Phân lập vi khuẩn bacillus subtilis từ thức ăn thừa

Đây là một chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí,hình que, có khả năng sinh nội bào tử để chống chịu các điều kiện bất thường của môi trường sống.. Trịnh Thành Trung, 2013 Theo phân

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS

TỪ CƠM THỪA

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực hiện : NGUYỄN TRƯỜNG AN MSSV: 1211100027 Lớp: 12DSH02

TP Hồ Chí Minh, 2016

Đồ án tốt nghiệp

i

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sựhướng dẫn của TS Nguyễn Thị Hai, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môitrường, Trường Đại học Công Nghệ TP Hồ Chí Minh

Những số liệu và kết quả có được trong đồ án này là trung thực, hoàn toànkhông sao chép từ đồ án tốt nghiệp của người khác dưới bất kỳ hình thức nào Cácthông tin trích dẫn sử dụng trong đề tài đều được chỉ rõ nguồn gốc và có độ chínhxác trong phạm vi hiểu biết của tôi Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đồ án củamình

TP HCM, ngày 18 tháng 08 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Trường An

Để hoàn thành được đồ án tốt nghiệp này, lời đầu tiên em xin được chânthành gửi lời cảm ơn đến Trường Đại học Công Nghệ TP HCM đã tạo điều kiệncho em được thực hiện đề tài tại Phòng thí nghiệm của trường.

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời tri ân chân thành đến Cô Nguyễn ThịHai, Cô đã động viên, tận tình hướng dẫn và chỉ bảo em trong suốt thời gian thựchiện đồ án tốt nghiệp

Đồng thời, em cũng xin được gửi lời cảm ơn đến quý Thầy, Cô khoa Côngnghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốtthời gian dài học tập, giúp em xây dựng nền tảng kiến thức cho công việc và học tậpsau này

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình đã luôn chăm sóc,tạo điều kiệncho em đến trường theo đuổi ước mơ và thường xuyên khích lệ, động viên em trongsuốt quá trình học tập và thực hiện đồ án tốt nghiệp

Em xin cảm ơn các bạn cùng thực hiện đề tài trong phòng thí nghiệm –những người bạn luôn sát cánh và giúp đỡ hết mình trong suốt thời gian thực hiện

đề tài này

Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy, Cô trong Hội đồng phản biện đã dànhthời gian đọc và nhận xét đồ án này Em xin gửi đến quý Thầy, Cô lời chúc sứckhỏe

Em xin chân thành cảm ơn!

TP HCM, ngày 18 tháng 08 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Trường An

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

MỞ ĐẦU 1

1.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 3

1.1.2 Mục đích nghiên cứu 3

1.2 Phương pháp nghiên cứu 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về vi khuẩn Bacillus subtilis 4

1.1.1 Lịch sử phát hiện 4

1.1.2 Phân loại 5

1.1.3 Đặc điểm 6

1.1.4 Bộ gen của Bacillus subtilis 13

1.1.5 Hệ enzyme của Bacillus subtilis 13

1.1.6 Tính chất đối kháng 14

1.1.7 Tính an toàn và ứng dụng của Bacillus subtilis 15

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 18

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 18

2.1.2 Thời gian nghiên cứu 18

2.2 Vật liệu nghiên cứu 18

2.2.1 Nguồn mẫu 18

2.2.2 Hóa chất 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp phân lập và làm thuần 18

2.3.2 Phương pháp định danh vi sinh vật 21

2.3.3 Xác định cấu trúc vi sinh vật 21

2.3.4 Kỹ thuật nhuộm bào tử 22

2.3.5 Định danh bằng các thử nghiệm sinh hóa 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn 27

3.1.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 27

3.1.2 Đặc điểm hình thái tế bào 27

3.1.3 Hình dạng bào tử 27

3.1.4 Tổng hợp kết quả xác định hình thái và cấu trúc của các chủng phân lập 28

3.2 Các thử nghiệm sinh hóa để xác định vi khuẩn Bacillus subtilis 46

3.2.1 Thử nghiệm khả năng di động 46

3.2.2 Thử nghiệm catalase: 48

3.2.3 Thử nghiệm methyl red 49

3.2.4 Thử nghiệm Voges Proskauer: 50

3.2.5 Thử nghiệm khả năng sử dụng citrate 53

3.2.6 Thử nghiệm khả năng sống trên môi trường chứa 6.5% NaCl 56

3.2.7 Thử nghiệm khả năng thủy phân tinh bột 58

3.2.8 Thử nghiệm thủy phân casein 59

3.2.9 Thử nghiệm khả năng lên men các loại đường 59

3.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme amylase ngọai bào của các chủng

phân lập 65

3.4 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ pH đến khả năng sinh enzyme của các chủng phân lập 67

3.4.1 Khảo sát khả năng đồng nuôi cấy giữa Bacillus subtilis với Lactobacillus 70 3.4.2 Khảo sát sự tương thích giữa các chủng Bacillus subtilis với nhau 72

3.4.3 Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn phân lập đối với nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh trên cây thanh long 73

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 76

1 Kết luận 76

2 Kiến nghị 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO 77

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.2 Khả năng lên men các loại đường của các chủng phân lập 72 Bảng 3.3 Kết quả thử nghiệm sinh hóa các chủng vi khuẩn phân lập được 72 Bảng 3.4 Khả năng phân giải tinh bột của các chủng 74 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ pH đến khả năng sinh enzyme của chủng phân lập 75

Bảng 3.6 Hiệu lực đối kháng giữa các chủng với nấm Neoscytalidium

dimidiatum 82

Hình 3.28 Hiệu lực đối kháng giữa các chủng phân lập với nấm

Neoscytalidium dimidiatum

83

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis 16

Hình 1.2 Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 16

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis 27

Hình 3 1 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM1 41

Hình 3 2 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM2 42

Hình 3 3 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM3 43

Hình 3 4 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM4 44

Hình 3 5 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM5 45

Hình 3 6 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM6 46

Hình 3 7 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM7 47

Hình 3 8 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM8 48

Hình 3 9 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM9 49

Hình 3 10 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM10 50

Hình 3 11 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM11 51

Hình 3 12 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM12 52

Hình 3 13 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM13 53

Hình 3.14 Khả năng di động của các chủng phân lập 56

Hình 3.15 Thử nghiệm catalase 57

Hình 3.16 Thử nghiệm Methyl Red 58

Hình 3.17 Thử nghiệm Voges Proskauer 61

Hình 3.18 Thử nghiệm citrate 64

Hình 3.19 Khả năng chịu mặn của vi khuẩn phân lập 65

Hình 3.20 Khả năng phân giải tinh bột của các chủng 66

Hình 3.21 Khả năng thủy phân casein của các chủng 67

Hình 3.22 Khả năng lên men các loại đường 71

Hình 3.23 Khả năng phân giải tinh bột của các chủng phân lập 74

Hình 3.24 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enzyme amylase 78

Neoscytalidium dimidiatum 82

sự đa dạng, phong phú về các thương hiệu có mặt trên thị trường Sự phát triển nàygóp phần thúc đẩy dự tăng trưởng kinh tế, tạo cơ hội việc làm, tăng thu nhập chohàng triệu người, cũng như tạo nên một thị trường thực phẩm đa dạng, phong phú,đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng Tuy vậy, bên cạnh những lợi ích mà sự pháttriển này mang lại, còn tồn đọng nhiều vấn đề tiêu cực, mà rác thải thực phẩm làmột trong những vấn đề quan trọng nhất Theo thống kê của Tổ chức Nông LươngLiên hiệp quốc (FAO), mỗi năm, khoảng 1/3 tổng số thực phẩm được sản xuất phục

