Nghiên cứu sử dụng gel alginate làm giá thể thay cho agar agar trong nuôi cấy mô thực vật

3.6a Kết quả nhân chồi trên giá thể alginate và giá thể agar 65 3.6b So sánh khả năng nhân chồi dâu tây trên giá thể alginate và agar sau 30 ngày nuôi cấy 66 3.7a Số rễ dâu tây trên giá

ĐẶNG THỊ SÁU

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG GEL ALGINATE

LÀM GIÁ THỂ THAY CHO AGAR-AGAR TRONG

NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành : Công nghệ sau thu hoạch

Người hướng dẫn khoa học : PGS-TS Ngô Đăng Nghĩa

Nha Trang – Tháng 06 năm 2008

văn hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bố trên bất cứ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Đặng Thị Sáu

Để hoàn thành luận văn này trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn cô Khúc Thị An, thầy Trang Sỹ Trung và các thầy cô trong bộ môn Chế Biến trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ và có những

ý kiến đóng góp rất quý báu cho tôi trong quá trình làm đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy Phan Ngọc Hùng trường Đại học Yersin Đà Lạt, thầy Nguyễn Duy Hạng - Viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt đã giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị ở Viện Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn bè đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Tác giả luận văn

Đặng Thị Sáu

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1

DANH MỤC CÁC BẢNG 2

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ 2

DANH MỤC CÁC HÌNH 4

MỞ ĐẦU 5

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 6

1.1 TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU VÀ ALGINATE .6

1.1.1 Tổng quan về rong nâu 6

1.1.1.1 Một số thành phần hóa học cơ bản của rong nâu 7

1.1.1.2 Nguồn lợi rong mơ ở Việt Nam 8

1.1.2 Tổng quan về alginate 9

1.1.2.1 Cấu trúc alginate .9

1.1.2.2 Một số tính chất quan trọng của alginate 12

1.1.2.3 Tách chiết alginate 17

1.2 TỔNG QUAN VỀ NUÔI CẤY MÔ 20

1.2.1 Lịch sử nuôi cấy mô 20

1.2.2 Các điều kiện nuôi cấy mô 21

1.2.2.1 Điều kiện vật lý 21

1.2.2.2 Môi trường nuôi cấy mô thực vật 22

1.2.3 Kỹ thuật vi nhân giống 25

1.3 TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC .27

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 27

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 27

1.4 TỔNG QUAN VỀ CÂY DÂU TÂY 29

1.4.1 Sinh trưởng và phát triển của cây dâu tây 29

1.4.1.1 Nguồn gốc, vị trí phân loại của cây dâu tây 29

1.4.1.2 Đặc tính sinh học 30

1.4.2 Các phương pháp nhân giống dâu tây tại Đà Lạt 32

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 33

2.1.1 Alginate 33

2.1.2.Các hóa chất dùng trong tạo gel alginate .34

2.1.3 Vật liệu nuôi cấy mô 35

2.1.4 Môi trường nuôi cấy mô 36

2.1.5 Phòng thí nghiệm và các dụng cụ 37

2.1.6 Điều kiện nuôi cấy 38

2.1.7 Điều kiện kỹ thuật 38

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.2.1 Phương pháp kiểm tra chất lượng của alginate .38

2.2.2 Các thí nghiệm kiểm tra tính chất lý hóa của hệ gel alginate 39

2.2.2.1 Xác định biến đổi pH của hệ gel alginate 39

2.2.2.2 Xác định độ bền của hệ gel alginate .40

2.2.3 Nghiên cứu ứng dụng hệ gel alginate trong nuôi cấy mô 41

2.2.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ alginate trong môi trường đến tốc độ nhân chồi dâu tây 41

2.2.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CaCO3 trong môi trường đến tốc độ nhân chồi dâu tây 42

2.2.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ 6-benzylamino purine (BA) đến tốc độ nhân chồi dâu tây 43

2.2.2.4 So sánh khả năng nhân cụm dâu tây trên giá thể alginate và giá thể agar 44

2.2.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ alginate trong môi trường đến khả năng ra rễ của cây dâu tây in vitro 44

2.2.2.6 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CaCO3 trong môi trường đến khả năng ra rễ của cây dâu tây in vitro 46

2.2.2.7 So sánh khả năng ra rễ của cây dâu tây trên giá thể alginate và giá thể agar 46

3.1 Kết quả nghiên cứu về tính chất ban đầu của alginate 49

3.2 Kết quả nghiên cứu về đặc tính lý hóa của hệ gel alginate 49

3.2.2 Kết quả xác định pH của hệ gel alginate 49

3.2.3 Kết quả xác định độ bền hệ gel alginate 51

3.3 Kết quả các nghiên cứu về nuôi cấy mô dâu tây trên hệ gel alginate 53

3.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ alginate đến công đoạn nhân chồi dâu tây 53

3.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CaCO3 trong môi trường đến tốc độ nhân chồi 56

3.3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ 6-benzylamino purine (BA) đến tốc độ nhân chồi 60

3.3.4 Kết quả so sánh nhân chồi tr ên giá thể alginate và giá thể agar 64

3.3.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ alginate trong môi trường đến khả năng ra rễ của cây dâu tây in vitro 67

3.3.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CaCO3 trong môi trường đến khả năng ra rễ của cây dâu tây in vitro 70

3.3.7 Kết quả so sánh khả năng ra rễ của cây dâu tây trên giá thể agar và giá thể alginate 72

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO 77

PHỤ LỤC 83

NAA : 1- NaphthlAcetic Acid

IAA : Indol- 3- Acetic Acid

IBA : Indol- 3- Butyric Acid

Kinetin : 6-furfuryamino purine

BA : 6-Benzylamino purine

MS : Murashige & Skoog, 1962

3.1 Một số thành phần của alginate và agar nghiên cứu 49

3.6a Kết quả nhân chồi trên giá thể alginate và giá thể agar 65 3.6b So sánh khả năng nhân chồi dâu tây trên giá thể alginate và

agar sau 30 ngày nuôi cấy

66

3.7a Số rễ dâu tây trên giá thể alginate với các nồng độ alginate 68 3.7b Chiều dài rễ trên giá thể alginate với các nồng độ khác nhau 68 3.8a Số lượng rễ trên giá thể alginate với các nồng độ CaCO3 khác

nhau sau 30 ngày nuôi cấy

70

3.8b Chiều dài rễ trên giá thể alginate với các nồng độ CaCO3

khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy

1.2 Cấu trúc của β-D - Mannuronic acid (M) và α- L-Guluronic acid (G)

theo hiện đại

10

2.1 Quy trình sản xuất alginate từ rong mơ S mcclurei 33-34

3.1 Hình mô phỏng tạo gel alginate khi có mặt của tác nhân GDL

và CaCO3

51

3.2 Chồi dâu tây trên giá thể alginate ở các nồng độ khác nhau sau

30 ngày nuôi cấy

55

3.3 Chồi dâu tây trên giá thể alginate với các nồng độ CaCO3khác

nhau sau 30 ngày nuôi cấy

58

3.4 Chồi dâu tây trên giá thể alginate với các nồng độ BA khác

nhau sau 30 ngày nuôi cấy

3.7 Rễ dâu tây trên giá thể alginate với các nồng độ CaCO3 khác

nhau sau 30 ngày nuôi cấy

71

3.8 Rễ dâu tây trên giá thể alginate và trên giá thể agar sau 30 ngày

nuôi cấy

74

MỞ ĐẦU

Sự phát triển nhanh chóng trong lĩnh vực công nghệ sinh học trong những năm gần đây, đặc biệt là trong lĩnh vực công nghệ tế bào đã làm tăng nhu cầu và sự tạo mới của nhiều tác nhân gel làm giá thể cho môi trường đặc trong nuôi cấy

