Tình trạng sạch bệnh của cây mẹ: cây mẹ được chọn để lấy mẫu nuôi cấy phải hoàn toàn không bị nhiễm với bất cứ mầm bệnh nào Thông thường những cây bị nhiễm bệnh thường tạo ra chồi hoặc phân sinh mô chồi có kích thước nhỏ

- Thời gian lấy mẫu: tùy thuộc cây mẹ được trồng tự nhiên ngoài đồng hay được chăm sóc đặc biệt trong nhà lưới mà có thể lấy mẫu nuôi cây theo mùa hoặc có thể lấy mẫu quanh năm Ngoài ra, các yếu tố bên ngoài như nhiệt độ, độ dài ngày,… ảnh hưởng nhiều đến hàm lượng carbohydrate, protein dự trữ và các chất điều hòa sinh trưởng trong mô cấy (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Thường phải lấy mẫu ở thời điểm mà cây sinh trưởng và phát triển mạnh nhất: mùa xuân hay đầu mùa hè Các mùa khác cây sinh trưởng kém hơn, và mang rất nhiều mầm bệnh

2.2.2 Mẫu cấy (explants)

Mẫu vật để nuôi cấy là một mảnh vật liệu thực vật được tách từ cây mẹ để được nuôi cấy (Hình 2.1) Mẫu nuôi cấy có thể lấy từ nhiều bộ phận trên cây như phân sinh mô (đỉnh sinh trưởng), chồi, đoạn thân mang nhiều mắt, mãnh lá, mãnh tử diệp, rễ,… Kích thước mẫu nuôi cấy tùy theo mục đích nghiên cứu (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Hình 2.1 Vị trí cây có thể đƣợc lấy mẫu để nuôi cấy (George, 2008)

Phẩm chất của mẫu cấy: sẽ quyết định sự thành công của mẫu vật được nuôi

cấy vào môi trường Đối với các mẫu nuôi cấy cần lưu ý một số đặc tính sau:

- Các vị trí thực vật được sử dụng làm mẫu nuôi cấy: trên mặt đất sạch hơn các

vị trí thực vật ở dưới đất Thường trên cây, mẫu ở vị trí cao sẽ có ít mầm bệnh hơn

- Các phần có cùng tuổi và cùng vị trí mà chịu ảnh hưởng của các điều kiện vật

lý khác nhau (ánh sáng), phần trong mát dễ thành công hơn phần ngoài nắng

- Mẫu nuôi cấy càng nhỏ càng dễ tránh các vấn đề về nhiễm bệnh thực vật (virus, microplasma, vi khuẩn), nhưng giảm mức độ sống sót sau khi khử trùng

- Các cấu trúc thực vật được bao kín (lá mầm, phôi, mô bên trong, ) thường không chứa hoặc chứa rất ít vi sinh vật

Mục đích và khả năng nuôi cấy: Để phục vụ cho nhân giống vô tính thường

chọn chồi ngọn, chồi bên; Nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy phôi có thể sử dụng lá mầm, trụ

lá mầm, thân, lá, phôi; Để thu cây đơn bội phục vụ cho lai tạo giống dùng bao phấn và hạt phấn cho nuôi cấy

- Phụ thuộc vào mẫu có nuôi cấy thành công hay không? Nếu nuôi cấy mô sẹo hay nuôi cấy phôi không thể thực hiện được với một đối tượng nào đó thì phải chuyển sang chọn đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy

Tuổi của mẫu nuôi cấy tuỳ thuộc vào tuổi của cành được lấy mẫu:

- Độ non của tế bào: Vị trí tuổi cành ở phía dưới thường non hơn vị trí tuổi cành ở phía trên (Hình 2.2) Mẫu cấy càng non thành công càng lớn

Hình 2.2 Vị trí của tuổi cành trên các phần của cây trưởng thành, J: chồi non; A:

chồi gốc; B: chồi vượt (George, 2008)

