Nghiên cứu bán tổng hợp kháng sinh cefotaxime từ axit 7 aminocephalosporanic

Quá trình axyl hóa được cải tiến hơn so với các phương pháp truyền thống bằng cách sử dụng natri bicacbonat thay thế trietylamin để muối hóa phân tử 7-ACA tạo điều kiện phản ứng axyl hóa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

o0o

NGUYỄN VIẾT TÚ

N

NGHIÊN CỨU BÁN TỔNG HỢP KHÁNG SINH CEFOTAXIME TỪ AXIT 7-

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành tốt luận văn, đạt được những mục tiêu đề ra, trong thời gian qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tâm, nhiệt tình từ các đồng nghiệp, các thầy cô

và bạn bè Bằng tấm lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi tới:

TS Phan Thanh Bình – Giám đốc Trung tâm Hoá thực vật - Viện Hoá học công nghiệp Việt Nam, người đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm cũng như những kiến thức, kỹ thuật trong tổng hợp hữu cơ Đây là điều hết sức quý báu đối với tôi không chỉ trong việc hoàn thành tốt luận văn này, mà còn trong công việc đang và sẽ làm

TS Vũ Đình Hoàng - Bộ môn Hóa Dược và Hóa chất bảo vệ thực vật - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, người thầy hướng dẫn thường xuyên động viên, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, tạo điều kiện và đóng góp nhiều ý kiến giúp tôi hoàn thành luận văn đúng tiến độ

Các anh, chị, các bạn đồng nghiệp - Trung tâm Hoá thực vật - Viện Hoá học Công nghiệp Việt Nam tham gia thảo luận, giúp đỡ tôi trong thời gian nghiên cứu thực nghiệm tại Trung tâm và đóng góp ý kiến giúp quý báu

Quý thầy cô trường Đại học Bách Khoa Hà nội, đặc biệt là những thầy cô đã tận tình dạy bảo cho tôi suốt thời gian học tập tại trường Các bạn lớp Cao học Hoá

cơ bản Khóa 2008 -2010 đã giúp đỡ trong quá trình học tập và tìm tài liệu

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, ông bà và những người thân đã luôn luôn động viên khích lệ, là điểm tựa vững chắc giúp tôi vượt qua những khó khăn thử thách trong học tập và cuộc sống

Mặc dù tôi đã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt tình

và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được những đóng góp quí báu của quí thầy cô và các bạn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2010 Sinh viên

Nguyễn Viết Tú

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan rằng, luận văn thạc sĩ khoa học “Nghiên cứu bán tổng hợp

kháng sinh cefotaxime từ axit 7-aminocephalosporanic” là công trình nghiên cứu

của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Vũ Đình Hoàng và TS Phan Thanh Bình

Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được trích dẫn cụ thể trong danh mục tài liệu tham khảo

Kết quả nghiên cứu này chưa được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào từ trước đến nay

Hà nội, ngày 28/10/2010

Tác giả luận văn

Nguyễn Viết Tú

1H- NMR 1H – Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

13C- NMR 13C – Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

IR Infrared Radiation spectroscopy (Phổ hồng ngoại)

MS Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng )

TLC Thin Layer Chromatography (Sắc ký bản mỏng)

HPLC High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)SEM Scanning electron microscope (Kính hiển vi điện tử quét)

KLPT Khối lượng phân tử

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các cephalosporin bán tổng hợp phân loại theo thế hệ 9

Bảng 1.2 Các chất hoạt hoá nhóm cacboxyl 17

Bảng 1.3 Các tác nhân bảo vệ nhóm amino 18

Bảng 1.4 Các tác nhân silyl hóa thông dụng 19

Bảng 1.5 Các tác nhân axyl hóa thông dụng 20

Bảng 3.1 So sánh ảnh hưởng của tỷ lệ mol 7-ACA/NaHCO3 và

7-ACA/TEA đến hiệu suất tổng hợp cefotaxime

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm điều chế cefotaxime 22

Hình 3.1 So sánh ảnh hưởng của tỷ lệ mol 7-ACA/NaHCO3 và

7-ACA/TEA đến hiệu suất tổng hợp cefotaxime

Hình 3.4 Sắc ký đồ TLC của các hợp chất theo thời gian phản ứng 31

Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình tổng hợp

1.1 CÁC KHÁNG SINH NHÓM CEPHALOSPORIN 6

1.1.1 Giới thiệu về cephalosporin 6

1.1.2 Các cephalosporin bán tổng hợp 6

1.1.2.1 Cấu trúc hoá học các hợp chất cephalosporin bán tổng hợp 6

1.1.2.2 Sự liên quan cấu trúc và tác dụng 7

1.1.2.3 Phân loại các cephalosporin bán tổng hợp 7

1.1.2.4 Phương pháp chung điều chế các cephalosporin bán tổng hợp 10

1.2.4.1 Tổng hợp cefotaxime theo hướng thứ nhất 17

1.2.4.2 Tổng hợp cefotaxime theo hướng thứ hai 20

2.2 Các phản ứng chuyển hóa đã nghiên cứu 22

2.2.1 Phản ứng axyl hóa điều chế muối cefotaxime-Na (3) 22

2.2.2 Phản ứng trung hòa điều chế cefotaxime dạng axit tự do (4) 23

2.2.3 Thu hồi sản phẩm phụ 2-mercaptobenzothiazol 23

2.3 Phân tích sản phẩm 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Nghiên cứu phản ứng axyl hóa điều chế muối cefotaxime-Na (3) 25

3.1.1 Ảnh hưởng của tác nhân muối hóa 7-ACA 25

3.1.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ 7-ACA-Na/MAEM 27

3.1.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi axeton/nước 28

3.1.4 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng 30

3.2 Phản ứng trung hòa điều chế sản phẩm cuối cefotaxime axit 32

3.2.1 Ảnh hưởng của pH 33

3.2.2 Ảnh hưởng của các axit khác nhau 34

3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 36

3.2.4 Ảnh hưởng của dung môi kết tinh 37

3.2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ kết tinh 37

3.3 Thu hồi sản phẩm phụ 2-mercaptobenzothiazol 38

3.4 Sơ đồ quy trình công nghệ 39

3.4.1 Các thông số công nghệ tối ưu 39

3.4.2 Đề xuất quy trình công nghệ 39

3.5 Xác định cấu trúc hóa học của sản phẩm 40

3.5.1 Cấu trúc cefotaxime axit 4 40

3.5.2 Cấu trúc cefotaxime-Na 3 43

3.5.3 Sản phẩm phụ 2-mercaptobenzothiazol 44

KẾT LUẬN 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

PHỤ LỤC 50

MỞ ĐẦU

Kháng sinh là những chất do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất hóa học bán tổng hợp, tổng hợp, với nồng độ rất thấp, có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc diệt được vi khuẩn [1] Việc phát minh ra thuốc kháng sinh để chữa bệnh

là một bước đột phá trong lịch sử phát triển của y học, vì nhờ sử dụng kháng sinh đã cứu sống được rất nhiều người khỏi các dịch bệnh nguy hiểm như: dịch tả, thương hàn, dịch hạch… [3]