Trong suốt thập niên cuối thế kỷ XX các nhà khoa học thế giới đã có nhiều

nổ lực trong nghiên cứu và thử nghiệm để tìm ra một số cơ chất mới dùng trong nuôi cấy mô Một số cơ chất đã được thử nghiệm và sử dụng như: Plantgar13; carragenan; alginate; Isubgol; Xyloglutan; tinh bột; Sago và Isubgol…Trong đó, alginate là tác nhân gel có tính tương thích sinh học cao đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu ứng dụng thành công trong nuôi cấy mô thực vật

Nước ta được thiên nhiên ưu đãi về nguồn lợi rong biển, nguồn rong vô cùng phong phú, với sản lượng lớn và chất lượng cao Mặc dù vậy sự đầu tư phát triển nuôi trồng, chế biến, khai thác, ứng dụng rong biển còn hạn chế và chưa có hiệu

quả Đặc biệt loài rong mơ Sargassum ở các vùng biển Việt Nam, cho alginate có

hàm lượng guluronic khá cao, tức là khả năng tạo gel tốt Do đó việc nghiên cứu để ứng dụng hệ gel alginate từ nguồn rong này vào trong lĩnh vực công nghệ sinh học

là một vấn đề có ý nghĩa thực tiễn Đến nay nước ta chưa có nghiên cứu nào về dùng alginate chiết xuất từ rong nâu ở vùng biển Việt Nam trong nuôi cấy mô

Xuất phát từ những lý do trên tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu sử

dụng gel alginate làm giá thể thay cho agar-agar trong nuôi cấy mô thực vật”

do PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa hướng dẫn

Khả năng áp dụng của đề tài: kết quả nghiên cứu thành công của đề tài góp

phần làm tăng phạm vi ứng dụng của alginate sản xuất từ rong Sargassum ở Việt

Nam trong lĩnh vực nuôi cấy mô thực vật

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU VÀ ALGINATE

1.1.1 Tổng quan về rong nâu

Rong nâu tên gọi chung các loài rong thuộc ngành Phaeophyta, ngành này chỉ

có một lớp Phaeophyceae, gồm 265 chi và khoảng 1500 đến 2000 loài [55]

Rong nâu cần có các vật bám nên nó mọc trên đá hoặc trên trên các chân đập, cầu cảng, san hô, động vật thân mềm và ngay cả trên các loài rong khác Rong nâu cần có đủ ánh sáng để quang hợp nên nó chỉ mọc ở vùng nước trong và ở độ sâu không lớn lắm sao cho ánh sáng có thể xuyên qua được

Một số loài rong nâu quan trọng trong công nghiệp alginate.[38]

Phaeophyceae

Laminariales Fucales

Laminariacea Alariacea Lessoniaceae Fucaceae Sargassaceae

Laminaria Ecklonia Macrocystis Ascophyllum Fucus Sargassum

L digitata E maxima M pyrifera A nodosum F.serratus

L.hyperborea

Loài Laminaria hyperborea được thu hoạch chính ở Pháp, Ireland, Na Uy và Scotland Loài Laminaria digitata có ở Pháp, Na Uy, Scotland Trung Quốc là quốc gia thành công nhất trong việc trồng rong Laminaria japonica, sản lượng hàng năm

của Trung Quốc lên đến một triệu tấn rong tươi, hai phần ba số đó dùng làm thực phẩm, phần còn lại dành cho sản xuất alginate

Loài Ascophyllum nodosum mọc ở Scotland và Ireland Ngoài ra nó còn có ở

phía bắc Nova Scotia

Loài Durvillaea antarctica mọc ở Chi Lê và loài Durvillaea potatorum ở Úc

được dùng để sản xuất alginate tại Anh và Hoa Kỳ

Loài Ecklonia cava mọc ở độ sâu 20 m, phân bố tại Nhật Bản và Hàn Quốc Các loài thuộc chi Sargassum phân bố ven biển các nước như Trung Quốc,

Ấn Độ, Philippines, Việt Nam

1.1.1.1 Một số thành phần hóa học cơ bản của rong nâu

Rong nâu có chứa các sắc tố fucoxanthin, xanthophyll, -carotene, chlorophyll a, c1 và c2 Các sắc tố này xuất hiện với tỷ lệ khác nhau tùy theo loài Chúng còn biến động theo ánh sáng mặt trời, nhiệt độ nước và các nhân tố khác của môi trường làm cho rong nâu có màu sắc khác nhau từ nâu -vàng nâu - nâu đậm - vàng lục.[14],[21]

Các hợp chất dự trữ khác là mannitol, laminarin và lipid Hàm lượng manitol dao động trong khoảng 6,24÷ 16,74%, hàm lượng trung bình khoảng 6,78÷ 14%,

trong đó loài S mcclurei có hàm lượng cao hơn cả vào tháng 4 đạt khoảng 15,9 %

so với trọng lượng khô Hàm lượng manitol biến động theo thời gian sinh trưởng trong năm, đạt cực đại vào lúc trưởng thành sau đó giảm dần.[21]

Các acid béo ở trong rong rất đa dạng Aknin đã tìm ra và định danh 40 loại acid béo, 10 loại sterol khác nhau từ 8 loài rong nâu ở vùng biển Senegal [30]

Hàm lượng protein trong rong nâu khá hoàn hảo Hàm lượng protein trong rong nâu ở vùng biển Nha Trang dao động từ 8,05 ÷ 21,11% so với trọng lượng rong khô

Hàm lượng iod trong một số loài rong nâu dao động từ 0,05÷ 0,16% so với rong khô tuyệt đối Các tháng mùa đông hàm lượng iod trong rong cao hơn trong các tháng mùa hè.[14]

Thành phần hóa học quan trọng nhất của rong nâu là alginate Alginate tồn tại chủ yếu trong vách tế bào ở dạng muối không tan Alginate còn được tìm thấy trong

tế bào chất

Hàm lượng alginate biến đổi theo loài rong, độ trưởng thành, vùng sinh trưởng

và vị trí trên cây rong, lớn nhất là trên thân, rồi đến lá, phần ngọn và đế (receptacles) Hàm lượng alginate đạt cực đại lúc cây rong đạt độ phát triển lớn

nhất Các loài rong mơ Việt Nam hàm lượng acid alginic dao động trong khoảng 26,41÷ 47,16% So với các loài rong nâu trên thế giới, rong mơ Việt Nam có hàm lượng acid alginic khá cao, đây là một nguồn nguyên liệu để sản xuất alginate có ý nghĩa thương mại

Thành phần khoáng trong rong nâu rất đa dạng bao gồm các nguyên tố đa lượng như K, Na, Ca, Mg, S, P, Cl, I và các nguyên tố vi lượng như Sr, Al, B, Fe,

Zn, Cu, Mn, Mo,…Rong nâu còn có khả năng tích tụ một số nguyên tố như Sr 90,

Cs 137 là những chất liên quan đến các chất thải phóng xạ Hàm lượng khoáng của các loài rong nâu Nha Trang dao động từ 15,51÷ 46,30% phụ thuộc vào mùa vụ và thời kỳ sinh trưởng.[14]

1.1.1.2 Nguồn lợi rong mơ ở Việt Nam

Họ rong mơ (Sargassaceae) tại Việt Nam thuộc bộ rong đuôi ngựa (Fucales), ngành rong nâu (Phaeophyta) Đây là nhóm rong có kích thước cá thể

lớn, chiều dài có thể lên đến 8m, sinh lượng có nơi đạt đến 12kg rong tươi trên một mét vuông Hình dạng của chúng rất giống thực vật bậc cao, sinh sản hữu tính hoặc sinh dưỡng Rong mơ bám vào vật bám như đá, san hô, nhờ đĩa bám hay hệ thống

rễ bò phân nhánh Thân cây rong gồm một trục chính ngắn, khoảng trên dưới 1cm

Từ đỉnh trục chính sẽ phân ra các nhánh chính, hai bên nhánh chính sẽ mọc ra nhiều nhánh bên Trên các nhánh có cơ quan sinh dưỡng, tại đó xảy ra sự quang hợp giống như lá của thực vật bậc cao mà người ta gọi là tản hay giả diệp (frond, blade) Rong mơ còn có các nang chứa khí gọi là phao Khi rong trưởng thành, trên các nhánh bên sẽ mọc ra các nhánh ngắn mang các cơ quan sinh sản đực và cái, được gọi là đế Đế có kích thước khá nhỏ nên khó nhận ra

