PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG AFLATOXIN CỦA CÁC GỐC PHÂN LẬP ĐƯỢC

TÓM TẮT LUẬN VĂN Qua thời gian thực hiện đề tài “Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất và khảo sát khả năng kháng aflatoxin của các gốc phân lập được” từ tháng 2/2008 đến tháng 8/2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT VÀ

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG AFLATOXIN CỦA

CÁC GỐC PHÂN LẬP ĐƯỢC

Giáo viên hướng dẫn: PGS – TS Nguyễn Ngọc Hải

Họ và tên sinh viên: Trương Hương Thảo Lớp: DH04DY

Niên khóa: 2004 – 2009

Tháng 9/2009

PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT VÀ KHẢO

SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG AFLATOXIN CỦA CÁC GỐC PHÂN

LẬP ĐƯỢC

Tác giả

TRƯƠNG HƯƠNG THẢO

Khóa luận được đệ trình đề để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ ngành Thú y

Giáo viên hướng dẫn:

PGS – TS NGUYỄN NGỌC HẢI

Tháng 9/2009

i

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin kính gửi lời cảm ơn Thầy Nguyễn Ngọc Hải đã hướng dẫn cho em hoàn thành luận văn này với tất cả tinh thần, trách nhiệm và lòng nhiệt thành

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Phòng Vi Sinh, Khoa Chăn Nuôi Thú

Y và Trường Đại Học Nông Lâm đã tận tình giúp đỡ và truyền đạt kiến thức quý giá cho em trong suốt quá trình học tập ở trường

Xin cảm ơn tất cả bạn bè đã luôn luôn bên cạnh giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho tôi trong quá trình học tập, trong cuộc sống cũng như khi thực hiện đề tài

Và trên hết, con xin kính gửi đến Bố Mẹ những lời biết ơn chân thành và sâu sắc nhất bởi những gì con đã và đang có như ngày hôm nay, tất cả là nhờ vào sự hi sinh cao cả và vất vả của Bố Mẹ

Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn đến tất cả mọi người với lòng tri ân sâu sắc nhất

Tp Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2009

Trương Hương Thảo

ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Qua thời gian thực hiện đề tài “Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất và

khảo sát khả năng kháng aflatoxin của các gốc phân lập được” từ tháng 2/2008 đến tháng 8/2009 tại Phòng thực hành Vi Sinh khoa Chăn Nuôi – Thú Y, chúng tôi thu được những kết quả như sau:

- Đánh giá sơ bộ khả năng ức chế aflatoxin của các gốc Bacillus subtilis phân lập được từ đất: sau 7 ngày nuôi cấy chung Bacillus subtilis và Aspergillus

flavus trên môi trường thạch nước cốt dừa, quan sát bên ngoài và dưới ánh đèn UV

cho thấy một số gốc có khả năng ức chế sự sản sinh aflatoxin và sự sinh trưởng của

nấm mốc Aspergillus flavus

- Khảo sát khả năng ức chế aflatoxin của các gốc vi khuẩn Bacillus

subtilis phân lập được từ đất trên môi trường bắp: kết quả cho thấy một số gốc vi

khuẩn có khả năng làm giảm aflatoxin trên môi trường bắp

- Thử nghiệm tác động của aflatoxin lên sự phát triển của Bacillus

subtilis: sau 7 ngày nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis trong môi trường TSB có bổ

sung aflatoxin theo các nồng độ khác nhau, các ống môi trường được gửi đi phân tích hàm lượng aflatoxin Kết quả là hàm lượng aflatoxin trong ống TSB có nuôi cấy vi khuẩn giảm so với hàm lượng aflatoxin trong ống TSB không nuôi cấy vi

khuẩn Số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis nuôi cấy trong môi trường không có

aflatoxin phát triển tốt hơn trong môi trường có aflatoxin Kết quả này cho thấy

aflatoxin có thể ức chế sự phát triển của Bacillus subtilis và vi khuẩn Bacillus

subtilis làm giảm aflatoxin theo phương thức phá huỷ aflatoxin

iii

MỤC LỤC

Trang tựa i

Lời cám ơn ii

Tóm tắt luận văn iii

Mục lục iv

Danh mục các chữ viết tắt vii

Danh mục các bảng viii

Danh mục các biểu đồ ix

Danh mục các hình x

Danh mục các sơ đồ xi

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 2

1.3 YÊU CẦU ĐỀ TÀI 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 3

2.1 KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 3

2.1.1 Lịch sử phát hiện 3

2.1.2 Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis 3

2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy 4

2.1.4 Đặc điểm sinh hóa 5

2.1.5 Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên 5

2.1.6 Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 5

2.1.7 Tính chất đối kháng với vi sinh vật gây bệnh 8

2.1.8 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về tác dụng đối kháng với Aspergillus của Bacillus subtilis 10

iv

2.2 SƠ LƯỢC VỀ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN 12

2.2.1 Khái niệm về nấm mốc và độc tố nấm mốc 12

2.2.2 Độc tố aflatoxin 13

CHƯƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 24

3.1.1 Thời gian 24

3.1.2 Địa điểm 24

3.2 NỘI DUNG ĐỀ TÀI 24

3.3 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 24

3.3.1 Đối tượng khảo sát 24

3.3.2 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 25

3.3.3 Môi trường nuôi cấy 25

3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.4.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 26

3.4.2 Thí nghiệm 1: Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốc Aspergillus flavus và đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các gốc Bacillus subtilis phân lập được .30

3.4.3 Thí nghiệm 2: Kiểm tra khả năng làm giảm aflatoxin trên môi trường bắp của các gốc vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được 31

3.4.4 Thí nghiệm 3: Thử nghiệm tác động của aflatoxin lên sự phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis 35

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis 37

4.1.1 Đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis 37

4.1.2 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis 37

4.1.3 Khảo sát đặc điểm sinh hóa của các vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis……… 38

v

4.2 Thí nghiệm 1: Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốc

Aspergillus flavus và đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các

gốc Bacillus subtilis phân lập được .39

4.2.1 Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốc Aspergillus flavus……… 39

4.2.2 Thí nghiệm đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các gốc Bacillus subtilis phân lập được 40

4.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng làm giảm aflatoxin sản sinh trên môi trường bắp của các gốc Bacillus subtilis phân lập được 42