Ở Việt Nam, do những đặc điểm về địa lý và kinh tế - xã hội nên mô hình bệnh tật chủ yếu là các bệnh nhiễm khuẩn (nhiễm trùng, ký sinh trùng) chiếm khoảng 23% số ca bệnh Hàng năm, nước ta tiêu thụ khoảng 700 tấn kháng sinh các

loại với tổng giá trị là 200 triệu USD, trong đó kháng sinh nhóm β-lactam chiếm

khoảng 50% [4] Vì vậy, sản xuất kháng sinh được coi là một trong những mục tiêu

ưu tiên hàng đầu trong chiến lược phát triển công nghiệp Hóa dược

Cefotaxime (7β-(2-(2-aminothiazol-4-yl)-(Z)-2-methoxyimino

acetamido)-3-acetoxy-methyl-3-cephem-4-carboxylic acid) là kháng sinh cephalosporin bán tổng hợp thế hệ 3, có hoạt tính sinh học cao, khả năng kháng β-lactamase tốt hơn các cephalosporin thế hệ trước, hiện đang được dùng thay thế các kháng sinh đã bị kháng thuốc

Việc nghiên cứu bán tổng hợp cefotaxime theo một quy trình đơn giản, sử dụng các tác nhân thân thiện môi trường, có thể triển khai sản xuất lớn, phục vụ cho nhu cầu chữa bệnh trong nước là rất cần thiết

Đã và đang có những cố gắng trong nghiên cứu áp dụng công nghệ tổng hợp kháng sinh phù hợp với điều kiện ở trong nước Trần Tựu và cộng sự [4] (đề tài Nhà nước KC04-09) nghiên cứu bán tổng hợp cefotaxime từ chất đầu etylaxetoaxetat Kết quả nghiên cứu đã cho những định hướng nhất định trong việc phát triển công nghệ sản xuất loại thuốc kháng sinh này Tuy nhiên, quy trình được đề xuất qua nhiều giai đoạn bao gồm cả các bước sử dụng tác nhân bảo vệ nhóm thế và gỡ bỏ chúng cùng với việc sử dụng dung môi dễ bay hơi chứa clo không thân thiện với môi trường có thể hạn chế tính khả thi của công nghệ này khi chuyển từ phòng thí

nghiệm sang áp dụng ở quy mô sản xuất, đặc biệt khi triển khai ở điều kiện trong nước

Với mục đích nghiên cứu góp phần cải tiến quy trình tổng hợp cefotaxime

theo xu hướng “phát triển bền vững”, tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu bán tổng hợp

kháng sinh cefotaxime từ axit 7-aminocephalosporanic” với nội dung chính như

sau:

1 Nghiên cứu và lựa chọn phương pháp tổng hợp cefotaxime theo quy trình

“one-pot” sử dụng những hoá chất công nghiệp có sẵn trên thị trường là 7-ACA aminocephalosporanic acid) và MAEM (2-mercaptobenzotiazolyl)-2-(2-amino-tiazol-4-yl)-2-metoxyimino-axetat)

(7-2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng, tìm các thông số tối ưu tổng hợp cefotaxime

3 Xác định cấu trúc sản phẩm bằng các phương pháp vật lý hiện đại: phổ khối (MS), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR)

4 Hàm lượng cefotaxime trong sản phẩm xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

5 Đề xuất quy trình công nghệ bán tổng hợp cefotaxime

Ưu điểm của phương pháp này là không sử dụng những tác nhân bảo vệ nhóm thế đắt tiền, khó bảo quản như: HMDS (hexamethyldisilazane), TMSC (trimethylsilylchloride), TMSI (trimethylsilyliodide) Quá trình axyl hóa được cải tiến hơn so với các phương pháp truyền thống bằng cách sử dụng natri bicacbonat thay thế trietylamin để muối hóa phân tử 7-ACA (tạo điều kiện phản ứng axyl hóa diễn ra thuận lợi: ở nhiệt độ phòng, độ chọn lọc và hiệu suất cao…) Phản ứng tiến hành trong hệ dung môi axeton/nước thân thiện môi trường Ngoài ra, sản phẩm phụ 2-mercaptobenzothiazol có thể được nghiên cứu thu hồi với độ tinh khiết và hiệu suất tốt

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Kháng sinh là những chất do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất hóa học bán tổng hợp, tổng hợp, với nồng độ rất thấp, có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc diệt được vi khuẩn [1, 3]

Có nhiều cách phân loại kháng sinh nhưng phổ biến nhất vẫn là phân loại theo cấu trúc hóa học (bộ khung cơ bản) của chúng bao gồm:

- Các kháng sinh nhóm β-lactam (các penicillin và cephalosporin)

- Các polyeste (monensin, nigericin, lasalocide)

- Các kháng sinh khác (axit fusidic, fosfomycin)

Việc phát hiện, sau đó phân lập, xác định được cấu trúc và bán tổng hợp thành công các cephalosporin là một thành tựu vô cùng to lớn về cả mặt lý thuyết cũng như về mặt thực tiễn của hóa học kháng sinh [1, 4]

Cho đến nay, lĩnh vực nghiên cứu này cũng vẫn chưa thể nói là đã kết thúc bởi hàng năm có tới hàng trăm công trình nghiên cứu được công bố Với việc biến đổi các nhóm thế trên khung cephalosporin C, người ta đã điều chế được hàng loạt các hoạt chất có tác dụng sinh học cao, hoạt phổ kháng sinh rộng đưa vào phục vụ cho điều trị lâm sàng Nhiều chất trong số đó đã được sản xuất rộng rãi ở quy mô công nghiệp bằng con đường bán tổng hợp [3]

1.1 CÁC KHÁNG SINH NHÓM CEPHALOSPORIN

1.1.1 Giới thiệu về cephalosporin [1, 3, 4]

Cephalosporin tự nhiên là những chất chứa vòng β-lactam được Abraham và

cộng sự phân lập (1948) từ dịch lên men chủng Cephalosporium acremonium

Sản phẩm chính của quá trình lên men này là cephalosporin-C (cấu trúc hóa học được tác giả xác định thành công năm 1961, tương tự cấu trúc của phân tử penixilin G)

O

H N N

S

COOH O

H H OOC

NH3

1 2

3

4 5 7 8

Cephalosporin-C

O

H N N S

O

CH3

CH3COOH H

2

3 4

5 6 7

Penixillin-G

Cephalosporin tự nhiên có hoạt tính sinh học thấp, nên các nhà hóa học đã tìm cách bán tổng hợp ra các dẫn xuất mới, nhằm tạo ra các hợp chất có hoạt lực mạnh hơn, phổ tác động rộng hơn Chính nhờ điều này đã hình thành ra các cephalosporin bán tổng hợp

1.1.2 Các cephalosporin bán tổng hợp

1.1.2.1 Cấu trúc hoá học các hợp chất cephalosporin bán tổng hợp [1, 3]

Cấu trúc chung của các hợp chất nhóm cephalosporin gồm hai vòng đính kết, một vòng β -lactam 4 cạnh (azetidin-2-on) gắn với một dị vòng 6 cạnh (2,3-dihidro-6H-1,3-thiazin)

O

H N N S

Nhìn vào công thức ta thấy rằng:

- Trong phân tử có hai cacbon bất đối ở vị trí C-6 và C-7 Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh, để có hoạt tính kháng sinh thì cấu hình của hai cacbon

bất đối này nhất thiết phải là 6-R, 7-R Liên kết đôi nhất thiết phải ở vị trí C3-C4

(∆ 3); còn nếu nằm ở C2-C3 (∆ 2) thì hợp chất không mang hoạt tính

- Các nhóm thế ở vị trí 2, 4, 5, 6, 8 là cố định

- Vị trí C-4 luôn là nhóm COOH (hoặc muối hay este dễ thuỷ phân của nó)