Ở miền Bắc, rong mơ tập trung nhiều ở Quảng Ninh, Hải Phòng, Thanh Hóa, Nghệ Tĩnh [4], ở miền Trung, rong mơ phân bố nhiều ở Đà Nẵng, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Quy Nhơn, Khánh Hòa, Phan Rang, Phan Thiết và Vũng Tàu [7]

Theo Nguyễn Hữu Đại [7], sản lượng rong mơ các tỉnh ven biển miền trung ước tính 30.000 tấn rong tươi/năm, trong đó quan trọng nhất là Khánh Hòa, Quảng Ngãi, Ninh Thuận, Qui Nhơn, Quảng Nam, Đà Nẵng

Thời điểm rong đạt mức tăng trưởng cực đại phụ thuộc vào điệu kiện sinh sống Ở nơi sóng mạnh, nước nông, rong phát triển sớm, còn ở nơi nước sâu, rong mọc chậm hơn Do đó, thời điểm khai thác sẽ khác nhau

Loài S Mcclurei tập trung ở ven biển các tỉnh miền trung Loài rong này dài

1-2m, có khi đến 4m khi mọc ở sâu Đĩa bám rộng khoảng 1cm, thường mọc liên kết 2-3 đĩa bám chung Đĩa bám có xẻ thùy nhưng không sâu Trục chính hình trụ ngắn khoảng 1cm Nhánh chính nhiều từ 3-5, hình trụ, không có gai, to khoảng 1,5÷ 2mm Các nhánh bên mọc cách nhau 3÷ 7cm, dài 20cm Lá hơi dày và dai chắc hình bầu dục, dài 1÷ 3cm, mép lá có răn cưa Cây có nhiều phao

S mcclurei thích nghi rộng với các dạng vật bám và điều kiện môi trường khác

nhau Chúng có thể mọc lên cao đến vùng triều thấp hay xuống sâu đến 4÷5m tùy điều kiện môi trường và vật bám nhưng thường bị giới hạn bởi dãi san hô và đá mềm ở độ sâu 2÷ 4m Chúng có thể mọc trên vách đá dốc đứng hay bãi san hô bằng phẳng

Chu kỳ sống của S mcclurei là một năm Kể từ lúc rong bắt đầu mọc (tháng

9 đến tháng 1) S mcclurei có xu hướng tăng trưởng chậm về chiều dài, giai đoạn

này tương ứng với việc rong hình thành giai đoạn phát triển trục chính Từ tháng 1 trở đi các nhánh chính của rong phát triển nhanh về chiều dài và đạt kích thước tối

đa vào tháng 4, giai đoạn này tương ứng với thời kỳ rong phát triển nhanh chóng các nhánh thứ cấp Sau khi đạt kích thước tối đa, rong sẽ dần tàn lụi vào các tháng sau đó Do đó để đạt được sản lượng khai thác lớn cũng như bảo tồn được rong, rong nên được khai thác vào cuối tháng 4 đầu tháng 5 [24]

1.1.2 Tổng quan về alginate

1.1.2.1 Cấu trúc của alginate

Alginate là tên gọi chung cho các muối của acid alginic Alginic là một

polyme mạch thẳng được cấu tạo từ 2 gốc monome là β-D-Mannuronic acid (M) và α-L-Guluronic acid (G) liên kết với nhau bằng liên kết 1-4 glycosid Trên phân tử

alginic số lượng M và G không theo tỷ lệ 1/1, tỷ lệ này khác nhau tùy thuộc vào từng loại rong, vị trí địa lý, mùa vụ khai thác và vị trí trên thân rong dùng để tách chiết alginate Tỷ lệ M/G là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tạo gel của alginic

Theo công thức cổ điển Haworth thì cấu tạo của 2 monome chỉ khác nhau ở nhóm cacboxyl nằm trên và dưới mặt phẳng của vòng pyranoza.[14],[62]

vị trí xích đạo

Acid -D- mannuronic Acid -L- guluronic

Hình 1.2: Cấu trúc của β-D-Mannuronic acid (M) và α-L-guluronic acid (G) theo hiện đại

Sự liên kết giữa 2 uronic này không phải ngẫu nhiên mà tạo thành 3 loại block như sau:

Block homopolyguluronic : gồm các gốc acid guluronic nối tiếp với nhau theo dạng GGGG

COOH

COOH HOOC

Block homopolymanuronic: gồm các gốc aicd manuronic liên kết với nhau theo dạng MMMMM

Block luân hợp: (Alternating) gồm các gốc acid guluronic và aicd manuronic liên kết luân phiên với nhau theo dạng MGMGMGMG

G block

M block

MG block

Hình 1.3: Mô hình block GGG; MMM và GMGMGM

Cấu trúc các block cho thấy, chuỗi polyG có dạng nếp gấp còn chuỗi polyM

có dạng phẳng Chính đặc thù này sẽ quy định tính chất khác nhau của chúng khi

kết hợp với các ion đa hóa trị

O COO _

O O

1,03 nm

o

Như vậy, alginate được xem là một copolyme block Độ dài trung bình của

mạch phân tử, độ dài của mỗi chuỗi block, tỷ lệ và trình tự kết hợp của chúng khác nhau theo nguồn gốc của alginate Điều này làm cho alginate có tính chất biến đổi trong một dãi rộng.[45]

Để đặc trưng cho thành phần hóa học của alginate, trước đây người ta chỉ dựa vào tỷ lệ mol của 2 gốc monome cấu tạo nên alginate, tức tỷ lệ M/G nhưng tỷ lệ này chưa đủ để mô tả chi tiết sự phức tạp trong cấu tạo alginate

Bảng 1.1 : Tỷ lệ M/G của một số loại rong nâu trên thế giới [14]

Để đặc trưng sâu xa hơn cho cấu trúc tinh tế của alginate người ta đưa ra các khái niệm về tần suất các khúc đôi (diad) , khúc ba (triad)…Như vậy, alginate sẽ có

4 khúc đôi đó là MM, GG, MG, GM và 8 khúc ba đó là : MMM, MMG, GMM, GMG, GGG, GGM, MGG, MGM Bằng kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân, người ta đã xác định được tần suất của các diad, triad của phân tử alginate [21],[35]

1.1.2.2 Một số tính chất quan trọng của alginate

a Khối lượng phân tử và độ nhớt của dung dịch alginate

Hầu hết các loại alginate thương mại có khối lượng phân tử trung bình trên 150.000 tương ứng với độ polyme hóa dP khoảng 750 Alginate, giống như các polysaccharid khác là một polyme đa phân tán theo khối lượng phân tử của nó Về mặt này, nó giống một polyme tổng hợp hơn là một polyme sinh học như protein hay acid nucleic Do tính chất đa phân tán, khối lượng phân tử của alginate được tính bằng gía trị trung bình của phân bố khối lượng phân tử

Nếu gọi Ni là số phân tử, wi là khối lượng của các phân tử có cùng khối lượng phân tử Mi, thì giá trị trung bình số và giá trị trung bình khối của khối lượng phân tử alginate được tính như sau:

Mn =  NiMi / Ni

Mw= wiMi/ wi = NiMi2/NiMi

Tỷ số Mw / Mn được gọi là chỉ số đa phân tán PI Đối với alginate , chỉ số PI nằm trong khoảng từ 1,4 đến 6 tùy theo loài rong và phương pháp tách chiết Sự phân bố khối lượng phân tử cũng như cấu trúc phân tử có liên quan đến tính chất và ứng dụng của alginate [56]