4.4 Thí nghiệm 3: Thử nghiệm tác động của aflatoxin lên sự phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis 44

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50

5.1 KẾT LUẬN 50

5.2 ĐỀ NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 54

vi

Đơn vị hình thành khuẩn lạc Colony Forming Units

cộng tác viên Czapek Yeast Extract Agar

Liều gây chết 50% tổng đàn Lethal dose

Phần tỷ (μg/kg) part per billion

Trypticase Soya AgarTrypticase Soya Broth

Tia cực tímUltra violet

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2-1: Sự khác nhau giữa tế bào dinh dưỡng và bào tử của Bacillus subtilis 6

Bảng 2-2: Một số loài nấm mốc có khả năng sản sinh aflatoxin 14

Bảng 2-3: Ảnh hưởng của độ pH lên hàm lượng aflatoxin (μg/150ml) trong thí nghiệm của A Ciegler và ctv (1966) 15

Bảng 2-4: Liều gây ngộ độc cấp tính qua miệng của aflatoxin B1 LD50 20

Bảng 3-1: Bố trí thí nghiệm 2 35

Bảng 4-1: Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin của thí nghiệm 2 43

Bảng 4-2: Số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis của thí nghiệm 3 (log10) 45

Bảng 4-3: Số lượng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis của thí nghiệm 3 (log10) 45

Bảng 4-4: Kết quả phân tích nồng độ aflatoxin của thí nghiệm 3 47

Bảng 5-1: Kết quả phân lập Bacillus subtilis từ đất 50

viii

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1: Số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis của thí nghiệm 3 46 Biểu đồ 4.2: Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên hàm lượng aflatoxin 48

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis 4

Hình 2.2: Hình dạng tế bào sinh dưỡng và vị trí bào tử 5

Hình 2.3: Công thức hoá học của sufactin 9

Hình 2.4: Công thức hoá học của agrastatin 9

Hình 2.5: Công thức hoá học của iturin 9

Hình 2.6: Quá trình sinh trưởng của nấm mốc 13

Hình 2.7: Công thức hoá học của một số aflatoxin 16

Hình 2.8: Sơ đồ phân tử aflatoxin gắn vào chuỗi ADN 18

Hình 3.1: Kết quả thử lecithinase 29

Hình 3.2: kết quả thử nitrate 29

Hình 3.3: Kết quả thử citrate 29

Hình 3.4: Kết quả thử VP 29

Hình 3.5: Kết quả thử maltose 29

Hình 4.1: Vi khuẩn phân lập từ đất trên môi trường TSA 37

Hình 4.2: Hình dạng Bacillus subtilis sau khi nhuộm Gram 38

Hình 4.3: Khuẩn lạc Aspergillus flavus sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch nước cốt dừa 39

Hình 4.4: Khuẩn lạc Aspergillus falvus dưới ánh đèn UV sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch nước cốt dừa 40

Hình 4.5: Khuẩn lạc Aspergillus flavus và Bacillus subtilis dưới ánh đèn UV sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch nước cốt dừa 41

x

Hình 4.6: Khuẩn lạc Aspergillus flavus và Bacillus subtilis sau 5 ngày nuôi cấy trên

môi trường thạch nước cốt dừa 41

Hình 4.7: Khuẩn lạc Aspergillus flavus và Bacillus subtilis dưới ánh đèn UV sau 5

ngày nuôi cấy trên môi trường thạch nước cốt dừa 42

xi

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 27

Sơ đồ 3.2: Các phản ứng sinh hoá của vi khuẩn Bacillus subtilis 28

Sơ đồ 3.3: Các bước thực hiện thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế sản sinh

aflatoxin của các gốc Bacillus subtilis phân lập được 31

Sơ đồ 3.4: Phương pháp thu hoạch huyễn dịch bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 33

Sơ đồ 3.5: Phương pháp xác định số lượng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 34

xii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Nấm mốc và độc tố nấm mốc (mycotoxin) trong thức ăn chăn nuôi có ảnh hưởng rất lớn đến năng suất vật nuôi Nấm mốc phát triển trong ngũ cốc, nguyên liệu và thức ăn chăn nuôi không những làm giảm giá trị dinh dưỡng của thức ăn mà còn sản sinh ra các độc tố gây bệnh cho con người và vật nuôi Hiện nay các nhà khoa học đã phát hiện trên 300 loại độc tố mycotoxin từ hơn 100 loài nấm mốc Trong các loại độc tố nấm mốc đó, phải kể tới aflatoxin (Dương Thanh Liêm, 2008)

Aflatoxin có rất nhiều tác hại trên con người cũng như trên gia súc như gây suy giảm miễn dịch, rối loạn chức năng, thoái hoá gan thận, ung thư trên động vật thí nghiệm mà còn gây chết gia súc, gia cầm nếu nhiễm phải lượng lớn Trong điều kiện khí hậu nước ta (nóng ẩm gió mùa) rất thuận lợi cho sự phát triển của nấm mốc sinh độc tố aflatoxin nếu như các loại nguyên liệu, thức ăn gia súc không được bảo quản tốt Nếu điều này xảy ra sẽ gây tổn thất rất lớn cho chăn nuôi, nguy hiểm nhất

là gián tiếp ảnh hưởng đến sức khoẻ con người

Để hạn chế sự sản sinh aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi, người ta đã sử dụng nhiều phương pháp, trong đó, phương pháp sinh học bổ sung vi khuẩn

Bacillus subtilis cũng đã được áp dụng Bacillus subtilis tiết ra hoạt chất sinh học có

khả năng ức chế nấm mốc và aflatoxin

Được sự phân công của khoa Chăn Nuôi Thú Y, trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, sự đồng ý của phòng vi sinh khoa Chăn Nuôi Thú Y và sự hướng dẫn của

thầy Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành đề tài: ”Phân lập vi khuẩn Bacillus

subtilis từ đất và khảo sát khả năng kháng aflatoxin của các gốc phân lập được”