vụ cho như cầu của người dân toàn thế giới – xấp xỉ 1.3 tỷ tấn –bị lãng phí hoặc mấtmát Chất thải thực phẩm là một nguồn thải khổng lồ đối với tài nguyên thiên nhiên

và gây ra các tác động tiêu cực về môi trường Hơn 97% chất thải thực phẩm sẽđược đưa vào các bãi rác, gây ô nhiễm môi trường đất, nước, không khí; gây ảnhhưởng xấu đến sức khỏe của con người Đặc biệt là ở nước ta với tính chất khí hậunhiệt đới nóng ẩm và mưa nhiều, là điều kiện thuận lợi cho các thành phần hữu cơphân huỷ, thúc đẩy nhanh quá trình lên men, thối rữa và tạo nên mùi khó chịu chocon người Các chất thải khí phát ra từ các quá trình này thường là H2S, NH3, CH4,

SO2, CO2, đây đều là những loại khí độc, gây hưởng đến sức khỏe con người.Ngoài ra, các bãi rác công cộng là những nguồn mang dịch bệnh Các kết quảnghiên cứu cho thấy rằng: trong các bãi rác, vi khuẩn thương hàn có thể tồn tạitrong 15 ngày, vi khuẩn lỵ là 40 ngày, trứng giun đũa là 300 ngày Các loại vi trùnggây bệnh thực sự phát huy tác dụng khi có các vật chủ trung gian gây bệnh tồn tại

trong các bãi rác như những ổ chứa chuột, ruồi, muỗi, và nhiều loại ký sinh trùnggây bệnh cho người và gia súc, một số bệnh điển hình do các trung gian truyền bệnhnhư: chuột truyền bệnh dịch hạch, bệnh sốt vàng da do xoắn trùng, ruồi, gián truyềnbệnh đường tiêu hoá, muỗi truyền bệnh sốt rét, sốt xuất huyết Hàng năm, theo tổchức Y tế thế giới, trên thế giới có 5 triệu người chết và có gần 40 triệu trẻ em mắccác bệnh có liên quan tới rác thải.

Trong chất thải thực phẩm,việc xử lý thức ăn thừa từ các hộ gia đình, cácquán ăn, nhà hàng, là một trong những vấn đề khó giải quyết nhất Hơn 50% số rácthải thực phẩm ở nước Anh đến từ các hộ gia đình Các chất thải từ các nhà máy sảnxuất công nghiệp, thường sẽ được xử lý trước khi thải ra môi trường bằng các côngnghệ xử lý chất thải Còn các chất thải thực phẩm từ các hộ gia đình, nhà hàng,quán ăn, thường được đưa thẳng vào các bãi rác mà không qua bất kỳ một côngđoạn xử lý nào, điều này không chỉ gây ảnh hưởng đến môi trường và sức khỏe conngười, mà còn gây ra các tổn thất và lãng phí về kinh tế Vì thế, việc tìm ra các tácnhân có thể phân hủy các rác thải thực phẩm - đặc biệt là phân hủy các lượng cơmthừa canh cặn được thải ra từ các hộ gia đình cũng như các nhà hàng, quán ăn – màkhông làm ảnh hưởng đến môi trường đang được các nhà khoa học quan tâm

Theo Zhi-Long Ye et al (2008) và Jialing Tang et al (2016), trong thức ăn

thừa chưa một lượng lớn tinh bột và cũng khá giàu protein và lipid Theo SyedaAzeem Unnisa (2015), Thức ăn thừa là nguồn vật liệu tốt để sản xuất phân bón dạnglỏng Theo tác giả, phân bón lên men từ thức ăn thừa tương đối dễ làm, không chứađộc tố gây hại và cho hiệu quả tốt đối cây trồng, Vậy các vi sinh vật có ích nào cótrong cơm thừa để có thể tăng cường quá trình lên men, tạo phân bón dạng lỏng từthức ăn thừa?

Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng Bacillus subtilis là một trong

những nguyên nhân gây hư hỏng thực phẩm Thức ăn thừa là một nguồn giàu các

chất dinh dưỡng như tinh bột, các chất béo, protein, và Bacillus subtilis có khả năng

tiết các hệ enzyme amylase, protease, lipase … phân hủy các đại phân tử thànhnhững đơn phân dễ hấp thu

Dựa trên cơ sở đó, đề tài “ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ thức ăn thừa” được thực hiện nhằm mục đích thu được chủng vi khuẩn Bacillus subtilis để

làm nguồn vật liệu bổ sung cho quá trình lên men tạo phân bón lỏng từ thức ăn thừa

1.1.1 Mục tiêu nghiên cứu

- Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ cơm thừa

- Đánh giá khả năng phân hủy tinh bột dựa trên khả năng sinh enzymeamylase của vi khuẩn

1.1.2 Mục đích nghiên cứu

- Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng phân hủy cơm

thừa

1.2 Phương pháp nghiên cứu

- Sử dụng phương pháp phân lập vi sinh vật để phân lập Bacillus subtilis

- Sử dụng phương pháp tuyển chọn vi sinh vật có khả năng phân giải

amylase để tuyển chọn chủng Bacillus subtilis có khả năng phân hủy tinh bột tốt

- Sử dụng các phương pháp thống kê phân tích để đánh giá hiệu lực củachế phấm sản xuất được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về vi khuẩn Bacillus subtilis

Bacillus subtilis thuộc chi Bacillus - một trong những vi sinh vật đầu tiên

được phát hiện và mô tả trong giai đoạn đầu của tiến trình phát triển ngành vi sinhvật học ở cuối thế kỷ XIX Đây là một chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí,hình que, có khả năng sinh nội bào tử để chống chịu các điều kiện bất thường của

môi trường sống Bacillus phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái tự nhiên: từ trên

cạn đến dưới nước, từ nước ngọt đến nước mặn và từ vùng ven bờ đến đáy các ĐạiDương (Trịnh Thành Trung, 2013)

Một số loài thuộc chi này đã được ghi nhận là tác nhân gây bệnh ở người,

trong đó hai loài được xem là quan trọng về mặt y học là B anthracis – gây bệnh than, một bệnh truyền nhiễm cấp tính, và B cereus – có thể gây ra một dạng bệnh từ thực phẩm tương tự Staphylococcus.( Public Health England, 2015)