- Tuổi thọ của tế bào: ví dụ cây 5 năm tuổi (cây đa niên) khi lấy mẫu cấy sẽ tạo

ra các cây con có tuổi thọ cao

Tuy mang cùng một lượng thông tin di truyền như nhau nhưng các cấu trúc mô khác nhau trên một cây có thể cho các kết quả phát sinh hình thái khác nhau, với khả năng tạo chồi, rễ, hay mô sẹo, Vì vậy phải chọn mẫu cấy cho phù hợp tùy thuộc vào trạng thái sinh lý hay tuổi của mẫu Mẫu non, trẻ có sự phản ứng với các điều kiện môi trường nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc biệt là trong nuôi cấy mô sẹo, phôi Ngoài

ra mô non trẻ mới được hình thành, sinh trưởng mạnh, mức độ nhiễm mầm bệnh ít hơn

Phần non ở một một dạng cây hình nón: độ non của một phân sinh mô thì tỉ

lệ với khoảng cách (dọc theo thân và nhánh) giữa sự liên kết chồi và rễ (A) tới phân sinh mô Các phân sinh mô có khoảng cách xa chồi và rễ thì càng già Chúng có nguồn gốc từ khoảng cách AB>AC>AD>AE>AF và do đó phân sinh mô B thì già nhất và phân sinh mô F thì non nhất (Hình 2.3)

Hình 2.3 Phần non ở một dạng cây hình nón (Debergh, 2008)

Sự trẻ hoá và sự nhân giống: Nhân giống in vitro của cây hình chóp (cây

thân gỗ) thường được thực hiện ở phôi (A) hoặc cây con nẩy mầm (B) Khả năng nhân

giống in vitro khó thực hiện ở (C), nhưng vẫn có thể được nhân giống bởi kỹ thuật nhân giống in vitro của cây hình chóp và tạo rễ theo phương pháp cổ điển Cành giâm

được lấy từ cây con tạo rễ này và thường tạo ra sự nhân giống đúng kiểu Cành giâm

từ một cây hơi già hơn (D) có một khả năng tạo rễ giảm và các cành giâm cho thấy sự thay đổi độ sinh trưởng hướng nghiêng (plagiotropic growth) Cành giâm từ những cây già (E) khó tạo rễ (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

2.3 SỰ VÔ TRÙNG (ASEPSIS)

Nuôi cấy mô là một kỹ thuật nuôi cấy cần điều kiện vô trùng Cần lưu ý:

- Sự vô trùng: tránh nhiễm bằng cách sử dụng phương pháp tiệt trùng

- Tiệt trùng (Sterilization): giết hoặc loại vi sinh vật hoặc bào tử của nó bằng nhiệt, lọc, hoá chất hoặc các chất tiệt trùng khác

2.3.1 Khử trùng bề mặt mẫu cấy

Khử trùng đưa mẫu vào ống nghiệm là khâu có tính chất quyết định đến sự thành công, vì nếu không có được mẫu sạch trong môi trường vô trùng (mẫu vô trùng) thì đương nhiên không có mẫu cấy mô Mẫu thực vật trong tự nhiên tiếp xúc với rất nhiều nguồn tạp như bụi, vi khuẩn, bào tử nấm, Do đó, việc tạo được mẫu vô trùng

là khâu khó trong qui trình nuôi cấy

Khử trùng bề mặt mẫu cấy là cách loại bỏ các vi sinh vật bám trên bề mặt mẫu cấy Có nhiều cách loại bỏ vi sinh vật như phương pháp cơ học (chà rữa), hay phương pháp hóa học như sử dụng các hóa chất (xà phòng, bột giặt, thuốc tẩy, thuốc diệt nấm, kháng sinh, hóa chất,…) Các hóa chất dùng để khử trùng phải không độc với mẫu vật cũng như với người thao tác Sử dụng loại nào hiệu quả là tùy thuộc vào mẫu thực vật

và phụ thuộc vào kinh nghiệm của người thực hiện Các bước thao tác khử trùng mẫu được trình bày ở Hình 2.4

Hình 2.4 Phương pháp khử trùng mẫu cấy Từ giai đoạn 4 đến 7 được thực

hiện trong tủ cấy vô trùng (George, 2008)

Trong thời gian xử lý, mẫu cấy phải ngập hoàn toàn trong hóa chất Đối với những mẫu quá bẩn, cần rửa kỹ mẫu dưới vòi nước chảy, sau đó có thể rửa lại bằng nước cất Trước khi đưa mẫu vào môi trường nuôi cấy cần loại bỏ những phần mẫu bị giập, hỏng do quá trình thao tác gây ra

