Nghiên cứu thu nhận axit béo không no có hoạt tính sinh học từ dầu cá tra bằng thủy phân với enzyme lipase candida rugosa

Ngày nay, việc nghiên cứu thu nhận các axít béo từ nguồn dầu mỡ thiên nhiên bằng phản ứng thủy phân với xúc tác enzyme đang thu hút sự quan tâm lớn trên thế giới vì có nhiều ưu điểm: phư

PHÂN VỚI ENZYME LIPASE CANDIDA RUGOSA

Chuyên ngành: Công Nghệ Thực phẩm & Đồ uống

Mã ngành: 605402

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2014

TS PHAN NGỌC HÕA PGS TS NGÔ MẠNH THẮNG

Cán bộ chấm nhận xét 1 : TS NGUYỄN THẢO TRANG

Cán bộ chấm nhận xét 2 : TS PHAN TẠI HUÂN

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 14 tháng 1 năm 2015

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

2 TS Nguyễn Thảo Trang

3 TS Phan Tại Huân

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: TRƯƠNG THỊ THÖY NGỌC MSHV: 12110205 Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm & Đồ uống

I TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THU NHẬN AXÍT BÉO KHÔNG NO CÓ

HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ DẦU CÁ TRA BẰNG THỦY PHÂN VỚI

ENZYME LIPASE CANDIDA RUGOSA

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

– Khảo sát quy trình thu nhận dầu cá tra từ mỡ cá tra và đánh giá đặc tính dầu cá tra thu và enzyme lipase

– Khảo sát quá trình thủy phân dầu cá tra với xúc tác enzyme lipase Candida

rugosa

– Thu nhận sản phẩm thủy phân và đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm thu được

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:

III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:

IV CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS PHAN NGỌC HÒA

PGS TS NGÔ MẠNH THẮNG

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2014

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

PHAN NGỌC HÕA LÊ VĂN VIỆT MẪN

TRƯỞNG KHOA

- -

Hoàn thành luận văn là sự vận dụng kiến thức, k năng thực hành, kinh nghiệm làm việc và n lực hết sức của em trong khoảng thời gian giới hạn để đạt kết quả này Tuy nhiên với kiến thức thực tế còn hạn hẹp nên không tránh khỏi những sai sót, kính mong thầy cô góp ý và sửa chữa để em có thể hoàn thiện hơn

Và với tấm lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin được gửi lời cảm ơn đến:

Cô Phan Ngọc Hòa và thầy Ngô Mạnh Thắng - Giảng viên Trường Đại Học

Bách khoa đã hướng dẫn và truyền đạt cho em nhiều kiến thức chuyên môn từ lý thuyết đến thực nghiệm và những kinh nghiệm nghiên cứu quý báu trong quá trình

em học tập, nghiên cứu, đồng thời đã h trợ một phần kinh phí nghiên cứu để hoàn thành luận văn

Cô Nguyễn Thị Nguyên, giảng viên trường Đại học Bách Khoa, đã giúp đỡ

và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn tại phòng thí nghiệm

Quý thầy Cô đang công tác tại: Bộ Môn Công Nghệ Thực Phẩm, Khoa K

Thuật Hóa Học, Trường Đại Học Bách khoa Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện tốt để em hoàn thành luận văn

Các Anh, Chị, Em cùng phòng thí nghiệm công nghệ thực phẩm 1 -

Trường Đại Học Bách khoa Thành Phố Hồ Chí Minh đã động viên và giúp đỡ em trong quá trình làm luận văn

Cha mẹ, người thân đã luôn động viên, h trợ em cả về vật chất lẫn tinh thần

trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2014

Người viết

TRƯƠNG THỊ THÖY NGỌC

- -

Dầu cá tra được thu nhận từ mỡ cá tra, một phụ phẩm của công nghiệp sản xuất thủy sản tại đồng bằng sông Cửu Long Thành phần axít béo trong dầu cá tra

có nhiều axít béo không no như axít oleic, axít linoleic, axít béo omega 3 là các chất

có hoạt tính sinh học Phương pháp thu nhận axít béo từ dầu cá tra bằng phản ứng thủy phân với xúc tác enzyme đang được quan tâm nghiên cứu do có nhiều ưu

điểm Nghiên cứu này tập trung xác định khả năng sử dụng enzyme lipase Candida

rugosa để thủy phân dầu cá tra Chế phẩm enzyme lipase được xác định tính chất:

hàm lượng protein, hoạt tính riêng Quy trình trích ly dầu từ phụ phẩm mỡ cá của xí nghiệp sản xuất philê cá tra được khảo sát Dầu cá được xác định tính chất và thành phần axít béo Các chế độ thủy phân dầu với enzyme được khảo sát: t lệ enzyme cơ chất, nhiệt độ thủy phân, pH, tốc độ khuấy và thời gian phản ứng Kết quả cho thấy với điều kiện thủy phân thích hợp: tỉ lệ enzyme cơ chất ,4 w w, nhiệt độ 4 o

C, pH 6,5, tốc độ khuấy 250 vòng/phút, sau 7 giờ thủy phân, mức độ thủy phân đạt được là 48,97 Sản phẩm thủy phân có hàm lượng axít béo tự do là 88,9 , trong đó axít oleic chiếm 41,22 Hàm lượng axít béo omega-3 trong dầu

cá tra sau thủy phân tăng gấp 2,1 lần so với dầu cá ban đầu

STUDY ON OBTAINING BIOLOGICAL ACTIVE FATTY ACIDS BY HYDROLYSIS OF TRA CATFISH OIL WITH

LIPASE FROM CANDIDA RUGOSA

ABSTRACT

Tra catfish oil is derived from Tra catfish fat, a by-product of industrial aquaculture production in the Mekong Delta Fatty acids in catfish oil such as oleic acid, linoleic acid, omega-3 acids are biologically active compounds Method of

determining the ability of using lipase from Candida rugosa to hydrolyze Tra

catfish oil Properties of lipase enzyme were determined: protein content, specific activity The process of extracting oil from Tra catfish fat was investigated Fish oil was determined the properties and composition of fatty acids Conditions which effect on hydrolysis were investigated: the rate of enzyme/substrate, hydrolysis temperature, pH, stirring speed and reaction time The results showed that with optimal hydrolysis conditions: the ratio enzyme/substrate 0.4% w/w, temperature 40°C, pH 6.5, stirring speed 250 rpm, after 7 hours, the degree of hydrolysis achieved 48.97% Content of free fatty acids in hydrolysate was 88.9%, in which oleic acid occupies 41.22% Catfish oil after hydrolysis was significantly enriched

in omega-3 fatty acid content, which occupied 1.89% comparing to 0.89% in initial fish oil

Tôi xin cam đoan đây là nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và nội dung này chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào trước đó

Học viên thực hiện Luận văn tốt nghiệp

TRƯƠNG THỊ THÖY NGỌC

MỤC LỤC

MỤC LỤC……….i

DANH MỤC BẢNG………v

DANH MỤC HÌNH………vi

MỞ ĐẦU……….1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN………2

1.1 SƠ LƯỢC VỀ ENZYME LIPASE 2

1.1.1 Định nghĩa 2

1.1.2 Phân loại enzyme lipase 3

1.1.2.1.Phân loại theo nguồn thu lipase……… 3

1.1.2.2.Phân loại theo đặc hiệu của enzyme 5

1.1.3 Cấu tạo không gian của enzyme lipase 8

1.1.4 Tính đặc hiệu của enzyme lipase 9

1.1.5 Cơ chế xúc tác phản ứng thu phân của lipase 10

1.1.6 Đặc tính của enzyme lipase 13

1.1.6.1Nhiệt độ và pH hoạt động 13

1.1.2.2Chất hoạt hóa và chất kìm hãm 14

1.1.7 Ứng dụng của enzyme lipase 15

1.1.7.1Trong công nghiệp thực phẩm 15

1.1.7.2Trong công nghiệp giấy và bột giấy 17

1.1.7.3Trong sản xuất dược phẩm và m phẩm 17

1.1.7.4Trong công nghiệp thuộc da 17

1.1.7.5Trong sản xuất Biodiesel 18

1.3 PHẢN ỨNG THỦY PHÂN THU NHẬN AXÍT BÉO 18

1.3 SƠ LƯỢC VỀ MỠ CÁ TRA 18

1.3.1 Cá tra 18

1.3.2 Mỡ cá tra……… 19

1.4 AXÍT BÉO KHÔNG NO CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC 20

1.5 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THỦY PHÂN DẦU BÉO BẰNG ENZYME

