Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý elicitor lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ... Phương pháp xác định chỉ số tăng trưởng, [r]
Trang 1-
NGUYỄN THỊ NHẬT LINH
NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY RỄ THỨ CẤP SÂM
NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) VÀ
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN SỰ TÍCH LŨY SAPONIN
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH LÝ HỌC THỰC VẬT
HUẾ - NĂM 2017
Trang 2Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS Dương Tấn Nhựt
GS.TS Nguyễn Hoàng Lộc
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:
Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Huế họp tại:
Vào hồi giờ ngày tháng năm
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
Trang 3
ĐẶT VẤN ĐỀ
Vietnamese ginseng, sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.), một loài sâm đặc hữu của Việt Nam, chứa rất nhiều dược chất saponin hơn so với các loài sâm quý khác trên thế giới Ngoài
26 hợp chất tương tự sâm Mỹ và sâm Triều Tiên, trong sâm Ngọc Linh còn phát hiện được hơn 20 loại saponin khác Những saponin quý này có tác dụng bồi bổ sức khỏe, tăng cường sinh lực, điều hòa huyết áp, chống oxy hóa, điều trị các bệnh ung thư, gan, thận và tiểu đường, Tuy nhiên, loài sâm quý và có giá trị kinh tế cao này đang nằm trong danh mục sách đỏ cần được bảo tồn Hơn nữa, để
sử dụng các hợp chất từ sâm Ngọc Linh vào sản xuất dược phẩm vẫn còn gặp rất nhiều khó khăn do thiếu nguồn nguyên liệu
Nuôi cấy rễ sâm in vitro có tiềm năng thu sinh khối lớn trong thời gian ngắn Rễ sâm Ngọc Linh in vitro tăng trưởng tốt khi có
được môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp Tuy nhiên, ngoài việc gia tăng sinh khối rễ, sự tích lũy các dược chất saponin cũng đóng vai trò hết sức quan trọng Sinh khối rễ sâm Ngọc Linh lớn có thể làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng, thậm chí để sản xuất thuốc, nếu có hàm lượng saponin cao Nhưng thực tế, rế
sâm in vitro có hàm lượng saponin thấp hơn rất nhiều so với rễ thu
ngoài tự nhiên Với lợi ích to lớn của các elicitor trong việc tăng cường tích lũy saponin trong nuôi cấy mô sẹo sâm Ngọc Linh, các nghiên cứu ứng dụng elicitor vào nuôi cấy rễ thứ cấp sâm Ngọc
Linh là rất cần thiết Chính vì thế, Đề tài “Nghiên cứu nuôi cấy rễ
thứ cấp sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) và
khảo sát ảnh hưởng của một số elicitor lên sự tích lũy saponin.”
đã được thực hiện để không những cải thiện sự hình thành rễ thứ
cấp (RTC) từ nuôi cấy rễ bất định (RBĐ) in vitro khi tối ưu môi
Trang 4trường và điều kiện nuôi cấy, còn tăng cường được hàm lượng 3 saponin (MR2, Rb1 và Rg1) trong sâm Ngọc Linh nhờ tác dụng của các elicitor
Mục tiêu của luận án
Xác định được điều kiện nuôi cấy và môi trường thích hợp để RBĐ của sâm Ngọc Linh phát triển và hình thành nhiều RTC, từ đó,
có được nguồn sinh khối lớn và ổn định để nhân nhanh sinh khối rễ sâm Ngọc Linh trong các hệ thống lớn như Bioreactor
Xác đinh được các loại, nồng độ của các elicitor khác nhau lên quá trình sản xuất ba saponin (MR2, Rg1 và Rb1) quan trọng có
