Phân lập vi khuẩn bacillus subtils từ phân heo, khảo sát khả năng ứng chế sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập được

Phân lập vi khuẩn bacillus subtils từ phân heo, khảo sát khả năng ứng chế sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập được

Độc tố aflatoxin chủ yếu do loài vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus tạo

ra, là độc tố nguy hiểm nhất và thường nhiễm trên nông sản, gây độc cho người và giasúc

Ở nước ta, với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm trong không khí thườngcao, thời vụ canh tác, thu hoạch thường rơi vào mùa mưa trong khi các phương tiện thuhoạch, phơi sấy nông sản kém, kho chứa không đảm bảo khô ráo thoáng mát là điều kiệnrất thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc tố cho thực phẩm và thức ăn chănnuôi Một số phương pháp vật lý (phân hủy bằng không khí nóng, nhiệt, tia xạ) và hóahọc (sử dụng chất oxy hóa khử, kiềm, khí NH3) đã được áp dụng để ngăn ngừa sự sảnsinh aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc Tuy nhiên, hầu hết các phương pháp

đó không được phổ biến rộng rãi do chi phí cao hoặc khó thực hiện, làm mất giá trị dinhdưỡng sản phẩm, chất lượng cảm quan Một trong những xu hướng hiện nay là áp dụng

phương pháp vi sinh vật học Các loài nấm mốc (Rhizopus stolonifer, Rhizopus arhizus),

vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus pulimus), nấm men (Saccharomyces cerevisiae), xạ

khuẩn đã được thử nghiệm về khả năng làm giảm aflatoxin thu được kết quả cũng rất khảquan

Được sự cho phép của Khoa Chăn Nuôi Thú y và dưới sự hướng dẫn của PGS.TS

Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành đề tài “ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtils từ phân

heo, khả sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập được”

Mục tiêu: Đánh giá khả năng ức chế aflatoxin của Bacillus subtilis.

Yêu cầu

- Phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus subtilis từ phân heo.

- Đánh giá khả năng ức chế aflatoxin của Bacillus subtilis.

CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS

2.1.1 Lịch sử phát hiện

Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ

chức y học Nazi của Đức Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ chocác binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi Việc điều trị phải đợi đến những năm

1949 - 1957, khi Henrry và các cộng sự tách được chủng thuần khiết của Bacillus

subtilis Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị các chứng

viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hoá Ngày nay, vikhuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi,thực phẩm (trích Lý Kim Hữu, 2005)

2.1.2 Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis

2.1.2.1 Đặc điểm phân loại

Theo đặc điểm phân loại của Bergey (1994), vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc

Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc của đường ruột,

chúng được phân bố hầu hết trong tự nhiên Phần lớn chúng cư trú trong đất, thôngthường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g Đất nghèo dinh dưỡng ở

vùng sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm Nước và bùn

cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis (Vũ

Thị Thứ, 1996)

2.1.2 Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn Bacillus subtilus là trực khuẩn Gram dương có hai đầu tròn, kích

thước 0,5 – 0,8 µm x 1,5 – 3 µm, thường đứng đơn lẻ hoặc tạo thành chuỗi ngắn,

có khả năng di động, có khả năng sinh bào tử nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng, kíchthước 0,9 - 0,6 µm Vị trí của bào tử trong tế bào sinh dưỡng không theo mộtnguyên tắc chặt chẽ nào, có thể lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm(trích dẫn bởi Nguyễn Lân Dũng,1983)

2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy

Điều kiện nuôi cấy: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu 370 C

Nhu cầu O2: Bacillus subtillis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát

triển trong môi trường thiếu oxy

Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7 - 7,4.

Trên môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa khôngđều, có tâm sẩm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm Sau

1 - 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi xẩm

Trên môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu hơi xám, rìagợn sóng

Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo

màng nhăn trên bề mặt môi trường canh, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, khótan đều khi lắc lên

Dinh dưỡng: cần các nguyên tố C, H, O, N và các nguyên tố khác

Bacillus subtilis có kháng nguyên H và O, cấu trúc kháng nguyên dạng D và L của

acid glutamic

Sản sinh kháng sinh subtilin và bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn G+ và G-

Bệnh học: đa số chủng Bacillus subtilis không gây bệnh.