- R2 trên vị trí C-7 có thể là H hoặc OCH3

- Nhóm thế R1 ở vị trí C-3, làm thay đổi tính chất dược động học của phân tử

(tăng tác dụng kháng khuẩn đặc biệt là đối với tụ cầu và Pseudomonas…) Trong

khi đó, nhóm thế R ở vị trí C-7 tạo ra sự cản trở không gian xung quanh vòng βlactam, ảnh hưởng lớn đến sự kháng β -lactamase

-1.1.2.2 Sự liên quan cấu trúc và tác dụng [1]

Qua sử dụng lâm sàng gần 40 năm nay người ta nhận thấy:

- Tác dụng kháng sinh luôn đi đôi với độ bền vững của vòng β-lactam, trong

tất cả các trường hợp mở vòng đều làm mất tác dụng kháng sinh của hợp chất Các nhóm thế có vai trò quan trọng trong tính chất, tác dụng của kháng sinh cephalosporin

- Trong phân tử cephalosporin, nhóm thế R làm thay đổi tác dụng kháng khuẩn của phân tử

- Sự kháng β-lactamase có thể đạt được bằng cách thay đổi lựa chọn các

nhóm thế R và R2, nói chung nhờ vào việc tạo ra sự cản trở không gian xung quanh

vòng β-lactam

- Nhóm thế R1 làm thay đổi tính chất dược động học của phân tử (ví dụ làm

tăng tác dụng kháng khuẩn đặc biệt là đối với tụ cầu và Pseudomonas)

1.1.2.3 Phân loại các cephalosporin bán tổng hợp [1, 3, 4]

Các kháng sinh cephalosporin bán tổng hợp có thể được phân loại theo công thức hoá học (chủ yếu dựa vào cấu trúc của R hoặc R1 trong công thức tổng quát)

hoặc theo đặc tính công dụng của nó (theo thế hệ )

- Cephalosporin bán tổng hợp thế hệ thứ nhất

Gồm các hợp chất dễ bị thuỷ phân bởi các cephalosporinase.Trong các phân

tử cephalosporin thế hệ này đều còn chứa nhóm R1 là axetoximetyl (-CH2OCOCH3)

ở vị trí C-3 (nhóm axetoximetyl này có ảnh hưởng lớn đến tính chất dược động học

của các hợp chất này do nó bị tác dụng của enzim esterase) hoặc ở những phân tử có nhóm R là thienyl, tetrazolyl hay các chất mà nhóm R là dẫn xuất của amino, phenyl-methyl

Những kháng sinh cephalosporin bán tổng hợp thế hệ thứ nhất được tiêu biểu gồm: cephalexin, cefadroxil và cefradine (dùng đường uống) Cephalothin và cephaloridine (dùng để tiêm)

- Cephalosporin bán tổng hợp thế hệ thứ hai

Là những hợp chất có tác dụng kháng các betalactamase Tác dụng kháng các betalactamase là do cản trở không gian xung quanh vòng betalactame được tạo bởi axyl (RCO) trên amino ở vị trí C-7 có chứa cả nhóm hidroxy (nhóm này ngăn cản

không cho các emzim đến gần β-lactam trong phân tử cefamandole) hay nhóm ankoxi-imin bảo vệ vòng β-lactam đối với các phản ứng thủy phân bằng ezim trong

phân tử cephuroxim hoặc nhóm metoxi (R2) ở vị trí C-7

Cephalosporin bán tổng hợp thế hệ thứ 2 bao gồm: cefuroxime ở dạng muối natri và cefamandole (dùng dưới dạng tiêm); cefaclor (dùng dưới dạng uống)

- Cephalosporin bán tổng hợp thế hệ thứ ba

Là những chất có ưu điểm hơn 2 thế hệ trước là :

+ Tác dụng kháng betalactame mạnh hơn

+ Có tác dụng mạnh hơn với các chủng vi khuẩn Gram âm

+ Có nồng độ tác dụng tối thiểu (MIC) thấp hơn

+ Có khả năng khuyếch tán tốt với những bộ phận mà các cephalosporin 2 thế

hệ trên không xâm nhập tới được

+ Thời gian bán phân huỷ dài hơn

Cephalosporin bán tổng hợp thế hệ thứ ba bao gồm năm kháng sinh sau: cefotaxime, cefetamet, cefazidime, cefoperazone và ceftriaxone

- Cephalosporin bán tổng hợp thế hệ thứ tư

Là những chất có tính bền vững với betalactame và có hoạt tính mạnh trên các

vi khuẩn Gram âm

Cephalosporin bán tổng hợp thế hệ thứ tư bao gồm: cefepime, cefpirome và cefclidine

Bảng 1.1 Các cephalosporin bán tổng hợp phân loại theo thế hệ [1, 3]

H2N

N

S N N

1.1.2.4 Phương pháp chung điều chế các cephalosporin bán tổng hợp [1, 3]

Quá trình điều chế các cephalosporin bán tổng hợp bao gồm 2 giai đoạn chính:

- Giai đoạn 1: điều chế ra các hợp chất chìa khóa trung gian mà trong phân

tử có chứa bộ khung cephem (7-ACA, 7-ACDA…)

- Giai đoạn 2: đưa các nhóm thế khác nhau vào vị trí tương ứng ở 7 và

C-3 của khung cephem nêu trên

1.1.2.4.1 Điều chế axit 7-amino-cephalosporanic [1, 4]

Axit 7-amino-cephalosporanic (7-ACA) là nguyên liệu cơ bản chứa khung

cephem được sử dụng phổ biến để bán tổng hợp các kháng sinh cephalosporin Công thức cấu tạo:

H2N N

S

COOH O

2

3

4 5 7 8

Trong gần bốn thấp kỉ nghiên cứu, người ta đã đưa ra rất nhiều phương pháp

để điều chế 7-ACA Nhưng chủ yếu đều xuất phát từ Cephalosporin C, thành phần của quá trình lên men sinh học hoặc tổng hợp toàn phần hoá học Từ Cephalosporin

C với việc phân cắt loại nhóm D-α-aminoadipinoyl khỏi mạch nhánh trên nhóm amino ở C-7 thì thu được 7-ACA

- Phương pháp hoá học [1]

Theo phương pháp này, trước hết cho muối natri của cephalosporin C phản ứng với nitrosylclorua (NOCl) trong axit formic, để nitrozo-hóa amin bậc nhất trong mạch nhánh adipinyl tạo ra hợp chất nitrozo, chất này sau đó trong môi trường axit, tạo thành muối diazoni, với việc đồng phân hoá, nhóm OH dạng enol của amit tấn công vào nhóm tách loại diazoni ion và tạo thành hợp chất vòng iminopyran Chất này dễ thuỷ phân trong axit loãng để cho 7-ACA với hiệu suất khoảng 50% tính

theo Cephalosporin C (Sơ đồ 1.1 a)

HN N

S

COOH O

HN N

S

COOH O

S

COOH O

H H HO

HOOC

N 2

N N

S

COOH O

H H O

HOOC

H 2 N N

S

COOH O

H H

H+/H2O

HN N

S

COOH O

S

COOSi(CH3)3O

S

COOSi(CH3)3O

S

COOSi(CH3)3O

H H C

OC2H5(CH2)3HC HOOC

CH3COOH O

H H

H2N N

S

COOH O

Sau đó, phương pháp này tiếp tục được cải tiến nhằm nâng cao hiệu suất của quá trình điều chế Trước hết, người ta bảo vệ nhóm cacboxylic tự do với dẫn xuất silan bằng cách cho cephalosporin C tác dụng với trimetylsilyl clorua để bảo vệ nhóm cacboxylic, chất này dưới tác dụng của tác nhân clo hoá (PCl5, POCl3, COCl2) tạo thành dẫn xuất imidonyl clorua sau đó được ancoxy hoá với etanol để được dẫn xuất imino ete, cuối cùng thủy phân với nước để thu được 7-ACA (Sơ đồ

nhà nghiên cứu Nhật Bản phát hiện trong tế bào của vi sinh vật Pseudomonas

putida có các enzym thuỷ phân được cephalosporin C tạo thành 7-ACA và axit

aminoadipic

Phương pháp 1: dùng cephalosporin acylase để chuyển hoá thẳng

cepha-losporin C thành 7-ACA với hiệu suất cao Phương pháp này hiện đang được sử dụng ở các nước tiên tiến

