Nghiên cứu sàng lọc và các đặc tính sinh học của một số nấm đảm trong sinh tổng hợp EPS, kháng vi sinh vật, tạo laccase từ các vùng sinh thái khác nhau (LV thạc sĩ)

Nghiên cứu sàng lọc và các đặc tính sinh học của một số nấm đảm trong sinh tổng hợp EPS, kháng vi sinh vật, tạo laccase từ các vùng sinh thái khác nhau (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sàng lọc và các đặc tính sinh học của một số nấm đảm trong sinh tổng hợp EPS, kháng vi sinh vật, tạo laccase từ các vùng sinh thái khác nhau (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sàng lọc và các đặc tính sinh học của một số nấm đảm trong sinh tổng hợp EPS, kháng vi sinh vật, tạo laccase từ các vùng sinh thái khác nhau (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sàng lọc và các đặc tính sinh học của một số nấm đảm trong sinh tổng hợp EPS, kháng vi sinh vật, tạo laccase từ các vùng sinh thái khác nhau (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sàng lọc và các đặc tính sinh học của một số nấm đảm trong sinh tổng hợp EPS, kháng vi sinh vật, tạo laccase từ các vùng sinh thái khác nhau (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sàng lọc và các đặc tính sinh học của một số nấm đảm trong sinh tổng hợp EPS, kháng vi sinh vật, tạo laccase từ các vùng sinh thái khác nhau (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sàng lọc và các đặc tính sinh học của một số nấm đảm trong sinh tổng hợp EPS, kháng vi sinh vật, tạo laccase từ các vùng sinh thái khác nhau (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sàng lọc và các đặc tính sinh học của một số nấm đảm trong sinh tổng hợp EPS, kháng vi sinh vật, tạo laccase từ các vùng sinh thái khác nhau (LV thạc sĩ)

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-*** -HOÀNG THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ NẤM ĐẢM TRONG SINH TỔNG HỢP EPS, KHÁNG VI SINH VẬT, TẠO LACCASE

TỪ CÁC VÙNG SINH THÁI KHÁC NHAU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2015

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-*** -HOÀNG THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ NẤM ĐẢM TRONG SINH TỔNG HỢP EPS, KHÁNG VI SINH VẬT, TẠO LACCASE

TỪ CÁC VÙNG SINH THÁI KHÁC NHAU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS TS Đặng Thị Cẩm Hà đã kiên trì chỉ bảo, quan tâm hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, giúp tôi có thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Ban giám hiệu Trường Đại học Thái Nguyên, cùng các Thầy cô giáo đã tham gia giảng dạy trong suốt khóa học

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS Đinh Thị Thu Hằng cùng tập thể cán bộ của phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường và các nghiên cứu sinh đã tận tình giúp đỡ tôi lấy mẫu và trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi cũng xin cảm ơn đến PGS TS Thành Thị Thu Thủy đã giúp đỡ tôi bổ trợ thêm những kiến thức mới Cảm ơn GS Bram Brouwer và công ty BioDetection Systems B.V- BDS, Hà Lan đã thực hiện các phân tích sử dụng công nghệ DR-CALUX

để có kết quả mới trong luận văn này

Cuối cùng, tôi xin dành lời cảm ơn tới chồng và con trai - là chỗ dựa tinh thần và những người thân trong gia đình là chỗ dựa vững chắc, động viên, giúp đỡ trong suốt thời gian qua

Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó !

Hà Nội, tháng 12 năm 2015 Học viên cao học

Hoàng Thị Nhung

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Nhung

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về nấm ăn và nấm dược liệu (MMS) 3

1.2 Lịch sử nghiên cứu và sử dụng nấm 5

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 5

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 7

1.3 Polysaccharide từ nấm- nguồn carbonhydrate có hoạt tính sinh học tự nhiên 8

1.4 Tách chiết và xác định các đặc tính của polysaccharide từ nấm 9

1.5 Đặc điểm cấu trúc của polysaccharide phân lập từ nấm 11

1.6 Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) trong nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide 12

1.7 Tính chất vật lý của polysaccharide 15

1.7.1 Khối lượng phân tử của polysaccharide 15

1.7.2 Độ hòa tan của polysaccharide từ nấm 15

1.8 Vai trò của polysaccharide từ nấm đối với sức khỏe 16

1.8.1 Tính kháng u, điều trị ung thư và miễn dịch của polysaccharide 16

1.8.2 Hạ lipid máu và hạn chế đường huyết 20

1.8.3 Tính chống oxy hóa của polysaccharide từ nấm 21

1.8.4 Prebiotic từ nấm 22

1.8.5 Tính kháng virus của polysaccharide từ nấm 23

1.8.6 Hoạt tính kháng khuẩn của polysaccharide từ nấm 24

1.9 Laccase và ảnh hưởng của nó đến sức khỏe con người 26

1.9.1 Tổng quan về laccase 26

1.9.2 Ứng dụng của laccase trong lĩnh vực bảo vệ sức khỏe 27

1.10 Phương pháp phân tích sàng lọc DR-Calux 28

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35

2.1 Vật liệu 35

2.1.1 Vi sinh vật 35

2.1.2 Hóa chât và thiết bị 35

2.2 Phương pháp nghiên cứu 36

2.2.1 Phương pháp phân lập các chủng nấm 36

2.2.2 Phương pháp phân loại nấm dựa vào trình tự xác định trình tự ITS 36

2.2.3 Chuẩn bị giống 37

2.2.4 Phương pháp xác định sinh khối và hàm lượng exopolysaccharide 37

2.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme laccase 37

2.2.6 Đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp polysaccharide và enzyme laccase 38

2.2.6.1 Đánh giá anh hưởng của pH 38

2.2.6.2 Đánh giá ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 38

2.2.6.3 Đánh giá ảnh hưởng của nguồn nitơ 39

2.2.6.4 Đánh giá ảnh hưởng của nguồn carbon 39

2.2.7 Xác định hàm lượng protein, carbonhydrate tổng số của EPS thô 39

2.2.8 Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định 40

2.2.9 Xác định thành phần của polysaccharide 41

2.2.10 Xác định hoạt tính của EPS và sinh khối nấm lên một số chức năng của tế bào 41

PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 Phân lập và phân loại các chủng nấm nghiên cứu 44

3.2 Khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và hoạt tính laccase của các chủng nấm……… 48

3.3 Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch nuôi cấy một số chủng nấm 54

3.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự tạo sinh khối, sinh tổng hợp EPS

và laccase của 2 chủng nấm Earliella sp FPT31 và Ganoderma sp FMD12 56

3.4.1 Ảnh hưởng của pH môi trường 56

3.4.2 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 59

3.4.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 61

3.4.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon 63

3.4.5 Ảnh hưởng của nồng độ glucose 65

3.4.6 Khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và laccase của FPT31 khi kết hợp các yếu tố môi trường 67 3.5 Hàm lượng carbonhydrate và protein của EPS thô thu được từ FPT31 và FMD12 70

3.6 Thành phần và cấu trúc EPS của FMD12 và FPT31 72

3.7 Hoạt tính in vitro của EPS từ 2 chủng nấm FMD12 và FPT31 75

PHẦN 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77

4.1 Kết luận 77

4.2 Kiến nghị 78

TÀI LIỆU THAM KHẢO 79

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)

CALUX Chemical Activated Luciferase Gene Expression

COSY Corelated Spectrscopy

CVD Cardiovascular Disease

D2O Deuterium oxide

dce Dried crude exopolysaccharide

DMEM/F12 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12

HIV Human Immunodeficiency Virus

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence

HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HPLC High- Performance Liquid Chromatography

IC50 Concentration Inhibiting 50% Of Groth

IFN Interferon

IL Interleukin

IPS Intracelular Polysaccharide

ITS Internal transcribed spacer

IZD Internal Zone Diameter

NEAA Non-Essential Amino Acid

MAE Microwave- Assisted Extraction

MIC Minimal Inhibitory Concentration

MMs Medicinal Mushrooms

MRSA Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus

MRSE Methicillin-Resistant Staphylococcus epidermidis

NK Natural killer

NMR Nuclear Magnetic Resonance

NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

Nrf2 Nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2

PBS Phosphate Buffered Saline

PDA Potato Dextro Aga

PDB Potato Dextro Broth

PGM Potato Glucose Malt

PLE Pressurized Liquid Extraction

PR Progesterone Receptor

PSP Polysaccharopeptide

ROESY Rotating Frame Overhauser Enhancement Spectroscopy

SEC Size-Exclusion Chromatography

SFE Supercritical Fluid Extraction

TNF Tumor Necrosis Factor

TSB Tryptone Soya Broth

UAE Ultrasonic- Assited Extraction

VREF Vancomycinresistant Enterococcus faecium

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 1.1 Một số phương pháp tách chiết polysaccharide từ nấm 10 Bảng 1.2 Độ chuyển dịch hoá học δ(ppm) từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của

polysaccharide và enzyme laccase của chúng

44

Bảng 3.3 Khả năng ức chế sự sinh trưởng 2 chủng vi khuẩn B cereus và M

luteus của dịch nuôi cấy chủng FMD12

50

Bảng 3.4 Sự sinh trưởng và khả năng tổng hợp EPS theo thời gian của FPT31

và FMD12

55

Bảng 3.5 Khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và laccase của FPT31

trên môi trường chứa đường và cao nấm men ở nồng độ khác nhau

62

Bảng 3.6 Điều kiện nuôi cấy của 2 chủng nấm FPT31 và FMD12 với một số

nghiên cứu quốc tế

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang Hình 1.1 Cơ chế tham gia miễn dịch của β- glucan từ nấm 18