LIPASE CANDIDA RUGOSA 21

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 24

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU – HÓA CHẤT – THIẾT BỊ 24

2.1.1 Nguyên vật liệu 24

2.1.2 Hóa chất sử dụng 25

2.1.3 Thiết bị 25

2.2 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU 25

2.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 26

2.3.1 Thu nhận dầu cá tra từ mỡ cá tra 26

2.3.2 Khảo sát nguyên liệu dầu cá tra 27

2.3.2.1.Xác định chỉ số axit – phụ lục 1 27

2.3.2.2 Xác định chỉ số peroxyt – phụ lục 2 27

2.3.2.3 Xác định hàm lượng chất khô – phụ lục 3 27

2.3.2.4 Xác định độ tro theo tiêu chuẩn TCVN 6531-1998 – phụ lục 4 27

2.3.2.5 Xác định hàm lượng béo tổng - phụ lục 5 27

2.3.2.6.Xác định chỉ số iot theoTCVN 6122-2 1 tại Công ty CP DV KHCN Sắc ký Hải Đăng 27

2.3.2.7.Xác định thành phần và hàm lượng axít béo bằng phương pháp sắc ký khí theo tiêu chuẩn AOAC 969.33 tại Công ty CP DV KHCN Sắc ký Hải Đăng 27

2.3.3 Khảo sát tính chất enzyme lipase Candida rugosa 27

2.3.3.1Xác định hàm lượng protein- phương pháp Bradford – phụ lục 6 27

2.3.3.2Xác định hoạt tính enzyme-phương pháp chuẩn độ acid-base – phụ lục 7 27

2.3.4 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới thủy phân mỡ cá tra của enzyme lipase Candida rugosa 28

2.3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme cơ chất 28

2.3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 29

2.3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH 29

2.3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ khuấy trộn 30

2.3.4.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân……… 31

2.3.5.Phân tách sản phẩm thủy phân………32

2.4 CÔNG THỨC TÍNH TOÁN 34

2.4.1 Xác định tốc độ thủy phân 34

2.4.2 Xác định mức độ thủy phân của enzyme 34

2.4.3 Phân tích sắc kí khí 34

2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 35

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 36

3.1 KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU DẦU CÁ TRA………36

3.1.1 Hiệu suất trích ly 36

3.1.2 Xác định chỉ số axit 36

3.1.3 Xác định chỉ số peroxyt 36

3.1.4 Xác định hàm lượng chất khô 36

3.1.5 Xác định hàm lượng tạp chất 37

3.1.6 Xác định hàm lượng béo tổng 37

3.1.7 Xác định chỉ số iôt 37

3.1.8 Xác định thành phần các axít béo 38

3.2 KHẢO SÁT TÍNH CHẤT ENZYME LIPASE CANDIDA RUGOSA 39

3.2.1 Xác định hàm lượng protein trong enzyme lipase Candida rugosa 39

3.2.2 Xác định hoạt tính riêng của enzyme lipase Candida rugosa 40

3.3 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG XÖC TÁC THỦY PHÂN CỦA ENZYME LIPASE CANDIDA RUGOSA 40

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme cơ chất 40

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 41

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH 42

3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ khuấy trộn 43

3.3.5 Khảo sát biến thiên của mức độ thủy phân theo thời gian 44

3.4 KHẢO SÁT SẢN PHẨM 46

3.4.1 Phân đoạn phân cực 46

3.4.1.1 Hàm lượng axít béo tự do……….46

3.4.1.2 Hàm lượng béo tổng……….46

3.4.1.3 Thành phần axít béo trong sản phẩm……… 46

3.4.2 Phân đoạn không phân cực 47

3.4.2.1 Chỉ số PV……… 47

3.4.2.2 Chỉ số IV……… 48

3.4.2.3 Thành phần axít béo……… 48

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……….5

4.1 KẾT LUẬN 50

4.2 KIẾN NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 52

PHỤ LỤC……… 58

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các kiểu xúc tác đặc hiệu của những lipase có nguồn gốc khác nhau 6Bảng 2.1 Thành phần axít béo trong dầu ô liu 24 Bảng 3.1 Kết quả thí nghiệm khảo sát tính chất dầu cá tra thu đƣợc 38Bảng 3.2 Tỉ lệ thành phần các axít béo trong dầu cá tra ban đâù ( trên tổng lƣợng axít béo) 39Bảng 3.3 Tỉ lệ thành phần các axít béo trong dịch thủy phân dầu cá tra ( trên tổng lƣợng axít béo) 47 Bảng 3.4 Tỉ lệ thành phần các axít béo trong dầu cá tra sau thủy phân ( trên tổng lƣợng axít béo) 49

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Phản ứng thủy phân của lipase không đặc hiệu[5] 5

Hình 1.2 Phản ứng thủy phân của lipase đặc hiệu vị trí 1-3 [5] 7

Hình 1.3 Cấu trúc không gian của lipase 9

Hình 1.4 Cấu trúc không gian của lipase từ Candida rugosa [24] 10

Hình 1.5 Sản phẩm quá trình thủy phân xúc tác bởi lipase 10

Hình 1.6 Mô hình hoạt động của lipase trên cơ chất hoà tan và không tan trong nước Sự thay đổi hình thể của lipase trong quá trình hoạt động xúc tác Mô hình này do Verger đề xuất (198 ) 11

Hình 1.7 Cấu trúc nắp của lipase Candida rugosa 12

Hình 1.8 Sơ đồ cơ chế xúc tác của enzyme lipase tại trung tâm hoạt động 12

Hình 1.9 Cá tra nuôi Pangasius hypophthalmus 19

Hình 1.10 Con đường tổng hợp axít béo không no nhiều nối đôi (Holub and Holub, 2 4) 20 Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 25

Hình 2.2 Quy trình thu nhận dầu cá tra từ mỡ cá tra 26

Hình 2.3 Quy trình thủy phân dầu cá tra để thu nhận axít béo có hoạt tính sinh học……….………33

Hình 3.1 Đồ thị đường chuẩn mật độ quang theo nồng độ protein 40

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme cơ chất 41

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến mức độ thủy phân của enzyme lipase Candida rugosa 42

Hình 3.4 Ảnh hưởng của pH đến mức độ thủy phân của enzyme lipase Candida rugosa 43

Hình 3.5 Ảnh hưởng của mức độ khuấy trộn đến mức độ thủy phân của enzyme lipase Candida rugosa 44

Hình 3.6 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới mức độ thủy phân và tốc độ thủy phân của enzyme lipase Candida rugosa……… …45

MỞ ĐẦU

Hiện nay, nghề nuôi cá tra và công nghiệp chế biến cá tra đang là một ngành chủ lực của đồng bằng sông Cửu Long Mỡ cá là loại phụ phẩm của ngành công nghiệp này và chứa hàm lượng lớn các axít béo không no có hoạt tính sinh học Trước đây phương pháp được dùng để sản xuất axít béo là phương pháp vật lý và phương pháp hoá học Ngày nay, việc nghiên cứu thu nhận các axít béo từ nguồn dầu mỡ thiên nhiên bằng phản ứng thủy phân với xúc tác enzyme đang thu hút sự quan tâm lớn trên thế giới vì có nhiều ưu điểm: phương pháp đơn giản, thân thiện với môi trường, chi phí tiêu thụ năng lượng thấp và sản phẩm thu được ở dạng glyceride thuận lợi về dinh dưỡng hơn so với các dạng metyl hoặc etyl este của các axít béo N.A Serri và cộng sự (2008) nghiên cứu thủy phân dầu cọ để sản xuất axít béo tự do và glycerol với các thông số như thời gian, nhiệt độ, pH và tốc độ khuấy Quá trình thu phân tối ưu với thời gian 90 phút, nhiệt độ 45°C, pH 7,5 và tốc độ khuấy 200 vòng/phút [1] Akila Bura Mohanarangan (2 12) đã nghiên cứu làm giàu

omega-3 trên cơ chất dầu cá trích với enzyme lipase Candida rugosa, với hàm

lượng EPA và DHA ban đầu là 4,46 và 5,92 , sau khi thủy phân, hàm lượng EPA và DHA đã tăng lên 6,49 và 11,17% [2] Kahveci và cộng sự (2010) báo cáo

rằng sau khi thủy phân dầu cá hồi với enzyme lipase Candida rugosa lượng EPA

tăng từ 4,8 lên 5,9 và DHA tăng từ 6,93 lên 19,39% [3]

