Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh

Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh.

41024 - GN Gt- bpp (36

HƯỚNG TRÌNH nồng NGHỆ STNH HOC

Misi: 52 D (CƠ QUAN GEỂ mĩ : BỘ ĐH VÀ THƠN)

WHUNG NGUOT THAM GIA ĐỀ-TẢI

prs TỪ MINH KOỐNG Đại Học Dược khoa

DS, NGUYÊN THỊXUNG — Đệi Học Dược khoa pts cag yan THU Đại học lược khoa

bs NGUYỀN QUỐC ÔƯỜNG XÝ nghiệp Hoá Dượo

ps PHM VĂN QUYỂN XÍ nghiệp Hoa Deyo

DSOKI DUONG YAN ĐẠT Pad pqo Dược khoa KTV NGUYÊN ext PRƯỞNG Tan

MỤG LỤ0

»

PHẦN ERYTHROMYCIN - Đặt vấn đề

I1 ~¬ Tổng quan tư liệu

It ~ Phương pháp nghiên cứu

TIT - Kẽt qua

IV - Kêt luận,

PRIN 6 APA - Đặt vấn đề

1 - Tổng quan tư liệu,

ÓC ~ Phương pháp nghiên cửu

III ~Kết quả

IV = Kết luận, PHAN TAT LIỆU THAM KHẢO :

it ~ Phần Erythromycin |

TI = Phin 6 APA

'

© O79 ‹

Chi ¥ - Tatlagu nay sik dyng danh phgp *"~so qu$ định ga

Bộ Y Tế,

Mồi năm hằng nghìn tần Srythronycin dược sáu xuất audi

cấc dạng mudi stearat, estolat, propionat Theo số liệu

cuá UduP năm 1976 ; dhệt sốn xuât 120//năm với doanh sÐ-

3 tỷ yên Sản lượng trên toàn thế giới ước tính 30001/kxm;

Phổ biển - ` ở Việt dam bzrythronycin được sử dung ` diều

trị các bận nhiễ kmh Š mọi lứa tuổi, nhất 1h với trở

em va 18 khang sinh còn thạy “chm cao vi, it khang thuốc

với nhiều loại khuân gây bệnh, ,

Hằng năm ta nhập khoảng % tấn, trong dó ;ao” dưới dạng ngl

và 10Tduới dạng thành phẩm, viện,cấc loại „ Tuy nhà cầu 1à

cấp bách nhưng công nghệ sản xuất Erythromyain phức tgp hơn các kháng ginh khác và còa xất mới với nước ta, wee -

trước khi nhộp công nghệ này phẩi khảo sắt những diều kiện

È trong nước và nhất là cđhu§n bả đổi ngũ cẩa bộ cổ kiển thức

và kinh nghiện đồi với qd trình lên nen nay « vo do chứng

tôi da được đương trình Gong nghệ sinh hac cho phấp sxriền

khơi đề thi nghiên cứu "Sinh - tổng hợp kháng minh

Erytronycin va tạo 6-4PA đìo kháng sinh bán téng hyp"

Myo tiêu cuổ đề tài về phần Hzyteomycin 1 3

4 - Suu tgp chgn lac chingenyt tf{oh sinh tng hợp

‘2 ~ kde 1ép quy trình lên men teyytironyc1a & phous

thí nghiện về trên thiết bị 20 - 100°

3 ~ Khao sáb phương pháp điết va tinh chế fryt£eomyciu

mam tr o£ EL MOM | 2/4 BGM AUGY Leg Jose Na 1724

Wasinan tách riêng được 3 ch&t : Erythromycin 4, B va OC

£47 đều thuộc nhốn những kháng sinh Macrolia và được phần

loạt theo sé carbon trong phân tử

Macrolid gồm 3 nhóm kháng sinh /(5 7 với 94 chết ;

vi dy:

- 12 ngyén tu © (Methymycin, Neomethymycin , YU 17)

- 44 " C (Pikromycins O#andomycin, Rrytromycins

Lankamycin, Kuj dicin a9? ò

= 16 " G (Carbomycin, Spiramycin, chalcomycin,

leucomycia .)

Theo Koyana £67 vai tro cudgmagrolia là giải dộc

các dường bất thường trong sinh vật ¡ nhóm 12 6 gin mot dung;

14 0 gấn 2 đường; 16 C gắn môt disaccarid „ tên Macrolid Là

do We@odwo#tuề nghị năm 1957 C1 cette et ⁄

rong các, Hiacrolid trên dây, Eyytromycin được av dựng

và sẵn xuất phổ biến nhất; sau đô là &§piranycin, 1eucomycin

và Gleandonycin Gần đây Tylosin (cling ao Me Guire tầm

ra 1961) cung được chí ¥ , Macrolia mới nhất do Arnoux

tim za năn 1980 (87 là chất 23672 RP cud hãng Bhéne ~

Poulenc

Cấu trúc phân tự cuả Rrylromycin đã được nhiều tác

gid kh sat £9, 10, 115 125 135 147 gồm Z phần :

aglycon va duong Phin aglycon 14 m§t Erytronolia;