1

1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Phân lập và tìm ra gốc Bacillus subtilis từ đất có khả năng ức chế aflatoxin, phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng Bacillius subtilis kiểm soát aflatoxin trong chăn

nuôi

1.3 YÊU CẦU ĐỀ TÀI

Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất

- Xác định các gốc có khả năng kháng aflatoxin từ các gốc phân lập được

- Thử nghiệm tác động trực tiếp của độc tố aflatoxin lên sự phát triển

của vi khuẩn Bacillus subtilis

2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN

BACILLUS SUBTILIS

2.1 KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN

2.1.1 Lịch sử phát hiện

Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ

chức y học Nazi của Đức Nhiều năm sau đó, vi khuẩn Bacillus subtilis được sử

dụng rộng rãi trên thế giới và nhanh chóng trở thành phương pháp hữu hiệu nhất để

trị bệnh kiết lỵ và các bệnh về đường ruột khác Ngày nay, Bacillus subtilis đã trở

nên rất phổ biến không chỉ trong y học mà còn được ứng dụng rộng rãi trong trồng trọt, chăn nuôi, công nghệ sinh học … (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006)

2.1.2 Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis

Đặc điểm phân loại

2.1.2.1

Theo phân loại của Bergey (1994) vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc:

Bộ : Eubacteriales

Họ : Bacillaceae Giống : Bacillus

Loài : Bacillus subtilis

2.1.2.2 Đặc điểm phân bố

Bacillus subtilis là vi khuẩn hoại sinh được phân bố hầu hết trong tự nhiên

như đất, nước, không khí, thực vật bị phân hủy… và cỏ khô nên còn được gọi là

trực khuẩn cỏ khô Tuy nhiên dưới hầu hết những điều kiện thì Bacillus subtilis bất

hoạt và tồn tại ở dạng bào tử (Nguyễn Lân Dũng, 2001)

3

2.1.2.3 Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn Bacillus subtilis có dạng trực khuẩn ngắn và nhỏ, hai đầu tròn, bắt

màu Gram dương, kích thước 0,5 – 0,8µm x 1,5 - 3µm, thường đứng đơn lẻ hoặc tạo thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 chiên mao, sinh bào

tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng, kích thước 0,9 – 0,6µm Vị trí của bào

tử trong tế bào sinh dưỡng không theo một nguyên tắc chặt chẽ nào, có thể lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm (Nguyễn Lân Dũng, 2001)

Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis

Hình 2.1:

(http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:Bacillus_subtilis_Gram.jpg)

2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy

Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có thể phát triển được trong môi

trường thiếu oxy Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn là 37oC Độ pH thích hợp nhất từ 7,0 – 7,4 Dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn là nguyên tố C, H, O và các nguyên tố khác (Lý Kim Hữu, 2005)

Trên môi trường thạch đĩa TSA, khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus subtilis có dạng

tròn, rìa răng cưa không đều, tâm sẫm màu, màu vàng sám, đường kính 3 – 5 mm Sau 1 – 4 ngày, bề mặt nhăn nheo, màu hơi sẫm (Phạm Hoàng Thái, 2007)

Trên môi trường thạch nghiêng TSA: vi khuẩn dễ mọc, màu hơi xám, rìa gợn sóng (Phạm Hoàng Thái, 2007)

4

Môi trường canh TSB: vi khuẩn phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn trên bề mặt môi trường canh, lắng cặn kết lại như vẫn mây ở đáy, khó tan đều khi lắc lên (Phạm Hoàng Thái, 2007)

2.1.4 Đặc điểm sinh hóa

Các đặc điểm sinh hoá của vi khuẩn Bacillus subtilis: Indol âm, nitrate dương,

MR-VP dương, H2S âm, NH3 dương, catalase dương, amylase dương, casein dương, citrate dương, maltose âm, lecithinase âm

Một số dòng khuẩn Bacillus subtilis gây dung huyết trên thạch máu ngựa và

thỏ do có khả năng sinh hemolysine (Nguyễn Lân Dũng, 2001)

2.1.5 Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên

Bacillus subtilis có kháng nguyên O và H, cấu trúc kháng nguyên dạng D và L

của acid glutamic Vi khuẩn sản sinh kháng sinh subtilin và bacitracin, có tác dụng

ức chế vi khuẩn Gram âm và Gram dương (Lý Kim Hữu, 2005)

Đa số chủng Bacillus subtilis không gây bệnh

2.1.6 Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis

Bào tử vi khuẩn là một dạng biến đổi đặc biệt của tế bào sinh dưỡng trong một giai đoạn nào đó của quá trình sinh trưởng của vi khuẩn Mỗi tế bào chỉ tạo thành một bào tử (trích dẫn bởi Nguyễn Khắc Tuấn, 1996)

Hình 2.2: Hình dạng tế bào sinh dưỡng và vị trí bào tử

của vi khuẩn Bacillus subtilis

5

(http://ec.europa.eu/research/success/images/0291b.jpg)

2.1.6.1 Cấu tạo bào tử

Gồm màng ngoài, lớp vỏ, màng trong và khối tế bào chất đồng nhất trong cùng

Vỏ gồm nhiều lớp, có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hòa tan trong nước

Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Tô Minh Châu, 2000)

Bào tử khác tế bào sinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và tính chất sinh lý

Bảng 2-1: Sự khác nhau giữa tế bào dinh dưỡng và bào tử của Bacillus subtilis

Đặc tính Tế bào sinh dưỡng Bào tử

Cấu trúc Tế bào Gram (+), điển

hình

Vỏ bào tử dày, khó thấm

nướcThành phần hoá học

Hoạt tính các chất hóa học và

Khả năng bắt màu thuốc

nhuộm Dễ nhuộm Phương pháp đặc biệt

(trích dẫn bởi Tô Minh Châu, 2000)

6

2.1.6.2 Đặc điểm và tác dụng của bào tử

Bào tử vi khuẩn không thực hiện chức năng sinh sản mà chỉ là một thể biến đổi của tế bào nhằm bảo tồn, đổi mới và nâng cao sức sống của vi khuẩn Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, có sự đề kháng cao với các nhân tố bất lợi của ngoại cảnh

Theo Nguyễn Xuân Thành và ctv (2005) thì sự tồn tại lâu dài của bào tử là

ổn định cao đối với nhiệt độ

- Các enzyme và các hoạt chất sinh học khác trong bào tử đều tồn tại dưới dạng không hoạt động làm hạn chế sự trao đổi chất của bào tử với môi trường bên ngoài