Với những lý do trên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu thu nhận axít béo không no có hoạt tính sinh học và dầu cá giàu nhóm axít béo omega-3 từ mỡ cá tra

bằng phản ứng thủy phân với xúc tác enzyme lipase Candida rugosa nhằm cung

cấp thêm những phương hướng phát triển và khả năng ứng dụng của lipase vào công nghiệp đồng thời tận dụng nguồn phụ phẩm của ngành công nghiệp chế biến thu sản một cách hiệu quả

Enzyme lipase có thể xúc tác cho 3 nhóm phản ứng sau:, [5], [6]

(a) Chuyển vị ester – ester

R1COOR2 + R3COOR4 R1COOR4 + R3COOR2(b) Chuyển vị ester – rượu

R1COOR2 + R3OH  R1COOR3 + R2OH (c) Chuyển vị ester – acid

R1COOR2 + R3COOH  R3COOR2 + R1COOH (d) Chuyển vị ester – amin

R1COOR2 + R3NH2 R1CONHR3 + R2OH Lipase chỉ thu phân chất béo đã được nhũ hoá và hoạt động tại bề mặt phân pha dầu nước Lipase khác với các enzyme esterase ở ch các esterase chỉ thu phân liên kết ester tan trong nước như triacylglycerol [7]

Enzyme nói chung và lipase nói riêng có ứng dụng rất lớn trong công nghiệp

Nó không chỉ làm tăng tốc độ phản ứng mà quan trọng hơn nhờ tính đặc hiệu của mình lipase có thể xúc tác rất chọn lọc, chỉ phản ứng ở một số liên kết nhất định, hướng phản ứng theo chiều cho ra một số sản phẩm nhất định vì vậy không những

tăng năng suất mà sản phẩm cũng tinh khiết hơn, đặc biệt với k thuật cố định enzyme còn có thể tái sử dụng enzyme nhiều lần giúp giảm chi phí sản xuất và hạn chế enzyme lẫn trong sản phẩm

1.1.2 Phân loại enzyme lipase

Lipase được phân bố ở động vật, thực vật và cả vi sinh vật, tuy nhiên nguồn thu nhận lipase lớn nhất trong công nghiệp là vi sinh vật vì khả năng xúc tác mạnh, hoạt tính ổn định, dễ sản xuất bằng con đường lên men và dễ thu nhận từ canh trường Lipase phân lập từ các nguồn khác nhau sẽ rất khác nhau về cấu trúc protein

và cơ chế xúc tác, khác nhau về đặc trưng acid béo, khả năng chịu nhiệt, pH tối ưu Hầu hết enzyme trích ly từ cơ thể động vật có nhiệt độ tối thích là 370

C, trong khi nhiệt độ tối thích của enzyme trích ly từ vi sinh vật phụ thuộc vào chủng vi sinh vật

tạo ra chúng Lipase thu được từ chủng Candida rugosa có hoạt tính tối thích ở

40oC, còn lipase thu được từ chủng Aspergillus sp 89 1 có nhiệt độ tối thích là 60oC [8]

Các enzyme nguồn gốc khác nhau cũng có pH tối ưu khác nhau, trong khi

lipase trích ly từ Yarrowia lipolytica NRRL Y-2178 có pH tối thích ở khoảng 8, [9] thì lipase trích ly từ chủng Y.lipolytica 681 lại có pH tối thích chỉ 6, , còn lipase trích ly từ chủng đột biến Y.lipolytica được phân lập từ đất có pH tối thích là 7,

Lipase động vật chủ yếu được chiết xuất từ tuyến tụy lợn, lipase tụy lợn ưu tiên xúc tác thủy phân liên kết ester của các axít béo có hơn 12 nguyên tử carbon và

chủ yếu tấn công vào vị trí C-1 của glycerol Lipase từ tụy lợn bao gồm một chu i

449 axít amin và trọng lượng phân tử của protein là vào khoảng 5 Da

Lipase chiết từ dạ dày dê cừu cũng là một loại lipase động vật phổ biến Loại lipase này ưu tiên xúc tác thủy phân axít béo chu i ngắn trong chất béo từ sữa và đặc biệt được sử dụng trong việc tạo thành hương thơm của phomat

 Lipase từ thực vật

Ở thực vật, lipase được tìm thấy ở mô dự trữ của hạt có dầu, hạt ngũ cốc trong quá trình nảy mầm Lipase thô có thể phân lập từ giống cây cải dầu, mù tạt, hoặc từ hạt thầu dầu bằng cách trích ly bằng dung môi aceton hoặc đệm thích hợp Trong những năm gần đây lipase còn có thể được chiết từ cám gạo [11]

Lipase từ các loại hạt có dầu cũng gây nhiều sự quan tâm Trong một số trường hợp, lipase từ thực vật có ưu điểm hơn so với lipase từ động vật và vi sinh vật như tính sẵn có và dễ tinh sạch Dù chưa được sản xuất trong công nghiệp và thương mại hoá nhưng với những ưu điểm trên, lipase từ thực vật vẫn có tiềm năng khai thác trong công nghệ enzyme [12]

 Lipase từ vi sinh vật

Phần lớn lipase trong công nghiệp được sản xuất từ các loại vi sinh vật: vi khuẩn, nấm mốc và nấm men Từ xưa, lipase từ vi khuẩn và nấm đã được sử dụng trong tập quán chế biến thực phẩm của những người cổ đại khi lên men yaourt và phomat Ngày nay, lipase có nguồn gốc từ vi sinh vật có ý nghĩa to lớn trong thương mại vì chi phí sản xuất thấp, dễ thu nhận từ canh trường nuôi cấy, hoạt tính ổn định hơn và ứng dụng rộng hơn lipase thực vật và động vật [13] [14]

Trong số các lipase từ vi khuẩn đang được khai thác, vi khuẩn Bacillus có

tiềm năng cho sản xuất enzyme và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực đa dạng

Bacillus subtilis, Bacilluspumilus, Bacilluslicheniformis, Bacilluscoagulans, Bacillus stearothermophilus và Bacillus alcalophilus là các lipase vi khuẩn phổ

biến nhất Ngoài ra, Pseudomonassp., Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia

multivorans, Burkholderia cepacia và Staphylococcus caseolyticus cũng đƣợc dùng

để sản xuất lipase từ vi khuẩn [15]

Các loài nấm men đã đƣợc tìm thấy để sản xuất lipase là: Candida rugosa,

Candida tropicalis, Candida antarctica, Candida cylindracea, Candida parapsilopsis, Candida deformans Trong số đó, lipase từ C.rugosa và C.antarctica đƣợc sử dụng phổ biến nhất vì khả năng xúc tác phản ứng cao và ổn

định [15]

1.1.2.2.Phân loại theo đặc hiệu của enzyme

Khả năng ứng dụng của lipase dùng làm xúc tác sinh học đều dựa vào tính chọn lọc hay đặc hiệu rất tinh tế của nó Tính đặc hiệu có thể là đặc hiệu về vị trí không gian, ví dụ nhƣ vị trí nhóm phân tử cơ chất của liên kết ester bị thủy phân hoặc hình thành; cũng có thể là đặc hiệu về axít béo, ví dụ nhƣ khả năng nhận biết

cơ chất; và một số đặc hiệu khác nhƣ đặc hiệu về đồng phân lập thể hay đặc hiệu về glyceride

 Đặc trƣng vị trí xúc tác thu phân

Nhóm 1: là những lipase không đặc hiệu – những lipase có thể thủy phân ngẫu

nhiên giải phóng chất béo tại bất kỳ vị trí nào trên triglyceride

Ví dụ: lipase từ chủng Chromobacterium viscosum, Candida cylindracea,

Humicola lanuginosa

 + + 3H2O 3RCOOH +



Hình 1.1 Phản ứng thủy phân của lipase không đặc hiệu [5]

Nhóm 2: là những lipase thủy phân đặc hiệu ở vị trí 1,3 và giải phóng các axít

béo từ vị trí 1 và 3 của triglyceride (chỉ có những axít béo bên ngoài, ở vị trí 1 và 3 mới đƣợc tách ra, axít béo ở vị trí 2 không phản ứng) Những lipase này thủy phân

không đặc hiệu

glyceride tạo thành các cho các axít béo tự do 1,(2,3)-diglyceride và

2-monoglyceride Một số lipase thủy phân đặc hiệu có thể kể đến như Aspergillus

niger, Muco miehei, Rhizopus arrhizu, Candida deformans Hầu hết lipase thông

dụng có tính đặc hiệu vị trí nhóm hydroxyl 1,3 (tương ứng các alcohol bậc 1) trong mạch glycerol