2.1.6 Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis

Bào tử vi khuẩn là một kết cấu do sự biến đổi của tế bào sinh dưỡng trong một giaiđoạn nào đó của quá trình sinh trưởng của vi khuẩn Mỗi tế bào chỉ tạo thành một bào tử(trích dẫn bởi Nguyễn Khắc Tuấn, 1996)

Bào tử vi khuẩn không phải là một bộ phận làm chức năng sinh sản mà chỉ là mộtthể biến đổi của tế bào nhằm bảo tồn, đổi mới và nâng cao sức sống của vi khuẩn

Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, có sự đề kháng cao với các nhân

tố bất lợi của ngoại cảnh

Theo Nguyễn Xuân Thành và ctv (2005) thì sự tồn tại lâu dài của bào tử là dochúng có các đặc tính sau:

- Nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có khả năng làmbiến tính protein khi tăng nhiệt độ

- Do trong bào tử có một lượng lớn ion Ca2+ và acid dipicolinic Protein trong bào

tử kết hợp với dipicolinat canxi tạo thành một phức chất có tính ổn định cao đốivới nhiệt độ

- Các enzyme và các hoạt chất sinh học khác trong bào tử đều tồn tại dưới dạngkhông hoạt động làm hạn chế sự trao đổi chất của bào tử với môi trường bênngoài

- Sự có mặt của các acid amin chứa lưu huỳnh, đặt biệt là cysteine giúp bào tử đềkháng với tia cực tím

- Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp màng, làmcho các chất hóa học và các chất sát trùng khó có thể tác động đến bào tử

Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành một tế bào mới cósức sống mạnh mẽ hơn (trích dẫn bởi Nguyễn Khắc Tuấn, 1996).

2.1.7 Cơ chế đối kháng của Bacillus subtilis với vi sinh vật gây bệnh

Với vi sinh vật gây bệnh, mỗi loài sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điềukiện môi trường, sinh khuẩn lạc khác nhau Thay đổi môi trường hoặccác yếu tố môi trường bất lợi làm thay đổi điều kiện sống, hạn chế hoặc ứcchế sự phát triển của vi sinh vật Thực tế khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự

hiện diện của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ xảy ra sự cạnh tranh dinh

dưỡng Cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và nấm, do vi khuẩn pháttriển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môitrường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ứcchế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Thuận, 1976)

Phương thức diệt nấm và tác nhân gây bệnh như sau:

Đầu tiên vi khuẩn Bacillus subtilis tạo thành khối xung quanh tác nhân gây bệnh

ngăn chặn không cho chúng bám vào vật chủ để gây bệnh

Sau đó, Bacillus tiết ra hỗn hợp gồm nhiều lipopeptid (được gọi là serenade) để

làm thủng vách tế bào và màng tế bào chất của tác nhân gây bệnh do đó ngăn chặn sựphát triển của chúng Serenade có thể được bảo quản, sử dụng như một loại thuốc trừ sâuhóa học tổng hợp, đã được kiểm tra và chứng minh trong phòng thí nghiệm là không gâyđộc đối với cá hồi, ong mật, chim cút,…và nhiều loài khác Serenade gồm 3 nhómlipopeptid có tên là surfactin, agrastain và iturin Ba nhóm này kết hợp với nhau để làmtăng hoạt tính diệt các mầm bệnh kể cả vi sinh vật gây hại, nấm mốc và cả bào tử gâybệnh của chúng

Surfactin là nhóm chất có hoạt tính sinh học, bản chất là lipopeptid Bản thânsurfactin không gây độc cho nấm nhưng khi kết hợp với iturin thì trở thành hợp chất diệt

nấm Surfactin có khả năng làm thủng vách tế bào của các tác nhân gây bệnh và bào tửcủa chúng, giúp cho agrastain và iturin phát huy tác dụng.