đường gồm t loại cố amin (desosemin) va không cổ anin

(cladinose với Erythromycin A wa I, Mycarose vol

Bryteomycin B)

Brytronolid 18 do nhdm carboxy cua proprionat cung cfps

Thực tế khung cơ Bán cud Brytromycin da duge chimg minh

là tập hợp đổ nhiều phân tỬ propionat (cde ggch dgm trong

Việc sửo ung tỉ ồầm chất có mạch propionat trong sinh

t8ng hap Erytromycin chính lầ xuất phát từ sự phát hiện cấu

trúc trên đây và dã đem lại lợi ích lớn cho sẩn xuất

iam 1967, Mawtin và Rosenbrook để dùng 1 chung sth

©@rythreus đột biến ØñU 153 ; và Tardrew, áyman (1964) dìng

chủng đột biển 9 BI 262 tạo m được chất trung gian 6=oesoxy erytronolid B va chuyển được thành krytronolidg 8 khi lổn men (716, 17-7 » Đồng thời chứng minh ring Erytromycin B

va ca G đều cé th§ chuyén thanh HErytromycin Anh? ching

@U 153 (không sẵn xuất ra urytromycin) whimg at xiện

trên đã dh o“phep dự -kit con đường minh tổng hợp brytranycin

Con, dường sinh tông hợp _Ezr&eouyckp

trong St, erythreus ewe

3-0- Mycaranyl_É USL, 3 ytron ycin je 0t G

erytronolid 8B Coy CH „V7 wits aan LHs7 J (65-0 )

- 6 =

fuy nhiên cơ chế này chưa dược nhật trf :

frong sơ đồ trên đây, hình như prytronelid 4 không phai

là chất quan 2rọng “ai với sinh tông hợp các Rzytlronycin

vì khi đụng một chung đột biến khác ATCG 31772 , Spagnali

£19.7 gần đây 193) dã chứng minh ring Srytronolia 4 1à trung gian chủ yếu trong sinh ting hợp, Erytromycin 4 ; B ;

G Lhmo những phat hiện trên đây vồần Lầ nguyên nhân “Lam

tăng hiệa suất sinh tédg hop efp + nhiều lần so vơi phát hiện

cu Mc Guire

3- dự diều chiển oud minh tổng bop Ezv&ronyein ¡

Kháng sinh Macrdlid chịu tác động cuả nhiều cơ 'chế điềi chính trong sinh tông hợp v VÍ dụ ¡7

Nồng độ & va Ni¿môi truờng, cùng với nồng độ cud

phoaphát vô cơ vượt quá giới hạn đều không tạo Ya macrolic |

Theo Goldstein va Sutter [20.7 , GO, 14m gidm hiệu

suất lên men cug srytronycin } flores vi sanchez Zat/

-chứng mảnh rằng jou WH, va @orcoran [227 nhận thấy

Brytrolia B ; + nhưng nhên to dod han cud biện _ guật

Erytromycin trong sỉnh tồng hep “ }

84 với kỹ thuật sinh bạo hiện đạt những yên đề trọng

điển phải nghiên cứu +È các nhấn tô ức chế (feed back

inhibệtLon), cám vig cug enzim (inauction of relevant enzyme )

va kich thd chủ trính 4MP nôi tể bào (atdmulation by

intracellular cya ic aMP), cáo nội dung nhy vần đang tiếp tục duge khảo sết nhằn ứng dụng vào nan xuất công nghi §p-

~ tin khẩp sất_ xể minh khu, la Eecjosgxsẻg 12906

pia maki Đ -

Người ta nhân thấy trong môi brường phúc hợp; chung

sữ erythreus bắt đầu gw dung neay tập tức pguồn hyc ret - carboa và nguồn dite, lim phét triện các khuẩn ty kể từ ngày

thứ bai có thể xuất hiện sryiựomgcia với nống độ do được ‹

Sau do lugng Erythromycin tăng lên theo tf 1 logarit che

đến khi hết nguồn hydrat carboa « Một số tac’ ‘gia nhận thấy

rồng chỉ khi đã tiêu thụ nất nguồn dạm để phát triển sinh

khối thÌ khi đô hydrat ‘carbon méi tham gia vae qué trình

-7-

sinh tồng hợp kháng sinh VẦ vậy 8mith cho răng sự cổ mặt cua nguồn Nitơ hấp thụ được, là 1 nhân tố ức chế tổng hợp jryfremycin - đòn Brinberg thì nhận thấy trong môi trường

nghÈo, tốc đô không khí không ảnh hưởng gì, ngược lại ở môi

trường giều; sự thông khí cao sễ lầm tăng hiệu suất sinh

tông hợp srythromycin

- (erium nhén thay dung 2 Logi đạm đồng thơi ¡ li ước ngấm ngô (corn steep liquor) và muối sunfat (t} 16 0,8% ‡ Os6%)

thì hiệi mals tdi m

~ Musilek nhfn m@h đến vai tro các acia amin trong môi trường l& men gồm saccarose, £lutamin và muối sunfat Tuy nhiên trong các acid amin da dung, thì nhiều tấc gia’ đều cho

răng valin cố hiệu quả cao nhất „ Gốc tác gif Ba Lan lei

bác bo di này, đứng mảnh ¿ 1leucin cố Lợi hơn về nhến mạnh

khéng cO acia emin nao xkhếc cố thể dùng 1ù nguồn cung cếp cễ

© và Ñ như leucin vì du có thể tạo nhiều sinh khối hơn

nhưng không tầng k¿ệi si ất kháng sinks

- Riêng Bếtain dùng phối hợp voi tyrosig vA glycin

(ngidn N, chfnh) cho kết qua xe rệt Trơng dd, Betain

1Ề nguồn tạo nhấm meiyl theo sơ đồ qươi dây :