Bảng 1.1 Các kiểu xúc tác đặc hiệu của những lipase có nguồn gốc khác nhau

Nấm mốc

Candida rugosa

Aspergillus niger Candida antarctica A Candida antarctica B Geotrichum candidum

Mucor javanicus Penicillium expansum Rhizomucor miehei Rhizopus delemar Rhizopus niveus Thermomyces lanuginosa Yarrowia lipolytica

Không đặc hiệu Đặc hiệu vị trí 1,3 Đặc hiệu axít béo dạng trans Đặc hiệu vị trí 1,3

Đặc hiệu axít béo không no cis-9

Đặc hiệu vị trí 1,3 Đặc hiệu vị trí 1,3 Đặc hiệu vị trí 1,3 Đặc hiệu vị trí 1,3 Đặc hiệu vị trí 1,3 Đặc hiệu vị trí 1,3 Đặc hiệu vị trí 1,3

Vi khuẩn

Bacillus thermocatenulatas Pseudomonas glumae Pseudomonas cepacia Bacillus subtilis Chromobacterium viscosum Pseudomonas fluorescens

Đặc hiệu vị trí 1,3 Không đặc hiệu Không đặc hiệu

- Không đặc hiệu Không đặc hiệu Thực vật Brassica napus Đặc hiệu vị trí 1,3

Động vật Lipase từ tụy heo Đặc hiệu vị trí 1,3

Hình 1.2 Phản ứng thủy phân của lipase đặc hiệu vị trí 1-3 [2]

 Đặc trưng axít béo

Về tính đặc hiệu đối với axít béo, lipase có thể chuyển hóa ester với mạch có

độ dài ngắn đến dài (C4 đến C18, có thể lên đến C22) nhưng với hiệu quả khác nhau Ngay cả những enzyme từ cùng một loài vi sinh vật cũng có thể khác nhau ở

tính chất này Với Candida rugosa, lipase dạng 1 chủ yếu hoạt động với cơ chất có

mạch carbon có độ dài trung bình (C8 – C1 ), dạng 3 với cơ chất mạch ngắn, trong khi dạng 2 và 4 tác động ở mạch dài (C16 – C18) Một số lipase lại có thể chọn lọc

axít béo không no Điều này nhận thấy ở lipase từ Geotrichum candidum với tính

đặc hiệu cơ chất chứa axít béo không no (Δ-9) dạng cis Lipase tụy và một số lipase

từ vi sinh vật thể hiện hoạt tính trên các axít béo không no nhiều nối đôi (polyunsaturated fatty acid, PUFA)

Lipase R babjeviaeBD 19 thu phân tốt nhất đối với ester của axít béo chu i trung bình Lipase của R glutinis có hoạt tính cao nhất với nitrophenyl butyrate (C4) và nitrophenyl laurate (C12); lipase Rhodotorula minuta có hoạt tính cao đối

với p-nitrophenyl butyrate (C4) trong nhũ tương lecithin [16]

Những lipase thủy phân chất béo này với những tính đặc hiệu khác nhau có thể ứng dụng riêng lẻ hoặc kết hợp để đạt được mục đích công nghệ mong muốn,

+ RCOOH

+ RCOOH

+ 2 RCOOH

nhƣ tạo triglyceride cấu trúc trong việc tăng giá trị dinh dƣỡng chất béo, sản xuất

bơ cacao thay thế và dầu ăn với hàm lƣợng PUFA cao [17] Trong lĩnh vực sản xuất thuốc, lipase cũng đang đƣợc ứng dụng để acyl hóa chọn lọc các phân tử nhƣ carbohydrate, amino acid và peptide [18]

 Đặc trƣng glyceride

Đặc trƣng glyceride của lipase là đặc trƣng về hoạt động của nó trên các axít béo của mono-, diglyceride Theo kết quả nghiên cứu của Sakiyama và cộng sự

(2 1) thì enzyme lipase từ Pseudomonas sp LP315 xúc tác cho phản ứng thủy

phân tất cả các monoglyceride, không thể thủy phân di- và tri-glyceride, tuy nhiên hoạt tính của nó tùy thuộc vào loại monoglyceride, ở monomyristin hoạt tính của

Pseudomonas sp LP315 thể hiện là cao nhất [19] Từ đó có thể thấy lipase Pseudomonas sp LP7315 có tính chọn lọc nghiêm ngặt cho các monoglyceride

Một đặc trƣng khá quan trọng khác của lipase, nhất là trong công nghiệp sản xuất hóa chất, thuốc và trong một số sản phẩm nông nghiệp, đó chính là tính chọn lọc với đồng phân lập thể của nó Tính chất này cho phép lipase xúc tác đặc hiệu cho phản ứng với từng loại đồng phân quang học và phản ứng chọn lọc h n hợp racemic Các lipase này đƣợc ứng dụng trong quá trình sản xuất trên nhắm vào các alcohol có đồng phân quang học, ester axít carboxylic, các hydroxy axít, diester, lactone, amine, diamin, amino alcohol, dẫn xuất của amino acid [2 ]

1.1.3 Cấu tạo không gian của enzyme lipase

Cũng nhƣ các loại enzyme khác, lipase cũng là một lƣỡng cấu tử bao gồm 2 thành phần: Protein (apoenzyme), phi protein (coenzyem, vitamin, ion kim loại) đƣợc gọi là nhóm ngoại hay nhóm prosthetic khi nó liên kết chặt chẽ với phần protein của enzyme bằng liên kết đồng hóa trị

Theo hình 1.3 phiến β màu xanh đƣợc bao quanh bởi các xoắn α màu vàng Nhóm serine hoạt động là các thanh màu đỏ và vùng nắp xoắn của enzyme cũng có màu đỏ

Cấu trúc chung của enzyme lipase gồm một phiến β ở giữa với nhóm serine hoạt động đặt trong một vòng (loop) gọi là cùi chỏ xúc tác (catalytic elbow) Trên serine là một khe kị nước (hydrophobic cleft) được hình thành sau sự hoạt hóa Khe

ưa nước là một túi dài (elongated pocket) tùy theo cơ chất gắn khít vào Cấu trúc 3 chiều của tất cả các lipase đều theo một kiểu chung, nếp gấp α, β của enzyme thì trong đó có 8 liên kết β song song chủ yếu được bao quanh bởi xoắn α [21]

Hình 1.3 Cấu trúc không gian của lipase

Cấu trúc của lipase Candida rugosa (hình 1.4) có một vài ch võng bề mặt

bao phủ bộ ba xúc tác Các ch võng sẽ cản trở sự tiếp cận của cơ chất đến vị trí xúc tác Cấu trúc nắp được cố định bởi cầu nối disulfide giữa Cys60 và Cys97 và sự tương tác giữa Glu96 và Arg97 Một ch võng khác thuộc vùng N-terminal, hình thành bởi

amino acid 76-85 cũng có tác dụng bao phủ trung tâm hoạt động [22], [23]

Hình 1.4 Cấu trúc không gian của lipase từ Candida rugosa [23]

1.1.4 Tính đặc hiệu của lipase

Enzyme lipase xúc tác phản ứng thủy phân lần lượt từng liên kết chứ không cắt đứt cả ba liên kết ester cùng một lúc, quá trình xúc tác của lipase thường chậm hơn so với quá trình xúc tác của các enzyme khác như protease hay amylase

Đặc hiệu là một trong những thuộc tính quan trọng nhất của các enzyme, bao

gồm đặc hiệu cơ chất và đặc hiệu vị trí Với lipase Candida rugosa, cơ chất tự nhiên

là glycerol ester như tri- (TAG), di-(DAG) và monoacylglycerol (MAG),

phospholipid, cholesterol estervà galactolipid Lipase Candida rugosa thuộc nhóm

enzyme không đặc hiệu, thủy phân TAG bằng cách cắt đứt liên kết ở các vị trí bất kì [8]

1.1.5 Cơ chế xúc tác phản ứng thuỷ phân của lipase

Quá trình xúc tác của lipase là quá trình xảy ra chậm so với quá trình xúc tác của các enzyme khác như protease hay amylase và lần lượt trên từng liên kết ester Sản phẩm của quá trình thủy phân nhờ sự xúc tác bởi lipase là monoglyceride và axít béo