Hình 2.1 Cấu trúc hóa học của surfactin(http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0927776511005807)

Agrastatin vừa mới được phát hiện cũng có khả năng diệt nấm giống nhưsurfactin và iturin

Hình 2.2 Cấu trúc hoá học của Argastin

Inturin là nhóm chất chiếm vai trò quan trọng nhất trong quá trình diệt nấm, bản

chất là lipoprotein được chiết từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis Iturin

diệt nấm bằng cách tác dụng lên màng tế bào chất, làm tan màng, tạo thành những lổ

thủng trên đó để làm mất tính thẩm thấu chọn lọc của màng

Hình 2.3 Cấu trúc hóa học của iturin

Ngoài ra, Bacillus subtilis cũng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli.

Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh nên gây ức chế quá trình

sinh trưởng và phát triển của Escherichia coli, điều đó được thể hiện qua số lượng

Escherichia coli trong bảng ( Nguyễn Quỳnh Nam, 2006).

Bảng 2.1 Bacillus subtilis đối kháng với Escherichia coli trong môi trường TSB

Mẫu đối chứng: môi trường TSB chứa Escherichia coli

2.1.8 Những nghiên cứu về tác dụng đối kháng Aspergillus của Bacillus subtilis

Trong nước:

Nguyễn Đình Đào năm 1993 đã tiến hành kiểm tra khả năng đối kháng của chủng

Bacillus subtilis AO1 với Aspergillus flavus và Aspergillus parasticus và kết quả là có sự

ức chế nấm mốc Aspergillus (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Ngọc Trân, 1995).

Nguyễn Hữu Phúc và cộng sự năm 1993 đã sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis để

ức chế sinh trưởng và sản xuất aflatoxin của Aspergillus flavus, Aspergillus parasticus

trên đậu phộng (trích dẫn bởi Lâm Thanh Thúy Trân, 1995)

Nguyễn Thị Ngọc Trân năm 1995 đã tiến hành kiểm tra khả năng đối kháng của

chủng Bacillus subtilis AO1 (do trung tâm công nghệ sinh học thuộc liên hiệp sản xuất

hóa chất cung cấp) với Aspergillus flavus trên môi trường thạch khoai tây-glucose và kết

quả rất khả quan

Năm 2006, Nguyễn Ngọc Thanh Xuân với đề tài “Khảo sát khả năng sử dụng vi

khuẩn Bacillus subtilis có nguồn gốc từ đất trong xử lý nhiễm aflatoxin trên nguyên liệu bắp” cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ đất có khả năng làm giảm aflatoxin

trên môi trường bắp Tỷ lệ nuôi cấy bào tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn là 1/103, hàm lượngaflatoxin giảm 99,6 lần

Năm 2007, Phạm Hồng Thái đã thực hiện đề tài “Phân lập vi khuẩn Bacillus

subtilis phân lập từ đất, khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng phân

lập được” Kết quả cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ đất có khả năng làm

giảm aflatoxin trên môi trường bắp Tỷ lệ nuôi cấy tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn là 1/103,hàm lượng aflatoxin giảm 8,8 lần

Ngoài nước:

Một số thí nghiệm về khả năng ức chế sinh tổng hợp aflatoxin của một số chủng vi

khuẩn Bacillus subtilis đã được thực hiện với Aspergillus flavus và Aspergillus

parasticus.

Norio Kimura (1990) đã sử dụng vi khẩn Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasticus trên đậu phộng và bắp Các chủng Bacillus subtilis NK330 và NK-C-3 ức chế mạnh mẽ sự phát

triển của nấm mốc và tổng hợp aflatoxin

2.2. KHÁI QUÁT VỀ NẤM MỐC SINH AFLATOXIN

2.2.1. Khái niệm nấm mốc:

Nấm mốc là vi sinh vật (vi nấm) có cấu tạo gần giống với thực vật, sống ký sinhhay hoại sinh trên nhiều loại chất khác nhau, đặc biệt là các chất hữu cơ đơn giản nhất làhydrocacbon

Nấm mốc không chứa diệp lục tố, cấu tạo dạng sợi có vách ngăn hoặc không cóvách ngăn.Những sợi nấm này phân nhánh, hình thành từng đám chằng chit gọi là hệthống sợi nấm Có 2 loại sợi:

• Sợi nấm dinh dưỡng: nằm trong lớp môi trường, làm nhiệm vụ hấp thu chấtdinh dưỡng cho toàn bộ hệ nấm