Bên cạnh đó, nhiều loài vi khuẩn Bacillus, đặc biệt là nhóm B subtilis, có

tiềm năng sản xuất các sản phẩm thương mại ứng dụng trong y học, trong nôngnghiệp và trong công nghiệp thực phẩm (Trịnh Thành Trung, 2013)

Theo phân loại truyền thống, chi Bacillus được chia thành 3 nhóm dựa vào đặc điểm hình thái của bào tử và nang bào tử, trong đó Bacillus subtilis thuộc nhóm

II – gồm những loài Gram biến đổi ( Gram variable), sinh bào tử hình ellip( PublicHealth England, 2015)

Những năm gần đây, hệ thống phân loại chi Bacillus đã phát triển thêm hai nhóm, được gọi là nhóm B subtilis và nhóm B cereus Trong đó, nhóm Bacillus subtilis là một nhóm gồm ít nhất 9 loài vi khuẩn có chung các đặc điểm kiểu hình và

có tính tương đồng đoạn gen 16S rRNA cao Định danh các loài trong nhóm này đòihỏi phải sử dụng tổ hợp nhiều kỹ thuật phân loại hiện đại (Trịnh Thành Trung,2013)

1.1.1 Lịch sử phát hiện

Bacillus subtilis được Christion Ehrenberg phát hiện lần đầu tiên vào năm

1835, tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”, là một trong số

những vi khuẩn được mô tả sớm nhất Năm 1872, nhà sinh học người ĐứcFerdinand Cohn, đã mô tả quá trình hình thành bào tử và đặt lại tên cho loài vi

khuẩn này là Bacillus subtilis (Ines Verbaendert and Paul De Vos, 2011)

Năm 1941, Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y

học Nazi (Đức) Ban đầu, chúng chủ yếu được dùng để phòng bệnh lị cho các binh

lính Đức chiến đấu ở Bắc Phi Môi trường nuôi cấy chứa Bacillus subtilis hoạt động

được bán trên toàn thế giới như một sản phẩm thuốc và nhanh chóng trở thànhphương pháp điều trị hàng đầu thế giới đối với bệnh lỵ và các vấn đề đường ruộtkhác trong nhiều năm cho đến khi các loại thuốc kháng sinh tổng hợp ra đời vào

cuối những năm 1950 Tuy nhiên, vi khuẩn Bacillus subtilis vẫn là một trong số

những vi khuẩn mạnh nhất và có lợi nhất trong tất cả các loại vi khuẩn tăng cườngsức khỏe và kích thích hệ miễn dịch (Stapelberg, Monica-Maria, 2016)

1.1.2 Phân loại

1.1.2.1 Phân loại

Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc:

− Giới (Kingdom) : Bacteria

− Ngành (Division): Firmicutes

− Lớp (Class) : Bacilli

− Bộ (Order) : Bacillales

− Họ (Family) : Bacillaceae

− Chi (Genus) : Bacillus

− Loài (Species) : Bacillus subtilis

Danh pháp hai phần: Bacillus subtilis (Ehrenberg 1835) Cohn 1872

1.1.2.2 Nhóm Bacillus subtilis

Hơn 20 năm qua, nhiều loài vi khuẩn có quan hệ gần gũi với Bacillus subtilis

đã được phân lập và mô tả Chúng gồm ít nhất 9 loài vi khuẩn là B amyloliquefaciens, B atrophaeus, B axarquiensis, B malacitensis, B mojavensis,

B sonorensis, B tequilensis, B vallismortis và B velezensis Phương pháp phân

loại truyền thống dựa trên hình thái tế bào, bào tử cũng như các đặc tính sinh hóa

không có khả năng phân tách các loài này Hơn nữa, kết quả phân tích trình tự đoạngen 16S rRNA cho thấy mức độ tương đồng giữa chúng rất cao (> 99%) Vì vậy, 9

loài vi khuẩn trên thường được gọi theo một thuật ngữ chung là nhóm vi khuẩn B subtilis

Bên cạnh việc phân loại dựa trên trình tự gen 16S rRNA, một số gen khác

như DNA gyrase subunit A (gyrA), DNA gyrase subunit B (gyrB) và component sensor histidine kinase (CheA) đã được sử dụng phân loại các loài trong nhóm B Subtilis Gần đây, xây dựng cây phát sinh chủng loại trên trình tự đa gen (gyrA, rpoB, purH, polC, groEL và 16S rRNA) đã được ứng dụng trong phân loại các loài hoặc dưới loài B Subtilis Nhiều loài trong nhóm này đã được phân tách thành các loài phụ như B subtilis được phân thành B subtilis subsp subtilis, B subtilis subsp spizizenii và B subtilis subsp inaquosorum (Trịnh Thành Trung,

two-2013)

Phân loại các loài trong nhóm B subtilis đòi hỏi phải có sự tổ hợp của nhiều

phương pháp phân loại hiện đại Hiện nay ở Việt Nam hầu như chưa có bất cứ mộtnghiên cứu nào công bố chính xác một loài vi khuẩn phân lập trong hệ sinh thái tựnhiên đến cấp độ dưới loài dựa trên việc phân tích trình tự đa gen.gen (Phan LạcDũng, 2013)

1.1.3 Đặc điểm

1.1.3.1 Đặc điểm sinh thái và sự phân bố trong tự nhiên

Vi khuẩn B subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi.

Chúng phân bố hầu hết trong các môi trường giàu dinh dưỡng trong tự nhiên nhưvùng rễ, đất, nước, phần lớn cư trú trong đất và rơm rạ, cỏ khô nên được gọi là “

trực khuẩn cỏ khô” Theo nhiều nghiên cứu về sự phân lập nhau Bacillus subtilis từ

rễ cây của các loài thực vật khác nhau thì mật độ vi khuẩn này trong rễ cây là khácao, vào khoảng 107 CFU / g đất vùng rễ Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đấthoang thì sự hiện diện của chúng rất hiếm (Anil Wipat and Colin R Harwood,1999) Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bàoBacillus subtilis (Bùi Thị Phi, 2007)

Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như bột mì ( trong

bột mì vì khuẩn Bacillus subtilis chiếm 75 – 79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo,

trong các thực phẩm như mắm, tương, chao

Bacillus subtilis đóng vai trò đáng kể về mặt có lợi, tuy nhiên cũng gây nhiều

tác hại trong quá trình biến đổi sinh học Chúng phân hủy pectin và polysaccharide

ở mô thực vật và góp phần gây nên các nốt trên củ khoai tây bị u Chúng sinhtrưởng trên môi trường nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố

kích thích sinh trưởng Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon trong khi một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus cereus

cần các hợp chất hữu cơ là vitamin và amino acid cho sự sinh trưởng.( NguyễnThùy Dương, 2012) Sự sinh trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng cácnguyên liệu có nguồn gốc động thực vật, là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì.(Nguyễn Thị Phương Như, 2008)

1.1.3.2 Đặc điểm hình thái

Bacillus subtilis là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu

tím Gram (+), tế bào đứng riêng rẽ hoặc nối lại với nhau thành các chuỗi có độ dàingắn khác nhau, kích thước: chiều dài 4 -10 µm x đường kính 0.25 – 1.0 µm, vớikhối lượng khoảng 4.6 fL khi tế bào ở pha cân bằng (stationary phase) Vi khuẩn có

khả năng di động, có từ 8 – 12 tiên mao.( ( Yu, Allen Chi-Shing et al, 2013 ).