Phương pháp 2: dùng 2 loại enzym, trước hết dùng enzym D-amino acid

oxidase để chuyển hoá cephalosporin C thành chất trung gian α-cetoadipyl-7-ACA đồng thời dưới tác dụng của H2O2 chất này sẽ chuyển thành glutaryl-7-ACA Sau

đó, dùng enzym glutaryl-7-ACA acylase để sinh chuyển hoá glutaryl-7-ACA thành 7-ACA Phương pháp này phức tạp hơn phương pháp 1

H N N

S

COOH O

H H

NH2HOOC

O

H N N

S

COOH O

H H

NH2HO

S

COOH O

H H

NH2HO

Glutaryl 7-ACA

H2N N

S

COOH O

Sơ đồ 1.3 Chuyển hoá cephalosporin C thành 7-ACA dùng enzym [1, 3]

1.1.2.4.2 Đưa các nhóm thế khác nhau vào vị trí C-3 và C-7 của khung cephem

Hợp chất trung gian quan trọng 7-ACA thể hiện hoạt tính kháng sinh yếu Để tổng hợp các cephalosporin mới, hiệu lực cao, các nhóm thế khác nhau được đưa vào vị trí C-3 hoặc C-7 của khung cephem Tùy thuộc vào bản chất nhóm thế mà hoạt lực kháng sinh cũng như tính chất dược động học của phân tử được cải thiện

Việc đưa nhóm thế vào vị trí C-3 thường được tiến hành trên cơ sở axyl hóa nhóm amino của 7-ACA và nhóm cacboxyl đã được hoạt hóa của tác nhân axyl

1.2 KHÁNG SINH CEFOTAXIME

Cefotaxime là kháng sinh cephalosporin thế hệ 3, có hoạt tính sinh học cao, khả năng kháng β-lactamase tốt [7, 19, 26] Cũng tương tự như các kháng sinh cephalosporin khác, hoạt tính của cefotaxime có được là do khả năng ức chế tổng hợp các thành phần cần thiết cấu tạo nên thành tế bào của vi khuẩn [31]

1.2.1 Danh pháp, tính chất vật lý, hoá học [1, 3, 20]

Tên khoa học: axit cephem-3-axetoxymetyl-4-cacboxylic

7-[(2-aminotiazol-4-yl)-2-(metoxyimino)axetamido]-3-Công thức phân tử: C18H17N5O7S2

Khối lượng phân tử: 455,4596

Công thức cấu tạo:

N S

H N N

H N N

Cefotaxime có 2 dạng đồng lập thể Syn và Anti Ở cấu hình Syn, nhóm

oximino và vòng thiazol ở 2 phía khác nhau so với mặt phẳng nối đôi C=N R

Bucourt và A Lutz [27], đã bán tổng hợp được đồng phân anti-cefotaxime, nhưng chất này thử tác dụng invitro cho thấy hoạt tính kháng sinh yếu hơn dạng syn- cefotaxime hàng trăm lần Thực tế, chỉ có đồng phân Syn mới được dùng làm thuốc

vì nó có tác dụng kháng khuẩn cao và bền với men β-lactam [4, 28]

Tính chất hoá, lý: trong điều kiện thường, cefotaxime tồn tại ở dạng tinh thể màu trắng đến hơi vàng, có nhiệt độ phân huỷ ở 180ºC, hầu như không tan trong nước, etanol, ete, tan ít trong metanol Cefotaxime chứa khung cephem kém bền nên

dễ bị ảnh hưởng trong môi trường axit và kiềm mạnh Phản ứng với dung dịch NaHCO3 làm sủi bọt khí, với dung dịch NaNO2 cho màu hồng [7, 18]

1.2.2 Tác dụng dược lý [1], [3]

Tác dụng của cefotaxime đối với vi khuẩn Gram dương và Gram âm tương

tự như nhóm kháng sinh ở thế hệ một và 2 nhưng đối với vi khuẩn Gram âm thì cefotaxime có tác dụng mạnh gấp 10 lần [19]

Cefotaxime được dùng trong những bệnh nhiễm trùng phổi, da xương, viêm khớp, viêm dạ dày, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng hệ thần kinh trung ương, viêm màng não, viêm não thất, viêm màng bụng, viêm màng trong tim, đường niệu và nhiễm trùng đường phụ khoa (genitourinary)

Cefotaxime dạng tiêm là dung dịch muối natri có màu vàng nhạt đến màu hổ phách sáng (light amber) phụ thuộc vào nồng độ và dung môi

Thời gian bán hủy của cefotaxime vào khoảng 1 giờ và khi chuyển hoá thành một dẫn chất khử axetyl có thời gian hủy chừng 1,6 giờ Mặc dầu dẫn chất khử axetyl tác dụng không bằng sản phẩm gốc, song nó lại tác dụng mạnh hơn phần lớn các cephalosporin thế hệ thứ hai, đồng thời tác dụng hiệp đồng với kháng sinh gốc

để chế ra một số vi sinh vật

Cefotaxime tạo ra các nồng độ trong dịch não tuỷ trong phạm vi từ 1 đến

30µg/ml, tuỳ thuộc mức độ viêm và liều dùng Nó đã được chứng minh là có hiệu

lực trong điều trị viêm màng não do liên cầu nhóm B, E Colin, H.influenzae (truyền khuẩn cúm), màng não cầu, phế cầu và Klebsiella (kháng sinh đường hô hấp)

Mặc dầu cefotaxime có một thời gian bán huỷ tương đối ngắn song hoạt tính của nó cùng với sự hiện diện của một sản phẩm chuyển hoá có tác dụng điều trị chỉ

ra rằng có thể dùng 8 giờ một lần trong phần lớn các bệnh nhiễm trùng, ngoại trừ những bệnh nhân sốt có giảm bạch cầu trung tính

1.2.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cefotaxime ở Việt Nam [3, 4]

Ở Việt Nam, do những đặc điểm về địa lí và kinh tế - xã hội nên mô hình bệnh tật chủ yếu vẫn là các bệnh nhiễm khuẩn (nhiễm trùng, ký sinh trùng) chiếm khoảng 23 % số ca bệnh

Theo kết quả thống kê của Bộ Y tế thì “tỷ lệ tiền thuốc sử dụng trong điều trị nội trú tại bệnh viện chiếm khoảng 33% tổng giá trị tiền thuốc” Hàng năm, Việt Nam tiêu thụ khoảng 700 tấn kháng sinh các loại cho điều trị bệnh với tổng giá trị

khoảng 200 triệu USD, trong đó kháng sinh β-Lactam chiếm khoảng 50%, đặc biệt

là kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin thế hệ mới, trong đó có cefotaxime

Đã và đang có những cố gắng trong nghiên cứu áp dụng công nghệ tổng hợp kháng sinh phù hợp với điều kiện ở trong nước Trong đó, đáng chú ý là việc nghiên cứu công nghệ bán tổng hợp cefotaxime