- Sự có mặt của các acid amin chứa lưu huỳnh, đặc biệt là cysteine giúp bào tử đề kháng với tia cực tím

- Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp màng, làm cho các chất hoá học và các chất sát trùng khó có thể tác động đến bào

tử

Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành một tế bào mới có sức sống mạnh mẽ hơn (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996)

7

2.1.7 Tính chất đối kháng với vi sinh vật gây bệnh

Đối kháng với nấm

2.1.7.1

Mỗi loài sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều kiện môi trường khác nhau, sinh khuẩn lạc khác nhau Thay đổi môi trường hoặc các yếu tố môi trường bất lợi tức là làm thay đổi điều kiện sống sẽ hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh

vật Thực tế khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis

với một số lượng lớn sẽ xảy ra sự cạnh tranh chất dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sống giữa vi khuẩn và nấm Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ

sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Nhuận, 1976, trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006)

Phương thức diệt nấm và các tác nhân gây bệnh của vi khuẩn Bacillus

subtilis như sau :

- Đầu tiên vi khuẩn Bacillus subtilis tạo thành khối xung quanh tác

nhân gây bệnh ngăn chặn không cho chúng bám vào vật thể chủ để gây bệnh

- Sau đó, Bacillus subtilis tiết ra hỗn hợp gồm nhiều lipopeptid (được

gọi là serenade) để làm thủng vách tế bào và màng tế bào chất của tác nhân gây bệnh do đó ngăn chặn sự phát triển của chúng Serenade có thể được bảo quản, sử dụng như một loại thuốc trừ sâu hoá học tổng hợp, đã được kiểm tra và chứng minh trong phòng thí nghiệm là không gây độc đối với cá hồi, ong mật, chim cút, sâu đất

và nhiều loài khác Serenade gồm có 3 nhóm lipopeptid có tên là surfactin, agrastatin và iturin Ba nhóm này kết hợp với nhau để làm tăng hoạt tính diệt các mầm bệnh kể cả vi sinh vật gây hại, nấm mốc và cả bào tử của chúng

- Surfactin là nhóm chất có hoạt tính sinh học, bản chất là lipopeptid Bản thân surfactin không gây độc cho nấm nhưng khi kết hợp với iturin thì trở thành hợp chất diệt nấm Surfactin có khả năng làm thủng vách tế bào của tác nhân gây bệnh và bào tử của chúng, giúp cho agrastatin và iturin phát huy tác dụng

8

Hình 2.3: Công thức hoá học của sufactin

- Iturin là nhóm chất chiếm vai trò quan trọng nhất trong quá trình diệt

nấm, bản chất là lipopeptide được chiết từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus

subtilis Iturin diệt nấm bằng cách tác động lên màng tế bào chất, làm tan màng, tạo

thành những lổ thủng trên đó để làm mất tính thẩm thấu chọn lọc của màng

Hình 2.5: Công thức hoá học của iturin

(http://blogs.princeton.edu/chm333/f2005/group3/05_serenade/04_chemistry/lipopeptide/)

9

2.1.7.2 Đối kháng với vi khuẩn

Ngoài nấm gây bệnh ra thì Bacillus subtilis cũng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli Khi nuôi cấy chung trên môi trường TSB thì Bacillus

subtilis có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh nên sẽ ức chế quá trình sinh

trưởng và phát triển của Escherichia coli

Nguyễn Quỳnh Nam năm 2006 đã tiến hành thí nghiệm nuôi cấy Bacillus

subtilis và Escherichia coli trên môi trường TSB và theo dõi số lượng Escherichia coli qua các thời điểm 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ và 36 giờ Kết quả cho thấy: số lượng Escherichia coli tăng dần khi nuôi cấy trên môi trường TSB không có Bacillus subtilis Còn khi nuôi cấy chung Bacillus subtilis và Escherichia coli trên môi

trường TSB thì số lượng Escherichia coli giảm dần theo thời gian

2.1.8 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về tác dụng đối kháng với

Aspergillus của Bacillus subtilis

Trong nước

Nguyễn Hữu Phúc và cộng sự năm 1993 đã sử dụng vi khuẩn Bacillus

subtilis để ức chế sinh trưởng và sản xuất aflatoxin của Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus trên bột đậu phộng (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Thanh

Xuân, 2006)

Nguyễn Đình Đào năm 1993 đã tiến hành kiểm tra khả năng đối kháng của

chủng Bacillus subtilis AO1 với Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus và kết quả là có sự ức chế nấm mốc Aspergillus (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Thanh Xuân,

2006)

Nguyễn Thị Ngọc Trân năm 1995 đã tiến hành kiểm tra khả năng đối kháng

giữa chủng Bacillus subtilis AO1 (do Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học thuộc Liên

Hiệp Sản Xuất Hoá Chất cung cấp) với Aspergillus flavus trên môi trường thạch

khoai tây – glucose và kết quả đạt được rất khả quan (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006)

10

Năm 2006, Nguyễn Ngọc Thanh Xuân với đề tài “Khảo sát khả năng sử dụng

vi khuẩn Bacillus subtilis có nguồn gốc từ đất trong xử lý nhiễm aflatoxin trên nguyên liệu bắp” cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được từ đất có khả

năng làm giảm aflatoxin trên môi trường bắp Tỷ lệ nuôi cấy bào tử nấm mốc/bào tử

vi khuẩn là 1/103 thì hàm lượng aflatoxin giảm 99,6 lần (25ppb so với đối chứng là 2490ppb)

Năm 2007, Phạm Hoàng Thái đã thực hiện đề tài “Phân lập vi khuẩn

Bacillus subtilis từ đất, khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng

phân lập được” Kết quả cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được từ đất có

khả năng làm giảm aflatoxin trên môi trường bắp Tỷ lệ nuôi cấy bào tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn là 1/105 thì hàm lượng aflatoxin giảm 8,8 lần (715ppb so với đối chứng là 6300ppb) Tỷ lệ vịt chết khi ăn thức ăn nhiễm aflatoxin được bổ sung

vi khuẩn Bacillus subtilis giảm 50% so với đối chứng và giảm đáng kể những tổn

thương gan về mặt đại thể cũng như vi thể Gan vịt trong lô thí nghiệm hơi sưng và thoái hoá mỡ nhẹ so với lô đối chứng gan sưng to và thoái hoá mỡ nặng