Như các thành viên khác của chi Bacillus, Bacillus subtilis có khả năng sinh

bào tử để tồn tại trong các điều kiện môi trường khắc nghiệt về nhiệt độ và dinh

dưỡng (Michael T Madigan et al, 2005) Bào tử hình bầu dục, nhỏ hơn tế bào,

kích thước từ 0.8 – 1.8 µm, vị trí của bào tử phân bố trong tế bào sinh dưỡngkhông theo nguyên tắc chặt chẽ nào, nằm chính tâm, gần tâm, hoặc nằm gần tận

cùng; bào tử không làm biến dạng tế bào (Paul Vos et al, 2011 )

Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis

( h tt p : / / l i b jia n g n a n e du c n / A SM/ 11 5 -I n t r o du c e h tm )

Hình 1.2 Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis

(Paul Vos et al, 2011) 1.1.3.3 Đặc điểm nuôi cấy

Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí, tuy nhiên, hiện nay đã có nhiều bằng chứng cho thấy chúng có khả năng phát triển trong điều kiện thiếu oxy (Paul Vos et

al, 2011)

Bacillus subtilis có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ khá rộng, với

nhiệt độ tối thiểu là 18oC, nhiệt độ tối đa là 43oC và nhiệt độ tối ưu cho sự tăng

trưởng của Bacillus subtilis là ở 30 -37oC (L Korsten et al., 1996)

Bacillus subtilis sinh trưởng trong phổ pH rộng, từ 2 – 11, sinh trưởng tốt ở

pH = 7.0 – 7.2

Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển trên hầu hết các môi trường dinh dưỡng

cơ bản

Hình thái khuẩn lạc của Bacillus subtilis biến đổi đa dạng trên các môi

trường khác nhau, thường xuất hiện với các đặc điểm trộn lẫn sau: khuẩn lạc cóhình dạng bất định, đường kính trung bình khoảng 2 – 4 mm, độ sệt dao động từdạng ẩm ướt đến dạng bơ, hoặc dạng nhầy đến dạng màng, khi khô trở nên xù xì vàcứng, rìa biến đổi từ dạng lượn sóng đến dạng sợi

o Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạcdạng tròn, rìa răng cưa không đều, màu vàng xám, đường kính 3 - 5 mm, sau 1 - 4ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu

o Trên môi trường giá đậu – peptone : khuẩn lạc dạng tròn lồi, nhẵnbóng, đôi khi lan rộng, rìa răng cưa không đều, đường kính 3 – 4 cm sau 72 giờnuôi cấy

Trên môi trường lỏng, vi khuẩn phát triển làm đục môi trường, tạo màngnhăn trên bề mặt, lắng cặn, kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều, ít hoặckhông tạo nhớt

Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số

nguyên tố vi lượng khác Bacillus subtilis có thể sử dụng ammonium, nitrate, amino

acid, các purine, urea, uric acid, allantoin, và các peptide như một nguồn nitơ.Glutamine, tiếp đó là arginine, là nguồn tốt nhất cho sự phát triển nhanh chóng

Bacillus subtilis phát triển tốt trong môi trường cung cấp đủ nguồn carbon (như glucose) và nitơ (như peptone) Bên cạnh đó, Bacillus subtilis cũng có thể sinh

trưởng và phát triển trong các nguồn carbon và nitơ thấp, rẻ tiền, vì hệ enzyme củachúng có thể thủy phân các protein, carbohydrate và lipid có nguồn gốc động, thực

vật thành những đơn vị cấu thành cơ bản dễ hấp thu (Jorge Olmos et ali, 2014)

1.1.3.4 Đặc điểm sinh hóa

Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol,saccharose, xylose, arabinose

Indol (-), VP (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein (+),citrate (+), di động (+), hiếu khí (+)

Bảng 1.2 Các thử nghiệm sinh hóa của Bacillus subtilis

P h

K ế

D

i +Ph

+C

a +O

x −I

n −M

R +VP

+C

i [+Ni

+U

r −G

e +Ar

+G

l +L

a [−S

u +M

a +Ma

+M

a +R

a +Ga

−H

2

−

(Paul Vos et al, 2011)

Các ký hiệu có ý nghĩa như sau:

+ : 90% hoặc trên 90% dương tính

− : 90% hoặc trên 90% âm tính

[+] : 76 – 89 % dương tính

[−] : 76 – 89 % âm tính

1.1.3.5 Bào tử và khả năng tạo bào tử của Bacillus subtilis

a Cấu tạo bào tử

Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học cơbản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thànhphần và có thêm một số thành phần mới

Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng , dưới lớp màng là lớp vỏ Vỏ bào tử

có nhiều lớp Áo bào tử và vỏ bào tử có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước

và chất hòa tan trong nước, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ lõi bào tử

Áo bào tử có cấu tạo protein sừng, không thấm nước, có khả năng chống chịucao với các tác nhân như lyzozyme, protease, chất hóa học, tia bức xạ… Vỏ bào tửchủ yếu được cấu tạo từ peptidoglycan, ít liên kết chéo, đặc biệt bên trong vỏ chứanhiều phân tử calcium dipicolinate (DPA-Ca) và cũng chính nhờ có Ca2+ mà lớp vỏtrở nên chắc cứng

Trái ngược với lớp áo bào tử, vỏ bào tử có tính thẩm thấu rất cao và điều đólàm cho nước trong lõi bị rút ra bên ngoài vỏ, lượng nước của nó có thể lên đến70% (trong khi đó tế bào dinh dưỡng chỉ chứa 80%), sự loại nước như là yếu tốquan trọng cho tính kháng nhiệt, kháng bức xạ và cao hơn hết là để ức chế hoạtđộng của enzyme ở bên trong lõi Măc dù sự hiện diện của Ca2+ ở vỏ không có chứcnăng kháng nhiệt nhưng sự có mặt của nó ở trong lõi rất quan trọng Nó sẽ liên kếtvới ADN làm cho cấu trúc ADN trở nên bền hơn trước những tác động bất lợi từbên ngoài (Biền Văn Minh, 2011)

b Khả năng tạo bào tử của Bacillus subtilis

Không phải mọi vi khuẩn đều có bào tử Nội bào tử thường gặp ở các vi

khuẩn thuộc họ Bacillaceae được tạo ra để giúp vi khuẩn chống chịu tốt hơn trước

những tác nhân bất lợi của môi trường ngoài như tia tử ngoại, tia gama, chất sáttrùng, nhiệt độ môi trường quá cao, môi trường thiếu dinh dưỡng hay sự khô cạn…Bào tử được hình thành ngay trong tế bào dinh dưỡng, mỗi tế bào dinh dưỡng chỉtạo ra một bào tử và không có chức năng sinh sản như bào tử nấm Khi vi khuẩn đãhình thành bào tử thì cũng là lúc nó chuyển sang trạng thái sống ẩn, đây là trạng tháigần như không hoạt động của tế bào