Trần Tựu và cộng sự [4] (đề tài Nhà nước KC04-09) đã nghiên cứu bán tổng hợp cefotaxime từ chất đầu etylaxetoaxetat Kết quả nghiên cứu đã cho những định hướng nhất định trong việc phát triển công nghệ sản xuất loại thuốc kháng sinh này Tuy nhiên, quy trình được đề xuất qua nhiều giai đoạn bao gồm cả các bước sử dụng tác nhân bảo vệ nhóm thế và gỡ bỏ chúng cùng với việc sử dụng dung môi dễ bay hơi chứa clo không thân thiện với môi trường có thể hạn chế tính khả thi của công nghệ này khi chuyển từ phòng thí nghiệm sang áp dụng ở quy mô sản xuất, đặc biệt khi triển khai ở điều kiện trong nước

Vì thế hàng năm, chục triệu liều cefotaxime đã được nhập khẩu từ nước ngoài (chủ yếu là Ấn Độ, Tây Ban Nha, Ba Lan, Mỹ…) để đáp ứng nhu cầu chữa bệnh của nhân dân Khi được nhập vào thị trường Việt Nam giá thành của cefotaxime cũng bị đội lên rất nhiều lần, nhất là các chế phẩm của Châu Âu

1.2.4 Các phương pháp tổng hợp cefotaxime [1, 4, 9, 13, 16, 17]

Cũng giống như các kháng sinh cephalosporin khác, cefotaxime được tổng hợp thông qua phản ứng giữa tác nhân axyl hóa và 7-ACA (Sơ đồ 1.4) [3]

N S

H N S OCOCH3COOH

N OCH3

O

H H

NH2N S OCOCH 3

COOH O

H H N

S

Z N OCH 3

Cefotaxime 7-ACA

Tác nhân axyl hóa

Sơ đồ 1.4 Phương pháp chung tổng hợp cefotaxime [3]

Trong đó Z là nhóm hoạt hóa nhóm chức cacbonyl (clo, thiazol, dẫn xuất của N,N'-dicyclohexylcarbodiimide…)

mercaptobenzo-Theo nhiều tài liệu tham khảo được, có thể thấy rằng quá trình tổng hợp cefotaxime có hai hướng khác nhau:

- Hướng thứ nhất: dùng tác nhân bảo vệ và hoạt hóa các nhóm chức (amino,

cacboxyl…) của các chất tham gia nhằm tránh các phản ứng phụ không mong muốn đảm bảo độ chọn lọc của quá trình tổng hợp

- Hướng thứ hai: cho phản ứng trực tiếp giữa tác nhân axyl hóa và 7-ACA

(có khống chế điều kiện phản ứng)

1.2.4.1 Tổng hợp cefotaxime theo hướng thứ nhất [4, 17, 31]

Theo hướng này, thì trước khi thực hiện phản ứng axyl hóa, để tránh xảy ra sản phẩm phụ thì người ta thường tiến hành bảo vệ và hoạt hóa các nhóm chức

Các tác nhân được dùng để bảo vệ nhóm amino và hoạt hoá nhóm cacboxyl

của mạch nhánh ATMA (axit (z)-2-(2-aminothiazole-4-yl)-2-(methoxyimino)

axetic)được chỉ ra trong Bảng 1.2 và Bảng 1.3

Bảng 1.2 Các chất hoạt hoá nhóm cacboxyl [3, 4]

97,0

8 2-mercapto benzothiazol N

S HS

169,0

Bảng 1.3 Các tác nhân bảo vệ nhóm amino [3, 4]

1 Clo axetylclorit Cl-CH2-CO-Cl 113,0

2 Tritylclorit (C6H5)3C-Cl 278,5

3 Tricloetoxy cacbonylclorit Cl3CCH2OCOCl 212,0

4 t-butoxy cacbonylclorit (CH3)3COCOCl 136,5 Đối với chất được axyl hóa (7-ACA) thì nhóm cacboxyl ở vị trí C-4 của khung cephem cũng cần phải được bảo vệ

Mục đích của việc bảo vệ này là hạn chế sản phẩm phụ trong quá trình phản ứng và cải thiện tính tan của 7-ACA trong các hệ dung môi

Theo các tài liệu đã tham khảo, hiện nay có 3 phương pháp chủ yếu để bảo

vệ nhóm cacboxyl của 7-ACA

- Muối hóa: sử dụng các bazơ hữu cơ như trietylamin, butylamin, dimetylamin… [13, 19, 20]

- Tạo dẫn chất este: sử dụng các tác nhân t-butyl, diphenylmethyl và nitrophenylbromid… [4]

p Tạo dẫn xuất silyl hóa: các hợp chất silyl hóa có khả năng hòa tan tốt hơn trong dung môi ít phân cực, do đó cải thiện được hiệu suất phản ứng

Các tác nhân silyl hoá thường dùng trong công nghệ tổng hợp kháng sinh cephalosporin được liệt kê trong Bảng 1.4

Bảng 1.4 Các tác nhân silyl hóa thông dụng

H 3 C OC 2 H 5

N OCH 3

OC 2 H 5

N OCH 3

Br

Thioure

N S (C6H5)3CHN O

N OCH 3

S

(C6H5)3CHN O

N OCH 3

H

N S OCOCH 3

COOH

N OCH 3

1.2.4.2 Tổng hợp cefotaxime theo hướng thứ hai [13, 19, 20]

Theo phương pháp này, nhóm amino của vòng thiazol trong các tác nhân axyl hóa (Bảng 1.5) không cần phải bảo vệ mà cho ngưng tụ trực tiếp với muối của 7-ACA (xem thêm Sơ đồ 1.5)

Bảng 1.5 Các tác nhân axyl hóa thông dụng [4]

Tác nhân axyl hóa Công thức cấu tạo

Dẫn xuất Clo

MAEM

C13H10N4O2S3 (M = 350,44)

N S

S N

N

Trong các tác nhân axyl ở trên, đáng chú ý là MAEM Tác nhân này được sản xuất thành sản phẩm thương mại phục vụ cho tổng hợp kháng sinh cephalosporin

Juan C Rodríguez và cộng sự [19], đã tổng hợp cefotaxime từ MAEM và muối trietylamin của 7-ACA, dung môi CH2Cl2, hiệu suất 90%

Theo một công trình nghiên cứu khác, J M Khanna [16] đã tổng hợp cefotaxime bằng cách cho MAEM phản ứng với dẫn xuất silyl hóa của 7-ACA (N,O-bis-(trimethylsilyl)-acetamid-7-ACA), dung môi CH2Cl2, hiệu suất 90%

Hai phương pháp trên đều dùng dung môi CH2Cl2 không thân thiện môi trường và có hại cho sức khỏe con người Hơn nữa, sau khi phản ứng kết thúc cần thêm giai đoạn chiết sản phẩm với nước (trước khi tiến hành trung hòa bằng axit) làm phức tạp hóa khi tiến hành sản xuất ở quy mô công nghiệp

1.2.4.3 Lựa chọn phương pháp

Việc sử dụng các tác nhân bảo vệ nhóm chức cùng những thao tác tháo gỡ sau đó đòi hỏi nhiều công sức và khó có thể áp dụng khi sản xuất ở quy mô công nghiệp, không phù hợp với điều kiện ở Việt Nam

Do đó, chúng tôi đã lựa chọn nghiên cứu quy trình “one-pot” tổng hợp

cefotaxime từ 7-ACA và tác nhân axyl hóa có sẵn trên thị trường MAEM

(2-mercaptobenzothiazolyl)-2-(2-amino-tiazol-4-yl)-2-metoxyiminoaxetat) (Sơ đồ 1.6)