2.3.1.1 Hoá chất khử trùng:

Có nhiều loại hoá chất được sử dụng để khử trùng:

a Dung dịch hypochloride

Ion hypochloride có trong sodium hypochloride (NaOCl) hoặc Calcium hypochloride [Ca(OCl)2] (chlorine) Sodium hypochloride hoà tan trong nước ở dạng lỏng Dung dịch này có trong các sản phẩm tẩy rửa như nước Javel, Clorox Nồng độ cuối cùng cần thiết có thể thay đổi từ 0,25 - 2% (trọng lượng/thể tích) tuỳ thuộc vào vật liệu thí nghiệm và thời gian ngâm mẫu Dung dịch này thường bằng với 5 - 20% (thể tích/thể tích) của các dung dịch Javel hoặc Clorox Tuy nhiên, nên xem kỹ liều lượng của dung dịch tẩy rửa thương mại

Calcium hypochloride được bán ở dạng bột và thường rẽ hơn sodium hypochloride Về mặt lý thuyết, calcium hypochloride [Ca(OCl)2] chứa 99,2% Chloride nhưng trong thực tế thì chiếm 65 - 70% độ tinh khiết

Dung dịch khử calcium hypochloride được chuẩn bị bằng cách hoà tan bột calcium hypochloride vào trong nước sau đó lọc qua giấy lọc và sử dụng ngay Calcium hypochloride sẽ phóng thích chloride khi nó được hoà tan vào trong nước Điều này nghĩa là chloride sẽ bị mất nếu bột calcium hypochloride bị ẩm, trong khi đó sodium hypochloride sẽ bị mất hoạt tính theo thời gian và nếu đặt nơi ánh sáng mạnh Nồng độ sử dụng từ 5-10% để ngâm mẫu trong 20 phút, và có thể thay đổi

b Chloramin B:

Thành phần là Sodium benzensulfochloramin Là chất tẩy rửa sát trùng dạng bột, hạn sử dụng dài không bị giảm hiệu quả sử dụng Có tính năng tiệt trùng khá

Lưu ý: Chloramin B rất nhạy cảm với mắt, cơ quan hô hấp và da Do đó, khi

sử dụng cần phải mang găng tay và khẩu trang

c Cồn

- Trong số các loại cồn được sử dụng để khử trùng, cồn ethanol được sử dụng rộng rãi nhất Cồn không những diệt khuẩn mà còn lấy đi các chất sáp từ mô mẫu cấy Cồn khử trùng thường sử dụng nồng độ từ 70-95% Tuy nhiên, nồng độ 70-80% hiệu quả khử trùng tốt hơn hơn cồn tuyệt đối (95%), vì cồn tuyệt đối bay hơi nhanh

- Cồn Methanol ít hiệu quả hơn cồn ethanol

- Cồn isopropanol rất có hiệu quả nhưng thời gian khử trùng tương đối ngắn 0,5-1 phút ở nồng độ 100%

d Ion kim loại nặng

- Trong các kim loại nặng thì Mercuric Chloride (HgCl2) là chất khử trùng rất hiệu quả nên được sử dụng thông dụng nhất Tuy nhiên, đây là chất độc mạnh, hiệu quả khử trùng cao nên thường người ta dùng với liều rất yếu, từ 0,01% - 0,05% (Dương Công Kiên, 2002) Sử dụng hoá chất này phải hết sức cẩn thận vì độc cho thực vật lẫn động vật, cũng như chất thải sau khi khử trùng có ảnh hưởng đến môi trường Các chất này không được thải ra môi trường tự nhiên nếu chưa xử lý

- Các ion Ag+ và Cu+ đôi khi cũng được sử dụng như là các chất diệt khuẩn

Lưu ý khi sử dụng các chất này nên mang găng tay, khẩu trang và thùng chứa hóa chất đã sử dụng

d Các chất khử trùng khác

Hai chất oxy hoá mạnh là hydrogen peroxide (H2O2) (oxy già) và potassium permanganate (KMnO4) cũng có hiệu quả cao trong khử trùng bề mặt Tuy nhiên, các chất này thường được kết hợp trước hoặc sau khi khử trùng với chất khử trùng khác