Enzyme lipase xúc tác chỉ xảy ra trên bề mặt phân pha giữa dầu và nước, thủy phân các liên kết ester giữa glycerol và các axít béo Khi diện tích tiếp xúc của enzyme càng nhiều thì quá trình thủy phân xảy ra càng nhanh chóng, chất tạo thành sau phản ứng sẽ là các 1,2- hoặc 2,3- diglyceride; 2-monoglyceride; 1- hoặc 3- monoglyceride và glycerol

O H 2 C

H 2 C O

O O

Hình 1.5 Sản phẩm quá trình thủy phân xúc tác bởi lipase

Theo các nghiên cứu, lipase có nhóm serin, histidin và axit aspastic ở trung tâm hoạt động của nó Với các cơ chất không tan trong nước, hoạt tính của lipase đạt được cực đại chỉ khi nó được phân tán vào giữa bề mặt phân pha dầu nước Quá trình đó được gọi là quá trình hoạt hoá phân pha

Hình 1.6 Mô hình hoạt động của lipase trên cơ chất hoà tan và không tan trong

nước Sự thay đổi hình thể của lipase trong quá trình hoạt động xúc tác Mô hình

này do Verger đề xuất (198 )

Trong đó:

E: Lipase hoà tan không hoạt động

E*: Lipase hoà tan dạng hoạt động

Es*: Lipase hoạt động có hấp phụ

Eis*: Lipase không hoạt động được hấp phụ

Sw: Cơ chất tan trong nước

S: Cơ chất không tan trong nước

E*Sw và Es*S: Phức hợp lipase- cơ chất

Khi không có mặt nước hoặc khi có nước với lượng nhỏ, phản ứng este hoá và phản ứng este được ưu tiên Trong trường hợp này, những đặc tính như tốc độ xúc tác và tính đặc hiệu phụ thuộc nhiều vào điều kiện phản ứng và bản chất cơ chất) Trung tâm hoạt động của các lipase là nhờ vào bộ ba amino acid Serine, Aspartate hoặc Glutamate và Histidine (bộ ba xúc tác)

Dựa trên kết quả chiếu X quang của enzyme lipase trước và sau khi liên kết với cơ chất, các nhà khoa học tin rằng lipase đã được kích hoạt trước khi chúng tham gia vào phản ứng biến đổi hóa sinh Trong trường hợp không có sự xuất hiện của bề mặt phân pha dầu-nước thì lipase tồn tại ở trạng thái không hoạt động và một

phần của phân tử enzyme sẽ bao phủ vị trí hoạt động Tuy nhiên khi enzyme liên kết với bề mặt phân pha của hệ thống hai pha dầu-nước một phần ngắn của cấu trúc xoắn α (phần nắp) được gấp lại để kích hoạt enzyme Nĩi một cách khác, nếu khơng

cĩ sự hiện diện của cơ chất phần nắp được đĩng lại và enzyme khơng hoạt động, khi cĩ sự hiện diện của cơ chất, giao diện dầu-nước tồn tại thì nắp được mở ra và lipase hoạt động [24]

Hình 1.7 Cấu trúc nắp của lipase Candida rugosa

O

Ser His

O

Ser His

H

H

O

R 1 Nu

R 1 Nu O

chất trung gian Acyl-Enzyme

Enz R 1

O

R 1 OH O

R 1 OR 2 O

R 1 HN-R 3 O

R 1 O-OH O ester aminolysis

hình thành peracid

chất trung gian Acyl-Enzyme

Theo Brokerhoff (1973), khi enzyme lipase này tác động lên “một siêu cơ chất”, ví dụ như bề mặt của giọt dầu thì nó được định hướng đúng cho phản ứng Vùng kị nước của enzyme liên kết với những cơ chất kị nước Còn những vùng hoạt động của enzyme thì có thể nằm gần với vùng kị nước này hoặc những vùng ưa nước cần thiết cho sự thủy giải acyl enzyme trung gian

Sự phân tích muối của lipid dẫn xuất từ glycerol-1-oleate-2,3-dipalmitate và từ 1,2-dipalmitate-3-oleate đã cho thấy 2 vị trí ngoài là 1 và 3 được phân cắt với tốc độ như nhau Do đó, enzyme lipase từ động vật là enzyme lipase đặc hiệu vị trí 1, 3 Nếu các glyceride hiện diện dưới dạng nhũ hóa thì axít béo mạch ngắn sẽ được thủy giải nhanh hơn axít béo mạch dài

1.1.6 Đặc tính của enzyme lipase

1.1.6.1 Nhiệt độ và pH hoạt động

Nhiệt độ và pH là hai yếu tố ảnh hưởng rất lớn tới hoạt tính của enzyme lipase Tùy theo nguồn gốc mà m i enzyme sẽ có nhiệt độ và pH hoạt động tối ưu là khác nhau Càng xa khoảng tối ưu thì enzyme hoạt động càng kém hay bị bất hoạt

 Nhiệt độ

Tốc độ phản ứng tăng gấp đôi khi nhiệt độ tăng lên 1 oC, nếu enzyme bền nhiệt thì khi phản ứng xảy ra ở nhiệt độ cao hiệu suất phản ứng có thể tăng lên rất nhiều Do đó, độ bền nhiệt là một tính chất mong muốn của enzyme lipase

Lipase bền nhiệt được tách chiết từ nhiều nguồn như: P.flourescens, Bacillus

sp., B.stearothermophilus, Geotrichum sp., Aeromonas sobria, B.coagulans, B.cereus và P.aeruginosa Một trong những enzyme bền với nhiệt đáng chú ý được

tách từ loài Bacillus sp., có hoạt tính tối đa ở 6 o

C và giữ được 9 hoạt tính khi ủ

15 giờ Hoạt tính của enzyme này vẫn giữ 1 hoạt tính ban đầu khi ủ ở 75o

C trong 3 phút Thời gian bán hoạt động của enzyme là 8h ở 75oC

Độ bền nhiệt của lipase có liên quan tới cấu trúc của nó, độ bền nhiệt bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như pH, sự có mặt của ion kim loại, do đó đã có nhiều thí nghiệm thực hiện gây đột biến lipase để cải thiện độ bền nhiệt So với

enzyme tự nhiên, độ bền nhiệt và hoạt động của nhiều lipase tái tổ hợp có thể đƣợc nâng cao đáng kể [25] [26] [27]

tối đa ở pH trong khoảng 7,5 – 9, và độ bền ở dải pH từ 7 đến 11 Lipase từ

Yarrowia lipolytica NRRL Y-2178 có pH tối thích ở khoảng 8 [28], lipase từ Y.lipolytica 681 có pH tối thích ở 6 và lipase từ chủng đột biến Y.lipolytica đƣợc

phân lập từ đất có pH tối thích là 7 [1 ]

Độ bền pH và pH tối ƣu là một trong những cơ sở khi chọn lipase để xúc tác phản ứng mong muốn Ví dụ nhƣ lipase có độ bền ở dải pH kiềm chính là một trong những điều kiện khi chọn loại lipase này làm phụ gia trong bột giặt

1.1.6.2 Chất hoạt hóa và chất kìm hãm

 Chất hoạt hóa

Chất hoạt hóa có tác dụng làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme Các chất hoạt hóa có bản chất hoá học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại hoặc các chất hữu cơ có cấu tạo phức tạp hơn Tuy nhiên m i chất hoạt hóa lại tác động hoạt hóa ở từng mức độ khác nhau và tùy từng loại enzyme khác nhau, có thể một chất hoạt hóa cho loại lipase từ nguồn gốc này lại không hoạt hóa lipase từ nguồn

gốc khác Ví dụ nhƣ hoạt tính enzyme lipase từ Pseudomonas aeruginosa KKA-5

giảm 2 -3 khi có sự xuất hiện của ion Na+

, K+, Cu+, tuy nhiên khi có sự xuất hiện của Ca2+ ủ trong 72h thì hoạt tính enzyme lipase lúc này tăng 56 [29] Theo Shamkant Patkar và Fredrick Bjorkling (1992), các chất hoạt động cation nhƣ các

muối amoni được đưa vào để làm tăng khả năng thu phân dầu ô liu của lipase từ

Mucor

 Chất kìm hãm

Ngược lại với chất hoạt hóa, chất kìm hãm làm giảm hoạt độ xúc tác của enzyme, hoặc trong một số trường hợp nó làm ngăn chặn sự xúc tác Cơ chế hoạt động của các chất kìm hãm này có thể được giải thích theo 2 hướng:

(1) Chất kìm hãm protein được hấp phụ lên bề mặt và gây ra sự thay đổi các tính chất của bề mặt đó

(2) Sự tác động trực tiếp của chất kìm hãm với lipase và cạnh tranh với cơ chất

Các chất kìm hãm này có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ, các phân tử protein hoặc còn có thể là chính sản phẩm thủy phân cơ chất Khi tham gia phản ứng nó có thể làm thay đổi vị trí trung tâm hoạt động của enzyme hoặc tác động vào tính chất của bề mặt phân pha dầu nước [3 ]

1.1.7 Ứng dụng của enzyme lipase

Lipase được sử dụng rộng rãi trong xử lý các chất béo và các loại dầu, sản xuất chất tẩy rửa, chế biến thực phẩm, sản xuất chất hữu cơ tổng hợp, dược phẩm, sản xuất giấy, m phẩm và dược phẩm Hầu hết các lipase vi sinh vật công nghiệp

có nguồn gốc từ nấm và vi khuẩn [4]

1.1.7.1 Trong công nghiệp thực phẩm

Hầu hết các lipase thương mại được sản xuất để phát triển hương vị trong các sản phẩm sữa và chế biến các loại thực phẩm khác như thịt, rau, trái cây, các sản phẩm từ sữa và bia

 Trong công nghiệp sữa

Lipase được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến sữa nhờ quá trình thu phân chất béo trong sữa Ngành công nghiệp chế biến sữa sử dụng lipase để thay đổi độ dài chu i axít béo nhằm tăng hương vị cho các loại phô mai, tăng tốc

quá trình ủ chín phô mai, thu phân chất béo trong bơ, cream Trong sản xuất các sản phẩm từ sữa, đặc biệt là trong phô mai mềm, các axít béo tự do mạch ngắn được tạo ra từ phản ứng thu phân chất béo sữa của lipase mang lại mùi vị đặc trưng cho sản phẩm Lipase có nguồn gốc từ tuyến tụy (trâu, bò, lợn) và dạ dày (dê, cừu, bê) giúp tăng cường hương vị cho phô mai Lipase từ dạ dày động vật đã được sử dụng

để tăng tốc độ ủ chín và tăng hương vị của nhiều loại phô mai bao gồm Cheddar, Provolone và Ras Việc kiểm soát lượng axít béo mạch ngắn (C4 đến C6) trong quá trình ủ chín là quan trọng đối với sự phát triển hương vị của phô mai Cheddar Một loạt các chế phẩm lipase từ vi sinh vật đã được phát triển để sản xuất phô

mai từ M miehei, A niger, A Oryzae… Trong một số trường hợp, lipase từ vi sinh

vật được dùng thay thế cho lipase động vật Nồng độ của chất béo trong EMC cao hơn 1 lần so với phô mai bình thường Các axít béo tự do tham gia vào các phản ứng hóa học tổng hợp các hương vị khác như aceto acetate, -ketone, flavour ester và lactone

 Trong công nghiệp dầu và chất béo

Dầu và chất béo là thành phần quan trọng trong thực phẩm Lipase có thể làm biến đổi tính chất của chất béo bằng cách thay đổi vị trí hoặc thay thế axít béo trong glyceride Bằng cách này, một chất béo rẻ tiền có thể được chuyển đổi thành một

chất béo có giá trị cao hơn Novozym435 (lipase C.antarctica) xúc tác thu phân

glyceride của các loại chất béo và dầu thương mại để sản xuất monoglyceride đã được nghiên cứu sử dụng đệm tetraamoni Hiệu suất tạo thành monoglyceride là 90% và thu phân triglyceride gần 100% Nippon Oils & Fats -Tokyo, là công ty

duy nhất hiện nay đã đưa lipase Candida rugosa vào trong sản xuất các axít béo

không no (oleic, linoleic, linolenic…) Ngoài ra việc loại bỏ các phospholipid trong dầu thực vật sử dụng phostpholipase thân thiện với môi trường đang được quan tâm nghiên cứu

 Trong những ngành công nghiệp thực phẩm khác

Lipase chủ yếu được sử dụng để tăng hương vị của sản phẩm bánh mì bằng cách tạo ra axít béo mạch ngắn Không chỉ tăng cường hương vị, nó cũng giúp kéo dài thời gian sử dụng của hầu hết các loại bánh Trong công nghiệp bánh kẹo, lipase

có tính đặc hiệu ở vị trí 1, 3 được khai thác trong sản xuất chất béo có nồng độ disteraroyl-2-monoloein cao Chất béo này có thể được sử dụng như một chất béo thay thế trong bơ ca cao, giúp ngăn ngừa hiện tượng nở hoa chất béo trong sản xuất chocolate

1,3-Lipase được sử dụng trong sản xuất các sản phẩm từ nước ép trái cây đến rau quả lên men Lipase tạo điều kiện để loại bỏ các chất béo trong thịt và cá Bổ sung lipase vào mì giúp kết cấu mì mềm hơn đáng kể mặc dù lượng cơ chất glyceride thấp

1.1.7.2 Trong công nghiệp giấy và bột giấy

Các thành phần kỵ nước của g (chủ yếu là triglyceride và sáp) gây khó khăn cho công ngành công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy Lipase được sử dụng để loại

bỏ các thành phần này trong sản xuất giấy và bột giấy Công nghiệp giấy Nippon,

Nhật Bản, đã phát triển một phương pháp sử dụng lipase Candida rugosa có thể

thủy phân đến 90% triglyceride [4]

1.1.7.3 Trong sản xuất dược phẩm và mỹ phẩm

Oleyl monooleate được sử dụng trong các loại dầu tắm, m phẩm dạng cream, dạng lotion, m phẩm trang điểm…Các ester của chất béo, ester của đường, và glyceride, các axít béo hydroxamic được tạo ra bởi ester hóa bằng lipase của hydroxyl amine và axít béo được sử dụng vào thành phần trong các loại m phẩm, sản phẩm làm sạch trong các hộ gia đình, dược phẩm… [31]

1.1.7.4 Trong công nghiệp thuộc da

Vì quá trình thuộc da cần phải loại bỏ lớp chất béo dưới da tránh chúng thủy phân gây hư hỏng và gây mùi nên việc sử dụng enzyme lipase kết hợp với một số enzyme khác như protease giúp loại bỏ toàn bộ lớp chất béo này đã thể hiện được tính năng đặc trưng ưu việt của loại enzyme này

1.1.7.5 Trong sản xuất Biodiesel

Sản xuất dầu diesel sinh học bằng enzyme lipase đã được các nhà khoa học nghiên cứu từ thập k qua mang lại giá trị cao phục vụ cho nhu cầu của loài người, không những thế lại có một ý nghĩa to lớn về khả năng thân thiện với môi trường Dầu diesel sinh học (methyl axít béo ester ethyl) có nguồn gốc từ chất béo trung tính, bằng việc sử dụng enzyme lipase thực hiện phản ứng transester hóa với methanol etanol Chi phí sản xuất giảm đáng kể khi ta sử dụng enzyme cố định [32]

1.2 PHẢN ỨNG THỦY PHÂN THU NHẬN AXÍT BÉO

Sản xuất axít béo và glycerol từ các loại dầu là đặc biệt quan trọng trong ngành công nghiệp hóa dầu Glycerol và axít béo được sử dụng rộng rãi làm nguyên liệu trong công nghiệp thực phẩm, m phẩm và dược phẩm Trước đây phương pháp được dùng để sản xuất axít béo là phương pháp vật lý và phương pháp hoá học Ngày nay, các nhà nghiên cứu đã sử dụng enzyme xúc tác thủy phân ở nhiệt độ phòng để giảm năng lượng tiêu thụ và giảm nhiệt của sản phẩm Việc sử dụng lipase cố định có lợi thế công nghệ và kinh tế vì nó có thể được tái sử dụng [33] Thu hồi omega-3 ở dạng glyceride thuận lợi về dinh dưỡng hơn so với các dạng metyl hoặc etyl este của các axít béo vì do cơ thể hấp thụ dạng glyceride tốt hơn [34] Phương pháp đơn giản và chi phí tiêu thụ năng lượng thấp

Các yếu tố chính ảnh hưởng đến tính kinh tế của quá trình sản xuất sản phẩm chứa axít béo tự do thông qua quá trình thủy phân với xúc tác enzyme lipase là nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, thời gian phản ứng và mức độ khuấy trộn Nhiệt độ của môi trường phản ứng và thời gian phản ứng được coi là quan trọng vì nó ảnh hưởng đến trạng thái oxy hóa của dịch giàu axít béo không no [34]