Sơ đồ 1.6 Tổng hợp cefotaxime từ 7-ACA và MAEM

Quá trình không sử dụng các tác nhân bảo vệ nhóm thế đắt tiền: HMDS (hexametyldisilazan), TMSC (trimethylsilylchloride), TMSI (trimethylsilyliodide) Phản ứng được tiến hành trong dung môi axeton/nước thân thiện môi trường, dễ dàng thu hồi và tái sử dụng

Theo quy trình cải tiến này, việc khóa nhóm cacboxylic của 7-ACA được thực hiện bằng một bazơ vô cơ natri bicacbonat thay vì sử dụng trietylamin như tài liệu [13, 20] tạo điều kiện cho phản ứng axyl hóa diễn ra thuận lợi và đúng hướng Điều này làm giảm giá thành sản phẩm, giảm ô nhiễm môi trường, mở ra khả năng ứng dụng sản xuất cefotaxime ở quy mô lớn

1.2.4.4 Cơ chế của phản ứng axyl hóa [1, 2]

Phản ứng axyl giữa 7-ACA và MAEM theo cơ chế thế nucleophin (thế ái nhân) như sau [1, 14]

X

O

R1-x-

Trong đó:

Sơ đồ 1.7 Cơ chế phản ứng axyl hóa tổng hợp cefotaxime

N

S OCOCH3COOH

O

H H

R =

N S

H2N

NOCH3

N S

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Hóa chất, thiết bị

2.1.1 Hóa chất

7-ACA (> 97%), trietylamin (> 99%), natrihidroxit rắn (> 99%), cacbonat (> 99%), axit monocloaxetic (99%), axit foomic (> 98%), axit axetic (> 99%), axit clohydric (36-38%), natri sulfat (> 99%) xuất xứ Merck (Đức); MAEM (> 97%) của hãng Acros (Bỉ);

natribi-Các dung môi: axeton, etanol, dietyl ete, etylaxetat, n-hexan, diclometan,

cloroform… xuất xứ Trung Quốc hàm lượng đạt tiêu chuẩn phân tích

2.1.2 Thiết bị

- Máy khuấy từ, gia nhiệt Heidolph

- Tủ sấy

- Máy đo pH

- Cân phân tích Sartorius

- Thiết bị lọc hút chân không,

- Lọ triển khai bản mỏng Camag

- Các dụng cụ thuỷ tinh: pipet, đũa khuấy, cốc, bình cầu phản ứng…

2.2 Các phản ứng chuyển hóa đã nghiên cứu

2.2.1 Phản ứng axyl hóa điều chế muối cefotaxime-Na (3)

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm điều chế cefotaxime

Cho 54,4 g (0,21 mol) 7-ACA, 50 ml nước và 450 ml axeton vào bình phản ứng ba cổ có lắp sinh hàn, máy khuấy và nhiệt kế Duy trì nhiệt độ phản ứng ở 20-

25oC Thêm từ từ lượng NaHCO3 cần khảo sát vào, khuấy đều Sau 30 phút hỗn hợp huyền phù đục chuyển dần thành dung dịch màu vàng, trong suốt

Thêm từ từ 72,7g (0,20 mol) MAEM vào dung dịch muối 7-ACA-Na thu được (15 phút), khuấy đều Hỗn hợp phản ứng có dạng sệt, màu vàng nhạt sau chuyển dần thành dung dịch trong suốt Tiến trình phản ứng được theo dõi bằng sắc

ký lớp mỏng trên bản silicagel, dung môi triển khai n-hexan : etylaxetat = 1 : 1

2.2.3 Thu hồi sản phẩm phụ 2-mercaptobenzothiazol

Dịch lọc hữu cơ sau khi rửa sản phẩm cefotaxime (4) ở trên được gom lại,

làm khan bằng Na2SO4 sau đó cô quay loại dung môi thu được chất rắn mercaptobenzothiazol màu vàng, điểm chảy 172-175oC Rửa sản phẩm bằng nước, kết tinh lại trong cloroform, thu được tinh thể hình kim màu vàng nhạt Sấy ở nhiệt

2-độ 70oC trong 1 giờ Điểm chảy 177-178oC Hiệu suất 81%

2.3 Phân tích sản phẩm

Phương pháp sắc ký được thực hiện trên những bản mỏng phủ silicagel 60

F254 (Merck, Cộng hòa Liên bang Đức); hệ dung môi triển khai A: n-hexan :

etylaxetat = 1 : 1 (v/v), hệ dung môi triển khai B: etylaxetat : etanol : nước : axit foomic = 60 : 25 : 15 : 1 (v/v)

Độ pH của môi trường phản ứng được kiểm tra bằng thiết bị Precisa pH900 (Thụy Sĩ)

Sản phẩm đã tổng hợp được kiểm tra xác định cấu trúc, hàm lượng tại Viện

Hóa học – Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam:

- Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Gallenkamp capillary

- Phổ hồng ngoại đo bằng phương pháp ép viên với KBr trên máy FTS 600 Biorad

- Phổ khối lượng đo trên máy LC/MSD Ion Trap 1100 Agilent, kiểu ion hóa dương

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) đo trên máy Bruker

Avance-500 (Mỹ), chất nội chuẩn TMS (tetramethylsilane), dung môi DMSO-d 6

hoặc CDCl3, hằng số tương tác J (Hz), độ chuyển dịch hóa học δ (ppm)

- Hàm lượng được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent 6410; detector SPD10A; cột sắc ký Agilent Zorbax-Rx Sil 2.1x150

mm, 5 µm; nhiệt độ 25oC; thể tích bơm mẫu 5 µl; sử dụng pha động là hỗn hợp đệm ammonium axetat (pH 6,8) : axetonitril 85 : 5 (v/v); tốc độ dòng 1,0 ml/phút; bước sóng 294 nm, có so sánh với mẫu cefotaxime chuẩn

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nghiên cứu phản ứng axyl hóa điều chế muối cefotaxime-Na (3)

Muối hóa phân tử 7-ACA bằng natribicacbonat tác dụng bảo vệ nhóm cacboxyl (tránh phản ứng phụ không mong muốn) đồng thời cải thiện tính tan của

7-ACA-Na 2 làm cho phản ứng axyl hóa tổng hợp 3 từ MAEM 1 bởi 2 diễn ra thuận

lợi (Sơ đồ 3.1)

N S

H N S OCOCH3COONa

COONa O

OCH3

N S

Sơ đồ 3.1 Điều chế muối cefotaxime-natri (3)

Hiệu suất phản ứng tổng hợp cefotaxime có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố: tác nhân muối hóa 7-ACA, tỉ lệ mol 7-ACA-Na/MAEM, tỉ lệ axeton/nước, thời gian phản ứng…

3.1.1 Ảnh hưởng của tác nhân muối hóa 7-ACA

Nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp cefotaxime sử dụng một số tác nhân

đặc biệt để bảo vệ nhóm cacboxyl của 7-ACA và nhóm amino của MAEM 1 nhằm

tránh các phản ứng phụ, đảm bảo độ chọn lọc của quá trình axyl hóa

Tuy nhiên, những tác nhân này thường có giá thành cao, khó bảo quản, nhạy cảm với môi trường Việc bảo vệ và gỡ nhóm bảo vệ ở giai đoạn sau làm phức tạp hóa khi triển khai sản xuất ở quy mô lớn Trên thực tế, chỉ cần khóa nhóm axit của 7-ACA cũng có thể đạt được mục đích nói trên và phương pháp đơn giản là muối hóa nhóm chức này bằng một bazơ hữu cơ thông dụng TEA (triethylamine) [13, 19, 20]