Các đoạn mạch ngắn giàu mannuronic sẽ không tham gia quá trình tạo gel và

do đó dễ thất thoát ra khỏi hạt gel

Acid alginic không tan trong nước nhưng nó có khả năng hấp thụ một lượng nước rất lớn, trương nở và tạo thành dạng bột nhão Ngược lại, alginate natri và các muối K+, NH4+, (CH2OH)3NH+ của alginate tan trong nước và tạo thành dung dịch

có độ nhớt cao Alginate có khối lượng phân tử trung bình càng lớn thì độ nhớt dung dịch của nó càng lớn Alginate natri với độ nhớt từ 200-400 mPa.s là loại được

sử dụng rộng rãi nhất

Khi còn nằm trong vách tế bào, alginate có độ nhớt rất cao nhưng khi tách

chiết bằng các phương pháp khác nhau, nó bị giảm độ nhớt Độ nhớt là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng của alginate

Dung dịch 1% của alginate thương mại có độ nhớt nằm trong khoảng 2000mPa.s Độ nhớt dung dịch alginate phụ thuộc vào bốn yếu tố chính:

20 Mức độ polyme hóa tăng làm tăng độ nhớt

- Nồng độ tăng thì độ nhớt tăng

- Nhiệt độ tăng thì độ nhớt giảm

- Dung dịch trong nước cứng hoặc có mặt của các chất điện ly sẽ ảnh hưởng đến độ nhớt của alginate.[31]

Bảng 1.2: Sự biến thiên độ nhớt (tính bằng mPa.s) theo nồng độ của

dung dịch alginate natri ở 20 0 C [21],[38]

Nồng độ alginate Loại alginate

Độ nhớt dung dịch alginate phụ thuộc vào nhiệt độ Khi nhiệt độ tăng độ nhớt giảm khoảng 2,5% cho một độ C Khi làm nguội, độ nhớt quay về giá trị thấp hơn ban đầu một ít Tuy nhiên, nếu duy trì nhiệt độ 500C trong nhiều giờ thì sẽ làm alginate cắt mạch và giảm độ nhớt Trái lại, khi hạ nhiệt độ đến khi đông đặc và rã đông thì không làm giảm độ nhớt của alginate

Độ nhớt của alginate khá ổn định trong khoảng pH =5-11 Khi pH thấp hơn 5 thì các ion -COO- bắt đầu bị proton hóa thành –COOH, do đó lực đẩy tĩnh điện giữa các chuỗi bị giảm, chúng trở nên gần nhau hơn và tạo liên kết hidro, làm độ nhớt tăng Khi pH giảm sâu hơn khoảng từ 3 đến 4 sẽ tạo thành gel Nếu alginate có chứa một ít ion Ca2+ thì sự tạo gel xẩy ra sớm hơn, khoảng pH 5 Nếu pH giảm nhanh đến 2 thì kết tủa acid alginnic hình thành Khi pH trên 11, alginate sẽ bị depolyme hóa từ từ và làm giảm độ nhớt Liên kết glycosid rất nhạy cảm với cả acid

và kiềm, do đó dưới các điều kiện thuân tiện cho việc thủy phân, alginate sẽ bị cắt mạch rất nhanh chóng Ngoài ra, tác dụng oxi hóa bởi các gốc tự do cũng làm cho dung dịch alginate bị giảm độ nhớt.[56]

Độ nhớt của alginate còn phụ thuộc vào trọng lượng phân tử, hàm lượng các ion đa hóa trị trong alginate và nguồn gốc của rong

Một vấn đề cần lưu ý là bột alginate natri khô, ở nhiệt độ thường sẽ bị cắt mạch và giảm khối lượng phân tử chỉ sau vài tháng Nếu hạ nhiệt độ và bảo quản nơi tối, sẽ duy trì được lâu hơn Nếu đông sâu có thể bảo quản vài năm mà không

làm giảm đáng kể khối lượng phân tử Ngược lại, acid alginic khô rất kém ổn định ở nhiệt độ thường do nó bị thủy phân dưới tác dụng của sự thủy phân nội phân tử do acid xúc tác

Alginate là một sản phẩm tự nhiên nên nó có thể bị tiêu hóa bởi một số loại

vi sinh vật Enzyme thủy phân alginate ngoại bào được phân lập từ đất, biển, các loài nhuyễn thể có thể cắt mạch liên kết glycosid do phản ứng -elimination

Dung dịch alginate là một dung dịch phi Newton, độ nhớt của nó biến thiên theo tốc độ trượt [39]

Tốc độ trượt càng cao, độ nhớt của nó càng giảm Do đó, khi đo độ nhớt của alginate bằng nhớt kế rotor, cần phải ghi chú tốc độ quay của rotor Thường người

ta đo độ nhớt dung dịch alginate 1% (w/v) ở 200C hoặc 250C với tốc độ quay của rotor là 60 vòng /phút (rpm)

b Tính chất gel của alginate

Khi có mặt của các ion kim loại hóa trị 2, 3 trở lên dung dịch alginate sẽ tạo gel Các gel này được hình thành ở nhiệt độ phòng hay bất cứ nhiệt độ nào cho đến

1000C và chúng không tan chảy khi đun nóng Gel của alginate có rất nhiều ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, đặc biệt là gel canxi alginate Đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự tạo gel của alginate canxi nhưng mô hình được chấp nhận rộng rãi nhất hiện nay là mô hình vĩ trứng (egg-box model) được minh họa trên hình 1.4

Do cấu trúc đặc biệt của đoạn mạch GGG nó tạo thành dạng nếp gấp như một cái vĩ trứng Khoảng không gian tạo thành giữa các vĩ khi xếp lên nhau tương

tự như chổ đặt quả trứng, điểm đặc sắc ở đây là kích thước của khoảng trống này khá phù hợp với kích thước của ion Ca2+ Các ion có kích thước lớn hơn ion Ca2+ sẽ cho liên kết mạnh hơn còn các ion có kích thước nhỏ hơn sẽ không tạo gel theo mô hình này Ái lực của ion đối với alginate theo thứ tự như sau:

Pb2+> Cu2+>Cd2+>Ba2+>Sr2+> Ca2+>Co2+ [12]

Tuy vậy, sự liên kết của ion canxi với các nhóm chức của alginate cụ thể ra sao vẫn còn nhiều bàn cãi Trước đây, người ta cho rằng ion canxi chỉ liên kết với

hai nhóm carboxyl của hai gốc guluronic nằm trên hai đoạn mạch khác nhau nhưng gần đây, một số công trình nghiên cứu sâu hơn cho thấy có sự liên kết phức tạp hơn

với cả các nhóm hydroxyl [ 58]

Một cách tổng quát, mô đun đàn hồi của gel alginate phụ thuộc vào số lượng

và độ bền của các liên kết ngang, vào chiều dài và độ cứng của các chuỗi tham gia liên kết Khi khối lượng phân tử lớn, mô đun đàn hồi không phụ thuộc vào khối lượng phân tử nữa [42,44]

Hình 1 4: Sự tạo gel của alginate theo mô hình vĩ trứng

Khi nghiên cứu gel alginate canxi, người ta nhận thấy mô đun đàn hồi phụ thuộc mạnh mẽ vào thành phần và trình tự sắp xếp của các gốc uronate Alginate có block G nhiều và dài sẽ cho gel bền hơn Mô đun đàn hồi còn phụ thuộc vào loại ion

tạo liên kết ngang, do đó ái lực giữa cation liên kết ngang và polyme càng lớn thì gel càng bền Độ bền gel còn phụ thuộc vào thời gian và các yếu tố của môi trường [51].