Betein ——> Dimetylglycin —————+> Gl yeas

peng chi ¥ 1% khi k&t thie qué trinh 1én men(thuong lam vio

ngày thu séu) luong céc acio amin tăng lên ? cơ thể nghĩ xì

đổ 1ã co sự tư tiêu cuổ các khuẩn ty ching ?

= Lỗi với nguồn carbon hyaret » Baccarose thường dược

coi 15 tốt nhất, vẦ nếu chữ dung một mình glucose tHẦ nếuồn

© sẽ nhanh chống cạn va _pR se giảm, do tạo thành các

acid hữu œ., VỀ nếu ta bể sung hyaret carbon thi higu sudt

erytronycin vẫn không tầng Trấi lại khi nồng độ khống

sinh đã ngưng từng; ba cho thên đồng thời glycin và saccaros

vào nồi l&a men tHÌ erytrmemycin lại bất dầu tăng thêm

- VỀ các chất vô cơ : nhu cầu v8 Mg và P hnh như

không thể thiếu; ngoồầi re cồn Fe , Zn , cả và 0a cũng

~ẨĐ~ `

cần thiết , Người ta nhận thấy rất rõ nếu không cho „M8

phosphat hoặc Kali phosphat Prong méi trương th cd sự

phát triển đả sinh kHối,lẫa hiệu suất sinh tổng hợp kháng

sinh đều rất kếm , Hiện tượng này để được Onura về Tanaka

giei thich va ching mảnh đối với nhiều Macroliad [23.7 :

Ion NE, (cho vao m6i trường hay, sinh ra trong quá trằnh

tra đổi chất) 8 be chế sinh tông hợp céc Macrolia Con

L ag Phosphat » Ganxi phosphat va Zeolit hấp thụ các

ton Ny lầm giảm nồng độ WH, trong môi trường, nhơ ad

im tag sy binh thanh khéng sinh Omura gọi đố 1b "tác

nhân bẩy ion soni" (ammonium ~ trapping agents ) „ Gác bác nhân nay co th? lim cho hiệu suất macrolLid tăng lên 2 = 10

18n “rong sinh tổng hợp - 1actam, aminoglycosia, quinone

ve acylamia cũng thấy tấc dung như vậy « lo do Masuma 1983

£247 để đề nghỉ "Xổ thuột lên men ức chế ion WH,"

(technique of ammentim ion-cepressea fermentation )

- Mg khếc nOng d6 phosphat vé cv quá cao cùng đổ chế

sự tạo th anh khan § sinh 4 V3 vậy theo ky thuêt trên, người

ta cung dưa ra x3 thuêt "bẩy phoaphat* ` (phésphate-trapping

agnts) a3 gian hin lương m ống rất thấp về phozphatb trong

môi trường Tốc nhên “bey phosphst" 15 M@ cerboaat xiềm

và sllophan vô cơ /7”25.7 2° qhậệt sản người ta dùng đất

"Kenuma tsuchi" tie Là ellophan có chứa nhựa Làm "chất

bey phosphat" (hyurat silica-dlumin oeng gel 1ề thành

phần đính cua đất ở Kanuma - Gity va Moka - city È Nhật)

Theo Omura co thể dung quặng, Helloysite va montmorillonite cing Yat giống Allophean V6i ty lệ O;5 = a cho vềo môi

trường È thời điểm thích hợp sẼ lầm tàng hiệu suất khống

sinh lên nhiầỀ: lần ahd “bay ion phosphat" Phgt minh nay

được dùng rộng rãi trong cổng nghệ cuẻ nhiều kháng sinh ở

Nhat 3a - (Leu comycibỷ tăng 6 lồn, spiramycin tăng 3 tần ;2#

Tylosin tăng 3 14n, Nenaomycin tang 1,5 1ần; Lihyarostzepto-

mycine tang 318n, cephalosporin tang 6 lần nho "bay

phosphet") Harada £267 va Higashica £277 cub hang

Takeda - ihgt, sau khi ph&t hiện re Loạt macrolid mới od

17 © : Lenimcidain , da aung 1% ~ 2% f.cyclodextrin trong môi

trường, tăng gấp 10 lần hiện suất cud lenkacicin G LES ,

Vai trò cuả /=cyclodextrin (“hông F phân hủy bởi vi sinh

=o Gea

vật khi lê men) 15 bẫy phân tư Lankacidin aut động phức, Bing céch d6 lam tăng hiệu suất kháng sinh „ GycLedextrin