Hình 3.1 Cây phát sinh chủng loại của các chủng nấm thuộc chi Ganoderma

trong nghiên cứu

Hình 3.4 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp

enzyme laccase và EPS của FPT31 và FMD12

53

Hình 3.5 Hoạt tính enzyme laccase của chủng FPT31 theo thời gian nuôi

cấy

54

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp

enzyme laccase và EPS của FPT31 và FMD12

57

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh trưởng, sinh tổng

hợp laccase và EPS của FPT31 và FMD12

59

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nguồn nồng độ glucose đến khả năng sinh trưởng,

sinh tổng hợp laccase và EPS của FPT31 và FMD12

61

MỞ ĐẦU

Giới nấm có khoảng 1,5 triệu loài tuy nhiên chỉ có 14.000 loài trong đó là nấm

đảm Basidomycetes Một vài trong số những chi này đã được trồng trên quy mô công nghiệp trên toàn thế giới bao gồm Pleurotus (nấm sò), Lentinula (nấm hương), Auricularia (mộc nhĩ), Agaricus (nấm Thiên Chúa), Flammulina (nấm kim châm), Hypsizygus (nấm ngọc châm), Ganoderma (nấm Linh Chi), Inonotus obliquus (nấm đen), Coprinus (nấm đùi gà), Agrocybe (nấm trân châu) và Volvariella (nấm rơm) Nấm được

sử dụng cho rất nhiều ứng dụng trong công nghệ sinh học đặc biệt là trong các ngành sản xuất thực phẩm, enzyme, bổ sung cho chế độ ăn kiêng, các hợp chất có dược tính, thực phẩm bổ sung [111] và nhiều ứng dụng khác

Một thành phần quan trọng của nấm chiếm được sự quan tâm lớn của khoa học là

polysaccharide Các polysaccharide từ nấm được thu nhận từ Ganoderma, Lentinus, Oyster, Flammulina, Cordyceps, Coriolus và Pleurotus đều đã được chứng minh là có

nhiều hoạt tính sinh học bao gồm miễn dịch, kháng u, chống ung thư, kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa, các đặc tính liên quan đến đường huyết và tim mạch Ngoài

ra các enzyme laccase cũng đang được chứng minh vai trò quan trọng của nó trong lĩnh vực bảo vệ sức khỏe con người

Nấm được sử dụng chủ yếu thông qua ăn trực tiếp (nấm ăn) và sắc lấy nước uống hoặc dùng hàng ngày cũng ở dạng sản phẩm uống (thực phẩm chức năng và thuốc) được tách chiết từ các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm Cho đến nay hầu hết các sản phẩm từ nấm đều được thu nhận trực tiếp từ quả thể của nấm tự nhiên hay nấm trồng thông qua quá trình tách chiết phức tạp và sử dụng nước nóng hay các dung môi hữu cơ khác nhau Lên men chìm là một giải pháp được đưa ra để khắc phục những nhược điểm của một số phương pháp tách chiết truyền thống như thời gian thu nhận, hiệu suất tách chiết, khả năng kiểm soát mức độ an toàn thực phẩm trong suốt quá trình sản xuất và sự phức tạp của quá trình thu nhận sản phẩm cuối cùng để tạo hàng hóa thương mại Vì vậy,

việc lựa chọn môi trường thích hợp cho nấm sinh tổng hợp một lượng lớn các hợp chất

có hoạt tính sinh học mà quan trọng là polysaccharide có ý nghĩa lớn

Các hoạt tính sinh học của polysaccharide bị ảnh hưởng bởi các đặc điểm về cấu trúc của chúng như thành phần hóa học, khối lượng phân tử, các liên kết glycosidic và dàng cấu hình Vì vậy, việc nghiên cứu các đặc điểm về cấu trúc của polysaccharide có ý nghĩa trong việc xác định các hoạt tính sinh học của chúng từ đó ứng dụng chúng vào các mục đích thích hợp

Công nghệ phân tích sàng lọc bằng CALUX đã trở thành một công cụ sinh học mới bắt đầu được sử dụng trong việc phát hiện các chất hay các cụm chất có tác dụng ở mức độ tế bào từ các mẫu sinh phẩm và môi trường dựa vào sự biểu hiện của gen đích gắn với promoter chỉ thị là luciferase Hiện nay, CALUX là phương pháp hữu hiệu để không chỉ xác định nồng độ dioxin hay các chất đích đang được mong muốn tìm mà công cụ này còn được ứng dụng trong các lĩnh vực như an toàn thực phẩm cho người Các lĩnh vực như nước uống, chất lượng môi trường, dược phẩm/ hóa chất, thức ăn chăn nuôi, sản phẩm tiêu dùng, các phép thử ở bệnh viện, các sản phẩm sinh học tế bào, các nguyên liệu đối chứng tham khảo và các sản phẩm khác v.v là đối tượng mà công nghệ CALUX có thể phân tích Việc đánh giá các chất có hoạt tính sinh học được tách chiết từ nấm lên các chức năng của tế bào giúp định hướng một cách rõ ràng hơn về khả năng ứng dụng của chúng để tạo thuốc, thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ sung cho người, vật nuôi và cây trồng

Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu sàng lọc và các đặc tính sinh học của một số nấm đảm trong sinh tổng hợp EPS, kháng vi sinh vật, tạo laccase từ các vùng sinh thái khác nhau” đã được tiến hành Nội dung chính của đề tài bao gồm:

- Phân lập, sàng lọc và tuyển chọn nấm có khả năng sinh tổng hợp EPS và enzyme laccase từ các mẫu nấm thu thập từ Vườn Quốc gia Xuân Sơn- tỉnh Phú Thọ; Vườn Quốc gia Ba Vì- thành phố Hà Nội; rừng keo tỉnh Bình

Phước; rừng bị rải chất độc hóa học là A Lưới- tỉnh Thừa Thiên Huế và Mã Đà- tỉnh Đồng Nai;

- Phân loại 2 chủng nấm bằng phương pháp xác định trình tự vùng ITS;

- Lựa chọn môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và

laccase của 2 chủng nấm Ganoderma sp FMD12 và Earliella sp FPT31;

- Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch nuôi cấy 2 chủng

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về nấm ăn và nấm dược liệu (MMs- Medicinal Mushrooms)

Nấm sợi và nấm mũ được phân bố rộng rãi và phong phú trên toàn thế giới Các ước tính gần đây về nấm cho thấy số lượng nấm vào khoảng 500 000 đến hơn 5 tỉ loài, được công bố hơn 20 năm trước [46] Cho đến nay, có khoảng 3 tỉ loài nấm được chấp nhận sử dụng chung Trong khi đó, hiện nay có 110 000 loài nấm đã được mô tả Số lượng các loài nấm trên trái đất hiện nay ước tính khoảng 150 00 – 160 000 Chưa hết,

có lẽ chỉ có 10% số loài có tên được khoa học biết đến [133] Một phân tích về nguồn gốc của các loài nấm mới cho khoa học đã được mô tả và công bố trong cuốn Biên lục

về Nấm xuất bản 10 năm trước cho thấy khoảng 60% các loài nấm mới được mô tả là từ các vùng nhiệt đới

Nấm được tiêu thụ trên toàn thế giới không chỉ do đặc tính cảm quan mà còn thu hút được nhiều sự quan tâm do lợi ích của chúng đối với sức khỏe con người Hiện nay nấm được đánh giá cao về giá trị dinh dưỡng cũng như dược lý của chúng Nấm có thể được coi là một loại thực phẩm tốt cho sức khỏe vì chúng có hàm lượng protein và hàm lượng chất xơ cao, với một lượng vitamin và khoáng chất đáng kể và lượng chất béo thấp Chúng là một nguồn dược phẩm lớn, mới nhưng chưa được khai thác Hơn nữa, nấm ngày càng thu hút sự quan tâm bởi chúng có thể được ứng dụng để tạo thực phẩm chức năng và là nguyên liệu cho sự phát triển của các loại thuốc và các sản phẩm dinh dưỡng do để bổ sung vào chứa một loạt các phân tử có hoạt tính sinh học như β- glucans, polyphenol, phytosterol, tecpen Quan trọng nhất đối với y học hiện đại là nấm dược liệu (MMs) là nguồn polysaccharide vô hạn (đặc biệt là β- glucan) và các phức hợp polysaccharide- protein có khả năng chống ung thư và tăng khả năng miễn dịch Hầu hết

các Basidiomycetes bậc cao đều chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học với phân tử

lượng thấp hoặc cao (triterpenes, lactones, alkaloids và các hợp chất khác) trong quả thể nấm, sợi nấm và dịch nuôi cấy [133], [128], [8], [27]

MMs được so sánh với thuốc thảo dược và được xác định có thể là các nấm lớn, hầu hết thuộc nấm đảm và một vài thuộc nhóm nấm sợi Chúng được sử dụng ở dạng chiết xuất hoặc dạng bột để ngăn ngừa, giảm thiểu hay chữa trị bệnh, và/ hoặc bổ sung cho người một chế độ ăn uống khỏe mạnh và cân bằng

Nấm dược liệu và nấm ăn có khoảng 130 chức năng để có thể sử dụng làm thuốc

do có khả năng kháng ung thư, tăng khả năng miễn dịch, chống lão hóa, kháng các bệnh tim mạch, chống tăng cholesterol, kháng vi rút, kháng khuẩn, kháng ký sinh trùng, kháng nấm, khử độc, bảo vệ gan, chống các ảnh hưởng của đái đường Nấm được sử dụng vào các liệu pháp tăng miễn dịch, và đã được chứng minh là có hiệu quả như chống viêm, chống oxy hóa, kháng u, hoặc là kháng virus và là các nhân tố kháng khuẩn

Rất nhiều, nếu không nói là tất cả, các nấm mũ bậc cao chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học không chỉ có trong quả thể nấm, trong sợi nấm qua nuôi cấy mà còn có trong môi trường nuôi cấy Các polysaccharide từ nấm đang được quan tâm đặc biệt bởi các đặc tính hữu ích của chúng Các dữ liệu khoa học về các polysaccharide từ nấm và các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được tổng hợp lại khoảng 700 loài Số lượng các polysaccharide có hoạt tính sinh học hoặc các phức hợp polysaccharide- protein từ các nấm thuốc có mặt để tăng cường các phản ứng miễn dịch bẩm sinh và phản ứng miễn dịch thu được và tạo ra hoạt tính kháng ung thư ở người và động vật Cho đến nay các cơ chế về hoạt động kháng ung thư của chúng vẫn còn chưa được hiểu một cách rõ ràng Polysaccharide và các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp có khối lượng phân tử thấp giữ vai trò đặc biệt quan trọng do đặc tính kháng ung thư và tăng khả năng miễn dịch của chúng [134]