Thời gian tồn tại của bào tử kéo dài: có thể là vài năm, vài chục năm và thậmchí vài trăm năm Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra.Sau đó, vỏ của chúng bị phá hủy và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới.Còn nếu bào tử bị vỡ cấu trúc thì lúc đó vi khuẩn sẽ chết (Biền Văn Minh, 2011)

Khả năng hình thành bào tử trong những điều kiện nhất định là một trong

những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis Chúng hình thành bào tử theo chu

trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong

môi trường bị kiệt quệ[tô minh châu] Bào tử Bacillus subtilis có dạng elip đến hình

cầu, có kích thước 0,6 - 0,9 µm x 1,0 - 1,5 µm, có khả năng chịu được pH thấp của

dạ dày, tiến đến ruột và nảy mầm tại phần đầu của ruột non – đây là đặc điểm quan

trọng trong ứng dụng sản xuất probiotic từ Bacillus subtilis

Sự tạo bào tử diễn ra qua nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất.Đầu tiên, nucleotid kéo dài trở thành một sợi trục Sau đó, tế bào hình thành mộtvách ngăn và bắt đầu phân chia thành hai phần Phần nhỏ hơn của tế bào được gọi làcác tiền bào tử (forespore) và phần lớn hơn được gọi là tế bào mẹ Tế bào mẹ nuôidưỡng tiền bào tử Khi hình thành vách ngăn, 30% số nhiễm sắc thể đã nằm bêntrong tế bào mẹ, 70% nhiễm sắc thể còn lại chuyển vào tiền bào tử thông qua mộtloại protein vận chuyển được gọi là SpoIIIE Khi bào tử trưởng thành, tế bào dinhdưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ (Nguyễn Thị Thúy,2012)

1.1.4 Bộ gen của Bacillus subtilis

Toàn bộ bộ gen của B subtilis đã được giải trình tự vào năm 1997 Tế bào vikhuẩn B subtilis chỉ có một phân tử DNA nằm trong một nhiễm sắc thể tròn Kích

thước tổng thể của DNA là 4 214 814 cặp bp (4,2 Mbp) Khoảng 87% bộ gen (baogồm 4.100 gen) mã hóa cho protein Trong 4.100 gen thì có 192 gen được cho làkhông thể thiếu và 79 gen được cho là cần thiết cho các quá trình sống của B.subtilis Hầu hết các gen cần thiết tham gia vào quá trình trao đổi chất (Nguyễn ThịThúy, 2012)

1.1.5 Hệ enzyme của Bacillus subtilis

1.1.5.1 Các enzyme nội bào Bacillus subtilis

Trong tế bào Bacillus subtilis nói riêng và vi sinh vật nói chung đều có

những enzyme xúc tác các phản ứng sinh hóa Các enzyme này được sinh tổng hợp

và nằm trong sinh khối tế bào, chúng thường không có khả năng di chuyển quamàng tế bào Đó là những enzyme nội bào

Enzyme nội bào (intracellular enzyme – endoenzyme ) là những enzymeđược vi sinh vật tổng hợp trong tế bào, nằm trong tế bào và chỉ tham gia vào quátrình phân giải (dị hóa) các hợp chất hữu cơ có phân tử lượng thấp hay sinh tổnghợp các vật chất trong tế bào của chúng

Các enzyme nội bào của Bacillus subtilis: các enzyme thủy phân như

protease nội bào (thường là peptidase và một số protease), pennicillin amidase,catalase, amylase nội bào…; các enzyme tổng hợp như aspagagin-syntetase; cácenzyme tham gia các quá trình oxy hóa – khử như dehydrogenase, oxydase,cytochrom, peroxydase và các enzyme tham gia chuyển hóa vật chất có trong tếbào

1.1.5.2 Các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis

Bacillus subtilis có thể sinh tổng hợp nhiều loại enzyme cần thiết cho quá

trình sống để thích ứng với hoàn cảnh và điều kiện môi trường: amylase amylase), β-glucanase, xylanase, protease…

(α-Bảng 1.2 Một số loại enzyme do Bacillus subtilis sinh tổng hợp, đặc tính

hiện diện của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ xảy ra sự cạnh tranh dinh

dưỡng cạnh tranh không gian sống giữa vi khuẩn và nấm do vi khuẩn phát triểnnhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môitrường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ứcchế ( Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Thuận, 1976)

1.1.7 Tính an toàn và ứng dụng của Bacillus subtilis

1.1.7.1 Tính an toàn đối với người và động vật

Ở châu Âu và ở Mỹ, B subtilis được chỉ định là đủ điều kiện về an toàn và

không hề có tác dụng phụ (GRAS, Genrally Regarded As Safe) bởi FDA, nghĩa là

loài vi khuẩn này không gây hại cho người hoặc động vật (Jorge Olmos et al , 2014) Một số chủng B subtilis và họ hàng gần của nó là B licheniformis, B pumulis, B megaterium có khả năng sản xuất lecithinase, một enzyme có khả năng

phá vỡ màng động vật có vú Tuy nhiên, vẫn chưa có bằng chứng nào cho thấylecithinase gây bệnh trên người

Trong một số các trường hợp người ta vẫn phát hiện ra B subtilis ở những

bệnh nhân bị ung thư phổi, hoại thư bạch cầu, áp xe khi lắp bộ phận giả…, nhưng tỉ

lệ các trường hợp này là rất hiếm (chỉ có 2 trong 1034 ca phát hiện có B subtilis) Bacillus anthracis là một loài của Bacillus gây bệnh than nguy hiểm cho người

(Nguyễn Thị Thúy, 2007)

1.1.7.2 Một số ứng dụng quan trọng của Bacillus subtilis

Bacillus được ứng dụng nhiều trong sản xuất enzyme công nghiệp vì nó có

khả năng sinh các loại enzyme như protease, amylase, cellulase, lipase, urease…

Ngoài ra, Bacillus còn có khả năng sinh các chất chuyển hóa sơ cấp như nucleotide

acid, inosinic acid, guanilic acid, kháng sinh Dưới điều kiện sống thiếu dinh dưỡng

Bacillus còn có khả năng sinh các loại kháng sinh peptid như surfactin hay subtilin

có hoạt tính kháng khuẩn

Sự hình thành bào tử của Bacillus thường xảy ra đồng thời với quá trình sinh

hóa khác như tổng hợp một số chất kháng khuẩn bản chất polypeptide (baxitraxin,tyroxidin, gramixidin, polymidin) Nhiều kháng sinh polypeptide được mô tả chi tiết

về tính chất hóa học và chức năng

Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp baxitraxin, một nhóm kháng sinh

polypeptide quan trọng, có tác dụng ức chế sinh tổng hợp màng tế bào Baxitraxin

có hoạt tính sinh học đa dạng: kích thích phân giải TB, tạo

TB trần, ngăn cản sự đồng hóa các acid amin tổng hợp mucopeptide thành TB

Baxitraxin có hiệu lực chống các VK Gram dương như: Actinomyces, Clostridium, Staphylococcus, Haemophilus, Diplococcus, Corynebacterium… Baxitraxin được

ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm để bảo quảthịt cá, trong y học điều chế thuốc chữa bệnh, đặc biệt Zn-baxitraxin là một trongbảy loại kháng sinh được ứng dụng rộng rãi trong chăn nuôi để kích thích tăng trọng

và phòng chống bệnh (Nguyễn Thùy Dương , 2012)

Trong công nghệ thực phẩm, người ta ứng dụng VK B subtilis, để sản xuất các enzyme quan trọng Chế phẩm amylase từ B subtilis, chịu nhiệt độ

cao được dùng trong giai đoạn dịch hóa tinh bột trước khi đường hóa rất tốt, ở nhiệt

độ 80 – 900C/ 10 – 15 phút α-amylase của VK bị vô hoạt một phần rất nhỏ (NguyễnThùy Dương , 2012)

Bacillus subtilis tạo protease kiềm (gọi tên là subtilisin) với số lượng lớn, có

đặc tính bền vững, hoạt động tốt ở nhiệt độ và pH cao nên chúng được ứng dụng ởnhiều ngành công nghiệp khác nhau Ngoài ra subtilisin còn sử dụng trong sản xuấtnước mắm cá, làm thức ăn gia súc, xử lý chất thải từ động vật giáp xác, xử lý rácthải trong lò mổ gia cầm

Hệ enzyme của Bacillus subtilis được ứng dụng nhiều trong sản xuất chất tẩy

rửa chúng có thể biến đổi các dạng chất thải độc hại thành những dạng hợp chất vôhại của nitrogen, carbon dioxide, và nước

Trong công nghiệp sản xuất amino acid, thức ăn gia súc, Bacillus subtilis là

một trong những chủng vi sinh vật tổng hợp lysine có hàm lượng khá lớn (15-20%)

từ tinh bột

Trong y dược, Bacillus subtilis được đóng thành thuốc Subtilis 10ml trị bệnh tiêu chảy cho trẻ em do vi khuẩn Coliform gây ra, bệnh đường ruột lị do trục trùng,

đắp các vết thương lở loét ngoài da ( Trẫn Đỗ Quyên, 2004)

Sản xuất các kháng sinh thực vật, ứng dụng trong phòng trừ vi sinh vật gây

bệnh nhu nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp, Pylicularia oryzae, … Người ta thấy rằng sự phát triển của Bacillus subtilis trongcaay làm tăng khả năng tổng hợp

các peptide kháng nấm của vi khuẩn nốt rễ (Rhizobacterium) Khả năng này được

ứng dụng trong kiểm soát sinh học (Nguyễn Thanh Thủy, 2007)

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi sinh khoa Công nghệ sinh học– Thực phẩm – Môi trường trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM

2.1.2 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 05/2016 đến tháng 08/2016

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Nguồn mẫu

Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn: mẫu cơm thừa được thu từ các quán ăn

2.2.2 Hóa chất

− Môi trường Nutrient Agar

− Môi trường Nutrient Broth

− Môi trường Starch agar

− Môi trường Potato Dextrose Agar

− Cồn 70o

− Cồn 96o

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phân lập và làm thuần

2.3.1.1 Quy trình phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis

Mẫu cơm thừa

10 g mẫu + 90 ml nước muối sinh lý vô trùng → lắc 250 v/p trong 5 phút, to phòng

→ nồng độ pha loãng 10-1

Pha loãng 10-2 , 10-3 , 10-4 , 10-5, 10-6

Hút 0,1 ml mẫu từ các nồng độ 10-3 , 10-4 , 10-5, 10-6 cho vào đĩa môi trường NA,

tiến hành cấy trang

Ủ 37o C / 24h

Chọn khuẩn lạc đặc trưng

Cấy chuyền làm thuần

Chủng thuầnkhiết

Giữ giống trên thạch nghiêng

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis

2.3.1.2 Thuyết minh quy trình

❖ Mục tiêu: phân lập và làm thuần vi khuẩn Bacillus subtilis từ mẫu

cơm thừa

❖ Phương pháp phân lập: phân lập bẳng phương pháp cấy trang

- Pha loãng mẫu:

• Cân 10g mẫu, cho vào bình tam giác, bổ sung 90 ml nước muối sinh lý

vô trùng, lắc 250 vòng ở nhiệt độ thường trong 5 phút, được nồng độ pha loãng 10-1

• Chuẩn bị 6 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9 ml nước muối sinh lý vô trùng

• Dùng micropipette hút 1ml dịch mẫu từ bình tam giác chứa mẫu phân lập

có nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm thứ nhất và lắc đều, được nồng độpha loãng 10-2

• Từ nồng độ pha loãng 10-2 , tiếp tục pha loãng đến các nồng độ 10-3 , 10

-4 , 10-5, 10-6

- Cấy trang: Dùng micropipette hút 0,1 ml mẫu từ các ống nghiệm có nồng

độ pha loãng 10-4 , 10-5, 10-6, lên đĩa môi trường NA và trang đều bằng que trang

vô trùng, sau đó đem đi ủ ở 37o C / 24 h trong tủ ấm ( mỗi nồng độ nên trang 2 đĩa)

❖ Làm thuần và giữ giống:

- Làm thuần: quan sát các khuẩn lạc hình thành trên đĩa, tuyển chọn các

khuẩn lạc nghi ngờ là của Bacillus subtilis, dùng que cấy vòng ria các khuẩn lạc

mọc riêng rẽ lên đĩa môi trường NA mới Tiến hành cấy chuyền đến khi thu đượccác khuẩn lạc thuần nhất

- Giữ giống: tiến hành giữ giống trên môi trường thạch nghiêng NA

Cách tiến hành: đổ môi trường giữ giống (môi trường NA) vào ống nghiệm,hấp khử trùng ở 121oC, 1atm trong 15’, sau đó để nghiêng ống nghiệm để tạo thạchnghiêng Dùng que cấy vòng cấy sinh khối vi khuẩn vào ống thạch nghiêng, sau đóđem ủ ở 37o C / 24 h trong tủ ấm, thấy có sự xuất hiện của khuẩn lạc thì chuyển ốngnghiệm vào tủ lạnh 4oC để giữ giống Giống được cấy chyền hàng tháng và cần tiếnhành hoạt hóa giống trước khi nhân giống

2.3.2 Phương pháp định danh vi sinh vật

Để xác định các chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus, một số thử nghiệm cho

sàng lọc bước đầu được thực hiện như: nhuộm Gram, nhuộm bào tử, định danhbằng các thử nghiệm sinh hóa

2.3.2.1 Xác định hình thái vi sinh vật

Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng, chọn lọc những chủng có đặc điểm

hình thái giống với Bacillus subtilis nhất để tiếp tục xác định cấu trúc

Khuẩn lạc đặc trưng của Bacillus subtilis thường mang đặc điểm sau: khuẩn

lạc sần sùi, mép răng cưa, màu trắng sữa, sau một thời gian thì tạo thành hệ matrixđặc trưng