Nhiều chất khử nấm có nguồn gốc là thuốc bảo vệ thực vật cũng được sử dụng trong khử trùng (Benomyl, Carbendazol,…) Nồng độ và liều lượng thay đổi theo loại mẫu thực vật

f Chất kháng sinh (antibiotic)

Một số chất kháng sinh cũng được sử dụng cho khử trùng bề mặt để loại trực tiếp các vi khuẩn trong mẫu cấy Sau khi xử lý với hóa chất, mẫu thực vật được ngâm vào các dung dịch có chứa kháng sinh trong khoảng 30 phút sẽ tăng đáng kể hiệu quả của quá trình vô trùng mẫu cấy

Các chất kháng sinh thường được sử dụng là: streptomycin, merthiolate, hỗn hợp penicilin/streptomycin,

2.3.1.2 Nồng độ và thời gian khử trùng

Nồng độ hoá chất và thời gian khử trùng mẫu cực kỳ quan trọng Nếu nồng độ quá cao và thời gian khử trùng khá dài mẫu có thể bị tổn thương và chết Còn nếu nồng độ quá thấp và thời gian khử trùng quá ngắn thì không giết được vi sinh vật Nồng độ thấp và thời gian khử trùng dài cũng có hiệu quả như nồng độ cao và thời gian khử trùng ngắn

Một số kinh nghiệm về nồng độ và thời gian khử trùng của một số hóa chất (Bảng 2.1; 2.2; 2.3):

Bảng 2.1 Các hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Hoá chất khử trùng bề mặt Hoá chất Nồng độ áp dụng Thời gian (phút)

Calcium hypochloride (Clorine)

(penicilline,

tetraciline)

4-1000 mg/l tùy loại mô

30-60 Hiệu quả không cao

và làm giảm sinh trưởng của tế bào

tế bào

Bảng 2.3 Các chất khử trùng và hiệu quả (Vũ Văn Vụ và cs., 2005)

Chất khử trùng Nồng độ sử dụng

(%)

Thời gian xử lý (phút)

Hiệu quả

Clorua thuỷ ngân (HgCl2) 0,1-1 5-10 Trung bình

Một số thí dụ về cách khử trùng bề mặt

* Đoạn cành của cây trồng ngoài đồng Pseudotsuga và Pinus (Gupta và

Durzan, 1985; trích trong Nguyễn bảo Toàn, 2010):

- Rửa nước máy trong 3-4 phút

- Ngâm trong bột giặt 0,1% trong 5-10 phút, sau đó rửa lại bằng nước máy.Thực hiện trong tủ cấy vô trùng

- Ngâm trong hydrogen peroxide 30% trong 15 phút, rửa lại bằng nước cất khử trùng 3 lần

- Ngâm trong sodium hypochloride 0,53% trong 10 phút, rửa lại nước cất khử trùng 3 lần

- Ngâm HgCl2 0,53% trong 10 phút, rửa lại bằng nước cất khử trùng 5-6 lần

* Một phương pháp khác theo Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2014) trên đoạn thân

cây Bình vôi (Stephania) như sau:

- Đoạn thân bình vôi được cắt tỉa sơ bộ, rửa dưới vòi nước chảy 15 phút

- Ngâm và lắc mẫu với bột giặt trong khoảng 10 – 15 phút

- Rửa lại dưới vòi nước chảy

- Đem vào tủ cấy vô trùng, ngâm và lắc trong Ethanol 70% khoảng 1 phút

- Rửa lại 3 - 5 lần nước đã thanh trùng

- Ngâm và lắc với HgCl2 0,1% + Teepol 2 giọt, trong khoảng 15 - 25 phút

- Rửa lại 3 - 5 lần nước đã thanh trùng

- Sau đó gắp mẫu ra giấy khô, cắt tỉa và cấy vào môi trường nuôi cấy

Chú thích:

+ Nước máy và bột giặt để lấy các phần nhỏ bám dính trên bề mặt

+ Ethanol 70% hầu như hiệu quả để làm biến tích protein Đối với ethanol 95% được sử dụng để hoà tan các lớp sáp bề mặt