1.2 Lịch sử nghiên cứu và sử dụng nấm

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Việc sử dụng các loài nấm trong các liệu pháp điều trị đã xuất hiện ít nhất từ thời

kì đồ đá mới Trải qua hàng nghìn năm, các loài nấm được đánh giá là có giá trị cho con người là nấm ăn và nấm dược liệu Các nghiên cứu hiện đại xác nhận và ghi nhận nhiều

kiến thức cổ xưa về nấm dược liệu Một lĩnh vực khoa học liên ngành tập trung vào nghiên cứu nấm dược liệu đã được phát triển và ngày càng chứng tỏ tính ưu việt và độc đáo của các hợp chất chiết xuất từ một loạt các loài nấm trong ba thập kỷ gần đây Các thử nghiệm lâm sàng hiện đại được tiến hành ở Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Nga

và một số nước khác dựa trên các nấm đã biết nguồn gốc Đông y học cổ đại đã nhấn

mạnh tầm quan trọng của một số loài nấm như nấm Linh chi (Ganoderma lucidum), nấm hương (Lentinus edode) Nấm cũng đóng vai trò quan trọng trong điều trị các bệnh ảnh hưởng đến dân cư vùng nông thôn ở các nước châu Âu Các loài quan trọng nhất là Inonotus obliquus, Fomitopsis officinalis, Piptoporus betulinus, Fomes fomentarius

Những loài này được sử dụng trong điều trị rối loạn tiêu hóa, các dạng ung thư khác nhau, hen phế quản, đổ mồ hôi đêm …Từ lâu, nấm đã được sử dụng trong điều trị bệnh

ở Trung Mỹ (đặc biệt là chi Psilocybe), ở châu Phi, Algeria và Ai Cập Vai trò đặc biệt

của nấm hương bay được tìm thấy trong Shaman giáo ở Siberia và Tây Tạng, trong Phật giáo và huyền thoại Celtic [107], [129], [133], [18]

Ngày nay, nấm dược liệu được sử dụng trong các lĩnh vực như làm thực phẩm

ăn kiêng (sản lượng nấm thế giờ là 30 tấn vào năm 2012); sản phẩm bổ sung vào chế độ

ăn uống (sản phẩm của lĩnh vực này phát triển mộtt cách nhanh chóng và có giá trị hơn

18 tỷ USD/ năm); một loại thuốc mới được gọi là “dược phẩm nấm”; nhân tố kiểm soát sinh học tự nhiên trong bảo vệ thực vật với các hoạt tính kháng côn trùng, diệt nấm, diệt khuẩn, diệt cỏ, diệt tuyến trùng, kháng vi rút ở thực vật Trong mỹ phẩm, các hợp chất khác của MMs, bao gồm polysaccharide như β-glucans, glucuronoxylomannan (GXM ), sacchachitin, tyrosinase và các enzyme khác được các công ty mỹ phẩm sử dụng do khả năng tạo màng của chúng, kích hoạt các yếu tố tăng trưởng biểu bì, chống oxy hóa, chống dị ứng, kháng khuẩn, va hoạt tính kháng viêm, kích thích hoạt động của collagen,

ức chế bạch biến tự miễn dịch và điều trị mụn trứng cá [133], [134], [54]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Từ xưa, người Việt Nam đã sử dụng nấm Linh chi dùng làm dược liệu Từ thời Lê Quý Đôn (1726-1784), nấm Linh chi được đánh giá rất cao Các chế phẩm từ Linh chi

(Ganoderma) được sử dụng để điều trị nhiều bệnh như: gan, tiết niệu, tim mạch, ung thư,

AIDS, suy nhược cơ thể, tiểu đường, giảm đau, giải độc trong cơ thể, đào thải chất phóng xạ, giảm cholesterol trong máu, mất ngủ, loét dạ dày, làm tăng hệ thống miễn nhiễm của cơ thể, tê thấp v.v Tuy nhiên những nghiên cứu về nấm dược liệu và nấm ăn cũng chủ yếu dừng lại ở thống kê, đánh giá và xác định sự đa dạng và giá trị tài nguyên của loại nấm này ở các khu vực khác nhau như Thừa Thiên Huế [1], Vườn Quôc gia Bù Gia Mập [6], vùng Thanh- Nghệ Tĩnh [5], tỉnh Tây Ninh [4]

Một nghiên cứu của Lê Xuân Thám và đtg (2011) đã xác định được thành phần

hóa học của mẫu nấm Linh Chi đen Amauroderma subresinosum Murr phân lập từ Vườn

Quốc Gia Cát Tiên bằng kỹ thuật sắc ký khí (GC) Nghiên cứu đã xác định được 14 axit béo, trong đó axit béo chưa bão hòa 11-octadecaenomic có nồng độ cao nhất (khoảng 51,01% tổng lượng axit béo đã được xác định) Ngoài ra, các axit béo là lignoceric, 14-methylpentadecaenoic, 8,11-octadecenoic cũng đã được xác định và làm sáng tỏ về cấu trúc [104]

Trần Thị Hồng Hà và đtg (2012) đã tách chiết và xác định hàm lượng các

polysaccharide từ quả thể nấm hầu thủ Hericium erinaceus Phân đoạn chiết bằng NaOH

4% cho tổng lượng polysaccharide chiếm 80% , bao gồm các dạng tan và không tan trong nước Một lượng ít polysaccharide được tổng hợp trong dịch nuôi cấy nấm Polysaccharide tan trong phân đoạn chiết NaOH 2% có hoạt tính ức chế sự hình thành khối u tế bào ung thư gan (Hep-G2) thể hiện bằng việc giảm kích thước khối u xuống 24,4% và mật độ hình thành khối u 61,5% so với đối chứng âm [2]

Tuy nhiên, những nghiên cứu được tổng hợp ở trên mới chỉ tập trung vào chi

Ganoderma và ứng dụng của chúng trong y học Trong khuôn khổ luận văn thạc sỹ này

học viên cao học không chỉ nghiên cứu, khảo sát về khả năng sinh tổng hợp

polysacchride của một số Ganoderma mà còn tập trung nghiên cứu khả năng sinh trưởng,

sinh tổng hợp expolysaccharide và enyme laccase của dịch lên men từ nấm phân lập mới

từ rừng ở các vùng khí hậu khác nhau Đồng thời đánh giá khả năng kháng một số vi sinh vật kiểm định; xác định thành phần và cấu trúc của polysaccharide trong dịch nuôi

cấy của 2 chủng nấm lựa chọn; đánh giá một số hoạt tính in vitro lên các chức năng của

tế bào Từ đó, có hướng ứng dụng thích hợp cho mỗi chủng nấm, đặc biệt trong lĩnh vực thực phẩm bố sung cho người và gia súc, gia cầm

1.3 Polysaccharide từ nấm- nguồn carbonhydrate có hoạt tính sinh học tự nhiên

Trong số các hoạt chất sinh học có trong nấm, polysaccharides chiếm được sự quan tâm hơn cả chủ yếu là do đặc tính tuyệt vời của trong miễn dịch, các chất chống oxy hóa, chống viêm, hoặc kháng u Polysaccharide là một polymer mà trong đó monomer là các phân tử đường đơn Một vài polysaccharide đã được phân lập từ các nấm nguyên liệu Khi tất cả các monosaccharide tạo thành carbohydrate cùng loại thì các polymer này được gọi là homopolysaccharide hoặc homoglycan Tuy nhiên, nếu có nhiều hơn một loại monosaccharide có mặt trong cấu trúc, chúng được gọi là heteropolysaccharide hoặc heteroglycan Như vậy, các heteropolysaccharide được hình thành bởi các loại đường khác nhau [22], [120] và phức hợp polysaccharide-protein [11] cũng có thể được tìm thấy trong một số nấm nhất định

Các đặc điểm về cấu trúc như tính chất của monomer, các loại hình liên kết và

vị trí liên kết, cũng như số lượng và vị trí của các nhánh có trong chuỗi polymer sẽ ảnh hưởng mạnh đến cấu trúc không gian 3 chiều cùng với kích thước phân tử từ đó sẽ xác định các tính chất và hoạt tính của polysaccharide [16] Tương tự, các tính chất vật lý như khả năng hòa tan, độ nhớt, độ đông đặc, có thể ảnh hưởng đến các hoạt tính sinh học

vì chúng có thể làm thay đổi tính sẵn sàng sinh học của polysaccharide [95] Do đó, việc xác định một cách rõ ràng các cấu trúc và tính chất vật lý phân tử của các polysaccharides có trong nấm là vô cùng quan trọng để dự đoán các hoạt tính sinh học của chúng

1.4 Tách chiết và xác định các đặc tính của polysacchride từ nấm

Việc tách chiết polysaccharide liên quan đến việc phân tách các carbohydrate từ

nấm nguyên liệu Các phương pháp tách chiết thông thường thường khuấy mẫu vào dung môi [27] Các dung dịch thường được sử dụng là nước ở nhiệt độ phòng, nước sôi, thậm chí là dung dịch NaOH, KOH (2%) Phần còn lại được tách ra bằng cách ly tâm còn polysaccharides được kết tủa với ethanol theo tỷ lệ 2: 1 ( v / v )

Trong một số trường hợp, nước hoặc dung môi cơ bản không đủ mạnh để tách các polysaccharide không tan thì giải pháp có thể sử dụng các dung dịch có tính axit mang tính khả thi cao Một số axit, bao gồm acetic, formic, clohydric, axit phosphoric,

đã được thử nghiệm trong quá trình phân tách β- (1-3)-glucans không tan [94]

Các kỹ thuật tách chiết bằng dung môi thường sử dụng một lượng lớn các dung môi hữu cơ độc hại, thường là mất nhiều thời gian, và có sản lượng thu nhận thấp và độ chọn lọc cũng thấp Thêm vào đó, với các phương pháp tách chiết này, các chất cần tách chiết có thể tiếp xúc với nhiệt độ quá cao,cần ánh sáng và oxy, đòi hỏi phải có thời gian tách chiết dài, dẫn đến sự hoạt động của các enzyme phân hủy glucan Trong thời gian tách chiết, một số hợp chất có hoạt tính sinh học có thể dễ dàng bị mất do sự ion hóa, thủy phân và oxy hóa Do đó, các kỹ thuật phức tạp hơn như tách chiết bằng áp suất chất lỏng (PLE), tách chiết có siêu âm hỗ trợ hoặc dùng vi sóng có thể là một giải pháp tốt để phân tách các polysaccharides Bảng1.1 tổng hợp các kỹ thuật chính và các điều kiện cần thiết cho việc chiết xuất các polysaccharide từ nấm