Trong môi trường canh (nutrient broth), chúng phải triển làm đục môi trường,tạo thành màng nhăn trên bề mặt, lắng cặn, ít hoặc không tạo nhớt

tế bào vi khuẩn bị biến dạng

• Khử màu: để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn 95o cho đếnkhi giọt cuối cùng chảy ra khỏi phiến kính không còn màu ( thông thường khoảng

10 – 20 giây Đây là bước quan trọng nhất, vì nếu bị tẩy màu quá mức, một số vikhuẩn Gram dương sẽ bị mất màu tím và sẽ trở thành Gram âm sau khi nhuộm màulần thứ hai

• Ngay lập tức rửa lại tiêu bản bằng nước cất rồi để khô vết bôi

• Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fucshin hoặc Safarin trong 1 phút,rửa lại tiêu bản bằng nước cất rồi để khô vết bôi

2.3.4 Kỹ thuật nhuộm bào tử

➢ Mục đích: kiểm tra xem vi khuẩn có sự hình thành bào tử hay không,

nếu có, ghi nhận hình dạng, kích thước, vị trí của bào tử trong tế bào

➢ Nguyên tắc nhuộm: khi dùng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh lục

malachite với tiêu bản có đun nóng, thuốc nhuộm xâm nhập vào nội bào tử và làmchúng nhuộm màu lục Khi rửa vêt bôi bằng nước cất các tế bào dinh dưỡng sẽ bịmất màu còn bào tử vẫn giữ lại màu lục Khi nhuộm bổ sung bằng đỏ safranin hayfuchsin sẽ làm phần bao quanh bào tử bắt màu phân biệt (màu đỏ hồng)

➢ Các bước tiến hành: sử dụng phương pháp Malachite green ( phương

pháp Schaeffer – Fulton)

Bước 1: Làm vết bôi và cố định tiêu bản.

• Dùng que cấy vô trùng lấy một ít sinh khối vi khuẩn cần xác định hoà vào

1 giọt nước cất giữa phiến kính, làm khô trong không khí hoặc hơ nhanh vết bôitrên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính

• Đặt một cốc nước lên bếp từ và đun nóng 85 – 90oC ( không để sôi), sau

đó đặt phiến kính có vết bôi lên miệng cốc

Bước 2: Tiến hành nhuộm tiêu bản

• Đặt miếng giấy lọc lên trên vết bôi

• Nhỏ 2-3 giọt dung dịch lục malachite 5% lên vết bôi và tiến hành hơ hơinước nóng trong 5 phút Nếu thấy thuốc nhuộm trên giấy bị khô thì phải bổ sungdung dịch malachite

• Bóc tờ giấy thấm ra, để cho phiến kính nguội hoàn toàn Rửa phiến kính bằng nước trong 30 giây (lúc đó các tế bào dinh dưỡng sẽ bị mất màu còn bào tửvẫn giữ lại màu)

• Nhuộm bổ sung với thuốc nhuộm Safranin hoặc Fuchsinh trong 60 -90giây

• Rửa lại bằng nước cất rồi thấm khô hay để khô tự nhiên vết bôi

Bước 3 : quan sát tiêu bản trên kính hiển vi quang học ở vật kính 100x

➢ Kết quả: tiêu bản nhuộm đúng thì bào tử sẽ bắt màu xanh lục, tế bào

chất bắt màu đỏ hồng

2.3.5 Định danh bằng các thử nghiệm sinh hóa

Sau khi tuyển chọn các chủng có đặc điểm hình thái và cấu trúc giống với

Bacillus subtilis, cần tiến hành kiểm tra khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa

phù hợp Dựa trên Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, các thử nghiệmsinh hóa được thực hiện gồm: thử nghiệm khả năng di động, thử nghiệm khả năngthủy phân tinh bột, thử nghiệm catalase, thử nghiệm Voges Proskauer, thử nghiệmCitrate, thử nghiệm khả năng sống trên môi trường chứa 6.5% muối NaCl, thửnghiệm khả năng lên men carbohydrate ( lên men mannitol, glucose, lactose,sucrose), thử nghiệm thủy phân casein

2.3.5.1 Thử nghiệm khả năng di động

➢ Mục đích: nhằm xác định vi sinh vật có khả năng di động hay không

➢ Các bước tiến hành:

Dùng que cấy thẳng, lấy sinh khối của khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis

và cấy đâm sâu vào môi trường thạch mềm ( đĩa thạch chứa môi trường NA 0.5 –0.7% agar), sau đó đem ủ ở 37oC / 24h Quan sát hiện tượng sau nuôi cấy

2.3.5.2 Thử nghiệm Vogest Proskauer

➢ Mục đích

Phát hiện khả năng vi sinh vật tạo thành một số sản phẩm trung tínhacetylmethylcarbimol (acetoin) trong quá trình lên men glucose

➢ Các bước tiến hành

Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose phosphate (MR –VP broth), ủtrong thời gian 2 – 5 ngày ở 37oC Thêm vào canh khuẩn dung dịch thuốc thử α-napthtol 5% trong cồn và dung dịch KOH 40% với tỷ lệ 3:1 Quan sát các phản ứngxảy ra trong 5 phút

Dùng que cấy vòng lấy sinh khối của khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis,

cấy lên đĩa môi trường NA có bổ sung 1% tinh bột, sử dụng phương pháp cấy điểm(agar spot) và đem các đĩa đi ủ ở 37oC / 24h Sau đó, đổ dung dịch lugol / iodinevào bề mặt môi trường nuôi cấy, nếu xung quanh vết cấy không hình thành màunâu, chứng tỏ tinh bột đã bị thủy phân bởi enzyme amylase do vi khuẩn sinh ra

2.3.5.6 Thử nghiệm khả năng lên men các loại đường

Chuẩn bị môi trường có chứa các loại đường cần kiểm nghiệm, sử dụng chỉthị Phenol Red Broth Base, phối môi trường vào các ống nghiệm có bổ sung ốngDurham, sau khi hấp khử trùng, tién hành cấy các chủng vi sinh vật cần khẳng định,

2.3.5.7 Thử nghiệm thủy phân casein

Cấy vi khuẩn lên các đĩa môi trường thạch sinh dưỡng có bổ sung cơ chất làcasein, sau đó đem đi ủ ở 37 độ C trong 24h Sử dụng thuốc thử lugol nhỏ lên bềmặt môi trường, nếu có sự xuất hiện của vòng trong suốt xung quanh vết cấy, chứng

tỏ vi khuẩn có khả năng phân giải casein trong môi trường

2.3.5.8 Thử nghiệm khả năng phân giải tinh bột của chủng phân lập

Sau khi đã tiến hành định danh sơ bộ, tiến hành xác định hoạt tính các enzymeamylase, từ đó tuyển chọn ra các chủng có hoạt tính enzyme tốt

- Xác định hoạt tính enzyme amylase bằng phương pháp khuếch tán trênđĩa thạch có cơ chất cảm ứng là tinh bột, thuốc nhuộm là dung dịch lugol

- Đo đường kính vòng phân giải, tuyển chọn các chủng có khả năng sinhenzyme ngoại bào tốt

2.3.5.9 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự sinh enzyme amylase của các chủng

phân lập

- Nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên môi trường có pH khác nhau, sau đó sửdụng phương pháp Heinkel để đánh giá hoạt độ enzyme amylase của các chủng

2.3.5.10 Đánh giá khả năng đối kháng giữa các chủng với nấm gây bệnh

Sử dụng phương pháp đục lỗ thạch Nuôi nấm gây bệnh cây trồng trên môitrường PDA, nuôi các chủng vi khuẩn trong môi trường NB Sau đó, cấy thạch nấm

sang một đĩa PDA khác, đục lỗ thạch và nhỏ dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilsi vô các giếng thạch, sau đó đem đi ủ ở nhiệt độ phòng.