trong RTC sâm Ngọc Linh in vitro thông qua 5 loại elicitor (SA, JA,
ABA, CHN và YE) hiện có tại phòng thí nghiệm Sau đó, tiến hành kết hợp các elicitor có nguồn gốc khác nhau để nâng cao hiệu quả sản xuất saponin, đồng thời tìm được thời điểm thích hợp để bổ sung
các elicitor này vào nuôi cấy RTC sâm Ngọc Linh từ RBĐ in vitro
Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu này cung cấp các dẫn liệu khoa học
mới có giá trị về nghiên cứu phát sinh hình thái rễ, nhân nhanh sinh khối và tăng cường tích lũy các hợp chất saponin trong các nuôi cấy
RTC sâm Ngọc Linh từ RBĐ in vitro Đồng thời, đây là tài liệu tham
khảo hữu ích cho việc nghiên cứu và giảng dạy về lĩnh vực chuyển hóa thứ cấp, sinh lý thực vật và nuôi cấy mô thực vật
Ý nghĩa thực tiễn: Luận án thiết lập được môi trường nuôi cấy, điều
kiện nuôi cấy và hệ thống nuôi cấy tối ưu cho RBĐ sâm Ngọc Linh tăng sinh và tạo nhiều RTC trong thời gian ngắn nhất Đồng thời, nâng cao hàm lượng các saponin nội sinh (MR2, Rg1 và Rb1) Kết quả này có thể ứng dụng vào sản xuất sâm Ngọc Linh trên quy mô lớn nhằm giải quyết vấn đề khan hiếm nguồn nguyên liệu
Trang 5CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
GIỚI THIỆU VỀ SÂM NGỌC LINH
1.
Cây sâm Ngọc Linh là một loài sâm đặc hữu của Việt Nam, chỉ có trên vùng núi cao thuộc hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam Hiện nay, sâm Ngọc Linh được cả thế giới biết đến bởi những hợp chất saponin của loài sâm này vượt trội so với một số loài sâm nổi tiếng khác như sâm Triều Tiên và sâm Mỹ
Saponin hay saponoside là một hợp chất glycoside tự nhiên
có hoạt tính bề mặt Đây là một nhóm đa dạng của terpenoid được đặc trưng bởi các cấu trúc khác nhau Saponin được cấu tạo từ một aglycon steroid hoặc triterpenoid với một hoặc nhiều chuỗi đường Những kết quả nghiên cứu phân lập thành phần hóa học mới nhất được công bố cho thấy các hợp chất saponin của sâm Ngọc Linh có trên 60 loại, mà nhóm chất quan trọng nhất của loài sâm này là các triterpene saponin với các đại diện chính là MR2, Rb1 và Rg1 nằm trong nhóm dammaran Triterpene saponin có cấu trúc phức tạp nên tổng hợp hóa học không có khả năng cạnh tranh kinh tế khi sản xuất trên quy mô lớn mà nguồn sâm lại vô cùng hiếm
NUÔI CẤY TẠO RỄ THỨ CẤP TỪ RỄ BẤT ĐỊNH
3.
Rễ bất định (RBĐ) là những rễ có nguồn gốc nội sinh, phát sinh
từ nhiều cơ quan khác nhau của thực vật (như lá, hoa, cuống lá) do
Trang 6sự phản biệt hóa của tế bào nhu mô nằm xung quanh hệ thống mô mạch dưới tác động của auxin
Rễ thứ cấp (RTC) được hình thành từ các vùng ngoại vi của trụ
bì trưởng thành ở những khoảng cách khác nhau từ các mô phân sinh đỉnh của rễ Sơ khởi RTC phát triển thông qua một chương trình phân chia tế bào rất đặc trưng để tạo ra một cấu trúc y như khuôn mẫu của rễ chính
Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy rễ thứ cấp và rễ bất định: Loại mẫu cấy, vị trí phát sinh, vai trò điều hòa của auxin, tương tác giữa auxin và cytokinin, nhiệt độ, ánh sáng, giá thể nuôi cấy
Các nghiên cưu trong và ngoài nước vể nuôi cấy rễ
ELICITOR VÀ SỰ KÍCH KHÁNG
4.