Năm 2008, Nguyễn Thị Minh Cương đã thực hiện đề tài “Khảo sát hiệu quả

của việc dùng Bacillus subtilis trong phòng và giảm tác hại của aflatoxin trên vịt” Kết quả cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ phân gà và ruột gà khả năng làm giảm độc tố aflatoxin trên môi trường bắp Ở tỷ lệ nuôi cấy bào tử nấm

mốc/bào tử vi khuẩn là 1/103 thì hàm lượng aflatoxin giảm 50 lần (5ppb so với đối chứng là 250ppb) Tỷ lệ vịt chết khi ăn thức ăn nhiễm aflatoxin được xử lý vi khuẩn

Bacillus subtilis giảm 55% so với đối chứng và giảm đáng kể những tổn thương gan

về mặt đại thể cũng như vi thể Vịt ăn thức ăn nhiễm aflatoxin được xử lý vi khuẩn

Bacillus subtilis gan chỉ sưng nhẹ, xuất huyết cục bộ và một vài điểm hoại tử, mô

gan bị thoái hoá mỡ nhẹ hơn so với lô đối chứng gan sưng to, xuất huyết gần như toàn bộ, hoại tử, tế bào gan bị thoái hóa mỡ nặng

Ngoài nước

11

Norio Kimura (1990) đã sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của các chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus trên bột đậu phộng và bắp Các chủng Bacillus subtilis NK 330 và NK – C – 3 ức

chế mạnh mẽ sự phát triển nấm mốc và tổng hợp aflatoxin Khả năng ức chế này thay đổi tuỳ theo từng chủng vi khuẩn (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006)

2.2 SƠ LƯỢC VỀ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN

2.2.1 Khái niệm về nấm mốc và độc tố nấm mốc

2.2.1.1 Nấm mốc

Theo Lê Anh Phụng (2001), mấm mốc là vi sinh vật (vi nấm) có cấu tạo gần giống với giới thực vật, sống ký sinh hay hoại sinh trên nhiều loại chất khác nhau, đặc biệt là các chất hữu cơ, đơn giản nhất là hydratcacbon

Người ta tìm thấy nấm mốc ở khắp mọi nơi từ phân, đất, trên các cây cối mục nát, quần áo, giày dép, trên ngũ cốc, ngay cả trên cơ thể sống của động vật và con người

Nấm mốc không chứa diệp lục tố, cơ thể dạng sợi có vách ngăn hoặc không

có vách ngăn Những sợi nấm này phân nhánh, hình thành từng đám chằng chịt gọi

là hệ sợi nấm có 2 loại sợi:

- Sợi nấm dinh dưỡng: nằm trong lớp môi trường, làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng cho toàn bộ hệ sợi

- Sợi nấm khí sinh : thường nhô lên trên môi trường, giữ vai trò sinh sản (tạo bào tử)

2.2.1.2 Độc tố nấm mốc (mycotoxin)

Độc tố nấm mốc là sản phẩm phụ của quá trình trao đổi chất tự nhiên của nấm mốc và có thể gây độc cho con người và gia súc Độc tố nấm mốc có tính bền

12

Hiện nay các nhà khoa học đã phát hiện trên 300 loại độc tố mycotoxin từ hơn 100 loài nấm mốc Trong đó, có khoảng 20 loại độc tố gây nguy hiểm đến sức khỏe con người và vật nuôi 5 loại độc tố nguy hiểm nhất hiện nay là aflatoxin, deoxynivalenol, zearalenone, ochratoxin và fumonisin (Trần Cúc Phương, 2008)

Hình 2.6: Quá trình sinh trưởng của nấm mốc

(Dương Thanh Liêm, 2008)

2.2.2 Độc tố aflatoxin

2.2.2.1 Nguồn gốc phát hiện ra độc tố

Độc tố này được phát hiện vào năm 1960 khi gây chết trên 10.000 gà tây (từ

3 – 6 tuần tuổi) ở nước Anh với tổn thương gan rất nặng nề Tiếp sau đó người ta còn phát hiện thêm loại độc tố này cũng gây tổn thương gan ở súc vật thí nghiệm khác như: vịt con, chuột, thỏ, khỉ, heo, bò… Đến năm 1961, người ta đã tìm ra bản chất hoá học của độc tố này và đặt tên cho nó là aflatoxin

Trong tự nhiên có 4 loại aflatoxin được nấm mốc sản sinh ra nhiều nhất và

có độc tính cao nhất, ký hiệu là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 (Dương Thanh Liêm, 2008)

13

2.2.2.2 Các loài nấm mốc sinh aflatoxin

Aflatoxin là một nhóm độc tố chủ yếu do loài nấm mốc Aspergillus flavus và

Aspergillus parasiticus sản sinh ra, được tìm thấy đầu tiên từ bánh dầu phộng nhập

từ Brazil Ngoài ra còn có một số nấm mốc khác có khả năng sinh aflatoxin (Lê Anh Phụng, 2001)

Bảng 2-2: Một số loài nấm mốc có khả năng sản sinh aflatoxin

Aflatoxin Loài nấm mốc

Aspergillus flavus + + Sargeant và ctv, 1961

Aspergillus parasiticus + + + + Coduer và ctv, 1963

Aspergillus nomius + + + + Kurtzman và ctv, 1987

Aspergillus ostianus + + Scot và ctv, 1968

Aspergillus ochraceus + Van Wallbeck và ctv, 1968

Penicillium puberulum + + + + Kulik và Holaday, 1967

Penicillium variabile + Kulik và Holaday, 1967

Penicillium frequentans + Kulik và Holaday, 1967

Penicillium citrinum + Kulik và Holaday, 1967

(Lê Anh Phụng, 2001)

14

2.2.2.3 Tính chất lý hóa

Aflatoxin là tinh thể màu vàng nhạt, có khối lượng phân tử thấp, dễ bị phân

hủy bởi chất kiềm, tia cực tím, nhưng rất bền với nhiệt Nhiệt độ cao hơn 100oC chỉ

khử được một phần nào aflatoxin (Dương Thanh Liêm, 2008)