1.3 SƠ LƯỢC VỀ MỠ CÁ TRA

1.3.1 Cá tra

Cá tra nuôi có tên khoa học Pangasius hypophthalmus, thuộc bộ cá da trơn

Cá tra có vây lưng của các loài cá này nằm gần đầu, thông thường cao và có hình tam giác, khoảng 5-7 tia vây và 1-2 gai Vây hậu môn hơi dài, với 26-46 tia Thông thường chúng có hai cặp râu hàm trên và một cặp râu cằm, mặc dù ở cá tra dầu trưởng thành chỉ có các râu hàm trên Thân hình đặc chắc Vây béo (mỡ) nhỏ cũng tồn tại

Hình 1.9 Cá tra nuôi Pangasius hypophthalmus

Cá tra phân bố ở một số nước Đông Nam Á như Campuchia, Thái Lan, Indonesia và Việt Nam, là loại cá nuôi có giá trị dinh dưỡng cao Đồng bằng sông Cửu Long của Việt Nam đã có truyền thống nuôi cá tra và cá basa Cá tra nuôi phổ biến ở ao và bè Những năm gần đây, việc nuôi cá tra phát triển mạnh phục vụ nhu cầu tiêu thụ nội địa và xuất khẩu Đặc biệt khi chúng ta hoàn toàn chủ động về sản xuất cá giống nhân tạo thì nghề nuôi càng ổn định và phát triển vượt bậc Nuôi cá thương phẩm thâm canh cho năng suất rất cao, cá tra nuôi bè có thể đạt tới 1 -300 kg/cm3 Cá tra và cá ba sa đã trở thành đối tượng xuất khẩu với nhiều mặt hàng chế biến đa dạng, phong phú và được xuất sang hàng chục nước và vùng lãnh thổ Cá tra hiện đang có sản lượng xuất khẩu cao nhất trong các loại cá nước ngọt Trong năm 2 13, diện tích sản xuất ước đạt 5.2 ha và sản lượng cá tra xuất khẩu nuôi đã đạt 1,15 triệu tấn (Theo báo cáo Tổng cục Thủy sản)

1.3.2 Mỡ cá tra

Ở bụng cá có buồng mỡ chiếm khối lượng đáng kể so với trọng lượng cơ thể

cá Trong mỡ cá, thành phần các axít béo gần giống như ở dầu thực vật, trên 5 là axít béo không no

Mỡ cá xuất sang Trung Quốc, Hồng Kông, Đài Loan, Campuchia được dùng thay thế dầu cọ làm thức ăn chăn nuôi

Gần đây, mỡ cá tra còn được ứng dụng vào sản xuất biodiesel ở Đồng bằng sông Cửu Long với giá 14 -15 đồng kg

Như vậy mỡ cá tra là nguồn phụ phẩm rất dồi dào ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long Việc tận dụng nguồn phụ phẩm này để chế biến dầu cá tra chất lượng cao, biodiesel, thu nhận các axít béo không no hoặc tạo sản phẩm giàu các axít béo không no nhiều nối đôi có giá trị dinh dưỡng, trị bệnh và giá trị kinh tế cao hơn là vấn đề cần quan tâm ở nước ta

1.4 AXÍT BÉO KHÔNG NO CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

Axít béo không no có hoạt tính sinh học được chia thành bốn nhóm chính: omega-3 (axít alpha-linolenic, axít eicosapentaenoic và docosahexaenoic axít), omega-6 (axít arachidonic và axít linoleic), omega-7 (axít palmitoleic và axít vaccenic) và omega-9 (axít oleic và axít eruxic) Kí hiệu omega (ω) chỉ vị trí của liên kết đôi đầu tiên tính từ đuôi methyl của axít béo Hình 1.1 mô tả con đường hình thành các axít béo không no nhiều nối đôi

Hình 1.10 Con đường tổng hợp axít béo không no nhiều nối đôi [35]

Axít béo omega-3 được biết đến như một chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển bình thường trong con người và chúng có thuận lợi điều hòa nhiều bệnh

(Connor, 2 ; Covington, 2 4) Các axít béo omega 3 là những chất dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể con người nhưng cơ thể con người không thể tự tổng hợp được

và phải được bổ sung từ các nguồn bên ngoài

1.5 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THỦY PHÂN DẦU BÉO BẰNG ENZYME

LIPASE CANDIDA RUGOSA

Wanasundara và Shahidi (1998) đã nghiên cứu sản xuất axít béo omega-3 trong quy mô nhỏ từ dầu (SBO) và dầu menhaden (MHO) ở dạng acylglycerol bằng

cách sử dụng lipase của các loại vi khuẩn khác nhau bao gồm loại Aspergillus niger,

Candida rugosa, Chromobacterium viscosum, Geotrichum candidum,Mucormiehei, Pseudomonas sp, Rhizopus oryzae và Rhizopusniveus Kết quả chỉ ra rằng tất cả các

lipase đều làm tăng hàm lượng omega-3 của acylglycerols của cả hai dầu SBO và

MHO một cách hiệu quả Tuy nhiên, lipase Candida rugosa cho nồng độ omega-3

cao nhất Sau 4 giờ thủy phân, thu được 43,5 omega-3 trong SBO [9,75% axít eicosapentaenoic (EPA), 8,61% axít docosapentaenoic (DPA), và 24,0% axít docosahexaenoic (DHA)] và 44,1% trong MHO (18,5 EPA, 3,62 DPA, và tăng

17,3 DHA) Kết quả cho thấy rằng lipase của Candida rugosa là phù hợp nhất cho

việc thu nhận omega-3 từ dạng acylglycerol của dầu biển [38]

Carvalho et al (2 2) đã nghiên cứu làm giàu axít béo omega-3 trong quy mô

nhỏ bằng cách sử dụng bốn enzyme lipase khác nhau (Candida rugosa lipase,

Rhizopus delemar lipase, Aspergillus oryzae lipase và Chromobacterium viscosum)

và kết quả là Candida rugosa lipase có hiệu quả cao nhất so với các enzyme lipase

khác [39]

Okada và Morrissey (2 7) nghiên cứu thủy phân dầu cá mòi bằng enzyme để

làm giàu axít béo omega-3 trong quy mô nhỏ với Candida rugosa, Mucor javanicus

và Aspergillus niger và kết quả cho thấy Candida rugosa lipase có hiệu quả hơn so

với các enzyme lipase khác [40]

Sun et al (2 2) đã nghiên cứu thủy phân bằng enzyme Candida rugosa và

Pseudomonas cepacia để làm giàu omega-3 hiệu quả nhất [41]

Mbatia et al (2 1 ) nghiên cứu làm giàu axít béo omega-3 bằng enzyme (quy

mô nhỏ) từ dầu nội tạng cá rô sông Nile và thấy rằng nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của lipase dẫn đến ảnh hưởng đến việc làm giàu omega-3 Mức độ làm giàu cao hơn gây tổn thất EPA và DHA nhiều hơn Chen và Ju (2 ) nói rằng việc sử dụng enzyme cố định tiết kiệm thời gian và tránh được quá trình oxy hóa PUFA [42]

N.A Serri và cộng sự (2008) nghiên cứu thủy phân dầu cám để sản xuất axít béo tự do và glycerol với các thông số như thời gian, nhiệt độ, pH và tốc độ khuấy Quá trình thu phân tối ưu với thời gian 90 phút, nhiệt độ 45°C, pH 7,5 và tốc độ khuấy 200 vòng/phút [1]

Kriti bhandari và cộng sự (2013) nghiên cứu sản xuất các axít béo có DHA

bằng cách thủy phân dầu cá ngừ sử dụng lipase Candida rugosa Quá trình thủy

phân dầu cá theo nghiên cứu này tối ưu tại nhiệt độ 35ºC, pH 7, tỉ lệ dầu nước là 1:1 (w v) và tỉ lệ dầu dung môi là 1:1 (w v) [43]

Một nghiên cứu của Kamol Tangkam và cộng sự (2 8) về khả năng xúc tác

của các enzyme lipase Candida rugosa trên dầu dừa tinh khiết ở 4 ºC, tỉ lệ

dầu nước là 1:1, tỉ lệ enzyme dầu là 3 (w w) cho kết quả thủy phân đạt 6 -70% sau 2 giờ [44]