1.1.2.3 Tách chiết alginate

Alginate được Standford tách chiết ra lần đầu tiên trên thế giới vào năm 1881

từ rong nâu Laminaria stenophyllum Năm 1927 Thernley thành lập một công ty để

sản xuất alginate cho ngành đồ hộp tại San Diego Hoa Kỳ Vào năm 1929, công ty được tổ chức lại thành Kelco Company Ở Anh, alginate được sản xuất lần đầu bởi công ty Alginate Industries Ltd vào năm 1934 Ở Na Uy alginate được sản xuất sau chiến tranh thế giới thứ hai Đến năm 1981 sản xuất alginate lan sang nhiều nước trên thế giới, tổng cộng có khoảng 17 nhà máy trên 9 quốc gia trên thế giới sản xuất alginate Hai công ty sản xuất alginate lớn nhất thế giới là Kelco Company của Mỹ

và công nghiệp sản xuất alginate ở UK, chiếm 70% sản lượng alginate trên thế giới Công ty lớn tiếp theo là Protan A/S của NaUy, rồi đến các công ty của Pháp, Nhật Bản và Trung Quốc

Việc nghiên cứu tách chiết alginate ở nước ta được thực hiện lần đầu tiên vào năm 1961 dùng để hồ sợi Năm 1966, bộ môn Chế biến trường đại học Thủy sản đã tách chiết alginate từ rong mơ vùng biển Hải Phòng và đã ứng dụng vào việc in hoa trên vải Quy trình sản xuất alginate natri đã được đúc kết trong Hội nghị alginate natri tại Uỷ ban Khoa Học Kỹ thuật Nhà Nước tháng 11 năm 1981[2]

Trong báo cáo này, quy trình sản xuất với các thông số kỹ thuật cũng như định mức tiêu hao nguyên vật liệu đã được đúc kết Sau đó, vào năm 1982, Trần Văn Ân trong luận án phó tiến sĩ đã đẩy việc nghiên cứu sâu hơn trong việc cải tiến quy trình tách chiết alginate Gần đây tác giả Ngô Đăng Nghĩa nghiên cứu tối ưu

hóa công đoạn tách chiết alginate từ rong nâu S Kjellmanianum và S mcclurei ở

vùng biển Hòn Chồng-Nha Trang với phương pháp acid hóa và xử lý bằng formol

Đối với rong mơ S mcclurei có nguồn gốc Hòn Chồng - Nha Trang thì tác giả sử

dụng chế độ nấu chiết như sau: nồng độ Na2CO3 1,54-1,68 %; tỷ lệ dung dịch 20 lần rong khô, nhiệt độ nấu chiết 55-600C, thời gian nấu chiết 1,15-2,2giờ Tác giả Trần Thị Luyến và cộng sự cũng đã nghiên cứu tách chiết alginate cho hai loài rong

S Kjellmanianum và S mcclurei ở vùng biển Hòn Chồng- Nha Trang theo quy

trình canxi hóa Xử lý bằng CaCl2 0,1%, nhiệt độ 450C, thời gian xử lý 1giờ, tỷ lệ dịch CaCl2 so với rong là 24/1, sau đó nấu chiết và xử lý tẩy trắng.[14]

Nguyên tắc để tách chiết alginate: Alginate tồn tại trong rong nâu phần lớn dưới dạng muối của ion hóa trị hai không hòa tan như Ca2+, Mg2+ Cần phải xử lý acid để chuyển alginate sang dạng acid alginic Sau đó nấu chiết trong dung dịch kiềm Na2CO3, acid alginic sẽ trao đổi ion và trở thành dạng alginate natri hòa tan vào dung dịch Sau đó lọc sạch cặn bã rong không tan, ta sẽ thu được phần dịch chứa alginate natri Vấn đề tách alginate ra khỏi dịch nấu chiết dẫn đến 2 quy trình khác nhau:

Một quy trình tách alginate ở dạng muối alginate canxi không tan và tách ra khỏi nước, sau đó muối alginate canxi được chuyển về dạng acid alginic

Một quy trình tách alginate ở dạng gel acid alginic kết tủa Hai quy trình chỉ khác nhau căn bản có một khâu canxi hóa Sở dĩ người ta dùng thêm khâu canxi hóa

là vì alginate canxi dễ ép tách nước hơn acid alginic

Rong nâu

Xử lý sơ bộ

Rửa

Nấu chiết trong kiềm

Dịch chiết alginate natri

Pha loãng

Lọc thô

Lọc tinh

Hình 1.5 : Sơ đồ quy trình chung để sản xuất alginate [21]

A Quy trình canxi hóa

1 2 TỔNG QUAN VỀ NUÔI CẤY MÔ

1.2.1 Lịch sử nuôi cấy mô

Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức là Schleiden và Schwann đã đề xướng thuyết tế bào Học thuyết này là nền tảng cho công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, từ đây mở ra 4 giai đoạn phát triển của ngành

Giai đoạn 1: Nuôi cấy tế bào cây đơn tử diệp Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm Haberlandt gặp thất bại trong nuôi cấy mô các tế bào đã phân hóa từ lá một số cây một lá mầm

Năm 1922, Kott người Mỹ, học trò của Haberlandt và Robbins, đã lặp lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo Trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng khá mạnh tạo nên một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ

Giai đoạn 2: Sự phát hiện vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật, vitamin, nước dừa Năm 1934, White đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài rễ

cà chua trong một môi trường lỏng chứa muối khoáng, glu cose và nước chiết nấm men Sau đó, White đề nghị thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp ba loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6) và Nicotiamin (B9) Cùng lúc Went và Thimann phát hiện ra IAA và kết tinh được chất này Năm 1941, Overbeck ở Mỹ chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi họ cà Sau thế chiến thứ hai, việc tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng thực vật đã được tiến hành thành công đối với NAA và 2,4D Năm 1954, Skoog ở Mỹ đã tình cờ phát hiện được một chất là sản phẩm của sự phân giải ADN, có khả năng kích thích sự tăng trưởng ở thực vật đó là kinetin và sau này người ta gọi các chất có hoạt tính tương tự kinetin là nhóm cytokinin do tác dụng kích thích phân chia tế bào của chúng

Giai đoạn 3: Tái sinh, nuôi cấy hạt phấn, nuôi cấy tế bào đơn, protoplast, vi nhân giống từ đỉnh sinh trưởng, chồi nách,.v.v Skoog và Miller đã chứng minh được ảnh hưởng của tỉ lệ auxin/ kinetin trong việc hình thành cơ quan mô sẹo của thuốc lá

Năm 1960, Cooking người Anh đã công bố việc dùng men cellulase để phân

hủy vỏ cellulose của tế bào thực vật và thu được tế bào không màng bọc gọi là tế bào trần (protoplast) Thành tựu này đã góp phần rất lớn trong công tác di truyền chọn giống thực vật thông qua kỹ thuật dung hợp protoplast Cũng vào năm 1960, Morel người Pháp đã thành công trong việc lai tạo các protocorm khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng của loài địa Lan Việc nuôi cấy thành công đỉnh sinh trưởng ở thực vật còn dẫn đến việc tạo cây sạch virus đặc biệt có giá trị đối với cây ăn quả, dâu tây, khoai tây,v.v

Hiện nay chúng ta đang ở giai đoạn 4 của nuôi cấy mô thực vật - giai đoạn ứng dụng nuôi cấy mô thực vật trong thực tiễn chọn giống, sản xuất cây giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vào việc nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao [20],[22],[29]

1.2.2 Các điều kiện nuôi cấy mô thực vật

1.2.2.1 Điều kiện vật lý

a Cường độ ánh sáng

Sự phân phối của ánh sáng, quang kì và hướng chiếu sáng cũng đóng vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng của thực vật nuôi cấy mô Hiện nay ánh sáng trắng (phổ ánh sáng 400-700nm) do đèn huỳnh quang được sử dụng phổ biến trong các phòng nuôi cấy mô Cường độ sáng thường dùng từ 2500lux - 3000 lux (tương đương 5w/m2 - 25 w/m2) Quang kỳ thay đổi tùy loài, nhưng phần lớn các phòng nuôi có quang kỳ 16-18giờ sáng/ngày

b Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển cây nuôi cấy in vitro Nhiệt độ phòng nuôi phải ổn định thường từ 23-250C Tuy nhiên tùy đối tượng nuôi mà điều chỉnh nhiệt độ phù hợp

c Độ ẩm :độ ẩm không khí tốt nhất khoảng 70%.[19]

d pH của môi trường

pH của đa số môi trường được điều chỉnh trong phạm vi 5,8-6,0 Trong quá trình nuôi cấy pH môi trường có thể giảm xuống do một số mẫu thực vật sản sinh ra acid hữu cơ