Do trietylamin có giá thành cao, mùi sốc, dễ bay hơi, khó áp dụng ở quy mô sản xuất lớn… nên natri bicabonat - bazơ ít ô nhiễm, giá thành thấp, dễ kiếm, được

ưu tiên sử dụng (trong nghiên cứu này) làm tác nhân muối hóa 7-ACA

Lượng bazơ dùng để muối hóa 7-ACA cũng cần được khảo được khảo sát kỹ lưỡng Các kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ mol 7-ACA/NaHCO3 tới hiệu suất tổng hợp cefotaxime so sánh với 7-ACA/TEA được trình bày tại Bảng 3.1 Phản ứng axyl hóa thực hiện ở 20oC

Bảng 3.1 So sánh ảnh hưởng của tỷ lệ mol 7-ACA/NaHCO3 và 7-ACA/TEA đến hiệu suất tổng hợp cefotaxime

Hình 3.1 So sánh ảnh hưởng của tỷ lệ mol 7-ACA/NaHCO3 và 7-ACA/TEA đến hiệu suất tổng hợp cefotaxime

Như vậy, tỷ lệ mol 7-ACA/NaHCO3 ảnh hưởng tỷ lệ nghịch đến hiệu suất tổng hợp cefotaxime Hiệu suất cao nhất 82,42% ứng với tỷ lệ 7-ACA/NaHCO3 =

1/1 Điều này có thể giải thích bởi tính kém bền của nhân β-lactam (mở vòng làm

giảm hoạt tính kháng sinh) trong môi trường kiềm (NaHCO3 dư) [1, 5] Khi lượng NaHCO3 ít quá không đủ để tạo muối hoàn toàn với nhóm cacboxyl của 7-ACA,

Kết quả thực nghiệm cho thấy hiệu suất phản ứng không bị ảnh hưởng nhiều

khi trietylamin được dùng dư trong phản ứng axyl hóa tổng hợp 3; ngược lại hiệu

suất lại giảm nhanh trong trường hợp dùng dư natri bicacbonat Theo tác giả, trong trường hợp này có thể trietyl amin (pKb = 4,20) là một bazơ yếu hơn natri bicacbonat (pKb = 3,67), do đó ít khả năng ảnh hưởng đến vòng β-lactam nên ít ảnh

hưởng đến hiệu suất

Theo nhiều tài liệu chúng tôi tham khảo được [13, 19, 20], hầu như chưa có công trình nào sử dụng natri bicacbonat để muối hóa 7-ACA Tuy hiệu suất phản ứng không cao hơn nhiều so với phương pháp đã biết, nhưng việc thay thế trietylamin bằng natri bicacbonat khi tạo muối của 7-ACA có ưu điểm làm giảm giá thành sản phẩm và giảm ô nhiễm môi trường, mở ra khả năng ứng dụng sản xuất cefotaxime ở quy mô lớn

Trong quá trình nghiên cứu, một bazơ thông dụng khác là natri hydroxyt được sử dụng để muối hóa nhóm cacboxyl của phân tử 7-ACA Trên sắc đồ TLC không quan sát thấy sự biến chuyển của phản ứng axyl hóa Điều này có thể do NaOH là một bazơ mạnh (pKb= 0,20) nên có khả năng phá vỡ khung cephem của 7-ACA ngay trong quá trình muối hóa, như vậy phản ứng axyl ở giai đoạn tiếp theo không thể thực hiện được

Khung cephem không bền trong môi trường kiềm có thể mở vòng β-lactam

theo cơ chế sau:

H

N S OCOCH3COOH

O

H H

HNu

R O Nu

- H +

NH HN S OCOCH3COOH

NuOC

H H R

O

Sơ đồ 3.2 Cơ chế mở vòng β-lactam [37]

3.1.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ 7-ACA-Na/MAEM

Về lý thuyết, 1 mol MAEM có thể phản ứng với 1 mol 7-ACA-Na để tạo thành 1 mol cefotaxime-Na Tuy nhiên, trong thực tế, phản ứng này diễn ra không hoàn toàn, vì vậy một trong hai chất tham gia phản ứng phải được dùng dư

Quá trình nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ mol 7-ACA-Na/MAEM đến hiệu suất được tiến hành tại các điều kiện cụ thể:

+Tỷ lệ 7-ACA/NaHCO3 = 1/1 (mol/mol)

+ Phản ứng axyl hóa ở 20oC

Kết quả được trình bày trong Bảng 3.2

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ mol 7-ACA-Na/MAEM đến hiệu suất tổng hợp

cefotaxime

Tỷ lệ mol 7-ACA-Na/MAEM 0,6/1 0,8/1 1/1 1,2/1 1,4/1 1,6/1

Hiệu suất (%) 60,21 66,89 80,30 82,15 82,10 81,95

50 60 70 80 90

Việc lựa chọn chất dư phụ thuộc vào giá thành, khả năng tách loại khỏi sản phẩm sau phản ứng Trong nghiên cứu này, muối 7-ACA-Na được dùng dư vì quá trình loại bỏ tạp chất ở giai đoạn trung hòa về sau khá dễ dàng

3.1.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi axeton/nước

Nhìn chung, các dung môi không có tính nucleophil hoặc có tính nucleophil rất yếu (diclometan, axetonitril, dioxan, tetrahydrofuran…) thường được ưu tiên sử dụng trong phản ứng tổng hợp cefotaxime nhằm tránh phản ứng phụ với tác nhân axyl hóa

Tuy nhiên, những dung môi này hoặc là độc hại, không thân thiện môi trường hoặc giá thành cao Để khắc phục những nhược điểm đó, axeton đã được lựa chọn, một lượng nước vừa đủ được thêm vào nhằm hòa tan hoàn toàn muối 7-ACA-

Na

N S

H2N O

S

NOCH3N

Sơ đồ 3.3 Phản ứng phụ giữa MAEM và nước

Với mục đích hạn chế tới mức thấp nhất sự cạnh tranh của nước (nucleophil) trong phản ứng với MAEM (electrophil) (Sơ đồ 3.3) đồng thời vẫn đảm bảo khả

năng tạo một môi trường đồng nhất của hệ phản ứng (7-ACA-Na 2 được hòa tan

hoàn toàn), thành phần hỗn hợp axeton/nước đã được khảo sát (Bảng 3.3) phản ứng được tiến hành tại các điều kiện cụ thể như sau:

50 60 70 80 90

Các kết quả thu được ở bảng trên cho thấy hiệu suất phản ứng đạt cao nhất 82,26% ứng với tỷ lệ axeton/nước 10:1 Tỷ lệ axeton/nước tăng lên, hiệu suất của

phản ứng có xu hướng giảm Điều này phù hợp với thực tế vì muối 7-ACA-Na 2 ít

tan trong axeton, nên nếu lượng axeton chiếm ưu thế so với nước thì phản ứng axyl hóa ở dạng huyền phù (phản ứng dị thể) làm hiệu suất giảm

Việc sử dụng hệ dung môi axeton/nước có nhiều ưu điểm: thân thiện môi trường, ít độc hại, dễ thu hồi để tái sử dụng; không cần thiết thực hiện công đoạn chiết sản phẩm (thường gặp ở các quy trình sử dụng các dung môi hữu cơ khác như diclometan, cloroform…) và sản phẩm có thể được tách ra ở dạng kết tủa dễ dàng lọc rửa sau quá trình axit hóa muối cefotaxime-Na