• Sợi nấm khí sinh: thường nhô lên trên môi trường, giữ vai trò sinh sản (tạobào tử)

2.2.2. Độc tố nấm mốc

Là sản phẩm phụ của quá trình trao đổi tự nhiện của nấm mốc và có thể gây độccho con người và gia súc Độc tố nấm mốc có tính bền với nhiệt độ cao và không bị tiêudiệt trong quá trình chế biến thức ăn thông thường Tùy từng loại mà độc tố nấm mốc cóthể gây nhiễm độc cấp tính và mãn tính

Hiện nay đã phát hiện trên 300 loại độc tố mycotoxin từ hơn 100 loài nấm mốc.Trong đó có khoảng 20 loại độc tố gây nguy hiểm đến sức khỏe con người và vật nuôi 5loại độc tố nguy hiểm nhất hiện nay là aflatoxin, deoxynivalenol, zearalenone, achratoxin

và fumonisin (Trần Cúc Phương, 2008)

2.2.3. Độc tố aflatoxin

2.2.3.1. Lịch sử phát hiện và quá trình hình thành aflatoxin

Aflatoxin là độc tố vi nấm được phát hiện vào năm 1960 khi gây chết trên 10.000

gà tây con ở nước Anh với tổn thương gan rất nặng nề như hoại tử, chảy máu trong gan,tăng sinh ống dẫn mật Tiếp sau đó người ta phát hiện thêm loại mycotoxin này cũng gâytổn thương gan ở súc vật thí nghiệm khác như vịt con, chuột, thỏ, khỉ, heo, bò, cừu Đếnnăm 1961, Sargeant và ctv đã cấy và phân lập được độc tố này và đặt tên là aflatoxin(Dương Thanh Liêm, 2009)

Aflatoxin được sản sinh ra bởi vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus

parasiticus Ngoài ra còn một số loài khác như Aspergillus nomius, Aspergillus pseudotamarii, Aspergillus bombycis, Aspergillus ochraceoroseus, Emericella venezuelensis (Yu và ctv, 2004) Con đường tổng hợp aflatoxin bao gồm ít nhất 18 phản

ứng chuyển đổi bắt đầu bằng cách tổng hợp polypeptide từ acetate, tương tự như quátrình tổng hợp axit béo Theo Prieto và Woloshuk (1997), quá trình hình thành aflatoxinB1 như sau: NOR → averantin → averufanin → averufin → hydroxyversicolorone →versiconal hemiacetal acetate → versicolorin A → saerigmatocystin → O-methylsterigmatocystin → aflatoxin B1

Một số gen tương ứng quy định các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợpaflatoxin bao gồm pksA, pksL1, fas1A, nor-1, NorA, avf1, vbs, ver1, stcP, omtA, ord1,avnA và gen aflR (Prieto và Woloshuk, 1997) 25 gen nằm trong khu vực DNA 70kb đãđược xác định liên quan đến quá trình sinh tổng hợp aflatoxin (trích dẫn Yu và ctv,2004)

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành aflatoxin có thể được chia thành 3 loại:vật lý, dinh dưỡng và các yếu tố sinh học (Gourama và Bullerman, 1995) Trong đó yếu

tố vật lý đóng vai trò quan trọng Yếu tố vật lý bao gồm nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, sự lưuthông khí và mức độ của các khí trong khí quyển Aflatoxin được sản xuất ở nhiệt độ từ

12 – 410C và nhiệt độ tối ưu là 250C đến 320C (Lillehoj, 1983) Sự sản xuất aflatoxin đặcbiệt ưa chuộng bởi những điều kiện rất ẩm ướt Tổng hợp aflatoxin tăng lên ở 270C, độ

ẩm không khí lớn hơn 62% và độ ẩm trong thức ăn chăn nuôi trên 14% (Royes vàYanong, 2002) Sự hiện diện của CO2 và O2 cũng ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của nấmmốc và sản xuất độc tố aflatoxin Nhiều nghiên cứu đã báo cáo rằng độ pH ban đầu

không ảnh hưởng đáng kể đến sản xuất độc tố aflatoxin, trong khi các nhà điều tra kháccho thấy rằng ở pH axit yếu, nấm mốc phát triển tốt hơn và sản sinh nhiều aflatoxin hơn(Landers và ctv, 1967).