Yuji Shimada và cộng sự (1998) nghiên cứu của về sản xuất γ -linolenic axít

(GLA) bằng thủy phân dầu cây lưu ly bởi enzyme lipase Candida rugosa trên 2 yếu

tố ảnh hưởng là thời gian và nồng độ enzyme cơ chất Nghiên cứu được thực hiện ở

35oC với thời gian là 15 giờ cho kết quả như sau: với nồng độ enzyme là 1 U g mẫu thì cho mức độ thủy phân là cao nhất với 8 với thời gian là 15h và sau 8h phản ứng thì mức độ thủy phân tăng không đáng kể, trong khi đó hàm lượng GLA sinh ra là 45 với nồng độ enzyme là 2 U g mẫu trong 4h và không tăng thêm khi tăng nồng độ enzyme và thời gian phản ứng [45]

Tomoko Okada và cộng sự (2 7) đã nghiên cứu sử dụng lipase xúc tác thủy phân dầu chiết xuất từ cá mòi Thái Bình Dương để sản xuất axít béo omega-3

Lipase vi sinh vật thương mại có sẵn là Candida rugosa, Mucor javanicus, và

Aspergillus niger đã được sử dụng cho thủy phân dầu cá mòi ở 37oC khuấy từ liên tục trong 1,5 - 3 - 6 - 9 giờ Dầu cá mòi được thủy phân nhanh chóng trong 1,5 giờ đầu tiên Sau đó, quá trình thủy phân chỉ tăng ít trong suốt khoảng thời gian 3, 6 và

9 giờ Phân tích thành phần axít béo bằng sắc ký khí cho thấy dầu cá mòi trước khi

thủy phân chứa 26,86 EPA và 13,62 DHA (w w ) Lipase Candida rugosa là hiệu quả nhất trong sản xuất axít béo omega-3 Với lượng lipase Candida rugosa sử

dụng 25 U mg dầu, sau 1,5 giờ phản ứng, hàm lượng EPA tăng lên đáng kể đạt 33,74% và duy trì ở mức tương đối ổn định sau 3, 6 và 9 giờ (33,45 ; 34,45 và

33,17 ) Với lượng lipase Candida rugosa sử dụng 5 U mg dầu cho kết quả

tương tự Sau 1,5 giờ phản ứng, hàm lượng DHA cũng tăng đáng kể đạt 23,12 với

Candida rugosa 25 U mg dầu và đạt 23,78 với lượng lipase Candida rugosa sử

dụng 5 U mg dầu Nồng độ DHA không có sự khác biệt đáng kể sau 1,5 giờ và thời gian phản ứng lâu hơn [46]

Xiao Yan Wu và cộng sự (1996) nghiên cứu hoạt tính thu phân của enzyme

lipase Candida rugosa, Porcine pancreas, Aspergillus niger, Pseudomonas

fluorescens, Chromobacterium viscosum, Rhizomucor miehei trên nhũ dầu ô liu

5 , nhiệt độ 37°C, pH 7 trong 3 phút đạt được kết quả như sau: lipase Candida

rugosa có hoạt tính cao nhất (88 U mg enzyme), lipase Porcine pancreas thể hiện

hoạt tính thấp nhất (1,5 U mg enzyme) [47]

L.L.You và cộng sự (2 6) nghiên cứu những ảnh hưởng của quá trình thủy

phân dầu cọ thô bằng lipase Candida rugosa trên hàm lượng nước, nhiệt độ phản

ứng và nồng độ enzyme thủy phân Các điều kiện tối ưu trong quá trình thủy phân dầu cọ thô thu được ở nhiệt độ 5 oC, nồng độ enzyme lipase C rugosa 1% (w/w)

và hàm lượng nước 5 (w w) [48]

Như vậy, việc nghiên cứu thu nhận các axít béo và làm giàu omega-3 từ nguồn dầu mỡ thiên nhiên bằng phản ứng thủy phân với xúc tác enzyme đang thu hút sự quan tâm lớn trên thế giới

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM

2.1.1 Nguyên vật liệu

 Chế phẩm enzyme lipase Candida rugosa

Enzyme lipase Candida rugosa (L1754, type VII) là chế phẩm dạng bột thu từ

loài nấm men cùng tên của hãng Sigma (M ) cung cấp

Chế phẩm có hoạt tính riêng là 1135 U mg bột rắn (sử dụng trên cơ chất là dầu

ô liu) ở pH 7,2, nhiệt độ 37oC

 Mỡ cá tra

Mỡ cá tra được thu nhận từ Công ty chế biến thủy sản Thuận An, An Giang

Mỡ cá tra được rửa sạch và bảo quản lạnh đông ở -18 oC

 Dầu ô liu

Dầu ô liu được sản xuất tại Tây Ban Nha và nhập khẩu bởi công ty TNHH Dầu thực vật Cái Lân (VN) Sản phẩm có: Độ acid: < ,8 , chất béo bão hoà 15g, chất béo không bão hòa: 84,9g

Bảng 2.1 Thành phần axít béo trong dầu ô liu

Các chất béo no

Axít palmitic 7,5-20 Axít stearic 0,5-5 Axít arachidic <0,6 Axít behenic <0,3 Axít myristic <0,05 Axít lignoceric <0,2

Chất béo không no

Axít oleic acid 55-83 Axít palmitoleic 0,3-3,5 Axít linoleic 3,5-21 Axít linolenic <1

2.1.2 Hóa chất sử dụng

- Protein chuẩn bovine serum albumin (BSA)

- Comasie blue G-25

- CHCl3, H3PO4, H2SO4, CH3COOH, Na2S2O3 0,01N, NaOH, NaH2PO4.2H2O,

Na2HPO4.12H2O, NH3, Ethanol 96o, ethanol tuyệt đối, diethyl ether, n – hexan,

KI bão hòa, hồ tinh bột 1 , phenolphatalein

2.1.3 Thiết bị

Máy đo quang phổ UV-VIS G-2 , máy đo pH, máy khuấy từ có gia nhiệt (Heidolph MRHei-Standard), bể điều nhiệt, máy đồng hóa, tủ lạnh, tủ sấy, hệ thống sắc ký GC FID, thiết bị cô quay Buchi, microburet có vạch chia độ nhỏ nhất là , 1

mL với thể tích tối đa là 2 mL và một số thiết bị thông thường khác

Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu

Phân tách sản phẩm thủy phân và xác định tính chất và thành phẩn của sản phẩm

Thu nhận dầu cá tra từ

cá tra bằng LCR

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Ảnh hưởng của

pH

Ảnh hưởng của thời gian thủy phân

Hàm lượng protein trong enzyme

Hoạt tính riêng của LCR

2.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM

2.3.1 Thu nhận dầu cá tra từ mỡ cá tra

Mỡ cá được bảo quản lạnh ở -18oC Mỡ cá sau khi được rã đông được rửa sạch với nước, xay nhỏ Sau khi xay, tiến hành gia nhiệt gián tiếp mỡ cá ở 8 oC, thu nhận phần tan chảy, lọc để bỏ cặn Rửa dầu cá thu được bằng dung dịch nước muối

1 (NaCl 1 ) Lắng tách nước được dầu cá tra sạch Bảo quản dầu cá tra thu được ở nhiệt độ 4-6o

C

Hình 2.2 Quy trình thu nhận dầu cá tra từ mỡ cá tra

Dung dịch nước muối 1

2.3.2 Khảo sát nguyên liệu dầu cá tra

 Mục đích:

Khả năng thủy phân của enzyme lipase không chỉ chịu ảnh hưởng bởi loại enzyme mà còn chịu ảnh hưởng rất lớn từ nguồn cơ chất Dầu thô hay dầu tinh luyện, thành phần chủ yếu là axít béo no hay không no, mạch carbon trung bình hay dài, hàm lượng tạp chất vô cơ nhiều hay ít đều ảnh hưởng đến mức độ thủy phân Vì vậy khảo sát nguyên liệu là điều hết sức cần thiết nhằm kiểm soát được tình hình

thủy phân của enzyme lipase Candida rugosa đối với mỡ cá tra Các tính chất được

khảo sát trong luận văn gồm: thành phần và hàm lượng axít béo, chỉ số axit, chỉ số peroxyt, hàm lượng tạp chất vô cơ (độ tro), hàm lượng béo tổng và hàm lượng chất khô

2.3.3 Khảo sát tính chất enzyme lipase Candida rugosa

2.3.3.1 Xác định hàm lượng protein- phương pháp Bradford – phụ lục 6

2.3.3.2 Xác định hoạt tính enzyme-phương pháp chuẩn độ acid-base – phụ lục 7