Theo tác giả, một phần nhóm C=O của axeton có thể tham gia phản ứng

ngưng tụ với nhóm amino của MAEM 1 và 7-ACA-Na 2 hình thành dẫn xuất imino

(-C=N-) [14] Tuy nhiên, phản ứng này có thể không cạnh tranh được với phản ứng

giữa nhóm cacbonyl (đã được hoạt hóa) của MAEM với nhóm amino của 2 khi

vắng mặt các xúc tác cần thiết [14] Do đó, không cần bảo vệ nhóm amino của

MAEM 1 vẫn tiến hành được phản ứng axyl hóa ở nhiệt độ thường (20 – 25oC)

3.1.4 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng

Do nhóm cacbonyl trong phân tử MAEM 1 đã được hoạt hóa, phản ứng axyl tổng hợp 3 có thể diễn ra một cách thuận lợi và được thực hiện ở nhiệt độ thường

(20 ÷ 25oC), cho phép tiết kiệm năng lượng khi triển khai quy trình công nghệ ở quy

mô công nghiệp

Quá trình chuyển hóa của nguyên liệu đầu MAEM 1 được theo dõi bằng

phương pháp sắc ký bản mỏng TLC (hệ dung môi triển khai n-hexan: etylaxetat = 1:1, hiện màu bằng hơi iốt)

Hỗn hợp phản ứng được lấy mẫu (ký hiệu là Cef-Na) sau từng thời gian phản

ứng (30 phút), được phân tích trên bản mỏng có so sánh với các mẫu chuẩn của 1

(ký hiệu là MAEM) và 2-mercaptobenzothiazol (ký hiệu là Mer) (Hình 3.4)

30 60 90 120 150 180 phút

Hình 3.4 Sắc ký đồ TLC của các hợp chất theo thời gian phản ứng

Trên sắc ký bản mỏng, có thể nhận thấy lượng MAEM giảm dần theo thời gian phản ứng trong khi lượng 2-mercaptobenzothiazol (được giải phóng từ phản

ứng của MAEM 1 và muối 7-ACA-Na 2, ký hiệu trên bản mỏng là Mer) tăng dần

Sau khoảng 150 phút thì lượng MAEM gần như không còn nữa Do tương tác mạnh

của cefotaxime-Na 3 với silicagel của bản mỏng, sản phẩm phản ứng có thể lưu lại

tại vạch xuất phát Sau 180 phút, trên sắc ký bản mỏng của hỗn hợp phản ứng hầu như không thấy xuất hiện những vết lạ, cho thấy phản ứng có độ chuyển hóa tốt, độ chọn lọc cao

Ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến hiệu suất tổng hợp cefotaxime được khảo sát định lượng bằng cách thay đổi thời gian phản ứng từ 30 – 180 phút Các thông số phản ứng khác được cố định:

+ Tỷ lệ 7-ACA/NaHCO3 = 1/1 (mol/mol)

+ Tỷ lệ 7-ACA-Na/MAEM = 1,2/1 (mol/mol)

+ Tỷ lệ dung môi axeton/nước = 10/1 (v/v)

+ Phản ứng axyl hóa ở 20oC

Với mỗi mốc thời gian phản ứng ở trên, sản phẩm của phản ứng axyl hóa

được trung hòa bằng axit, thu được kết tủa cefotaxime dạng axit tự do 4 (Bảng 3.4)

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình tổng hợp cefotaxime

Thời gian phản ứng (phút) 30 60 90 120 150 180 Hiệu suất (%) 30,39 63,52 79,35 82,21 82,18 82,20

20 30 40 50 60 70 80 90

Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình tổng hợp cefotaxime.

Từ các số liệu thu được, ta thấy thời gian phản ứng tổng hợp cefotaxime tối

ưu là 120 phút, phù hợp với những kết quả thu được theo phương pháp sắc ký bản mỏng Nếu kéo dài thời gian phản ứng, hiệu suất tăng lên không đáng kể, không có lợi về mặt kinh tế khi tiến hành sản xuất ở quy mô lớn

Hiệu suất của sản phẩm cuối cefotaxime 4 phụ thuộc vào quá trình axit hóa muối cefotaxime-Na 3 và được thảo luận ở phần tiếp theo

3.2 Phản ứng trung hòa điều chế sản phẩm cuối cefotaxime axit

Muối cefotaxime-Na (3) được tổng hợp ở trên được xử lý với axit tạo thành cefotaxime (4) (Sơ đồ 3.4)

N S

H N S OCOCH3COONa

N OCH 3

O

H H

4 3

Sơ đồ 3.4 Điều chế cefotaxime dạng axit tự do (4)

dụng, nhiệt độ, dung môi…

Ingolf Macher [13] trong một nghiên cứu tương tự tổng hợp cefotaxime từ

MAEM 1 và muối trietylamin của 7-ACA, giai đoạn trung hòa đã sử dụng axit HCl,

nhiệt độ t = 20oC, pH = 3,5, hiệu suất 80%

Trên cơ cơ này, chúng tôi đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH môi

trường (giai đoạn axit hóa muối cefotaxime-Na 3) đến hiệu suất tổng hợp 4 Axit

được sử dụng là foomic, phản ứng tiến hành ở nhiệt độ phòng (Bảng 3.5)

Bảng 3.5.Ảnh hưởng của pH quá trình trung hòa đến hiệu suất tổng hợp cefotaxime

pH 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5

Hiệu suất (%) 14,98 25,41 51,19 65,58 77,89 78,25 73,41 33,80

0 20 40 60 80 100

Từ các kết quả thu được ở Bảng 3.5 và Hình 3.6, nhận thấy hiệu suất tối ưu

của quá trình tổng hợp 4 từ 3 xoay quanh điểm đẳng điện (pH = 3,5) của hợp chất

này

Khi axit hóa muối cefotaxime-Na thu được ở pH < 3,0 hiệu suất cefotaxime giảm rõ rệt Sản phẩm thu được là một chất rắn có các tính chất vật lý gần giống với cefotaxime nhưng không cho biểu hiện phản ứng của nhóm cacboxyl (không giải phóng bọt khí khi có mặt trong dung dịch NaHCO3 loãng) Phổ 1H-NMR (DMSO-

d 6) không cho tín hiệu ở vùng trường mạnh của nhóm axetoxy của cefotaxime δ =

2.03 ppm (3H, OCOCH3 ở vị trí C-3 của khung cephem) (Xem thêm phần phụ lục)

Kết hợp dữ liệu phổ này với những nghiên cứu của H Fabre và cộng sự [11],

có thể khẳng định rằng ở môi trường pH thấp đã có sự ngưng tụ của nhóm axetoxy

ở C-3 và nhóm cacboxylic ở C-4 của khung cephem tạo thành vòng lactone (Sơ đồ 3.3)

RHN N S OH COOH O

H H

RHN N S OH O

H H

C

RHN N S

OH O

H H

C

HO OH+

RHN N S

O

H H

O HO OH

RHN N S

O

H H

O HO

RHN N S

O

H H

O

H 2 O OH

RNN N S

O

H H

O HO Deaxetylcefotaxime lacton

3.2.2 Ảnh hưởng của các axit khác nhau

Theo các tài liệu chúng tôi tham khảo được, nhiều công trình nghiên cứu sử

dụng axit HCl ở giai đoạn trung hòa muối cefotaxime-Na 3 tổng hợp cefotaxime axit 4 Một câu hỏi được đặt ra là: bản chất của axit khác nhau sẽ ảnh hưởng như thế

nào đến hiệu suất của phản ứng?