1.2.2.2 Môi trường nuôi cấy mô thực vật

Môi trường nuôi cấy là nhân tố quan trọng nhất để xác định sự thành công hay thất bại trong nuôi cấy mô Có hơn 50 công thức môi trường khác nhau sử dụng cho nuôi cấy in vitro nhiều loại cây (Gamborg và cộng sự, 1976; Huang và Murashige, 1977) Trong đó môi trường MS được sử dụng phổ biến nhất, đặc biệt là trong tái sinh cây Môi trường B5 (Gamborg và cộng sự, 1986), N6 (Chu, 1978),

NN (Nisch và Nitsch (1969) và các dẫn xuất từ các môi trường này có thể sử dụng rộng hơn cho nhiều loại cây.[15]

Nuôi cấy trong điều kiện thí nghiệm yêu cầu dinh dưỡng tương tự như trồng

ở đất, thành phần cơ bản của bất kỳ môi trường nuôi cấy nào cũng bao gồm các thành phần sau: các nguyên tố khoáng đa lượng và vi lượng, vitamin, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, cacbonhydrate và các chất hữu cơ tùy chọn khác

b Muối khoáng đa lượng

Là những chất cần cung cấp với số lượng lớn cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Nhu cầu về muối khoáng đa lượng của cây nuôi cấy mô không có

sự khác biệt đáng kể so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên Các nguyên tố cần phải cung cấp là: Nitơ, Photpho, Kali, Canxi, Magiê và Sắt

Chức năng sinh học của chúng như sau:

- Nitơ: là thành phần của protein, acid nucleic và một số coenzyme Đòi hỏi

số lượng lớn nhất

- Kali: điều hòa tính thấm tế bào, là cation ngoại lai chủ yếu

- Canxi: tổng hợp thành tế bào, tham gia vào ch ức năng màng, nhận biết tế bào

- Magiê: tiền tố enzym, tham gia vào thành phần của diệp lục

- Sắt: tham gia vận chuyển electron như một thành phần của cytochrom Các nguyên tố này có thể được cung cấp dưới nhiều dạng khác nhau như:

- Kali: KNO3; KC2; KH2PO4

c Muối khoáng vi lượng:

Số lượng những thành phần này chỉ đòi hỏi dưới dạng vết cho sự sinh trưởng

và phát triển của thực vật mà thôi, chúng có vai trò đa dạng và biến đổi Chúng gồm: Mangan, Iod, Đồng, Coban, Bo, Molipden và kẽm,.v.v đôi khi có cả Nhôm

và Niken Các công trình nghiên cứu về muối khoáng vi lượng của mô thực vật trong nuôi cấy mô còn rất hạn chế Nhưng để bảo đảm cho sự phát triển của cây in vitro, người ta cung cấp hầu hết các nguyên tố vi lượng cho cây và sự cung cấp này chỉ mang tính chất kinh nghiệm Do đó có thể trong một số trường hợp, đối với một

số đối tượng nuôi cấy việc bổ sung một vài nguyên tố khoáng vi lượng là không cần thiết

d Vitamin và amino acid

trường vì lí do lịch sử

 Amino acid

Thường có mặt trong các hợp chất hữu cơ cung cấp trong môi trường nuôi cấy mô Nó cung cấp nguồn Nitơ cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Glycine được sử dụng nhiều nhất tuy nhiên các amino acid khác như: arginin, asparagin, aspactic acid, alan in, glutamine, glutamic acid v à prolin,… cũng rất cần thiết

e Các chất điều hòa sinh trưởng

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là thành phần then chốt trong môi trường quyết định hướng phát triển của tế bào thực vật Chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng phổ biến nhất là các hoocmon thực vật và các chất tổng hợp tương tự Ngày nay, đã có nhiều chất điều hòa sinh trưởng tự nhiên được xác định, cũng như các chất nhân tạo được tổng hợp bằng con đường hóa học Tùy thuộc vào mục đích

và đối tượng nuôi cấy mà người ta bổ sung vào môi trường chất điều hòa sinh trưởng thích hợp Có 5 nhóm chính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid và ethylene Auxin đẩy mạnh quá trình phân chia và phát triển tế bào Cytokinin kích thích phân chia tế bào Gibberellin điều hòa

sự kéo dài tế bào, quyết định chiều cao cây và lượng trái đậu Abscisic acid ức chế phân chia tế bào Ethylen điều hòa sự chín của trái Trong đó auxin và cytokinin được sử dụng rộng rãi nhất và thường được dùng kết hợp với nhau Tỉ lệ auxin/cytokinin quyết định kiểu nuôi cấy Tỉ lệ auxin/cytokinin cao thiên về hình thành rễ, thấp kích thích tạo chồi, trung gian thiên về tạo mô sẹo

Các chất thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là:

- Thidiazuron: 1-phenyl-3-metyl-trans-2-butenylamino purine

f Các chất bổ sung

- Thạch agar: đây là thành phần quyết định tình trạng vật lý của môi trường,

là nguyên liệu phổ biến nhất để pha môi trường bán đặc hay môi trường đặc Hàm lượng agar dùng trong nuôi cấy mô thường dao động từ 0,6-1% theo khối lượng Ngoài agar người ta còn sử dụng các chất làm đặc khác (tuy không thường xuyên) như: gelatin, alginate, carrageenan và gelrite

- Than hoạt tính: than hoạt tính thường được bổ sung vào môi trường ở các giai đoạn nuôi cấy khác nhau Nó không phải là chất điều hòa sinh trưởng nhưng lại

có khả năng làm thay đổi môi trường Than hoạt tính có khả năng hấp thu nhiều chất khác nhau, có thể là các chất được tạo ra trong quá trình hấp khử trùng môi trường, có thể là các chất do mô cấy tạo ra hay là các chất điều hòa sinh trưởng có trong môi trường Những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng than hoạt tính còn ngăn cản sự phát triển của những mô sẹo không mong muốn, kích thích sự tạo hình, tăng hiệu suất phát sinh phôi

- Nước dừa: nước dừa thuộc nhóm chất không xác định bởi vì thành phần hóa học của nó rất phức tạp.[15],[23],[29]

1.2 3 Kỹ thuật vi nhân giống (micropropagation)

Các giai đoạn của quá trình vi nhân giống:

+ Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây mẹ Cây mẹ phải sạch bệnh và tốt nhất là chọn cây trong nhà kính hoặc cây trong phòng tăng trưởng Cây mẹ phải được chăm sóc chu đáo, đúng quy cách

+ Giai đoạn 2: Khử trùng mẫu cấy Mục tiêu là thu được mẫu cấy vô trùng

mà vẫn còn khả năng tăng trưởng Khử trùng mẫu cấy bao gồm rửa mẫu và tiếp theo là khử trùng mẫu cấy Mẫu sau khi khử trùng được đặt vào môi trường khoáng

có bổ sung vitamin, đường, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật thích hợp nhất với sự tăng trưởng của mẫu cấy và loài thực vật

+ Giai đoạn 3: Giai đoạn tăng sinh mô Mục đích chính của giai đoạn này là tăng sinh nhanh mô Tùy theo mục đích ta chọn môi trường thích hợp để:

- Tạo phôi soma

- Tăng cường sự phát triển chồi bên

- Tăng cường phát triển chồi bất định

+ Giai đoạn 4: Ra rễ in vitro: chồi được tách thành từng đơn vị riêng rẽ và cho vào môi trường thích hợp tạo rễ để trở thành cây con hoàn chỉnh

+ Giai đoạn 5: Thuần hoá ở vườn ươm: tạo điều kiện cho cây con in vitro từng bước thích nghi với điều kiện bên ngoài tự nhiên [23],[26]