+ HgCl2 hoạt động trên cơ sở ion Cl- và kim loại nặng làm biến tính protein, chất thấm (wetting agent) (ví dụ: Teepol) được thêm vào để tăng sự bám dính

bề mặt

Theo Đặng Phương Trâm (2005) thì việc lựa chọn chất khử trùng tùy theo từng đối tượng và tùy theo nguồn mẫu Nếu là mẫu lấy từ nhà kính, hoặc mẫu có lớp vỏ bao bọc (hột trong trái, chồi được che bởi nhiều lớp vỏ bên ngoài, ) dùng các chất khử trùng tương đối như nước javel, canxi hypolorit, ngâm trong khoảng 15 - 30 phút là

đủ Đối với mô lấy từ cây trồng trong tự nhiên, nhất các loại mô bị vùi trong đất bẩn hoặc không được che phủ cần áp dụng phương thức khử trùng nhiều lần, ngâm lâu hơn và đôi khi phải dùng chất khử trùng mạnh như HgCl2 ngâm trước, rồi mới ngâm tiếp vào chất khử trùng nhẹ hơn

Thời gian và nồng độ khử trùng phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm, đôi khi phải thực hiện nhiều lần để biết chính xác khả năng chịu đựng của mô và liều lượng hóa chất thích hợp vừa đủ diệt hết nguồn nhiễm trên mô Với những mô thực vật quá mềm, có bề mặt không trơn láng hoặc bị nấm vi khuẩn nhiễm sâu vào trong tế bào thì việc khử trùng là rất khó, đôi khi trong số hàng ngàn mẫu được khử trùng chỉ cần có một vài mẫu sạch khuẩn và phát triển tốt trên môi trường là đã thành công

2.3.2 Khử trùng môi trường và dụng cụ nuôi cấy

- Thành phần chịu nhiệt thì được hấp khử trùng, như tiệt trùng môi trường nuôi cấy, Thành phần không chịu nhiệt như hóa chất (GA3), sử dụng tiệt trùng bằng lọc

- Dụng cụ cấy (như que cấy, kẹp, kéo, giấy, dụng cụ thủy tinh,…) được hấp khử trùng bằng nhiệt khô 100oC trong vài giờ

- Dụng cụ làm việc: dùng nhiệt như đèn cồn, hộp chứa hạt thủy tinh nóng,…)

- Bề mặt tủ cấy: lau cồn (ethanol) 70%, đèn cực tím,…

- Không khử trùng môi trường nuôi cấy quá lâu, một số thành phần của môi trường sẽ bị phân hủy Theo Hagel và cộng sự (1991), có khoảng 5% đường sucrose của môi trường lỏng bị phá hủy khi khử trùng

Có rất nhiều kiểu nồi hấp khử trùng, từ thể tích 20 lít đến trên 100 lít Có loại điều chỉnh bằng tay, có loại hoàn toàn tự động

- Đối với dụng cụ: khi khử trùng bằng nồi hấp ướt (Autoclave) dùng hơi nước

áp lực cao (121oC, 1 at, trong 30 phút) Sau khi khử trùng xong nên sấy khô trước khi

sử dụng

2.3.2.2 Khử trùng bằng lọc Millipor

Khử trùng bằng lọc áp dụng cho các hóa chất không chịu nhiệt Thông thường, dưới điều kiện nhiệt độ và áp suất (như khử trùng môi trường nuôi cấy) thì các hóa chất này bị mất tác dụng, như Gibberellin hoặc một số Vitamin Khi đó người ta phải

sử dụng phương pháp khử trùng bằng lọc (Hình 2.5)

Hình 2.5 Bộ vi lọc, các phần cấu thành và các thao tác lọc dung dịch

(Nguyễn Bảo Toàn, 2010)Phương pháp này chủ yếu sử dụng giấy lọc hoặc màng lọc (sử dụng một lần)

có kích thước lỗ không lớn hơn 0,22 (m) Giấy lọc được gắn trong bộ vi lọc bao gồm đầu, đế và một vòng cao su Bộ vi lọc và màng lọc phải được khử trùng trước khi sử dụng Dung dịch tiệt trùng được lọc và chứa trong một đồ chứa tiệt trùng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