(nq dược goi lầ "schardinger dextrin") khá rẻ và cổ thể

cế tác dung" với nhiều loại kháng sinh „ Cốc phân tử “hãy”

trở thần H một kỸ thuât mối trong sản xuất các MacreLid 3

Thi môi trường khác nhai đã được nghiên cứu trong céng nghig san xuất Exrytemycin ˆ 7

- Singl ở Ấn bộ £297 dùng glucemee lầm nguồn carben

trong nôi trường gồm : -gluco# 1; cao nếm men 14; Prypton

0,5 4; để nh giống và gieo 255 - 5% vho mêi trường lên

men gồm :‡ sucrose 3% ; tinh bot ngô 3 ; môn SO, 053 % 3

cae nam mm 0,5 % ; NeCl 0,3 % 3; GaCO, 0,2 % 3; pH 6,5 - 73

t° = 26°C Det duge higu sugt «chéng sinh 47 mg/l ,

- Wbex ð uty £530.7 dùng môi trường phúc hợp gềm :

saccarese 10,3 2 ¡ K80, ©,025 %; cao nfm men C,65 %; pepton 0,4 % 3 Trypton 0,5 % ; cho thém sau khi khu tring dung djch gồm : glucose 50% 207 ¡ Qi trizin base (pH7) 12, 5¢ ; EELPO, G,5% 5Ì ¡ NaOH N - 2,5 ¡ GaGl,K 50°; Mem, M 50° “va

et Gung did vết các nguyên tố (nu, 40ng/1 ý “Feal, - 6 H.o

Z00ng/1 ; Gul, - 2 H,C mg/l ; dinGl, 4 HAO %ng/1 ;

Ne 25 01+ +0 He ỗ 5mg/1 ; (WH, 26 Mon O-v 4 BRO ®ẹg/2) che

4m? moi trvong

~ Vign INRA & Phấp (192) cùng môi trường tổng hợp gềm :

‹« Tinh bột ype 3 glucose 2,5 % ; Bot Gaus 4,7 % 3 cao ngd 1% ;

cao nếm men 0,5 #4 3 Watl 0,5 % ; Ga002 G,2 f 3 COLL, vet

„ Hoặc :t ` glucose 4% ; cao agd tự 3 Watl O;£2 % 3 = 1 š Auôn SO, 0,5 % ¿ đầu ngô 0,6 % :

$ Hoặc ¡ Saccarose #2 ;¡ aeic glutamic 0,1 % 3 igSO, 7 Be

0,05 % 5 #eS0, 7 HO 2107 Pel; Wm 4 0 810? g/l ; Gu80,, 5 E,O “5.1075 8/1 ¡ 90014 6H20 5.1 0ˆ2 g/1 vơi nhi@ dộ 37°C va thông khÍ mạnh 8/1/1 ; đạt được hiệu ˆ

- Một nhà mấy khối g sinh lốa & Pháp dùng môi trường sau

đây đạt được 4;4Š/1 (1979) : ột đậu tương 3;2 % (hoặc

- 10 -

bột hgt boing % ; Pharma media); cao ném men 0,8 &% ; Caco,

0,3 % ; Amon SO, 0,25 % ¡; cầu dgu twong 0,25 %@ 3; dBu lực

10% Ở” nhi@ độ 32°C thông khÍ 1/1/1 đồng thời khuấy

400 /ph & giờ đầu và 520Ÿ/phút Š giờ 24 Tùy theo

thời gian : 210% agt 4,48 , 260° dạt 5,75/1 về 310° đạt

6/1 , Sinh khối fât đặc nhưng nhẹ,

~ Whi tác gié st dụng môi trường cuả Smith (1962) cổ

thay dôi, cơ bẩn gồm có : sucrose 6% ; cao ngd 0,5 % ¡ đầu

đồ tương 1;5 & ; cao men bia 1 (hoặc thay bằng dietiller's

seLuble cố 35 chất đặc) ; NaCl 0,5 % về GaGO; 6.3% trong

thot ky dBu (1960 - 1970) môi trường nay thương cho hiệu

z4 Môi trường và thông sé : ⁄

- Tin hình trên may lÉc tốc đê tối da 240°%/ph cud Ý,

= Lùng các môi trường có thùnh phần “hấc nbau đễ chọn

- Trên nồi lê men: 63! và nồi là mên 100”

- shéng khí duge lec qua %5iết bị lọc (bông, than) “@® máng lộc khí PVC cud hang Marubishi (Nhật ) ve MX Hunters

~ hhmÈh trùng bằng nồi hơi 68 bar, lưu lượng 50 Ê/n , gia

nhiệt bằng điện cục 220 - 380Ï;và tăng nồi hơi cầu 120*E/w

cud Mỹ °

4 pink ivope ?

~ Đườae : theo phương phấp School - kegen — Bore m

- Định lương aZ6E : bằng phương phấp Kjendhall.