Bảng 2.2: Một số loài nấm mốc có khả năng sản sinh aflatoxin

Penicillium

frequentans

Các loài nấm mốc có vai trò quan trọng trong sản sinh Aflatoxin là Aspergillus flavus và

Aspergillus parasiticus, các loài nấm khác: Penicillium spp và Rhizopus Spp thường ít có

vai trò gây bệnh trong thực tế (Lê Anh Phụng, 2001)

2.2.4. Cấu trúc và tính chất vật lý, hóa học

Aflatoxin là hợp chất hữu cơ có nhân đa mạch vòng là dẫn xuất difurocoumarin.Khoảng 20 loại aflatoxin đã được xác định.Trong đó có 4 loại được để ý sớm nhất vànhiều nhất là B1, G1, B2, G2 Trong ánh sáng cực tím bước sóng dài (380-315 nm), B1

và B2 phát ra màu xanh nước biển, G1 và G2 phát ra màu xanh lá cây (Devero, 1999)

Hình 2.4 Cấu trúc hoá học của aflatoxin B1, B2, G1, G2Mặc dù aflatoxin B1, B2, G1, G2 được phổ biến trong cùng một mẫu thức ăn,nhưng aflatoxin B1 là chủ yếu, chiếm 60 – 80% tổng số aflatoxin Ngoài ra, trong hầu hếtcác trường hợp, aflatoxin G1 được tìm thấy ở nồng độ cao hơn aflatoxin B2 và G2(Weidenborner, 2001).

Các aflatoxin phát quang mạnh dưới ánh sáng cực tím sóng dài Điều này chophép phát hiện các hợp chất này ở nồng độ cực kỳ thấp ( 0,5ng hay thấp hơn trên một vết

ở sắc kí bản mỏng) Nó cung cấp cơ bản về mặt thực hành cho tất cả các phương pháphóa lý về việc phát hiện định lượng Nồng độ aflatoxin M1 0,02mg/l có thể được pháthiện trong sữa lỏng

Aflatoxin tinh khiết rất bền bững ở nhiệt độ cao lên đến điểm nóng chảy, khi đượclàm nóng trong không khí Tuy nhiên, nó tương đối bền khi để dưới không khí và dưới tiacực tím ở phiến sắc kí bản mỏng, và đặc biệt khi hòa tan ở các dung môi có độ phân cựccao Các aflatoxin trong các dung môi clorofom và benzene bền vững trong nhiều nămnếu được giữ trong chỗ tối và lạnh Các aflatoxin ít hoặc không bị phá hủy dưới điều kiện

nấu bình thường và làm nóng khi thanh trùng Tuy nhiện, khi có độ ẩm và ở nhiệt độ caovẫn có thể tiêu hủy aflatoxin trong một khoảng thời gian nhất định.

Các aflatoxin được hòa tan trong các dung môi phân cực nhẹ như clorofom,methanol và đặc biệt ở dimethylsufoit (dung môi thường được sử dụng như phương tiệntrong việc áp dụng các aflatoxin vào các động vật thí nghiệm) Tính tan của aflatoxintrong nước dao động từ 10-20mg/l

Sự có mặt của vòng lacton ở phân tử aflatoxin làm chúng nhạy cảm với việc thủyphân trong môi trường kiềm, đặc tính này là quan trọng trong bất kì quá trình chế biếnthực phẩm vì quá trình xử lý kiềm làm giảm hàm lượng aflatoxin của các sản phẩm, mặc

dù sự có mặt của protein, pH và thời gian xử lý có thể thay đổi các kết quả Tuy nhiênnếu xử lý kiềm là nhẹ thì việc axit hóa sẽ làm phản ứng ngược trở lại để tạo aflatoxin banđầu

Ở nhiệt độ cao (khoảng 100oC) sự mở vòng decarboxylation xảy ra và phản ứng cóthể tiến xa hơn, dẫn đến sự mất mát các nhóm methoxy từ vòng thơm