Bảng 1.1 Một số phương pháp tách chiết polysaccharide từ nấm

10.1 MPa; 28°C; 70 phút - Thân thiện với môi trường;

- Lượng dung môi sử dụng ít, thường là nước;

- thời gian thực hiện ngắn;

- Là phương pháp tự động và sử dụng oxy, ánh sáng từ môi trường

Lentinus edodes

[112]

Chiết xuất dòng

siêu tới hạn (SFE)

35 MPa; tốc độ dòng 10 kg/h CO2; 25°C ; 4 giờ

- Sử dụng CO2 như các dung môi chiết;

- Thân thiện với môi trường;

- Nhiệt độ tương đối thấp và các dung môi hữu cơ được loại bỏ trong quá trình chiết xuất sẽ tránh được sự phân hủy các thành phần có hoạt tính sinh học;

- Hiệu suất tách chiết sẽ tốt

Ganoderma lucidum

Agaricus bisporus

- Lượng dung môi sử dụng ít;

- Quá trình chuẩn bị mẫu nhanh chóng

Agaricus blazei

-Giảm thời gian chiết nhưng làm tăng hiệu suất chiết và tiết kiệm năng lượng

Ganoderma lucidum

[29], [21]

Theo Lindequist và đtg (2005) thì 80- 85% các sản phẩm từ nấm dược liệu được thu nhận từ quả thể và chỉ 15- 20% được thu nhận từ sợi nấm và dịch nuôi cấy thông qua lên men chìm [121] Tuy nhiên, lên men chìm đã được chứng minh là có hiệu quả và khả năng kiểm soát tốt hơn cho quá trình sinh tổng tổng hợp các hợp chất

có dược tính từ Basidomysetes [33], [12], [8] Bước đầu tiên để thành công trong lên

men chìm là chọn lọc môi trường thích hợp cho mỗi chủng nấm để sinh tổng hợp một lượng lớn các chế phẩm sinh học Ngoài ra, quá trình thu nhận exopolysaccharide từ lên men lỏng cũng có nhiều ưu điểm hơn so với thu nhận từ quả thể Thời gian lên men chỉ khoảng 10-15 ngày so với nuôi cấy để thu quả thể có thể kéo dài đến 3 tháng [66] Dịch lên men chỉ qua bước kết tủa với ethanol ở 4oC trong khi một số polysaccharide được thu nhận từ quả thể nấm tốn nhiều thời gian, qua nhiều bước phức tạp để tách chiết và tách phân đoạn như tủa đường trong ethanol, lặp lại các bước tách chiết bằng nước nóng và dung dịch ammonium oxalate của NaOH, sau đó các polysaccharide đã được tách chiết lại trải qua nhiều bước làm sạch để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo Hiệu suất tách chiết từ dịch lên men cũng cao hơn so với các phương pháp tách chiết từ quả thể [56] Với những ưu điểm này, lên men chìm để thu một lượng lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học đang lựa chọn và nghiên cứu nhằm tìm ra phương pháp khả thi nhất

1.5 Đặc điểm cấu trúc của polysaccharide phân lập từ nấm

Các phân tích về cấu trúc của các polysaccharide giúp xác định các đặc điểm phân tử như khối lượng phân tử, thành phần chuỗi, cấu hình và các dạng đồng phân, trình tự các monosaccharide, sự có mặt và vị trí các nhánh, sự có mặt của các liên kết interglycosidic Ngày nay, có một loạt các kỹ thuật đặc trưng để có được các thông tin chi tiết về cấu trúc của các polysaccharide

Kích thước phân tử thường được xác định bằng phương pháp sắc ký loại trừ kích thước (size-exclusion chromatography- SEC) bằng cách so sánh với các vật liệu tiêu chuẩn

Thành phần monosaccharide có thể được nghiên cứu bằng cách thủy phân các polysaccharide trong axit và sau đó phân tích các loại đường tạo thành bằng

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high- performance liquid chromatography- HPLC ) bằng sắc ký khí ( gas- chromatography- GC ) [14]

Sự có mặt và vị trí xuất hiện của các nhánh có thể được xác định thông qua

sự hình thành các dẫn xuất như methyl acetate alditol, trimetylsilyl, acetyl, trifluoroacetyl, methaneboronate, acetal hoặc sự kết hợp của chúng và các phân tích tiếp theo có thể làm sáng tỏ bằng sắc ký khí khối phổ (GC/MS) [13] MS là một kỹ thuật vô cùng hữu ích vì nó chỉ đòi hỏi một lượng mẫu tương đối thấp (picograms hoặc ít hơn) và không cần polysaccharide quá tinh khiết Mặc dù các phân tích về cấu trúc của polysaccharide bằng MS có thể được thực hiện đối với nhiều olygosaccharides không dẫn xuất và các phức glyco nhưng các polysaccharides được O- methyl hóa vẫn được sử dụng để tăng tính ổn định của các ion và độ nhạy của MS GC/MS cung cấp thông tin về vị trí của liên kết glycosid, sự có mặt của các nhánh và thành phần monosaccharide trong các carbohydrate phức tạp

Polysaccharide có mặt trong tự nhiên ở cả 2 dạng cấu hình α và β; tuy nhiên các tính chất vật lý về cơ bản khác nhau phụ thuộc vào loại liên kết Do đó, việc làm sáng rõ các cấu hình liên kết là một vấn đề quan trọng trong nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một công cụ ưu việt để có được các thông tin về thành phần các monosaccharide và cấu hình anomeric, các liên kết trong chuỗi và xa hơn nữa là các kết quả phân tích sự methyl hóa [72]

1.6 Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance- NMR) trong nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide

Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân đã được sử dụng rộng rãi trong phân tích cấu trúc và cấu hình không gian của các polysaccharide trong dung dịch Giá trị

độ dịch chuyển hóa học và các hằng số tương tác thu được từ phổ NMR sẽ cung cấp các thông tin về loại đường và cấu hình anomeric

Phổ 1H-NMR của polysaccharide có thể khẳng định độ tinh khiết của mẫu (không có mặt của các tín hiệu các oligonucleotide, protein hay lipid) Phổ cũng có thể cho biết số monosaccharide thực từ số các cộng hưởng proton anomer thông qua các tín hiệu trong khoảng 4,3 đến 5,8 ppm Nếu các cấu hình là α thì sự thay đổi hóa

học là lớn hơn so với β Khi tín hiệu xuất hiện ở vùng 5,0- 5,8 ppm, cấu hình anomer

là α và nếu xuất hiện ở vùng 4,3- 5,0 ppm, thì đó là anomer β Như vậy dựa vào tỷ lệ tích phân tương đối của các cộng hưởng anomer cũng có thể đánh giá tỷ lệ phân tử của các monosaccharide Về mặt này kết quả phân tích hoá học có thể phù hợp với kết quả phân tích 1H-NMR Nhìn chung, kết quả tính tích phân NMR là chính xác hơn so với kết quả phân tích hoá học Nhiều nhóm thế có thể được xác định hoặc sự

có mặt của chúng được dự đoán dựa vào phổ 1D 1H-NMR Tiếp theo, số lượng chính xác của các monosaccharide có thể được khẳng định chính xác nhờ vào việc khảo sát vùng anomer của phổ 2 chiều dị hạt nhân 1H-13C-HSQC

Độ dịch chuyển hoá học của proton anomer (4,4 –5,8 ppm) được tách biệt một cách không hoàn toàn rõ rệt khỏi các cộng hưởng 1H ở các vị trí khác (3,2– 4,5 ppm) trong khi độ dịch chuyển 13C anomer (95 – 110 ppm) lại tách biệt rất rõ, không hề trùng chập với các cộng hưởng 13C ở các vị trí còn lại (60 – 85 ppm)

Dạng vòng (hexose hay furanose) và các cấu hình anomer được suy ra từ các thông tin kết hợp có giá trị từ độ dịch chuyển hoá học 1H (H cộng hưởng giữa 5,0 và 5,8 ppm trong khi H cộng hưởng trong khoảng 4,4 và 5,2 ppm) với hằng số tương tác vô hướng của C-1, H-1 (1JC-1, H-1 165-175 Hz đối với  trong khi 1JC-1, H-1 158-165

Hz đối với ) Tương tác dị hạt nhân liên kết 1JC-1,H-1 có thể thu được từ phổ 1H – 13C HSQC không khử tương tác

Ở phổ 13C-NMR, các carbon trong vòng được tìm thấy trong khoảng 50- 85 ppm trong đó các carbon gắn với nitơ xuất hiện ở trong khoảng 65- 75 ppm Các carbon tham gia vào quá trình glycosyl hóa dịch chuyển xuống một khoảng 5-10 ppm Các nguyên tử C6 không thế được tìm thấy quanh vùng 60- 63 ppm và các carbon C6 liên kết với các đường dư khác xuất hiện quanh vùng 65- 70 ppm Các tín hiệu carbon của các nhóm methyl hóa được tìm thấy trong khoảng 15-30 ppm và các carbon carbonyl hóa được tìm thấy ở 165- 185 ppm (Bảng 1.2) [72]

Bảng 1.2 Độ chuyển dịch hoá học δ(ppm) từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của