~ 11 =

- Oxy + theo phương phấp sunfit,

- Định lượng khếng nh :¡ bằng vi sinh vật, chẳng

kiền định là 3B, subtilis var Lo

= Định Lượng bằng phương phép do quang; pha + sẵn g

bằng dung dịch đệwu pH7

- Chuẩn so sánh là Ezrgthromycin tịnh khiểt de Viện

VNTIA (Liên Xô) cung Bp

4 Thân 1& khángzinh :

- Chiết bằng Butyl acetat & pH kiềm , Xác định

Ill - SEP gua VA aioe wl vi ~UAN

1¬ X € hung gL ống :

- Str grythreus phét triển phên nhénh, không có vách

ngăn đường kính 0,5 - 08M „ Khuẩn ty khí sinh có cuống

bàc tủ gồm 1 sơi trục hình lăn sống Đoạn phần nhénh cuối cùng sinh bào tử hồnh cBL hay ellip

- Đồng nog duce saccerose, khéng đồng hoế dược Arabinose

~ KRhuỗn hẹế chia lâm 2 loai :

« Lồi c© uy mếp không bằng phẳng; khuẩn ty khí sinh mầu hồng thẫm hay nâ&i nhạt Sắc tố hoà tan vàng nhat, nấu và đẻ

Nhễ hơn, không ce chuẩn ty khí sinh mỀu nâu, -

Chứng tôi chẹn 1egi khuẩn lạc: thứ nhất vì cđhiểm ae 26 +‡ên

hop Petri trén méi tm ng thạch “đặc

Ghọn giống : = Se sanh 3 giống E4» Ep» Ey trên môi

trường go 2 với nồng dô Ezytfromycin 100, 500 và 1000 /m

- Se sếnh chan giống BE, trên môi trường

số hi, - với nồng đô stepbốmycin khác nhau

ôi

trường mu đống !:- _

~ Giống dược gìiử trên môi trường thạch nghiêng gềm :

Bệt đệu tương 1% ; cae ngd 0,25 % 3 glucese 2% ; NaCl 0,25 4;

~i2-

cae nfm men 0,6 %; thach 3,0 % ; nude va 100 5 PH 6,8 -7 ;

khử trang 121°C/30 phit

Cấy trên bề mặt Giữ ở tủ ấm t° = 32° # 1, Thời giam

7 - 10 nềg Xiẫm tra lăng kính hiển vị,

Môi trường nhân ciống : Binh non dung tich 500% ; dừng

50 ` môi trương ,điều kiện pH 6,6 - 7 Khử tring | 120°C/45 phit

Cấy 1 ống Sống « Đặt trên mếy lắc tròn bốc độ 200Ÿ/ph ;

t® = 33°C Ở 4 § trời gian 36 - ac ; 3 «iém tre ding kfnh hian

vi

Thử trên 9 môi trường Kngc aheu :

1 — kậi trường 1.5 co thinh phan s bột đặu tương 14

giucese 1x; atl Cod & 3 vale, Os Foe

2 = Lôi trường 6; : ĐỘC dậa tương 12 ; cao ngô 0,25 % ;

Glucose 1% ; NaUL 0,25 % ; 0aCO2 G;2 % ; thạch 3%

2 = Môi trường Gm, = BOt dgu tương 12 5 cae ngô O;25 %;

@lucese tw ; cao nfm men 0,5 % ; jiatl 0,25 % ; Gao, Os2 % 3

glucese 2 ; Wall 0,3 -% ; tact, Ô;2 % ¡ cao nấu men O,s6 %

á = xôi trường I, : Bot câi tương 1⁄4 ; cao ngd 0,3 %

a

5 ~ Môi trường Fy s Saccarese 5% ; cao ngô O.5 % 3 b

dg twong 1,5 4 3 cao nfm men 0,5 % 5; NaCl 0,5 % ; 0a002 o

_ 6= BOL trường $= Ni Saccarose Ho ; ÄadOs Ose % i

K„H PO, 0,4 %.; MgSO «7 H„O 0,05 %; KGL 0,05%; Fe S0,-7H,0

0,001 & ;(pH 7 = 7532

_T = Lôi trường 2B: Tinh oft tan tw 5 Nallv, 01 % 5

KH PO, C03 % 3 HeG 0,05 % 5 QO, 0,3 % 53 PH 6,5

Fe

8 - Xôi trường Gn, : Tinh bột 2%; KUO, 0,1 % 3 KH PO,

0,05 %; MgSO, 7 HAO 0,05 % ; NGGL 0,05 % 5 Pes, oT HAO

“0,001 % ; bot đậi tương 12 ; cao nfm men 0,3 %

| 9 ~ Môi trường Gm, i Tinh Dot He ; KUO, 0,1 % Kee PO,

- 13~

sng I - So sdnh cac giéng Str erythreus

serps fete eneneeeze este tezeeenecezezae et co = ess ®

- Chẳng Str @rythreus E„ cố khổ năng phết triển trên

môi trường có nồng cộ hến¿, sinh vuvui/ml,

~ hi nuôi cấy nhiều lần thì xuết hiện các biến chững

(variant ) „23a › “3p , đạo cổ khả nàng ức chế fac subtilis

1„ như Ba gil: (Ø khối thạch 7 mm)

dạng 1T - haả năng ức chế vị sinh vật cua SỨ erythreu:

Ree esse ee StS RR FRESE KE SSE eC ses eK FZ Ss = =®8 =

st erythreus É vodg vô khuẩn

~ Hhững khuẩn lạc E 3e phát triên mạnh, sau thoi gian 3~ 5 ngày ; che 'khuên lạc Ø 3mm , te và öầy; sau 3 = 5 ngày

%ge sắc tế mần› nâu để tươi, -

~ Kt ou® chan đống với 5treptemycin ‡ thu được chung

đổng sốt với nồng độ 80 ui/nủ tăng i se với chủng ban dap, đạt 500 ui/n

s

- Kết quả cua chứng đột biến : ching yéu chi det higu

suất khóng sinh 4u ui/wl (thyc nign tei wgi Hec Tong hop)

- 14 =

Xết quả chọn mơi trường nhận giống :

Beng LII = Xt quả tuyển chẹn mơi trương nhân giống

Sress Resse SSS H AS SSSH SSS SSH SS SSS SSK SESS SSSA SS SSS SS SSS SSS SSS SETS

Chẳng E 3a trong mơi trường số 9 (Gm 3) det 595 “/mi

se véi ching ban đầu tăng khốnc 6 Lồn,

Shi chu + ˆ « ,, khang + « a * -

Gác mơi trường khác phat triéa,déng ke, veng vo khuén ce dường kính nhỏ khơng cếø ý nghiậ¿ nên khơng thống &ê trong bằng

Hình 1 ¡ Anh khuẩn lạc cuŠằ varisat Sứ, @rythreus'

Ba, s

15 =

`

2 sâ3 ` va :

Chúng tôi đã thư nghiệu trên 2 môi trường trên mấy Lắc,

~ Môi truong A: Tính bột 2Z ; bột đậu tương 15 ¡ cao nẩm men O;3 % (địch tự phân nếm men pha lesng 5⁄2) và các

tka h phần vô cơ khác (No; 0,1 % 3 K HPO, 0,05 & ; MESO,

THO 0,05 w 5 WaGl 0,05 » 5 FeSO, 7 HAO 0,01 x 3 Cac0, 0,42;

Khu t rùng riêng trên bằnh lên men 500 ml ‡ 3 thành phần đầu cồn cấc thhnh phần vô cơ cùng dầu lạc được khử trùng

riêng v Sai đồ lên me ở các điều kiện #au ‡ máy lắc dùng

tếc độ 220Ÿ/phút ; È® = 33°G È + „ thÈi gian 6 nghy

Những kết quả cuả 6 mể lên men che thấy :

~ Hig mất khóng ginh dạt cao nhất BOO iu/ml; thấp nhất

400 ui/mữ , trung bánh cuá 6 mể 1š 400 du/m

- pH bai đều 7 ; từ git 57 giảm đi cồn 6,5 va giữ

1

1

1 '

pH môi trường lên men,

#trd bờ thứ O đến 56 pH ban đầu không thay đổi; từ giờ t thứ 57 đến kết thíc, pH giảm xuống 6;5 va tăng lên 7 Ở

giv 96 che đến kết thứo,

YÀ môi trương trên đây dei hei nhiều heá chất tỉnh khiết

va khế kiếm, chứng tôi sư ụng một môi trường đơn giấn hơn _

để khae sáb các thông số; môi trường này che hiệu suất kháng

ginh 2300 = 600 iu/m1,

tiéh chat thi đùng môi trường không cõ propanol va có

propanol)

Kết quả : các thông số đã khảo sat trén 50 me oc may 1&c

- So sanh ngudn carbon : chúng tôi so sanh bốn loại :

bột ngô; bột khoai tây va ri dwong, sacerose

Kết qua như gan :

*" Nguön carbon ` Nong độ Z

-W7-

~ Yei trộ cua tiền chất

Vi 1ã thành phần cung cấp bộ khimg để vi sinh vật tạo

ra phân tử Erytromycin, nên đây là thể nghiệm được làm nhiều lần nhất Bằng đươi dây ghỉ kết quả so sanh khi có và không

co propenol và so sanh các nồng độ propeno1 khác nhau

Ghi chú : Trong thí nghiệm nay ri dwong chi dat 35%

Bảng V : So senh lên men có và không cô tiền chết

_ Propanol lam ting thêm hiệu suất „ Chứng tôi so sánh tìm

nồng độ propanol thích hợp , kết qua ghi ở Bang VI

Bang VI: 8o sẽnh nồng độ propenol

(rung bình cua 15 mẻ thí nghiệm)

~ Nồng 66 propanol thich hgp la 0,6 % lãm tăng hiện

ñ‡ khang sinh khoang 23%

1 ~ VÀ trong cua trình nghiên cứu chứng tôi nhận thấy

~ 18 ~

trong địch lên men B„ propionil Shermeni (Vitamin B12) hình

thành 1 lượng đống kề acid propionie va nước thải san khi tha vitamin B12 còn chứa nhiều seid propionic ma nhiều tae giả cũng đừng làm tiền chất trong lên men Pmytromycin)

nên chúng tôi có thử nghiệm thêm nhằm khảo gét khả năng sử đụng

một đư phẩm cuả qua trình lên men khác vào sinh tổng hep nay

Cach lam như sau : :