Khi có các acid vô cơ và bổ sung nước, aflatoxin B1 và G1 chuyển hóa thànhaflatoxin B2A và G2A Các sản phẩm cộng hợp tương tự của aflatoxin B1 và G1 cũngđược hình thành với clorua acid formic thionyl, clorua acid acetic và acid thionyltrifluoroacetic

Nhiều tác nhân oxy hóa, chẳng hạn như hypochloride ratri, thuốc tím, chlorine,hydrogen peroxide, ozone và peborat natty phản ứng với aflatoxin và thay đổi các phân

tử aflatoxin, một số phản ứng làm mất huỳnh quang

Sự hydro hóa aflatoxin B1 và B2 sinh ra aflatoxin G1, G2 tương ứng Sự khửaflatoxin B1 bằng 3 mol hydro sinh ra tetrahydroxyaflatoxin Khử aflatoxin B1 và B2bằng natriborohydride tạo ra RB1 va RB2 tương ứng Hiện tượng đó là kết quả của việc

mở vòng lacton bởi sự khử nhóm acid và nhóm xeton ở vòng cyclopentene

2.2.5. Cơ chế gây độc

Aflatoxin B1 là phân tử ái lực mạnh với thành ruột, có trọng lượng phân tử thấpnên dễ dàng được hấp thụ hoàn toàn sau khi ăn

Khi đến ruột non, aflatoxin B1 sẽ nhanh chóng được hấp thu vào tĩnh mạch và ruộtnon, tá tràng.

Từ ống tiêu hóa, theo tĩnh mạch cửa, aflatoxin tập trung vào gan nhiều nhất (chiếmkhoảng 17% lượng aflatoxin của cơ thể) tiếp theo là ở thận, cơ, mô mỡ, tụy, lách và 80%

bị bài tiết ra ngoài trong khoảng một tuần và đáng chú ý là nó còn bài tiết qua tuyến sữagây bệnh cho thai nhi đang bú sữa mẹ Chu kì bán rã trong huyết tương là 36,5phút,lượng phân phối là 14% trọng lượng cơ thể, giải phóng khỏi cơ thể là 1,25l/kg/h.aflatoxin M1 chủ yếu bài tiết trong vòng 48h (Hendrickse, 1991)

Cho đến nay, các luận chứng khoa học đã công nhận khả năng tác động lên tế bào gancủa aflatoxin trải qua 5 giai đoạn sau:

- Tác động qua lại với AND và ức chế các polumeraza chịu trách nhiện tổng hợpAND và ARN

- Ngừng tổng hợp AND

- Giảm tổng hợp AND và ức chế tổng hợp ARN truyền tin

- Biến đổi hình thái nhân tế bào

- Giảm tổng hợp protein

Hậu quả của quá trình tác động sinh hoá lên tế bào gan này là gây ung thư biểu mô

tế bào gan

2.2.6. Những tác hại do aflatoxin gây ra

Theo Dương Thanh Liêm (2002), aflatoxin gây ra những tác hại rất lớn cho cơ thể conngười và động vật Những tác hại đó như sau:

- Gây tổn thương tế bào gan: tất cả các trường hợp xác nhận sự ngộ độcaflatoxin đều có bệnh tích giống nhau là gan của động vật bị nhiễm đều hư hạinặng Tuỳ theo mức độ nhiễm ít hay nhiều, lâu hay mau mà bệnh tích trên gan

có khác nhau Biểu hiện chung là: ban đầu gan biến thành màu vàng tươi, mậtsưng Sau đó gan sưng to lên, mật căng phồng và bắt đầu nổi mụt nhỏ trên bềmặt gan làm cho nó gồ ghề đôi khi có những nốt hoại tử trắng Sau cùng donhiễm khuẩn mà gan trở nên bở, dễ bể

- Thận cũng bị sưng to làm cho việc bài thải chất độc ra khỏi cơ thể trở nên khókhăn Từ đó làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng

- Bào mòn ống tiêu hoá nên làm giảm khả năng tiêu hoá các chất dinh dưỡngtrong thức ăn Đôi khi cũng thấy tổn thương ở miệng, làm cho thú khó lấy thứcăn.