4,840,46 102,92,4

5,160,35 99,13,1

4,680,26 103,52,4 H-2

C-2

3.520,06 72,51,0

3,310,05 74,11,1

3,890,12 68,91,3

3,530,17 71,72,1 H-3

C-3

3,760,10 73,80,4

3,550,07 76,31,4

3,930,16 70,21,7

3,800,16 73,51,7 H-4

C-4

3,410,05 70,70,6

3,510,13 70,41,0

4,120,19 68,61,9

4,080,18 67,92,0 H-5

C-5

3,740,10 72,90,5

3,550,09 76,01,3

4,110,29 71,02,0

3,740,20 75,51,1 H-6a

C-6

3,640,16 61,40,4

3,770,05 61,51,0

3,730,07 61,70,8

3,740,05 61,80,7 H-6b 3,780,08 3,940,05 3,730,04 3,740,05

Các vị trí được thế của monosaccharide được gọi là vị trí aglycon tương ứng với các nguyên tử C ở các vị trí không phải anomer của liên kết glycoside Từ dữ liệu NMR, vị trí liên kết được suy ra dựa trên sự tăng mạnh (> + 3ppm) về độ dịch chuyển hoá học của 13 C so với độ dịch chuyển hoá học của các monomer không thế Việc phân tích này cũng mang lại thông tin giống với những phân tích khi methyl hoá Trật

tự các đơn phân trong mạch của polysaccaride được xác định chính là chuỗi các liên kết glycoside, thể hiện thông tin cấu trúc chính cần xác định thu được từ hai loại phổ HMBC và NOESY

Kỹ thuật NMR hai chiều (2D) bao gồm phổ tương quan (COSY), phổ tăng cường định kỳ Overhauser (ROESY), hiệu ứng quang phổ hạt nhân Overhauser (NOESY) và sự kết hợp lượng tử đa dị nhân (HMQC) làm sáng tỏ cấu trúc của polysaccharide gồm thành phần monosaccharide, liên kết glycosidic

1.7 Tính chất vật lý của polysaccharide

Các tính chất vật lý như độ tan trong nước, độ nhớt, độ đặc là các yếu tố quan trọng gần như quyết định khả năng sinh học và các hoạt động sinh lý khác Hầu

hết các nghiên cứu về tính chất vật lý của các polysaccharide đã được thực hiện đối với các β - glucans từ ngũ cốc, tuy nhiên ngày nay các polysaccharide phân lập từ nấm đang chiếm được tầm quan trọng ngày càng lớn với số lượng các nghiên cứu tăng đáng kể

1.7.1 Khối lượng phân tử của polysaccharide

Khối lượng phân tử (MWS) của các polysaccharide khác nhau tùy thuộc vào phương pháp xác định Các β- glucan tan trong nước từ nấm có khối lượng phân tử trong khoảng 105-106 Da Phương pháp sắc ký kích thước loại trừ kết hợp với tán xạ ánh sáng laser đa góc (SEC-LLS) thường được sử dụng để đo kích thước các phân tử

Theo đó, khối lượng phân tử của polysaccharides từ Auricularia auricula-judae là 2,15- 106 Dal [143], các carbohydrate từ Ganoderma lucidum là 1,24- 105 Dal [132]

và từ Pleurotus tuber-regium là 3.14- 105 Dal [124] Các kỹ thuật tương tự được kết

hợp với các kỹ thuật dò khác nhau, chẳng hạn như chỉ số khúc xạ (HPLC - RI , đã

chứng minh rằng các polysaccharides từ Calocybe indica có khối lượng phân tử là 2-

105 Dal [80] , từ bào tử của Ganoderma lucidum là 1,26- 105 Dal [9], và một carbohydrate phân lập từ quả thể của Pleurotus Sajor - caju có khối lượng phân tử

9,75- 105 Dal [17]

1.7.2 Độ hòa tan của polysaccharide từ nấm

Độ tan trong nước của các polysaccharide phụ thuộc rất nhiều vào loại liên kết xuất hiện trong chuỗi Thông thường, cụm các liên kết liền kề cùng loại như β- (1 → 3) hoặc β- (1 → 4) có xu hướng tổng hợp các liên kết trong chuỗi thông qua các liên kết hydro mạnh mẽ do đó có thể góp phần làm tăng độ cứng của các phân tử trong dung dịch và độ hòa tan thấp hơn Sự kết hợp của các liên kết tiếp giáp β- (1 → 4) hay β- (1 → 3) tạo nên các liên kết dài giống như cellulose và kết quả là các polysaccharide không tan Curdlan và các liên kết β- (1 → 3) glucan khác thường không tan trong nước, rượu, và hầu hết các dung môi hữu cơ nhưng tan trong các dung dịch có tính kiềm như 0,25 M NaOH, Dimethylsulfoxide (DMSO), acid formic,

và một số thuốc thử dung môi không proton [87] Các polysaccharide có cấu trúc lặp của các liên kết đơn vị (1 → 3), (1 → 6) glucose - thường rất cứng, hình que, có hình

xoắn ba trong dung dịch nước Ba sợi xoắn được giữ với nhau và ổn định bằng các liên kết hydro mạnh Một số điều kiện có thể phá vỡ các chuỗi xoắn ba, chẳng hạn như nồng độ DMSO ≥ 87%, nhiệt độ ≥ 135°C, hoặc bổ sung natri hydroxide > 0,2 mol /L để xoắn ba phân ly gần như hoàn toàn thành các chuỗi đơn và làm tăng khả năng tăng khả năng hòa tan

Sự hiện diện của các mối liên kết khác nhau trong cấu trúc phá vỡ tính cân đối của các trình tự và làm cho các phân tử hòa tan và linh hoạt hơn Các khoảng cách bất thường trong chuỗi β– glucan chịu trách nhiệm tạo nên hình dạng tổng thể cho polysaccharide và do đó các chuỗi không thể sắp xếp chặt chẽ trên các vùng mở rộng, tăng độ tan trong nước của các polysaccharide Tuy nhiên, sự hiện diện của một mô hình lặp đi lặp lại xen kẽ các mối liên kết như ba phần cellotriosyl liên tiếp có thể tạo thành hình dạng ổn đinh Phần đã được sắp này có thể áp đặt một số cấu hình không đều đặn lên chuỗi β – glucan và do đó hình thành mức độ tổ chức cao hơn của các polyme trong dung dịch dẫn đến khả năng hòa tan thấp [122]

Sự xuất hiện của các monosaccharide khác nhau trong chuỗi có thể điều chỉnh

độ hòa tan Sự hiện diện của monosaccharide khác nhau như nhóm thế arabinosyl, xuất hiện để ngăn chặn sự kết hợp này và làm cứng các phân tử lại bằng cách duy trì khung xylan trong một cấu hình mở rộng hơn [95]

1.8 Vai trò của polysaccharide từ nấm đối với sức khỏe

1.8.1 Tính kháng u, điều trị ung thư và miễn dịch của polysaccharide

Polysaccharide từ nấm đã được sử dụng rộng rãi và có tác dụng trong điều trị khối u bởi chúng làm tăng cường miễn dịch của cơ thể Các polysaccharide với hoạt tính kháng u mạnh có cấu trúc hóa học khá đa dạng từ homoglycan cho tới các heteroglycan với các loại monomer như glucose, galactose, mannose, xylose, arabinose, fucose, ribose, axit glucuronic Ngoài các β-glucan mạch thẳng, một số β-glucan mạch nhánh cũng có hoạt tính kháng u Nhóm các polysaccharide có hoạt tính kháng u thường là heteroglycan gồm các galactan, fucan, xylan, và mannan tùy thuộc vào loại đường đơn trong chuỗi chính và các đường nhánh gồm arabinose, mannose, fucose, galactose, xylose, axit glucuronic [118], [119]

Nhiều polysaccharide có hoạt tính kháng u đã được tìm thấy trong quả thể,

trong khuẩn ty hoặc trong dịch lên men của một số nấm đảm Basidiomycetes Những

chất này tuy khác nhau về thành phần hóa học, cấu trúc không gian và hoạt tính kháng u nhưng phần lớn thuộc nhóm b-1,3/1,6-glucan Hoạt tính kháng u ở nấm phần lớn do các polysaccharide có đơn phân tử là glucose và được gọi chung là glucan Trong các phân tử glucan có tương đối nhiều kiểu liên kết, và phần nhiều trong số đó

là heteroglycan Các phân tử glucan này tập trung chủ yếu ở vách tế bào nấm cùng với một số polysaccharide khác như chitin, cellulose, galactomannan-protein, glucuromannan-protein v.v.Tuy nhiên, chitin, chitosan hay cellulose không có hoạt tính kháng u

Các cơ chế hoạt động kháng u của các polysaccharide không hoàn toàn rõ ràng; người ta tin rằng hoạt động gây nguyên phân của các polysaccharide từ nấm gồm nhiều phản ứng miễn dịch thông qua việc kích hoạt các tế bào miễn dịch cụ thể để tăng cường một loạt các chức năng của tế bào Chúng bao gồm việc kích hoạt các đại thực bào, tế bào lympho T và các tế bào diệt tự nhiên (NK)- là các tế bào có khả năng tiết chất trung gian gây kích thích và các cytokine như các yếu tố hoại tử khối u α (TNF - α), interferon γ (IFN - γ), hoặc 1β interleukin (IL - 1β) Các polysaccharide cũng có thể ức chế các protein E - selectin và sự biểu hiện gen, ức chế tế bào ung thư bám dính tế bào (tumoral cell-to-cell adhesion) [148] Các cơ chế khác bao gồm các hiệu ứng chống tăng sinh (antiproliferative), sự cảm ứng cơ chế gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis), và sự khác biệt của các tế bào ung thư [130]

Các nghiên cứu đã chứng minh rằng các polysaccharide được phân lập từ các chi nấm khác nhau đa số có khả năng cung cấp các hoạt tính kháng ung [51], [66], [71] [130] [148] Một số nghiên cứu lâm sàng đã làm rõ được tác dụng ức chế ung

thư của Lentinus edodes [149] [48], Grifola frondosa [15], Schizophyllum commune [15] [48], Ganoderma lucidum [69] [78], Trametes versicolor [48], Inonotus obliquus [91], Phellinus linteus [50], Flammulina velutipes [82], Hypsizygus marmoreus [83] Ophicordyceps (Cordyceps), [49] Agaricus brasiliensis [136] và Tremella mesenterica [71] [64] Bảng 1.3 trình bày một số polysaccharide có hoạt tính kháng

ung thư từ nấm điển hình

Hình 1.1 Cơ chế tham gia miễn dịch của β- glucan từ nấm

Các hợp chất miễn dịch được tách từ hơn 30 loài nấm thuốc đã chứng minh hoạt động kháng u trong điều trị ở động vật Tuy nhiên, chỉ một số ít đã được thử nghiệm tiềm năng chống ung thư ở người Một vài nghiên cứu trong số đó đã được tiến hành mà đối tượng là β-d-glucans hoặc phức hợp β-d-glucans liên kết với protein Hơn nữa, các thử nghiệm cũng cho thấy hoạt tính miễn dịch của phức hợp β-d-glucan- protein cao hơn so với glucan tự do Hình 1.1 minh họa cơ chế miễn dịch đơn giản của β- glucan [8]