Dịch lên men Bacterium Propioni Shermani seu khi loc

riêng sinh khối để thu Vitemin BI2 giữ lại đích lọc có chữa

acid propionic

Dung 10% dich loe nay d2 pha mi trvong lén men St

Két_ mg ghi trong bang VII

Beng VIT : Si đựng nước thải lên mẹn B Propioni

co cra acid propionic dime + tiền chất (trung bình cua #2 thí nghiệm),

12, Co dich thai B Propinni ! 15,6 4 - — 94

- Không thể đùng nguyên nước thấi địch lọc ginh khối) cuỗ

qua trình lên men B„ Propioni a8 cung cấp tiền chất trong lên

men tạo Erytromycin « Điều này đễ hiểu vì trong địch lọc con nhiều chất metabolit khác có thỄ 1à những nhân tế ơi hẹn đối vơi sinh tổng hợp Brxytromycins nhất la phần lớn các aeid heữu

eơ lại tồn tại đưối đang muối amin hiện được coi như ion

gigi hạn trong sinh tổng hợp Macrolid (xem phần "Các chất vô cơm

~ 19 ~

và nhân tố "bẩy ion NH," - Omura , nơi ở phần tổng quan)

= Thởi gian lên men :

Yếu ts nay quan trọng đặc biệt trong điều kiện điện nước

không én định của Hiệt Nam, Mặt khác như đã noi ở trên, trorg công nghiệp, có nược kéo đầi quá trảnh lên men cến 13 ngày (số

bổ sung chất đỉnh đương) „ Voi moi trường nghèo và đơn giản của

chung tôi, khi không có bể sung chất đỉnh đương, thời gianc6

thể không cần kéo dài (dễ dỡ gặp rủi ro vì điện bị cẾt đột

ngột)

Két qua khảo sát ghi trong bangVIII

Bang VIII - Khao sat thời gien lên men

(trung bình kết quả của 15 thí nghiệm)

- Voi mi trường ngheo, qua trinh tao kheng sinh erytromy-

cin đừng lei ở giờ thứ 16, sau do kháng sinh bị tiêu hủy mộ +

phần, giam hiéu suất

Ghi chủ : Trong thí nghiệm này tiền chết được cho vào ngay

® giờ dầu Chứng tôi nhận thấy nỀUu cho tiền chất vào giờ thứ 48

!tthì thời gian lên men đừng lại ở ngày thứ sáu

3~ Ấp dụng cốc thông số dễ lên men St erythreus ở nồi lên

Môi trường giong và nhận giống gh ở trên được chuyển,

vô trùng vào thiết bị lên men dung tích 631 theo ty lệ 5,4 % ;

- 20 -

nhiệt độ 335G t 1 (Hinh 2) : 35Ì môi trưởng lên men có pH 6,8

-7 được ae trung ở 12 190/6o phút, lầm nguội đến 32°C va gieo 0,62 gidngy da ủ 6Ð giờ © 32°C; thing khi 0,8 - 1,6

(22/TT/PH) Kimay lién tuc voi t6ée¢ đô cao 200 Y/phút, không

chỉnh pH Tiền chat 0,6 % propanol cho ngay giờ đầu,

Ảnh nồi lên men 63“ chẽ tạo tại XÍ nghiệp Hoá

thiết bị tự chẽ tạo từ một nồi cao vị cue

Đức bằng thép tráng men, bổ sung ruột gà inox

Dege =

~ Ket qua :

+ Yề hình thoi xe khuẩn :

mừ giờ thứ 33 xuất hiện sợi menh và dai, cen gig thr

45 zợi ngẩn hơn va giờ 57 sợi gẫy, ngắn và thưa, đến giờ

96 syi Kha đỀy.

= 21-

~ Yé_ham lvéng Erytromycin :

Để dám bảo diều kiện vô trùng khi lên men thử nghiệm,

chưng tôi chỈ cịnh lượng hàm lượng Erytromyein vào giờ kết

thúc lên men,

Két quá được ghi trong Bảng TY

Beng IX - Nồng 2ê hydrat cacrrbon va ham lượng

Erytremvycin trong nồi lên men 632 (rung bình cuả 6 mễ lên men

Nguồn carbon tiêu thụ 70% vao 2 ngay sầu „ Điều nay

phu hợp voi đặc ciểm cuá loai St Erythreus, vi nguồn hydrat carbon dược tiêu thụ ngay lập tức; và chỉ sau 3 ngày cã sắn

ginh ra Erytromycin v Điều nay chine tố khi lên men có thối khi

có khác vơi khi lam ở mấy lắc Tuy nhiên môi trương có lẽ con cần cai tiển thêm vì hiệu suất trung bình cua chủng ở giờ