- Làm giảm khả năng đề kháng của động vật, ức chế hệ thống sinh kháng thể

Do đó khi nhiễm aflatoxin cơ thể rất mẫn cảm với các bệnh thông thường, cóthể gây tử vong cho thú

- Làm thay đổi hoạt động sinh lý bình thường, gây rối loạn sinh sản

- Làm giảm tính ngon miệng đối với thức ăn do sự phát triển của nấm mốc làmmất mùi thức ăn

- Làm hư hại các chất dinh dưỡng trong thức ăn như glucid, protein, acidamin,vitamin…Làm thức ăn bị giảm giá trị nghiêm trọng, mất mùi tự nhiên nên thúkhông thích ăn

Đặc biệt, aflatoxin có có khuynh hướng gây ung thư

Từ đó có thể thấy aflatoxin làm giảm thấp sự sinh trưởng, sức sản xuất của thú.Hậu quả cuối cùng là có thể gây chết thú

2.2.7. Các phương pháp ức chế và loại trừ aflatoxin

Phương pháp vật lý

- Loại bỏ phần bị nhiễm nấm mốc: các hạt bị nhiễm nấm mốc thường có sự thay đổi

về màu sắc và có thể được lựa ra

- Xử lý nhiệt: ở nhiệt độ cao thì có khả năng tiêu diệt nấm mốc sinh độc tố (DươngThanh Liêm và ctv, 2006) Còn aflatoxin là chất chịu nhiệt, vì vậy các biện phápvật lý bằng nhiệt chỉ làm thay đổi nhỏ về mức độ của chúng (Tripathi và Mishra,2010)

- Phương pháp chiếu xạ: tia X, tia γ, tia UV, tia hồng ngoại, ánh sáng mặt trời đượcnghiên cứu rộng rãi nhằm làm giảm độc tố aflatoxin

- Dùng các chất hấp phụ và chất kết dính độc tố: dùng một số chất có khả năng hấpphụ hoặc liên kết được độc tố nấm mốc trong đường tiêu hóa của động vật nên làmgiảm sự hấp thu qua niêm mạc ruột (Lê Anh Phụng, 2002)

Phương pháp hóa học

Phương pháp sử dụng các dung môi hóa chất có thể trích xuất các hợp chất này màchỉ gây ảnh hưởng tối thiểu về chất lượng dinh dưỡng Tuy nhiên, công nghệ này vẫn còntốn kém, khó thực hiện trong thực tế, bên cạnh đó còn gây mùi vị không tốt Ozon hóa làphương pháp hóa học đã được nghiên cứu nhiều nhất cho việc khử nhiễm aflatoxin trongthực phẩm.

Phương pháp vi sinh vật học

Hiện nay, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng aflatoxin dễ bị một số vi sinh vật nhưnấm, vi khuẩn và nấm men phân hủy sinh học Một số loài vi khuẩn, chẳng hạn như

Lactobacillus, Bacillus, Pseudomonas, Ralstonia và Burkholderia spp đã cho thấy khả

năng ức chế sự phát triển của nấm và sự sản xuất aflatoxin bởi Aspergillus spp trong

phòng thí nghiệm (Reddy và ctv, 2010) Taylor và ctv (2010) đã nghiên cứu một số

enzyme thuộc nhóm actinomicetales ở Mycobacterium smegmatis có khả năng tác động

vào nhóm este của aflatoxin bằng cách kích hoạt các phân tử cho quá trình tự thủy phân

và khử nhiễm Niu và ctv (2008) đã nghiên cứu một số vi sinh vật sử dụng coumarin như

là một nguồn cacbon, kết quả chỉ ra rằng tác động làm giảm aflatoxin đã được thực hiệnbởi enzyme protease Nghiên cứu của Cacciamani và ctv (2007) đánh giá sử dụng

A.oryzae và Rhizopus sp có thể làm giảm đến 80% aflatoxin B1 Các loại nấm hoại sinh

như Candida krusei và Pichia anomala cũng hứa hẹn cho thấy là tác nhân kiểm soát sinh

học aflatoxin (Reddy và ctv, 2010)