Các hoạt chất miễn dịch hoạt động chủ yếu bằng cách cải thiện hệ thống miễn dịch của vật chủ Như đã đề cập ở phần trên, quá trình này bao gồm kích hoạt các tế bào đuôi gai, tế bào tiêu diệt tự nhiên (NK), tế bào T, đại thực bào, và sinh ra các cytokine Một số sản phẩm của nấm thuốc, chủ yếu là các polysaccharide (đặc biệt là β-glucans), được phát triển cho mục đích lâm sàng và thương mại như Krestin (PSK)

và PSP (Polysaccharide peptide) từ T versicolor; Lentinan được phân lập từ L edodes; Schizopyllan (Sonifilan, Sizofiran, hoặc SPG) từ S commune; Befungin từ I

obliquus; D-fraction, từ Gr frondosa; GLPS polysaccharide phần từ Ga lucidum;

hexose hoạt động tương quan hợp chất (AHCC); và nhiều hoạt chất khác

Bảng 1.3 Một số polysaccharide có hoạt tính kháng ung thư từ

các loài nấm điển hình

Loài Trị u hay ung thư Nguồn gốc

phân lập Cấu trúc hóa học Tên gọi

C versicolor Ung thư hệ tiêu

hóa, phổi và vú Sợi nấm

Chuỗi β -1,3-glucan

có nhánh β-1,4 và 1,6 PSK và PSP

L edodes Ung thư dạ dày Quả thể β1,3/1,6-glucan Lentinan

S commune Ung thư cổ tử cung Dịch lên men β1,3/1,6-glucan Schizophyllan

G lucidum Chữa ung thư Quả thể,

Sợi nấm

β-glucan, heteropolysaccarit glycoprotein

Ganoderans Protein LZ8 GLP

A blazei Chữa ung thư Quả thể,

Sợi nấm β-1,6-glucan

G frondosa Chữa ung thư Quả thể

Galactoxyloglucan-protein complex

Sclerotium rolfsii,

S glucanicum β-1,3/1,6-glucan Scleroglucan

1.8.2 Hạ lipid máu và hạ đường huyết

Hầu hết các polysaccharide có hoạt tính sinh học từ nấm có thể ví như là chất

xơ, vì vậy chúng không được tiêu hóa trong hệ tiêu hóa ở người [40] Theo các

nghiên cứu trên một vài động vật và ở người, glucan từ các nấm L endodes, G lucidum, S commune, P ostreatus, G frondosa, A blazei, C sinensis và C miltaris

có khả năng làm giảm lượng đường trong máu và cholesterol trong huyết thanh [ 65], [70] Tác dụng hạ đường huyết có được thông qua việc gắn các polysaccharide khó tiêu hóa vào biểu mô ruột làm giảm tốc độ hấp thu glucose trong khi hiệu ứng hypolipidemic là do sự gián đoạn tuần hoàn ruột gan của các axit mật [40], [65]

Bệnh tim mạch (Cardiovascular Disease- CVD) là một trong những nguyên nhân chính gây tử vong ở các nước đang phát triển Bệnh tim mạch do nhiều nguyên nhân gây ra và bệnh sinh của các hình thức động mạch của bệnh tim mạch có liên quan đến xơ vữa động mạch Một số dấu hiệu sinh học có nguy cơ tiềm ẩn liên quan

đến bệnh tim mạch đã được xác định, như sự chuyển hóa lipid và lipoprotein (mật độ lipoprotein thấp [LDL] và mật độ lipoprotein cao [HDL], hàm lượng cholesterol và triacylglycerol), chức năng đông máu, tổn thương oxy hóa, chuyển hóa homocysteine, huyết áp [89] Polysaccharides từ nấm đã được chứng minh có khả năng bảo vệ và chống lại bệnh tim mạch và các biến chứng của chúng Ở đường ruột, β-glucans làm giảm sự hấp thu cholesterol và các chuỗi axit béo dài [30] Chuột đực được cho ăn 2%

cholesterol và 1% polysaccharide loại β-glucan ngoại bào tách chiết từ Volvariella volvacea (nấm rơm) cho thấy cholesterol tổng số trong huyết thanh giảm đáng kể,

LDL-cholesterol trong gan và cholesterol toàn phần cũng giảm ở các mức độ khác nhau Trong khi đó không có thay đổi nhiều triacylglycerol trong huyết thanh; HDL-cholesterol và lipid gan tổng số [23] Tương tự như vậy, các polysaccharide từ

Agaricus auricula có hiệu quả đáng kể làm giảm cholesterol và HDL cholesterol tăng

trong chuột được nuôi với chế độ ăn giàu cholesterol [19] Các phân đoạn

polysaccharide từ nấm Pleurotus nebrodensis đã được chứng minh có khả năng làm

giảm huyết áp tâm thu ở những chuột mắc chứng tăng huyết áp tự nhiên [90] Ảnh

hưởng của dịch chiết từ Cordyceps sinensis trong nước nóng được đánh giá ở chuột

với chế độ ăn uống không chứa cholesterol và chuột với chế độ ăn giàu cholesterol Lượng cholesterol huyết thanh tổng của tất cả các nhóm chuột giảm sau khi có sự tác động của polysaccharide Trong số chuột được nuôi với chế độ ăn giàu cholesterol, mức HDL cholesterol tăng nhưng giảm mật độ lipoprotein xuống rất thấp (VLDL) và giảm mức cholesterol LDL [62]

Ngoài ra, các polysaccharide có hoạt tính sinh học từ nấm cũng có tác dụng hạ đường huyết thông qua sự điều tiết quá trình chuyển hóa carbonhydrat và tổng hợp insulin Các polysaccharide đường uống có vai trò rất quan trọng vì chúng có thể được sử dụng làm thực phẩm chức năng cho người bệnh tiểu đường

1.8.3 Tính chống oxy hóa của polysaccharide từ nấm

Các polysaccharide được chiết xuất từ các nấm G lucidum, T versicolor, L endodes, P linteus và Agaricus có khả năng khử và đặc tính tạo phức và có thể ức

chế sự oxy hóa lipid hoặc stress oxy hóa- khử Những tác dụng trên có liên quan đến

sự có mặt của β- glucan và một phenolic (chủ yếu là tyrosine và ferrulic acid) bán liên kết với chuỗi chính β- glucan bằng các liên kết cộng hóa trị [40], [63], [147]

Mặc dù các hợp chất phenolic có trong quả thể và sợ nấm của G lucidum là các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất nhưng polysaccharide của G lucidum cũng

thể hiện đặc tính khử các gốc tự do, thế khử và ức chế peroxy hóa lipid [47], [127] Saltarelli và đtg (2009) đã nhận thấy trong số các polysaccharide khác nhau được

chiết từ sợi nấm của G lucidum thì các polysaccharide khối lượng phân tử thấp có

hoạt tính chống oxy hóa cao nhất, dựa vào hoạt tính tạo phức với Fe2+, xác định lipoxygenase và gốc tự do1,1- diphenyl- dipicrylhydrazyl (DPPH) trong khi đó các polysaccharide nội bào không có tác dụng chống oxy hóa [110] Tương tự, các nghiên

cứu in vitro đã chỉ ra rằng peptidedoglucan từ G lucidum có tác dụng bảo vệ ty thể,

lưới nội chất và các tiên mao của các đại thực bào khỏi các tác dụng tie cực từ hóa chất và các biến cố [146] Thêm nữa, dịch chiết trong methanol của các glucan và

proteoglucan từ G lucidum và G tsugae cũng thể hiện hoạt tính chống oxy hóa bằng

cách thu các yếu tố của phản ứng oxy hóa [65]

Một cơ chế chống oxy hóa khác là khả năng của các polysaccharide trong việc hạn chế quá trình sản xuất các gốc oxy tự do từ nấm và hoạt động của các tế bào đơn nhân ngoại vi ở các đại thực bào có gai, điều này liên quan đến quá trình suy hô hấp

và lão hóa [142], [146], hoặc làm tăng hoạt tính của các enzyme chống oxy hóa trong

huyết thanh [141] Các dịch chiết trong methanol từ sợi nấm của các loài G frondosa,

M esculenta và Termitomyces albuminosus cũng thể hiện các hoạt tính chống oxy

hóa nhưng chủ yếu liên quan đến sự có mặt của các hợp chất phenolic trong dịch chiết [84] Các polysaccharide khác từ nấm bao gồm các polysaccharide được chiết

bằng nước từ quả thể của G lucidum, Auricularia auricula và Cordyceps militaris

cho thấy có các đặc tính thu dọn, tạo phức và tính khử do đó làm tăng hiệu quả chống oxy hóa tổng số [22], [75], [140], [92] Không chỉ các dịch chiết từ quả thể, một số nghiên cứu đã tìm thấy hoạt tính chống oxy hóa của dịch nuôi cấy và sinh khối nấm

thu được trong điều kiện lên men lỏng Trong môi trường nuôi cấy Hericium enrinaceum có bổ sung các nguồn selen (sodium selenite và selol), một

exopolysaccharide chứa selen được sinh tổng hợp Exopolysaccharide này bộc lộ khả

năng chống oxy hóa tuyệt vời, dựa trên sự khử và ức chế quá trình peroxy hóa lipid

và thu dọn các gốc tự do DPPH [79] Hai mươi lăm chủng nấm thuộc các chi

Agaricus, Lentinus, Schizophyllium, Pleurotus sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt

tính chống oxy hóa với hoạt tính thu được từ 753 đến 9.384 % quercetin/l/ngày theo một công bố của Umeo và đtg [202]