Hiệu lực đối kháng của vi khuẩn với nấm được đánh giá bằng công thức:[(dnấm ở đĩa ĐC – d nấm ở đĩa thử nghiệm) / dnấm ở đĩa ĐC ] * 100

2.3.5.11 Đánh giá khả năng đối kháng giữa các chủng Bacillus subtilis với

Lactobacillus

Đánh giá khả năng đối kháng giữa các chủng Bacillus subtilis với Lactobacillus bằng cách cấy các đường giao nhau, nếu hai chủng mọc giao nhau,

chứng tỏ chúng không đối kháng với nhau

2.3.5.12 Đánh giá sự tương thích giữa các chủng Bacillus subtilis phân lập

được với nhau

Tiến hành cấy trang chủng vi khuẩn chỉ thị trên đĩa môi trường NA, sau đóđục lỗ thạch và nhỏ dịch nuôi cấy của các chủng vi khuẩn thử nghiệm vào lỗ thạch,nếu không xuất hiện vòng trong suốt quanh giếng thạch, chứng tỏ các chủng có khảnăng tương thích với nhau, không kháng nhau

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn

3.1.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc

Từ các nguồn mẫu cơm thừa, tiến hành pha loãng mẫu và cấy trang trên môitrường đĩa NA, sau 24 giờ ủ, quan sát và bắt giữ những khuẩn lạc nghi ngờ là

Bacillus subtilis, tiến hành làm thuần bằng cách cấy chuyền nhiều lần Tiến hành

giữ giống trong ống thạch nghiêng để sử dụng cho các thử nghiệm tiếp theo

Bacillus subtilis có sự biến đổi đa dạng về hình thái, nhưng nhìn chung, hình

thái khuẩn lạc của các chủng phân lập có các điểm chung như sau: hình thái khuẩnlạc dạng tròn hoặc dạng bất định, rìa răng cưa hoặc gợn sóng, khuẩn lạc mọc lantrên bề mặt môi trường; một số tạo lớp màng nhăn, mịn trên bề mặt thạch, dưới lớpmàng là lớp nhầy; một số chủng lại sinh khuẩn lạc khô, có tâm; màu sắc khuẩn lạcthay đổi từ màu trắng đến trắng đục

Hình thái khuẩn lạc của các chủng phân lập được thể hiện qua bảng 3.1

3.1.2 Đặc điểm hình thái tế bào

Nhuộm Gram là hình thức quan sát vi thể hình thái tế bào vi sinh vật

và là cách đơn giản nhất, nhanh nhất để phân biệt vi khuẩn Gram âm và vikhuẩn Gram dương Sau khi tiến hành nhuộm kết quả cho thấy, các chủngphân lập được có lớp peptidoglycan dày nên khả năng bắt màu thuốc nhuộm tímkết tinh và iod rất cao nên không bị rửa trôi khi tẩy cồn Các chủng đều sinh tế bàohình que, có độ dài ngắn khác nhau, bắt màu tím Gram dương Các tế bào hoặcđứng riêng lẻ, hoặc bắt cặp với nhau, hoặc xếp thành chuỗi có độ dài ngắn khácnhau Kết quả, từ 21 chủng ban đầu, có 13 chủng hình que bắt màu tím Gramdương,loại 8 chủng có hình cầu hoặc bắt màu hồng Gram âm

3.1.3 Hình dạng bào tử

Khả năng tạo bào tử là một trong những đặc điểm nhận biết Bacillus subtilis.

Để quan sát sự hình thành bào tử, cũng như hình dạng bào tử, cần tiến hành nhuộmbào tử Tuy nhiên, do tính không thẩm thấu của áo bào tử nên với những phươngpháp nhuộm thông thường không làm cho bào tử bắt màu hoặc chỉ bắt màu rất

nhạt Bào tử có đặc điểm là khó bắt màu hơn tế bào dinh dưỡng, song khi bắt màurồi thì lại rất khó bị tẩy màu, trong khi đó tế bào dinh dưỡng bị tẩy màu nhanhchóng Để bào tử có thể bắt màu thuốc nhuộm, ta cần hoạt hóa nó bằng tác nhânnhiệt độ cao hay kết hợp acid với nhiệt Việc hoạt hóa sẽ kích thích bào tử nẩy mầm

và khi bào tử ở trạng thái nẩy mầm thì thuốc nhuộm sẽ dễ dàng xâm nhập vào bêntrong lõi dẫn đến bào tử bắt màu ( Biền Văn Minh, 2011)

Quan sát các mẫu vi khuẩn đã nhuộm bào tử trên kính hiển vi, nhận thấybào tử bắt màu xanh của thuốc nhuộm Malachite Green và thành tế bào vi khuẩnbắt màu hồng của Fucshin Các bào tử có dạng hình ovan, với vị trí trong tế bàokhông xác định, có bào tử nằm chính tâm, có bào tử nằm lệch tâm, một số bào tửthoát ra khỏi tế bào sinh dưỡng; bào tử không làm biến dạng tế bào Thời gian nuôi

vi khuẩn càng lâu thì bào tử hình thành càng nhiều Điều này có thể được giảithích do thời gian nuôi lâu dinh dưỡng ngày càng ít, kích thích sự hình thành bào

tử Cả 13 chủng phân lập đều có khả năng hình thành bào tử

3.1.4 Tổng hợp kết quả xác định hình thái và cấu trúc của các chủng phân lập

Qua 2 đợt thu mẫu ( tổng số mẫu thu là 5 mẫu), phân lập được 21 chủng vikhuẩn, sau khi tiến hành định danh sơ bộ bằng nhuộm Gram, thử nghiệm kéo sợi vànhuộm bào tử, thu nhận 13 chủng có kết quả phù hợp với các đặc điểm của

Bacillus: Gram (+),sinh bào tử ; loại bỏ 8 chủng cho kết quả Gram (-) hoặc Gram

(+) nhưng hình cầu

Các chủng thu nhận được đặt tên như sau: ký hiệu BM + STT; trong đó BM

là ký hiệu cho chủng thuộc chi Bacillus, STT là số thứ tự chủng được đánh từ 1 đến

13

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và cấu trúc của các chủng phân lập được thểhiện trong bảng 3.1 dưới đây

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc của các chủng phân lập