Hình 1.6 : Các giai đoạn của quá trình vi nhân giống

1.3 TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về giá thể thay thế giá thể agar trong nuôi cấy mô thực vật, chưa có công trình nghiên cứu nào về sử dụng gel alginate làm giá thể nuôi cấy mô

Năm 2006 Th.S Lương Mỹ Ngân (Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học

tự nhiên TP Hồ Chí Minh) thử nghiệm thành công việc sử dụng môi trường thạch dừa làm giá thể nuôi cấy mô một số loài thực vật như: hoa lan, dứa, thuốc lá

Trên giá thể agar kỹ thuật nuôi cấy mô ở nước ta cũng đạt được kết quả rất tốt trong việc nhân giống khoai tây, giống hoa và một số giống cây trồng khác

Ở Lâm Đồng, đã được ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống khoai tây, dâu tây, hoa lan, lyly, cây lô hội.v.v…[59]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

- Mbanaso EN Adaoha và Roscoe DH (1982) đã có công bố dùng alginate làm giá thể gel của môi trường đặc dùng trong nuôi cấy tế bào trần [43]; Kurt Ingar Draget, Kjetill Ostgaard, and Olav Smidsrod (1989) đã nghiên cứu dùng alginate

làm giá thể gel trong nuôi cấy mô bắp cải Brassica napus kết quả cho thấy tính

tương thích sinh học cao của hệ gel alginate và nó có thể thay thế agar trong nuôi cấy mô.[40]

- Năm 2001, Endale Gebre and B N Sathyanarayana nghiên cứu dùng Tapioca (được chiết từ tinh bột củ sắn Manihot esculenta Cratz) với lượng 9-18% (w/v) và sago (được trích từ lõi thân của cây Metroxylon sagu Rottb) với lượng 10-14%(w/v) thay cho agar trong vi nhân giống khoai tây (Solanum tuberosum L.) từ nốt đơn thân trên môi trường MS bổ sung 3% sucrose, 0,03 mg/l NAA, 0,25 mg/l GA3 and 2,5 mg/l Ca-panthothnate Sau 32 ngày nuôi cấy kết quả cho thấy số lượng chồi và chiều cao chồi hình thành từ mô cấy trên giá thể Tapioca và sago cao hơn với chồi trên giá thể agar Giá thể Tapioca và sago cũng rẻ hơn so với agar Kết quả

nghiên cứu cho thấy có thể dùng tapioca và sago thay cho agar trong vi nhân giống khoai tây.[34]

- Năm 2004, Ruchi Jain và Shashi B Babbra nghiên cứu dùng Guar gum (trích từ nội nhũ của Cyamopsis tetragonoloba) và isubgol (từ vỏ trấu của hạt

Plantago ovata ) thay agar trong nhân giống hoa lan, Dendrobium chrysotoxum từ lá

và protocorm Môi trường nuôi cấy là môi trường Mitra bổ sung 2% sucrose, 1 g /lpeptone và được làm đặc với 0,9% agar hoặc 3% guar gum hoặc 3% isubgol Môi trường dùng cấy mô lá chứa 1 mg/l BA Kết quả nghiên cứu cho thấy cả 2 giá thể mới này cho hệ số nhân chồi cao gấp 2-3 lần so với cấy trên giá thể agar và giá thành của 2 giá thể mới này cũng rẻ hơn agar nên nó được dùng để thay agar trong nhân giống

Dendrobium chrysotoxum [52]

- Năm 2005, Radjiskumar Mohan; Eduardo Assami Chui; Luis Antonio Biasi; Carlos Ricardo Soccol nghiên cứu dùng bã mía thay cho agar dùng trong

công đoạn ra rễ của nhân giống dâu tây cv Dover trên môi trường MS/2 bổ sung

3% sucrose và 0,05 mg/l BA Kết quả cho thấy số lượng rễ, chiều dài rễ của cây con sau 10, 20, 30 và 40 ngày nuôi cấy trên giá thể bã mía tốt hơn so với agar và khi thuần hóa vườn ươm 100% cây sống, cao hơn so với 83% cây sống khi ra rễ trên giá thể agar và chi phí giá thể bã mía cũng rẻ hơn so với agar.[53]

- Agarose có khả năng tạo gel tốt, trong suốt Tuy nhiên nó đắt tiền và nó không thể sử dụng lặp lại nhiều lần trong nuôi cấy

- Carrageenan có khả năng tạo gel khi có mặt của những ion xác định nó cũng được nghiên cứu để thay thế cho agar

- Năm 1988 Henderson, W.E và Kinersley A.M nghiên cứu dùng tinh bột bắp làm tác nhân tạo gel thay thế agar trong nuôi cấy mô thực vật.[53]

- Năm 2004, Moses F.A Malirol và Grace Lameck nghiên cứu dùng tinh bột sắn làm tác nhân thay thế agar làm giá thể môi trường nuôi cấy mô thực vật Tuy nhiên, vì tính chất gel kém, gel đục hơn so với agar và đặc tính của nó có thể thay đổi trong quá trình nuôi cấy, dẫn đến làm mềm môi trường nuôi cấy Hơn nữa, trong

hấp vô trùng tinh bột có thể bị đường hóa, ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy, thẩm thấu và trao đổi chất nên nó không được chấp nhận trong nuôi cấy mô.[46]

- Năm 2005, N Lucyszyn, M Ouirin, A Anjos và M R Siera Kowski

nghiên cứu dùng Guar galactomannan chiết xuất từ hạt của Cymopsis

tetragonolobus và Cassia galactomannan chiết từ hạt của cây Cassia fastuosa trộn

với agar theo tỷ lệ 3/3 g/l(w/w) và được dùng làm giá thể gel thay agar trong nhân giống táo Marubakaido Kết quả cho thấy giá thể hỗn hợp này thúc đẩy tốc độ nhân chồi và làm giảm hiện tượng tinh thể hóa trong nhân giống so với giá thể gel agar chuẩn và giá thành của hỗn hợp gel này cũng rẻ hơn so với agar.[47]

1.4 TỔNG QUAN VỀ CÂY DÂU TÂY

1.4.1 Sinh trưởng và phát triển của cây dâu tây

1.4.1.1 Nguồn gốc, vị trí phân loại của cây dâu tây

Dâu tây là một chi thuộc họ Rosaceae giống Fragaria Có 4 nhóm cơ bản trong Fragaria do sự kết hợp các nhiễm sắc thể đơn bội hoặc là do số lượng nhiễm

Loài F vesca có 14 NST và được coi là thể lưỡng bội, loài F x ananassa là

loài quan trọng nhất với thể bát bội với 56 nst Việc lai tạo những giống đơn bội rất khó nhưng việc lai tạo dễ thành công hơn khi lai hai loài có cùng mức độ bội thể

như nhau Trong thực tế, giống F x ananassa được lai tạo bởi 2 loại mới trên thế giới là F chiloensis (L) Duch và F virginiana Duch.[60]

Những loài dâu tây được phân loại bởi Staudt (1989,1999) và Yuetal (1985)

được phân bố theo sự phân vùng địa lý Ở châu Âu và Mỹ loài Fragaria đã được phân loại rất kỹ, những loài ở châu Á không được phân loại rõ ràng Loài Fragaria

vesca là loại phân bố rộng nhất bao gồm ở châu Âu, châu Á và châu Mỹ Những

loài còn lại phân bố hạn chế theo vùng sinh thái địa lý như ở các vùng châu Âu- Siberia, Bắc Trung Quốc và Manchuria, nam Trung Quốc, Nhật Bản và châu Mỹ [37]