1.8.4 Prebiotic từ nấm

Prebiotic là các chất tiền trợ sinh học tạo ra thức ăn và môi trường thuận lợi cho vi khuẩn có lợi (probiotic) phát triển trong đường ruột Các chất tiền trợ sinh học này góp phần duy trì sự cân bằng của hệ vi khuẩn đường ruột, kích thích miễn dịch đường tiêu hóa, giảm khả năng ung thư ruột kết, giảm cholesterol trong máu Các tác dụng prebiotic từ các polysaccharide từ nấm cũng đã được mô tả trong nhiều nghiên cứu Vì các enzyme tiêu hóa của người không thể thủy phân liên kết β-glucosid nên nhiều polysaccharide nấm có thể hoạt động như là các nguồn prebiotic [8] Synytsya

và đtg (2009) đã đánh giá hiệu quả prebiotic của các glucan được phân lập từ quả thể

của P ostreatus và P eryngii trên một vài chủng probiotic như Lactobaciluss, Bifidibacterium và Enterococusii [123] Cả 2 dạng glucan tan trong nước β-1,3/β-1,6-

glucan và gtan trong kiềm α-1,3-glucan của các loài nấm nói trên đều được đánh giá

là có khả năng kích thích sự tăng trưởng của các vi khuẩn probiotic, đặc biệt là các

glucan từ P eryngii Trong một nghiên cứu khác, các β- glucan từ màng cứng của P tuber-regium đã được đánh giá hiệu quả của chúng đối với Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, và Bifidobacterium adolescentis trong môi trường dịch thể,

sử dụng inulin như là chất kiểm soát prebiotic [150] Người ta nhận thấy rằng sau 24 giờ lên men, quần xã vi khuẩn có ích có bổ sung glucan từ nấm có mức tăng trưởng gấp 3-4 lần tương tự như sự tăng trưởng khi bổ sung inulin [150] Gần đây, Chou và đtg (2013) đã chỉ ra rằng các polysaccharide từ các phần bỏ đi của nấm như cuống

của L.endodes, gốc của P.eryngii, và gốc của F.velutipes có thể làm tăng tỷ lệ sống sót của Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus casei , và B longum trong sữa chua

[25] Các tác giả cũng quan sát thấy tác dụng hiệp đồng của các polysaccharide với các peptide và amino acid có trong môi trường sữa chua để duy trì số lượng vi khuẩn

có lợi trên 107 CFU/ml ở điều kiện lạnh Họ cũng phát hiện ra rằng các

polysaccharide từ nấm có tác dụng đáng kể trong bảo vệ (tăng tỷ lệ sống) cho các vi khuẩn có lợi probiotic trong dịch dạ dày và mật mô phỏng

1.8.5 Tính kháng virus của polysaccharide từ nấm

Một vài polysaccharide từ nấm dược liệu và nấm ăn đã được công bố có các chất thể hiện hoạt tính kháng virus thông qua tăng sự giải phóng IFN- γ và tăng cường sự phát triển của các tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC- peripheral blood

mononuclear cell) [70], [81] Các dịch chiết carbohydrate khác nhau từ nấm Lentinus edodes đã được thử nghiệm và kết quả chỉ ra rằng dịch chiết này có hoạt tính kháng

virus gây bệnh sốt bại liệt loại 1 (PV - 1) và virus đậu bò loại 1 (BoHV - 1) Các minh chứng thu được cho thấy các polysaccharide có tác dụng kháng virus và chúng hoạt động ở giai đoạn đầu của quá trình sao chép ở cả hai chuỗi virus [108] Đối với việc điều trị vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV), chưa có một số lượng nghiên cứu thực nghiệm đủ lớn liên quan đến các polysaccharide từ nấm Đáng chú ý,

lentinan và một proteoglucan có tính acid từ G lucidum đã được áp dụng thành công

như một liệu pháp điều trị bổ sung đối với HIV trong việc kết hợp với các thuốc kháng HIV thông thường vì chúng có khả năng tăng cường sức đề kháng đối với virus HIV và hạn chế độc tính của các thuốc chống HIV Một nghiên cứu đã được tiến hành đối với 88 bệnh nhân HIV dương tính với CD4 ở mức 200-500 tế bào/mm

Các bệnh nhân được điều trị với sự kết hợp của lentinan polysaccharide từ L edodes

và didanosine (ddI) Sự kết hợp này đã tạo nên sự tăng đáng kể CD4 kéo dài đến 38 tuần, trong khi nếu chỉ điều trị bằng ddI thì mức tăng CD4 là 5 % ở 14 tuần [42]

Hoạt tính kháng HIV tương tự cũng đã được phát hiện ở các glucan từ G frondosa và

T versicolor [70], [81]

1.8.6 Hoạt tính kháng khuẩn của polysaccharide từ nấm

Sự phát triển của kháng sinh là một trong những thành tựu khoa học quan trọng nhất trong 70 năm qua Các hợp chất này hoạt động bằng nhiều cách như can thiệp vào quá trình chuyển hóa hoặc trong các cấu trúc sinh vật [38] Trong những năm gần đây, việc ứng dụng các thuốc kháng sinh thương mại được tổng hợp hóa học

đã thu hút sự quan tâm của lớn do các tác động nguy hại của chúng đến sức khỏe

Hiện tượng kháng các thuốc kháng sinh hiên nay đang là mối quan tâm lớn của các bác sỹ, bệnh nhân, các nhà sản xuất dược và cộng đồng [86] Ngoài ra, việc điều trị các bệnh truyền nhiễm phổ biến ngày càng trở nên phức tạp do sự gia tăng tính kháng nhiều loại thuốc của các vi sinh vật gây bệnh ở con người Vì vậy, điều thiết yếu là phải phát triển các tác nhân điều trị mới và hiệu quả chống lại được các mầm bệnh kháng thuốc [10] Mặc dù số lượng các hợp chất kháng khuẩn rất nhiều và đa dạng nhưng thực tế sự kháng lại kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh đang có chiều hướng gia tăng mạnh Năm 2010, tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã khuyến cáo tất cả các nước tiến hành việc kiểm soát sự lây truyền của các vi khuẩn kháng đa thuốc cũng như nêu bật lên những rủi ro gặp phải khi thiếu các trị liệu luân phiên để chống lại các vi sinh vật trên [138] Hiện tượng kháng đa thuốc kháng sinh của các vi sinh vật gây bệnh ở người đang ngày càng gia tăng do việc sử dụng các kháng sinh thương mại một cách bừa bãi, các kháng sinh này được sử dụng chung trong điều trị nhiều bệnh nhiễm trùng [113] Các nhà nghiên cứu nhận ra rằng liều lượng kháng sinh thấp không có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn nhưng có tác dụng ức chế chúng

Các bệnh viêm nhiễm trước đây có thể dễ dàng chữa bằng kháng sinh thì ngày nay lại trở nên nghiêm trọng do kháng lại kháng sinh [139], [101] Mối liên hệ giữa các vi sinh vật đa kháng khuẩn và các bệnh nhiễm trùng bệnh viện là vấn đề cấp bách cần được giải quyết đối phó [102] Vì vậy, việc nghiên cứu các chất kháng sinh mới hay các chất kháng khuẩn không phải là kháng sinh có hiệu quả kháng lại các vi sinh vật gây kháng thuốc hiện nay thực sự rất quan trọng Các nhóm các sinh vật mới, trong đó có nấm có thể là một nguồn thay thế có tính kháng vi sinh vật mới

Các phương pháp khác nhau đã được sử dụng để xác định hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất và dịch chiết từ nấm, bao gồm các phương pháp pha loãng, phương pháp khuếch tán đĩa, phương pháp vết pha loãng trên aga dựa trên cơ sở khuếch tán xuyên tâm và hơn nữa là xác định số lượng khuẩn lạc Do đó, các kết quả

về hoạt tính kháng vi sinh vật được biểu diễn bằng các đơn vị khác nhau

Tác động kháng khuẩn của các nấm từ khắp nơi trên thế giới và các hợp chất tách chiết từ chúng đã được tổng hợp Kết quả này rất hữu ích cho các nghiên cứu

khoa học trong tương lai Cả các nấm ăn được và không ăn được đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn kháng lại các vi sinh vật gây bệnh, trong đó có các vi khuẩn liên

quan đến nhiễm trùng bệnh viện như Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas maltophila, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Proteus mirabilis, Serratia marcescens và các vi khuẩn đa

kháng như MRSA, MRSE, VREF, PRSP, ERSP

Các số liệu cho thấy các dịch chiết nấm và các hợp chất phân lập được thể hiện hoạt tính kháng lại vi khuẩn Gram dương cao hơn so với Gram âm Trong các nấm,

Lentinus edodes là loài đã được nghiên cứu là tốt nhất và gần như có hoạt động kháng

khuẩn kháng lại cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương Các chủng nấm thuộc các chi

Boletus, Ganoderma và Lepista hứa hẹn nhiều tiềm năng cho các nghiên cứu trong

tương lai Xét về số lượng các nghiên cứu đối với các hợp chất riêng biệt thì Plectasin

peptide- phân lập từ Pseudoplectania nigreella biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn cao

nhất kháng lại các vi khuẩn Gram dương

Các nghiên cứu về nấm là rất rộng với hàng trăm loài đã được chứng minh là

có phổ ứng dụng trong công nghiệp y dược bao gồm cả các hoạt tính kháng khuẩn Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào đánh giá các đặc tính kháng khuẩn của dịch chiết từ quả thể nấm Thực tế chưa có nhiều các nghiên cứu về xác định các đặc tính kháng khuẩn cho các hợp chất riêng biệt, mới chỉ một số hợp chất có phân tử lượng thấp và một vài peptide đã được mô tả Sau khi cơ chế hoạt động của chúng được làm sáng tỏ, các chất chuyển hóa từ nấm hoặc các hợp chất có liên quan khác có thể được

sử dụng để phát triển trong lĩnh vực dinh dưỡng hoặc như các loại thuốc có hiệu quả chống lại các vi sinh vật gây bệnh đã kháng lại các phương pháp điều trị thông

thường [145]

1.9 Laccase và ảnh hưởng của nó đến sức khỏe con người

1.9.1 Tổng quan về laccase

Laccase (p-benzenediol: oxygen oxidoreductase, E.C.1.10.3.2) là một

polyphenol enzyme thuộc nhóm enzyme oxydase Trong phân tử có chứa 4 nguyên tử đồng có khả năng oxy hóa cơ chất sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử

Laccase có phổ cơ chất khá đa dạng bao gồm: diphenol, polyphenol, các dẫn xuất phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, polychlorinated biphenyl (PBC), dioxin

và cả hợp chất vô cơ như iot Các loại laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau thì khác nhau về khối lượng phân tử, tính chất glycosyl hóa và các tính chất động học [28] Laccse được phân bố rộng rãi ở cả thực vật, nấm đảm, nấm sợi, xạ khuẩn và vi khuẩn Tuy nhiên cho đến nay, laccase chủ yếu được phát hiện ở nấm đảm

(Basidomycetes với hoạt tính cao), đặc biệt là ở các loài nấm có khả năng phân hủy lignocellulose như Agaricus basidomyces, Botrytis cinerea, Chaetomium thmophilum, Coprius, cinereus, Neurospora crassa, Phlebia radiatre, Pleurotus otreatus, Pycnoporus cinnabarius, Trametes versicolor v.v

Trong những năm gần đây, laccase được đặc biệt quan tâm bởi những ứng dụng rộng rãi của nó trong xử lý môi trường và nhiều ngành công nghiệp khác nhau như dệt nhuộm, tổng hợp hữu cơ, thực phẩm và tiềm năng trong lĩnh vực mỹ phẩm, dược phẩm và bảo vệ sức khỏe con người

1.9.2 Ứng dụng của lacacse trong lĩnh vực bảo vệ sức khỏe

Do tính đặc thù và bản chất sinh học của chúng nên laccase có tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực y dược và đang được quan tâm nghiên cứu

Chứng viêm da nhiễm độc do nhựa cây (kết quả của việc da tiếp xúc với các chất độc từ cây thường xuân, cây yến mạch hay cây sơn mà chủ yếu là từ nhựa) chủ yếu do urushiol- một chất độc là dẫn xuất của catechol gây nên Khi urushiol bị oxy hóa trở thành dẫn xuất ο- quinone thì lại trở thành một chất không độc Lacase thể hiện tính oxy hóa, polymer hóa và khử độc urushiol từ đó hạn chế được ảnh hưởng của chứng viêm da do nhiễm độc nhựa cây

Một ứng dụng tiềm năng khác của laccase trong lĩnh vực này là dựa vào sự

vận phát sinh iodine insitu Laccase có thể oxy hóa iodide để tạo thành iodine- một

loại thuốc thử được sử dụng một cách rộng rãi như một loại thuốc tẩy Việc ứng dụng

hệ thống sinh iodine bằng hệ thống laccase- muối iodide để khử trùng mang lại nhiều tiến bộ hơn so với sử dụng trực tiếp iodine Thứ nhất, muối iodide có tính ổn định và

an toàn hơn so với I2 trong việc bảo quản, vận chuyển và sử dụng Thứ hai là việc giải phóng iodine từ hệ laccase- iodide dễ dàng điều khiển (có thể điều chỉnh bằng hoạt độ

laccase) Hệ thống này có thể được sử dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp như dược phẩm, nội thất, chăm sóc sức khỏe, khử trùng nước uống hay nước bể bơi cũng như trong việc tẩy sạch các dây quấn vô cùng nhỏ

Ngoài ra laccase còn được ứng dụng trong công nghệ khử mùi vì laccase có khả năng oxy hóa nhiều hợp chất thiol và các hợp chất chứa sulphur Thậm chí hệ laccase còn có khả năng khử những mùi hôi thối thành mùi thơm nhờ khả năng tấn công và biến đổi các phân tử hoặc tiêu diệt các vi sinh vật gây nên những mùi hôi thối này Laccase còn được sử dụng như là chất xúc tác trong quá trình sản xuất các thuốc chống ung thư Thậm chí laccase còn là thành phần của nhiều mỹ phẩm Nhiều cảm biến sinh học có chứa laccase đã được phát triển cho các xét nghiệm miễn dịch

và xác định glucose, các amin thơm và các hợp chất phenol (Kunamneu và đtg, 2008) Laccase tạo liên kết đồng hóa trị với các phân tử liên kết sinh học như kháng thể, kháng nguyên, DNA, RNA, biotin và streptavidin có thể được sử dụng như một enzyme đánh dấu cho các xét nghiệm phát hiện trong hóa học mô, hóa học miễn dịch, hóa học tế bào hay axit nucleic (Schmid và Urlacher, 2007)

Nấm dược liệu cũng chứa một số các enzyme như laccase, superoxide dismutase, glucose oxidase, và peroxidase Các enzyme này cũng đã được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong các liệu pháp điều trị ung thư bằng cách ngăn chặn sự oxy hóa và ức chế sự tăng trưởng của các tế bào ung thư Nhiều sản phẩm được tạo ra từ laccase như các nhân tố kháng khuẩn, giải độc hay chăm sóc sức khỏe con người Laccase có thể được sử dụng trong quá trình tổng hợp các hợp chất phức tạp có dược tính như thuốc mê, thuốc kháng viêm, thuốc kháng sinh, an thần v.v., bao gồm triazolo(benzo)cycloalkyl thiadiazines, vinblastine, mitomycin, penicillin X dimer, cephalosporins và dimerized vindoline [98] Ngoài ra, laccase đã được các nhà nghiên cứu chứng minh về hoạt động ức chế một cách đáng kể quá trình phiên mã ngược của HIV-1 [131] Một laccase khác cũng đã được khẳng định về khả năng chống lại aceruloplasminemia (một bệnh rối loạn di truyền do đột biến ở gen) Cách đây vài năm, một phương pháp enzyme mới dựa trên laccase đã được phát triển để phân biệt đồng thời morphine và codeine trong các mẫu thuốc được tiêm vào hệ thống phát hiện

1.10 Phương pháp phân tích sàng lọc CALUX

Dioxin và các chất ô nhiễm tương tự (các chất nồng độ thấp-Micropollutants) thường được phát hiện ở các nồng độ rất thấp trong mẫu sinh phẩm và mô trường Các phương pháp phân tích cần có kỹ thuật, thiết bị đặc hiệu có độ nhạy cao như sắc

ký khí độ phân giải cao pha loãng đồng vị (high-resolution gas HRGC, sắc ký khí khối phổ độ phân giải- HRGC/HRMS, sắc ký khí lỏng khối phổ độ phân giải cao -LC/MS/MS) v.v Các phương pháp này có hạn chế là lượng mẫu lớn

chromatography-để phân tích lớn (khoảng 15 ml), chi phí cao, thời gian dài

Trong cơ thể con người nói riêng và sinh vật nói chung tồn tại các thụ thể Mỗi thụ thể tương ứng với một chất hay một nhóm chất có đặc tính giống nhau và có khả năng liên kết đặc hiệu với các chất hay nhóm chất này Khi các chất này đi vào cơ thể,

nó sẽ được gắn một cách đặc hiệu với các thụ thể tương ứng và một protein vận chuyển tạo thành một phức hợp Phức hợp này đi vào trong nhân tế bào (gọi là các yếu tố phản ứng) tham gia vào quá trình dịch mã tạo ra các protein khác nhau, tùy thuộc vào mức độ ô nhiễm của hợp chất ngoài môi trường CALUX là một công cụ dựa vào sự biểu hiện gen đã nghiên cứu và áp dụng để phát hiện và định lượng các đơn chất hay hỗn hợp chất trong các mẫu sinh phẩm và môi trường Nó gồm một dòng tế bào cải biến di truyền với DNA được chèn thêm một gen (reporter) luciferase

để biểu hiện enzyme kết hợp với các yếu tố phản ứng gây ra sự phiên mã của các gen chèn vào (Hình 1.2) Phụ thuộc vào liều lượng của các hợp chất hóa học xâm nhập vào tế bào, tế bào sẽ sinh ra enzyme luciferase Khi bổ sung cơ chất luciferin, enzyme này sẽ chuyển hóa cơ chất thành hợp chất phát quang Ánh sáng tạo thành sẽ được định lượng bằng một máy đo luminometer Mức độ phát quang trong tế bào CALUX nhờ phần mềm chuyên dụng có thể tính được nồng độ các chất xác định Các dòng tế bào CALUX có thể được thiết kế lại để phát hiện một số nhóm chất quan tâm Hầu hết các ứng dụng của CALUX được định hướng và thành công nhất đầu tiên để phát hiện các chất độc hại trong môi trường như dioxin hay các hoocmon

CALUX là một công nghệ sàng lọc hiệu quả vì nó dựa trên phép đo tổng các phối tử có hiệu quả trên một thụ thể Không giống như các phân tích hóa học, CALUX có thể đo tất cả các hoạt tính trên thụ thể quan tâm Những năm gần đây, các

tác giả Hà Lan đã phát minh ra 28 dòng nữa (Bram Brouwer và đtg) để không những định lượng được dioxin mà công cụ này còn đo được các chất như hoocmon, các chất

ô nhiễm ở nồng độ thấp và nhóm các chất liên quan đến các chức năng của tế bào

Kết quả phân tích bằng Calux đã được cộng đồng chung châu Âu, Hoa Kỳ, Nhật Bản.v.v công nhận mang tính pháp lý như phân tích bằng HRGC/HRMS Phương pháp này được phổ biến nhanh và rộng bởi hiệu quả kinh tế, thời gian và chi phí Những ưu điểm trên đã giúp các nhà quản lý môi trường, y tế và hoạch định chính sách có thể nhanh chóng đưa ra quyết định trong các vấn đề liên quan đến ô nhiễm nói chung và dioxin nói riêng (http://www.biodetectionsystems.nl/)

Hình 1.2 Sơ lược về CALUX

Ngoài DR- CALUX là công nghệ rất phất triển cho đến ngày nay để xác định nồng độ tổng số TEQ của một hỗn hợp phức hệ các chất trong huyết thanh người (< 0.1ppt) thì hiện nay CALUX cũng đang được phát triển để xác định sự có mặt và hoạt tính của nhiều hợp chất khác trong cơ thể như các chất ô nhiễm nồng độ thấp hay các hoormon Các hợp chất này tuy có hàm lượng rất thấp nhưng lại gây ra tác động nghiêm trọng đến sức khỏe con người, gây ra hậu quả tức thời và lâu dài như làm hỏng hệ nội tiết, gây ung thư và rất nhiều bệnh tật khác Nhóm chất hiện nay được