Elicitor (elicitor thực vật) có thể được định nghĩa như là một chất
cơ bản mà khi đưa với các nồng độ nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì khởi động quá trình phòng vệ ở thực vật, dẫn đến sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp Kích kháng là việc gây kích thích hay tăng cường quá trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp do sự hiện diện của các elicitor trong môi trường nuôi cấy Elicitor có thể được phân loại dựa vào bản chất hoặc dựa trên nguồn gốc
Cho đến nay, các nghiên cứu ứng dụng elicitor vào nuôi cấy in
vitro sâm Ngọc Linh nhằm nâng cao hàm lượng các saponin còn rất
hạn chế Dương Tấn Nhựt và cs (2012) bước đầu nghiên cứu đánh giá tác động của MeJA lên việc tích lũy saponin của mô sẹo sâm Ngọc Linh đã cho thấy hiệu quả của các elicitor trong việc tăng cường các saponin lên đáng kể Trịnh Thị Hương (2017) cũng đã bước đầu nghiên cứu tác động của MeJA, SA và ABA nhằm tăng cường các hợp chất saponin trong nuôi cấy rễ tơ sâm Ngọc Linh
Trang 7CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
1.1 Nguồn mẫu
Mẫu rễ bất định (RBĐ) 30 ngày tuổi được tách ra từ các cụm RBĐ nuôi cấy trên môi trường SH bổ sung 5 mg/L IBA hiện có tại Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên
2 PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
2.1 Tối ưu cách chọn mẫu và môi trường nuôi cấy RTC từ nuôi cấy
rễ bất định sâm Ngọc Linh in vitro
2.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của cách cắt mẫu rễ bất định lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành và tăng
trưởng của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro
2.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp giữa auxin và cytokinin lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
2.1.4 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự hình thành
và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
2.1.5 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ NH4
+
/NO3 -
trong môi trường MS lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
2.1.6 Khảo sát ảnh hưởng của các loại đường carbohydrate lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
2.1.7 Khảo sát ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
2.2 Tối ưu điều kiện nuôi cấy rễ bất định sâm Ngọc Linh để tăng
cường sự hình thành RTC và tích lũy saponin trong nuôi cấy in vitro
2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự tăng sinh và
Trang 8tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên sự tăng sinh và tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro
2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của giai đoạn nuôi cấy tối và sáng lên sự tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của thể tích nuôi cấy lên sự tăng trưởng
của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro
2.2.6 Khảo sát ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
2.3 Tối ưu khả năng tích lũy saponin của RTC hình thành từ rễ bất định sâm Ngọc Linh nhờ tác động của các elicitor
2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh và tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro
2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết nấm men lên sự tăng sinh
và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của abscisic acid lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
2.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của salicylic acid lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
2.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của jasmonic acid lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
2.3.6 Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của elicitor ngoại sinh và elicitor nội sinh lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
in vitro
2.3.7 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý elicitor lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ
Trang 9bất định in vitro
2.4 Phương pháp xác định chỉ số tăng trưởng, tỷ lệ chất khô, tỷ lệ hình thành và tăng sinh của mẫu cấy
2.5 Môi trường nuôi cấy
Môi trường dinh dưỡng khoáng MS, SH và B5 có bổ sung 30 g/L đường sucrose, 8 g/L agar, pH = 5,8 và thay đổi tùy vào từng thí nghiệm
2.6 Điều kiện nuôi cấy
Các thí nghiệm được tiến hành ở nhiệt độ 25±2C (trừ thí nghiệm khảo sát nhiệt độ nuôi cấy), độ ẩm trung bình 50-60%, tất cả các thí nghiệm đều đặt trong điều kiện tối hoàn toàn (trừ thí nghiệm khảo sát