A Ciegler và ctv (1966) đã tiến hành thí nghiệm thử ảnh hưởng của độ pH

lên hàm lượng aflatoxin

Bảng 2-3: Ảnh hưởng của độ pH lên hàm lượng aflatoxin (μg/150ml) trong thí

nghiệm của A Ciegler và ctv (1966)

Ngày

5,5 190 190 190 190 190 6,5 190 190 190 190 152 7,5 190 190 190 190 114 8,5 76 76 76 76 46 9,5 46 19 19 19 23 Ghi chú:

Thí nghiệm tiến hành trên môi trường TGY ở 28oC Độ pH được điều chỉnh

bới NaOh và HCl

Aflatoxin tan trong một số dung môi hữu cơ như chloroform, acetonitril,

methanol, ethanol, aceton, benzene … nhưng không tan trong các dung môi béo

như hexan, ether ethylic, ether dầu hỏa … Dưới ánh sáng UV (λ = 365 nm) AFB1 ,

AFB2 có màu xanh nước biển AFG1 và AFG2: có màu xanh lá cây (Dương

Thanh Liêm, 2008)

Các loại aflatoxin khác là sản phẩm chuyển hoá từ 4 loại aflatoxin trên trong

cơ thể động vật như aflatoxin M1, aflatoxin M2…

Giữa các loại trên thì aflatoxin B1 chiếm số lượng nhiều nhất trong nông sản

và cũng gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc mạnh nhất (Bùi Xuân Đồng, 2003)

15

Hình 2.7: Công thức hoá học của một số aflatoxin

2.2.2.4 Cơ chế sinh tổng hợp aflatoxin

Aflatoxin là chất biến dưỡng thứ cấp được tổng hợp theo con đường polyketid (Steyn, 1984) Có 17 gen mã hoá cho 12 enzyme xúc tác các phản ứng sinh tổng hợp aflatoxin Gen điều hoà trong sinh tổng hợp aflatoxin có ký hiệu là

AflR Ở Aspergillus flavus gen Afl – 2 chịu trách nhiệm trong sinh tổng hợp aflatoxin B1 và aflatoxin B2, trong khi gen apa – 2 ở Aspergillus parasiticus có vai

trò quyết định trong sinh tổng hợp 4 loại aflatoxin B1,aflatoxin B2, aflatoxin G1, aflatoxin G2 (Payne và Brown, 1998; trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001)

2.2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo thành aflatoxin của nấm mốc

Aflatoxin là sản phẩm biến dưỡng thứ cấp từ các loài nấm sinh ra chúng nên aflatoxin chỉ được tạo ra khi nấm đã phát triển Nhìn chung, các điều kiện thuận lợi

16

Các yếu tố chính ảnh hưởng đến sự tạo thành aflatoxin gồm loài nấm mốc,

cơ chất và điều kiện ngoại cảnh

Loài nấm mốc

Khả năng sinh aflatoxin của các loài nấm mốc, thậm chí của các chủng nấm

mốc trong cùng một loài cũng rất khác nhau Loài Aspergillus flavus và Aspergillus

parasiticus là có khả năng sinh aflatoxin nhiều nhất (Bùi Xuân Đồng, 2003) Trong

các chủng Aspergillus flavus thì chỉ có 50% chủng có khả năng sản sinh aflatoxin

Khả năng sản xuất aflatoxin rất khác nhau từ các chủng sinh rất ít cho đến các chủng sinh rất nhiều lượng aflatoxin (100 – 200 mg/kg đậu phộng) (Doupnik, 1969; trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001)

Loại cơ chất

Aflatoxin được phát hiện trên các nguyên liệu có hàm lượng hydratcacbon cao như bắp, gạo, hạt kê, đậu phộng, hạt cà phê, ca cao, hạt bông vải, hạt hướng dương… Trên các hạt có dầu, đặc biệt là đậu phộng thì nấm mốc sản sinh aflatoxin nhiều hơn trên các loại ngũ cốc khác (Lê Anh Phụng, 2001)

Một số tác giả (Amberecht, 1963; Diener và David, 1969) cho biết

Aspergillus flavus nuôi cấy lâu trên môi trường tổng hợp sẽ bị giảm hoặc mất khả

năng sinh aflatoxin, trong khi nuôi cấy trên môi trường tự nhiên lại làm tăng khả năng sản xuất aflatoxin (trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001)

Điều kiện ngoại cảnh

Nhiệt độ, ẩm độ, nồng độ O2 và CO2 có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm mốc

Nhiệt độ thích hợp nhất để sản sinh aflatoxin của các chủng nấm mốc là từ

25 – 28oC (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

17

Độ ẩm hạt tốt nhất cho sản sinh aflatoxin là 15 – 30 % Tăng độ ẩm sẽ làm tăng sản xuất aflatoxin nhưng nếu độ ẩm trên 50% thì lại làm giảm vì lúc đó giữa các hạt có quá nhiều nước sẽ gây ra sự thiếu thoáng khí và tăng CO2 trong môi trường (Moreau, 1974; trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001)

2.2.2.6 Cơ chế gây bệnh của aflatoxin

Aflatoxin có khả năng liên kết với ADN trong nhân tế bào Sự liên kết này gây ức chế enzyme polymerase của ARN Nó gây tác dụng hạn chế trong tổng hợp ARN và ức chế polymerase t – ARN Đây là nguyên nhân làm giảm sút sự tổng hợp protein trong tế bào Người ta cũng đã chứng minh rằng vòng α –, β – lacton không bão hoà có trong phân tử aflatoxin làm cho hợp chất này có hoạt tính gây ung thư,

và cũng chính vòng lacton này gây ức chế tổng hợp ADN trong nhân tế bào, do đó

nó làm rối loạn sự tăng trưởng bình thường của tế bào (trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001)

Hình 2.8: Sơ đồ phân tử aflatoxin gắn vào chuỗi ADN

(theo Hsieh, 2000; trích dẫn bởi Dương Thanh Liêm, 2008)

2.2.3.5 Những tác hại do aflatoxin gây ra

Theo Dương Thanh Liêm (2008), aflatoxin gây ra những tác hại rất lớn cho

cơ thể con người và động vật Những tác hại đó như sau:

18

- Aflatoxin gây tổn thương tế bào gan Tất cả các trường hợp xác định

sự ngộ độc aflatoxin đều có bệnh tích giống nhau là gan của động vật bị nhiễm đều

hư hại nặng Tùy theo mức độ nhiễm ít hay nhiều, lâu hay mau mà bệnh tích trên gan có khác nhau Biểu hiện chung là ban đầu gan biến thành màu vàng tươi, mật sưng Sau đó gan sưng to lên, mặt căng phồng và bắt đầu nổi các mụn nhỏ trên bề mặt gan làm cho nó gồ ghề đôi khi có những nốt hoại tử màu trắng Sau cùng do nhiễm khuẩn mà gan trở nên bở, dễ bể

- Nhiễm độc aflatoxin làm thận bị sưng to làm cho việc bài thải chất độc ra khỏi cơ thể trở nên khó khăn Từ đó làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng

- Aflatoxin làm giảm khả năng đề kháng của động vật, ức chế hệ thống sinh kháng thể Do đó khi nhiễm aflatoxin cơ thể rất mẫn cảm với các loại bệnh thông thường, có thể gây tử vong cho thú

- Độc tố bào mòn niêm mạc ống tiêu hoá nên làm giảm khả năng tiêu hoá các chất dinh dưỡng trong thức ăn Đôi khi cũng thấy các tổn thương ở miệng, làm cho thú khó lấy thức ăn

- Ngộ độc aflatoxin làm thay đổi hoạt động sinh lý bình thường, gây rối loạn sinh sản

- Aflatoxin làm giảm tính ngon miệng đối với thức ăn do sự phát triển của nấm mốc làm mất mùi thức ăn

- Độc tố làm hư hại các chất dinh dưỡng trong thức ăn như glucid, protein, acid amin, vitamin… làm thức ăn bị giảm giá trị nghiêm trọng, mất mùi tự nhiên nên thú không thích ăn

- Đặc biệt aflatoxin còn có khuynh hướng gây ung thư

- Aflatoxin làm giảm thấp sự sinh trưởng và sức sản xuất của thú

- Hậu quả cuối cùng là ảnh hưởng xấu về mặt kinh tế

19

Bảng 2-4: Liều gây ngộ độc cấp tính qua miệng của aflatoxin B1 LD50

(Dương Thanh Liêm, 2008)Loài vật LD50 mg/kg thể trọng Thỏ 0,30 Vịt con (11 ngày tuổi) 0,43

Mèo 0,55 Heo 0,60

Chuột lang 1,40 – 2,00 Khỉ đầu chó 2,00

Gà 6,30 Chuột nhắt đực 5,55 – 7,20 Chuột nhắt cái 17,90

Khỉ cái 7,80 Chuột bạch 9,00 Chuột đồng 10,20

2.2.2.7 Các phương pháp phân hủy aflatoxin

Phương pháp vật lý học

Cấu trúc hoá học mạch vòng của aflatoxin rất bền chắc Nếu ta đem nguyên liệu nấu ở nhiệt độ bình thường (≤ 100oC) thì aflatoxin không bị phá hủy Tuy nhiên

ở nhiệt độ này thì có khả năng giết chết nấm sinh ra độc tố, từ đó giới hạn được mức

độ nhiễm aflatoxin (Dương Thanh Liêm, 2008)

- Phân hủy aflatoxin bằng không khí nóng: dùng không khí nóng thổi qua nguyên liệu có chứa aflatoxin để làm giảm thiểu lượng aflatoxin đã được nhiều tác giả nghiên cứu (Lee, 1969; Waltking, 1971; Elkady, 1981; Frank, 1974; trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) Phương pháp này đã đem lại nhiều kết quả đáng kể Nếu nhiệt độ thổi gió là 100 – 145oC ở ngô hạt thì lượng aflatoxin B1 có thể giảm từ 877 ppb còn 452 ppb, từ 378 ppb còn 213 ppb, từ 133 ppb còn 80 ppb và từ 80 ppb còn 25 ppb Nếu tăng nhiệt độ thổi lên tới 165oC có thể làm cho lượng aflatoxin B1 giảm từ 66 – 77 %

20

- Phân hủy aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao: phương pháp hấp ướt

ở nhiệt độ cao dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn Quá trình này phá vỡ nhanh chóng vòng lacton trong cấu trúc phân tử aflatoxin Rehana (1979) (trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) nhận thấy nếu gạo nhiễm aflatoxin từ 40 – 4000 ppb được hấp ướt trong 5 phút ở 120oC (thêm nước vào gạo

tỷ lệ 1:4) có thể làm giảm hàm lượng aflatoxin B1 tới 68% Ở đậu phộng có độ ẩm 10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 được hấp ướt ở 120oC trong 4 giờ đã giảm còn

370 ppb Ở hàm lượng aflatoxin thấp (760 ppb) được hấp ở 1,5 atm trong vòng 1 giờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin

- Làm giảm aflatoxin bằng các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: các chất hấp phụ thường là các chất vô cơ hoặc hữu cơ (tự nhiên hoặc nhân tạo) có hoạt tính bề mặt cao Các chất có khả năng hấp phụ aflatoxin gồm: than hoạt tính, một số polymer vô cơ có bản chất aluminosilicat như bentonite, HSCAS (Hydrated sodium calcium alumino – silicate), một số chất sét đặc biệt (kaolin, sepiolite, clinoptilolite, zeolite), một số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo (nhựa trao đổi ion, polyvinyl polypyrrolidone) (Charmley, 1994; trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) Những chất này không được hấp phụ qua ruột mà được bài thải ra ngoài

- Tách aflatoxin bằng dung môi hữu cơ: đây là phương pháp có thể áp dụng đối với thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi Một thí nghiệm sử dụng hỗn hợp methanol – nước để tách aflatoxin ra khỏi bắp ở tỷ lệ 5:1 đã cho kết quả rất khả quan

- Phân hủy aflatoxin bằng các tia bức xạ: aflatoxin rất mãn cảm với tia cực tím Ở bước sóng 365 nm, khả năng hấp thụ của aflatoxin đạt cực đại Okonkwo (1978) nhận thấy lượng aflatoxin ở bắp (150 ppb và 250 ppb) có thể giảm tới 30 %

và 16% trong 10 giờ tiếp xúc với ánh nắng mặt trời (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) Như vậy ánh sáng mặt trời có tác dụng tốt để phá hủy aflatoxin, tuy