2.3.2.3 Khử trùng nhiệt khô

Tủ sấy: được sử dụng để tiệt trùng dụng cụ cấy, chai lọ và giấy Các dụng cụ

trước khi đem sấy phải được gói kín bằng giấy, giấy nhôm và chỉ được mở trong tủ

cấy vô trùng Không xếp quá chặt để không khí lưu thông làm nóng đều dụng cụ cần khử trùng

Thời gian khử trùng khô với hầu hết các dụng cụ như sau:

- Khử trùng ở nhiệt độ từ 160-1700C trong thời gian 1 giờ Khi nhiệt độ trong tủ khử trùng xuống đến nhiệt độ phòng mới được lấy dụng cụ ra

- Thời gian duy trì ít nhất là 120 phút mới có thể loại bỏ hết các loại bào tử

- Thời gian giảm dần nhiệt độ, đặc biệt đối với các dụng cụ thủy tinh, tránh làm giảm nhiệt độ quá đột ngột gây vỡ bình

Tiệt trùng dụng cụ cấy: có thể sử dụng đèn cồn hoặc hộp nóng có hạt thủy tinh

(Hình 2.6) Hiện nay, nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô sử dụng hộp nóng vì có nhiều lợi ích như tránh được sự cố do dùng đèn cồn

Hình 2.6 Hộp nóng có hạt thuỷ tinh (Đặng Phương Trâm, 2005)

2.3.2.4 Tủ cấy vô trùng

Tủ cấy vô trùng hiện nay được sử dụng cho nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô cũng như nuôi cấy vi sinh vật (Hình 2.7) Thiết bị này loại trừ một cách hiệu quả nguồn vi sinh vật lây nhiễm theo không khí và tạo điều kiện thoải mái cho người sử dụng Tủ cấy vô trùng có hai kiểu là luồng không khí vô trùng đi ngang và luồng không khí vô trùng đi theo chiều đứng từ trên xuống Luồng không khí được lấy vào và thổi ra xuyên qua một màng lọc HEPA nhờ một quạt gió cực mạnh Màng lọc này có kích thước lỗ rất nhỏ (0,2 m) có khả năng ngăn cản các bào tử nấm, vi khuẩn xuyên qua màng

Vì vậy trước và sau mỗi lần sử dụng, buồng cấy cần được lau sạch bằng cồn 700

đối với bề mặt tủ cấy, mặt kính trong và ngoài tủ Đồng thời để đảm bảo mức độ vô trùng cao, phòng cấy cần có đèn tử ngoại (đèn cực tím U.V) giúp loại bỏ các nguồn bệnh lây nhiễm, trong không khí và trên bề mặt các dụng cụ, các thiết bị nuôi cấy Mở đèn cực tím U.V khoảng 5 phút cùng với mở quạt gió (Dương Công Kiên, 2002)

Hình 2.7 Tủ cấy vô trùng (Đặng Phương Trâm, 2005)

2.4 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Môi trường nuôi cấy mô có bản chất giống như “đất trồng” đối với cây ngoài tự

Tuy nhiên, môi trường nuôi cấy mô có ưu điểm hơn vì được nhân tạo nên hoàn toàn

có thể chủ động kiểm soát, bỏ bớt hay thêm vào môi trường các thành phần theo ý muốn một

cách hợp lý đúng thời điểm cần thiết Giá thể đất được thay bằng thạch hay gelatine hoặc cấy

trong môi trường lỏng không cần giá thể Trong khoảng 50 năm đầu khi nuôi cấy mô thực

vật mới phát triển người ta sử dụng rất nhiều loại môi trường theo công thức riêng cho từng

loài, giống khác nhau Hiện nay, đa số sử dụng theo công thức của khoảng một vài chục môi

trường phổ biến nằm trong ba nhóm giàu, trung bình, hay nghèo dinh dưỡng Môi trường của

Murashige & Skoog (1962) được sử dụng hầu như cho đa số trường hợp nuôi cấy vì giàu

dinh dưỡng và cân bằng ion Các nghiên cứu nói chung khi sử dụng một công thức môi

trường nào đó đều gia giảm, sửa đổi chút ít các thành phần, nhất là các thành phần phụ Việc

lựa chọn môi trường phù hợp là rất quan trọng (Đặng Phương Trâm, 2005)