96 la 350 dễn 500 du/m1l

Ghi chú - co 1 mé churig tôi dat 800 iu/ml có thể

vi điện tốt, máy khuấy và máy nen khí mạnh hơn nhưng vì chỉ

eó 1 thÍ nghiệm nên không thống kê trong Bang IX

= Một mẻ khác lam chưa đủ thời gien thÌ bị mất điện cung

không thống kê vào dây Cũng như 2 mẻ bi nhiễn tạp phổi bổ

t

~ 22 ~

4= Thử nghiệm ở nồi lên men đung tích 1001 ; °

Đây 1à thiết bị cuả Nhật (hãng Marubishi) , dung Ích

1007 6 hệ thông theo rõi lưu lượng khÍ và nhiệt khí (Điện

cực pH bị gia, qua tuổi thông do _ dược) „ Hơi nược được một mồi hơi (auntolee của Anh) cung cấp; công suất 50%E sn va

thông khí bằng máy nến khÍ (KOIB cuả "Têy Đức) công suất

120 Ì/phi+ (xem các hình 4 „, 5 , 6)

Agh chụp nồi lên men (Marubishi) 1001 (BmƠND)

va bằng điện theo roi thing so.

Hình 6 :

ảnh chụp mấy nen khi Karl Kollo - Tây Đức

120/h (Bệ mn CND)

Dung 50Ì môi trường lên men với các thông số nh lãm ở

nồi 63! (XNHD) ; áp suất dư 0,2 = O,g4 at ; tốc độ khuấy

250°/ph

Kết qua ghi o Bang Xx

Băng X - Sinh tổng hợp Erwtromycin ó nồi 1001 (2 mẽ)

~ 25 =

Rất dáng tiếc là tại kim vực làm thí nghiệm (13 Lé Thanh

Téng) bị mất điện từ vai ngay cền vai giờ trong ngày; nên cả

2 me thf nghiệm trên thiết bị toot chi én dinh va theo roi

được 3 ngày Seng ngay thứ tư bị cất điện, nên chúng tôi die

có số liệu đầy dủ,

Gó, thể nhận thấy : niểu tiếp tục len men thì quá trình

sinh tổng hợp có thể thuận lợi „ Hiên tại vì chưa trang bị

được may phat ciện nên chúng tôi tạm ngừng thí nghiệm trên

thiết bd 1007 ve dến Lem tiếp ở thiết bị 631 tai XNED vi ở

dỡ Ít mất ciện về có may phát cđiên dự phòng (200K"Ay

bao cho quá trình nghiên cứu liên tục

Những kết qua sẽ dược thông báo tiếp

5= Thử nghiệm chiết Erytromycin từ địch lên men trong

Thí lêm,

Chứng t8â#1lãm nhưogau :

Cé& ch chiét : Dịch lên men dem loc gua loc khung ban,

thu địch lọc và nước rưc (chỉnh pH = 7 nều hơi kiềm)

Chiết bằng acetat buty1 1:10 ; chuyén seng"môi trương

nước ty lệ 1:4 chiết ở nhiệt độ thấp „ Phân hủy bằng hỗn

‘pH : 9 » Gan riéng Nop dung moi BS lớp nược lam tanh Ly tâm lấy Erytromycin thd (-15°C) đựng base am , để riêng

phần nhũ tương CHCl, « Đem sấy ở 70°C va thn được san

phẩm thô ; Nếu làm tốt ham lượng dat 980 iu/me

Tinh chế phần nHữ CHCl, : cho thém nược khuay và để

ling loại bo DMF (Dimetylformebil) „ Gất tìm hồi CHƠI,

_ Cho thêm nước; ty tấm lấy bột Erytromycin thd, hút khô

trong bình hút Âm „ Hoa tan lại vào 5,7 thé tich/ CHCL, - DMF

45 - 50°C Loc phéu sop „ Dịch lọc làm lạnh, thy Erytromycin

hầm lượng thấp hon (800 iu/me)

Hiệu suất chiết dat cuge 1a : 80% thu hồi thên 3,47 % trong phần nhủ,

GHẾt dễ dinh lượng : VÌ phương phép phồng thí nghiện trên

đây đòi hoi nhiều loại đunghmôi khó kiễm, nên khi đỉnh lượng

- 26 -/

Dich Bọc bỏ sinh khối, chỉnh pH= 7, Loc qua gi ay ho&e

ly tém Dùng NaOH 10 chỉnh ,PH= 9,5 - 10, chiết bằng -

butyl acetat (1:3) Gem lẫy lớp dung mơi chiết bằng dung

địch đệm Kali monopho sphat PE4,5-5 (ty 18 133) Dung

dich đệm Bẹn riêng, ,cùng NaOH 102 dưa về pH 7

_

khơng cịn 1⁄3 thể tÍch ; cho thêm N 4 L tưng địch _

oc, thu tua Hoa ten vào"ọh

NaCl 20% + ut 50°C p od-autes

5% (nhe vừng đệm phòphat 7,6) Pha dung dich 30 4u/nI”—- —= trong cồn 5% (pH = 7,6 66m phosphat) định : lượng bằng

Kiểm tre bằng sốc ký lớp mơng : trên tấm silicagel nhựa

F254 triển khai bằng hệ dung mơi etyl acetat : Dietylamin

94:6 , phat hién bing acid phosphomolybdic, trimg «St chuém

a chuẩn (Rf 0,5)

b mẫu thr (RF 0,5) aA