21

Phương pháp hoá học

- Phương pháp sử dụng các chất oxy hoá khử: các chất oxy hoá khử như natri hypochlorite (NaOCl), oxy già (H2O2) được sử dụng để làm mất độc tính aflatoxin Tuy nhiên sử dụng NaOCl để xử lý hạt nhiễm aflatoxin có thể làm mất màu sắc của hạt và biến chất các acid amin Khí ozon (O3) cũng được thử nghiệm

về khả năng phân hủy aflatoxin trong mẫu và đạt được hiệu quả tốt, song có bằng chứng là chất lượng các thành phần của thức ăn bị giảm đặc biệt là protein, vitamin

- Phương pháp sử dụng các chất kiềm: hydoxit amon (NH4OH) và hydroxit Natri (NaOH) là 2 chất kiềm được thử nghiệm làm vô hoạt aflatoxin Các chất này đều có hoạt tính mạnh, có thể phá vỡ vòng lacton trong cấu trúc phân tử aflatoxin

- Phương pháp sử dụng khí NH3: nhiều thí nghiệm đã chứng minh hiệu quả của việc dùng khí NH3 làm vô hoạt aflatoxin Xử lý ngô hạt bằng khí NH3 được đặt biệt quan tâm ứng dụng hơn cả Người ta nhận thấy, nếu hàm lượng NH3 là 0,5 – 1,5 % và nhiệt độ bên ngoài là 25oC, trong 14 ngày tiếp xúc, lượng aflatoxin từ

200 ppb có thể giảm xuống còn 10 ppb (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

Phương pháp sinh vật học

Phương pháp sinh vật học dùng các loại nấm men, mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn không có độc tính để thử nghiệm về khả năng làm giảm aflatoxin

Rhizopus stolonifer phân hủy được aflatoxin G1 Rhizopus arrhizus có thể

làm giảm tính gây độc của aflatoxin B1 Aspergillus parasiticus cũng có thể tác

động lên aflatoxin qua hệ thống men của sợi nấm Tuy nhiên, tác dụng này còn phụ thuộc vào chủng loại nấm, nhiệt độ, độ pH và hàm lượng aflatoxin trong môi

trường Một số dạng nấm men Saccharomyces cerevisiae có tác dụng hạn chế ảnh

22

Một số chủng vi khuẩn Bacillus subtilis đã được thử nghiệm về khả năng ức chế sinh tổng hợp aflatoxin của nấm mốc Aspergillus flavus và Aspergillus

parasiticus Thí nghiệm được tiến hành đối với các chủng Bacillus subtilis NK–330

và NK–C3 trên ngô hạt và lạc hạt đã nhiễm aflatoxin từ Aspergillus flavus hay

Aspergillus parasiticus Kết quả cho thấy có sự ức chế rõ rệt khả năng sinh tổng

hợp aflatoxin của các chủng nấm mốc này (chỉ còn 34 ppb với chủng Bacillus

subtilis NK–C–3 trên ngô nhiễm Aspergillus flavus NRRL 3357 sau 5 ngày, so với

đối chứng 720 ppb) (Norio Kimura, 1988; trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006)

23

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2 NỘI DUNG ĐỀ TÀI

Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất

-

- Khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các gốc vi khuẩn

Bacillus subtilis phân lập được

- Thử nghiệm tác động qua lại giữa độc tố aflatoxin và sự phát triển của

vi khuẩn Bacillus subtilis

3.3 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM

3.3.1 Đối tượng khảo sát

Vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được từ đất

-

- Chủng nấm mốc Aspergillus flavus có khả năng sinh độc tố aflatoxin

do phòng thực hành Vi Sinh cung cấp (1 chủng)

24

- Tất cả các dụng cụ thủy tinh dùng để nuôi cấy vi sinh vật phải được

xử lý sạch, bao gói và sấy tiệt trùng ở 121oC trong 15phút

3.3.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy tổng hợp

3.3.3.2 Môi trường nuôi cấy tự nhiên

- Môi trường thạch nước cốt dừa: để kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốc Nước cốt dừa đóng hộp được pha loãng với nước cất theo tỉ lệ 1:1, sau đó, bổ sung thêm agar để làm môi trường thạch

- Môi trường bắp: bắp trước khi dùng nuôi cấy phải được đo độ ẩm Sau đó điều chỉnh hàm lượng ẩm đến 30% bằng nước, rồi cho vào chai nâu, mỗi chai 50g bắp

- Tất cả các môi trường đều được hấp tiệt trùng trườc khi sử dụng

25

3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.4.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất

Cách lấy mẫu để phân lập vi khuẩn từ đất

3.4.1.1

Thu thập các mẫu đất ở trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh bằng cách: dùng muỗng gạt bỏ lớp đất mặt khoảng 2 -3 cm, lấy lớp đất ở dưới Cân 10g mẫu đất cho vào bình tam giác có chứa 90ml nước muối sinh lý vô trùng và lắc đều, được nồng độ pha loãng 10-1.

3.4.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis

Chuẩn bị 7 ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý vô trùng, đánh số thứ tự

từ 1 đến 7 Dùng micropipette hút 1ml từ bình tam giác chứa mẫu đất phân lập có nồng độ 10-1 cho vào ống nghiệm thứ 1 và lắc đều bằng máy vortex, ta được nồng

độ pha loãng 10-2, tiếp tục pha loãng đến ống thứ 7 Tiếp theo dùng micropipette hút 0,1ml từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA (mỗi nồng độ lặp lại 2 lần) và trang đều bằng que trang vô trùng Để đĩa TSA ở 37oC trong 24 giờ, sau đó quan sát khuẩn lạc hình thành trên đĩa Chọn ra những khuẩn lạc nghi ngờ

của Bacillus subtilis, dùng que cấy vòng bắt và nuôi cấy giữ giống trên môi trường

ống nghiêng TSA

26

Để đĩa TSA ở 370C trong 24 giờ

Bắt khuẩn lạc nghi ngờ là vi khuẩn Bacillus subtilis

lên đĩa TSA

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất

(Theo Nguyễn Lân Dũng, 2001)

27