về thời gian chiếu sáng), các thí nghiệm ngoài sáng được để dưới ánh sáng đèn huỳnh quang có cường độ chiếu sáng khoảng 40-45 µmol.m-2.s-1 với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ/ngày Nuôi cấy lỏng trên máy lắc Innova 2100 plantform shaker (Hermle, Đức) với tốc độ 100 vòng/phút
3 PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN
3.1 Phương pháp định tính bằng sắc ký lớp mỏng
3.2 Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
3.3 Phương pháp xác định năng suất tổng hợp saponin
4 PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT TẾ BÀO HỌC
5 PHƯƠNG PHÁP THỐNG KÊ VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU
Trang 10CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1 TỐI ƯU NUÔI CẤY RỄ THỨ CẤP SÂM NGỌC LINH TỪ
NHỮNG MẪU RỄ BẤT ĐỊNH IN VITRO
1.1 Tối ưu cách chọn mẫu và môi trường nuôi cấy RTC sâm Ngọc Linh
1.1.1 Ảnh hưởng của cách cắt mẫu rễ bất định lên sự hình thành
và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn RBĐ (RBĐ) lên sự
hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh in vitro thể hiện
ở Bảng 3.1, cho thấy nguồn RBĐ từ mẫu cuống lá, kích thước 2 cm, không tách hết mẫu cấy là thích hợp nhất cho RTC sâm Ngọc Linh
in vitro hình thành và tăng trưởng
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của cách cắt mẫu RBĐ lên khả năng hình
thành và tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh in vitro
Mẫu
KT (cm)
Tỷ lệ tạo RTC (%)
Số RTC
Chiều dài RTC (cm)
KLT (mg)
Trang 111.1.2 Ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy RBĐ in vitro
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của auxin lên khả năng hình thành và tăng
trưởng RTC từ RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro
Auxin
(mg/L)
Tỷ lệ tạo RTC (%)
Số RTC
Chiều dài RTC (cm)
KLT (mg)
KLK (mg)
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của IBA kết hợp với cytokinin lên sự hình
thành và tăng trưởng RTC từ RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro
Số RTC
Chiều dài
KLK (mg)
0,2 10,00 h 0,75 g 0,13 h 60,00 g 5,00 i
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan
Trang 121.1.4 Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của các môi trường khác nhau lên sự hình
thành và phát triển RTC sâm Ngọc Linh từ RBĐ in vitro
Chiều dài RTC (cm)
KLT (mg)
KLK (mg) Đặc điểm rễ
RTC màu trắng trong
và mảnh, rễ chính màu trắng và mảnh
RTC mập, màu trắng đục và rễ chính màu vàng, dày
RTC màu vàng và mảnh, rễ chính hóa nâu, phồng dày lên
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 trong Duncan’s test KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô, RTC: Rễ thứ cấp
1.1.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ NH 4
+
/NO 3 -
trong môi trường MS lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ NH4
+
/NO3 -
KLT (mg)
KLK (mg)
Trang 13Biểu đồ 3.1 So sánh giữa môi trường cải biên có tỷ lệ NH4
+
/NO3 -
tốt nhất so với các môi trường nuôi cấy khác
Các chữ cái khác nhau (a, b, c ) trên mỗi cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p
≤ 0,05 trong phép thử Duncan
1.1.6 Ảnh hưởng các loại đường carbohydrate lên sự hình thành
và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.6 Ảnh hưởng loại đường carbohydrate lên sự hình thành và
tăng trưởng RTC từ RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro
Loại đường
(g/L)
KLT (mg)
KLK (mg)
Tỷ lệ chất khô (%)
50 533,33 b 47,83 cde 9,16 bcd dài, trắng đục, mập, nhiều nhánh
60 526,67 b 46,33 de 7,80 cd dài, hơi vàng, mập, nhiều nhánh
Môi trường nuôi cấy
Trang 141.1.7 Ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên khả năng hình thành
và tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh in vitro
Giá thể
Tỷ lệ
tạo RTC
(%)
Số lượng
rễ (rễ/mẫu)
Chiều dài rễ (cm)
KLT (mg)
KLK (mg)
Agar 100,00 a 48,45 a* 2,70 a 121,40 a 12,47 a
Gelrite 100,00a 13,83b 0,94b 121,03a 13,23aBông gòn 93,34b 8,80c 0,68b 77,20b 8,27b
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô
1.2 Tối ưu điều kiện nuôi cấy RTC từ nuôi cấy RBĐ sâm Ngọc
Linh in vitro
1.2.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy RBĐ in vitro
Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng hình thành và tăng
trưởng RTC từ nuôi cấy RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro
Thời gian nuôi cấy (ngày)