1.4.1.2 Đặc tính sinh học của dâu tây

Dâu tây là cây thân thảo lâu niên có một thân chính hay đỉnh sinh trưởng, từ

đó sẽ mọc lên lá, rễ, ngó (cây con) và những chồi hoa

Đỉnh sinh trưởng là một chồi ở trung tâm và các lớp mạch bao xung quanh Đỉnh sinh trưởng bao gồm một lõi chính và được bao phủ bằng những lớp mỏng vòng lên phía trên nó Phía cùng của mỗi nách lá là những chồi bất định có thể tạo thành cây con, đỉnh sinh trưởng mới hay ở dạng chồi ngủ tùy thuộc vào điều kiện môi trường

a Lá

Lá của dâu tây được sắp xếp theo hình xoắn trôn ốc, lá thứ 6 lại có phương trùng với lá đầu tiên Lá dâu thông thường có hình lông chim với 3 lá chét, chúng có lớp biểu bì bao quanh và những lớp thịt lá đặc thù của cây 2 lá mầm

Lá hầu hết của tất cả các giống chỉ sống được vài tháng rồi rụng Vào mùa lạnh giá cây dâu vẫn tồn tại nhưng hầu như chúng không có lá, duy chỉ có loài

L chilogensis vẫn còn một vài lá và cây được thay lá trong mùa xuân

b Rễ

Rễ cơ bản được phát sinh từ đỉnh sinh trưởng và sau đó được mọc trực tiếp xuống đất Phẫu hình của rễ thuộc dạng mầm (hai lá mầm) Những rễ mọc thêm cũng mọc ra xung quanh từ đỉnh sinh trưởng Những rễ nhánh thường dài từ 2-5cm

và nếu được cung cấp nước đầy đủ chúng sẽ chuyển sang dạng bó sợi

Thông thường cây dâu có từ 20-30 rễ chính và hàng trăm thứ rễ thứ cấp ( cấp

2, cấp 3 và cấp cao hơn) Có từ 50 -90% rễ tập trung ở độ sâu từ 10-15cm trong đất

Rễ bên (rễ thứ cấp) sống được từ 1-2 năm, rễ chính có thể sống được từ 2-3 năm phụ thuộc vào chủng loại và điều kiện môi trường Rễ dâu thường bị các loài nấm tấn công để làm nơi phát triển và sinh sản

c Ngó ( cây con)

Hầu hết các giống dâu tây thường tạo thành cây con ở dạng ngó (stolon) bao

gồm 2 đốt Những cây con được tạo thành ở đốt thứ 2 Mắt đốt thứ nhất ở dạng ngủ

nghỉ hoặc hình thành một nhánh tạo thành cây một con khác

Mỗi cây con dạng ngó có thể sản sinh ra cây ngó tiếp theo Giống

F ananassa thường tạo ra 10 -15 cây ngó, cây của loài F virginiana có thể sản sinh

gấp 2-3 lần số lượng trên Ngó của loài F ananassa sống được trong vòng một

năm, nhưng của loài F chiloensis có thể sống được vài năm

Cây mẹ có thể chuyển nước, chất dinh dưỡng và các chất đồng hóa đến cho

cây con trong vài tuần đầu hay có thể đến 1 năm tùy thuộc vào loài và kiểu gen của

chúng Rễ của cây con có thể tự hút nước và dinh dưỡng sau 2-3 tuần

d Hoa

Kiểu phát hoa của dâu tây là một cụm được giới hạn trên một chồi phát hoa

nguyên thủy Từ chồi phát hoa nguyên thủy có 2 bông thuộc thế hệ thứ 2, có 4 bông

thuộc thế hệ thứ 3 và 8 bông thuộc thế hệ thứ 4 Một bông có 10 đài hoa, 5 cánh hoa

và 20-30 nhị hoa đực và từ 60-600 nhụy hoa cái Số lượng nhụy hoa lớn nhất tìm

thấy ở hoa đầu tiên, sau đó giảm dần theo từng thế hệ của bông

Sự thụ phấn của dâu tây phụ thuộc vào côn trùng, thông thường do loài ong

thụ phấn Phấn hoa đã thành thục trước khi bao phấn nở và không phát tán ra ngoài

trước khi hoa nở Hạt phấn có thể sống được từ 2-3 ngày và núm nhụy có thể tiếp

nhận phấn hiệu quả trong vòng 8-10 ngày Sự thụ phấn xẩy ra sau 24-48 giờ tính từ

lúc nhụy tiếp nhận hạt phấn

e Quả

Trái dâu là trái tập hợp, bởi vì trên một noãn bao gồm nhiều bầu nhụy Các

hạt tạo thành có thể được gọi là trái thật của dâu Phôi của dâu chứa 2 lá mầm hình

½ elip, bên trong chứa protein và chất béo, không chứa tinh bột, phía chính giữa là

lõi Sau khi 2 lớp vỏ được tách ra bởi các bó mạch thì hạt yêu cầu chất dinh dưỡng

để phôi phát triển [37]

1.4.2 Các phương pháp nhân giống dâu tây tại Đà Lạt

1.4.2.1 Phương pháp truyền thống

Dâu tây được trồng ở Đà Lạt từ rất lâu khi con người đến vùng đất này để sinh sống và khai phá Loại dâu thường được trồng là giống dâu cũ mà người dân quen gọi là “dâu ta” Hầu hết là các cây dâu thường sinh cây con ở dạng ngó nên người dân Đà Lạt thường sử dụng phương pháp nhân giống bằng cách tách những cây con hoặc những cây ngó sinh ra từ cây mẹ ban đầu để làm cây giống cho thế hệ nhân giống tiếp theo Phương pháp này vẫn còn được sử dụng cho đến ngày nay

1 4.2.2 Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô

Khi có kỹ thuật nuôi cấy mô, bắt đầu là cây khoai tây, người nông dân đã thấy hiệu quả khi sử dụng cây khoai tây bằng cấy mô đã mang lại hiệu quả kinh tế như thế nào nên họ bắt đầu chú ý đến những cây giống khác thông qua phương pháp này Nuôi cấy mô dâu tây thường được các cơ sở cấy mô và các trung tâm nghiên cứu đóng trên địa bàn Đà Lạt cung cấp giống Qua nuôi cấy bằng đỉnh sinh trưởng người ta đã tạo ra hàng loạt các cây giống đồng đều và có được những giống phù hợp với vùng đất cũng như điều kiện sản xuất

Phương pháp nhân giống cổ truyền thường được người dân sử dụng do rất dễ thực hiện lại không tốn kém và không mất nhiều thời gian Tuy nhiên nhân giống bằng phương pháp này không tạo ra được giống với số lượng lớn, chất lượng lại không đồng đều và việc nhân giống này có thể làm giảm năng suất ở những thế hệ tiếp theo Với một số giống mà đặc tính sinh cây con bằng ngó hạn chế thì việc nhân giống theo phương pháp cổ truyền không đạt hiệu quả

Nhân giống bằng phương pháp cấy mô đòi hỏi phải có cơ sở thực hiện, phải

có kỹ thuật chuyên môn và cần phải có một thời gian nhất định Tuy nhiên ưu điểm của phương pháp này là có được số lượng cây giống lớn, chất lượng đồng đều, và

có thể nhân giống được một số giống dâu mà khả năng sản sinh cây ngó của giống hạn chế Hơn nữa việc nhân giống bằng cấy mô tạo ra cây con sạch bệnh và đáp ứng được nhu cầu về cây giống của người nông dân [18]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Alginate

Alginate được tách chiết từ rong mơ S mcclurei thu ở vùng biển Hòn Chồng

theo quy trình acid hóa như sau:

Hình 2.1 Quy trình sản xuất alginate từ rong mơ S mcclurei

2.1.2 Các hóa chất dùng trong tạo gel alginate

- GDL (glucono-δ-lactone) dạng bột của hãng Sigma

GDL là một chất acid hóa Nó là este dạng vòng của D-gluconic acid Khi cho vào nước nó dễ dàng hình thành dạng cân bằng của hỗn hợp lactone GDL và acid gluconic Nó có công thức hóa học C6H10O6 Trọng lượng phân tử 178,14 g/mol GDL tinh khiết dạng bột màu trắng, không mùi

Gluconolactone Gluconic acid

Hình 2.2 Công thức cấu tạo của GDL và gluconic acid

- CaCO3 dạng bột trắng của Trung Quốc