ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN THỊ NHƯ HẰNG XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ BẢN CHẤT HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ HOẠT CHẤT TỪ NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY KHỔ SÂM Croto
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
TRẦN THỊ NHƯ HẰNG
XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ BẢN CHẤT HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ HOẠT CHẤT
TỪ NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY KHỔ SÂM
(Croton tonkinensis Gagnep.)
VÀ CÂY BÙM BỤP (Mallotus apelta Lour.)
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
HÀ NỘI- 2010
Trang 2ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
TRẦN THỊ NHƯ HẰNG
XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ BẢN CHẤT
HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ HOẠT CHẤT
TỪ NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY KHỔ SÂM
(Croton tonkinensis Gagnep.)
VÀ CÂY BÙM BỤP (Mallotus apelta Lour.)
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số : 62.42.40.01
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1 PGS.TS LÊ MAI HƯƠNG
2 PGS.TS NGÔ TỰ THÀNH
HÀ NỘI – 2010
Trang 3iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ix
DANH MỤC CÁC BẢNG xi
DANH MỤC CÁC HÌNH xiii
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Đại cương về các cơ thể nội sinh thực vật (CTNS) và nấm nội sinh thực vật (NNS) 3
1.2 Sinh học và sinh thái học của NNS 5
1.2.1 Quan hệ của NNS với cây chủ của chúng 5
1.2.2 NNS bảo vệ cây chống các tác nhân có hại 14
1.2.2.1 Bảo vệ cây chủ chống côn trùng hại cây 14
1.2.2.2 Bảo vệ cây chủ trước những điều kiện môi trường bất lợi 20
1.2.3 Đa dạng sinh học của NNS 21
1.2.4 NNS trong các cây nhiệt đới 23
1.3 Các chất có hoạt tính sinh học từ nấm nội sinh 25
1.3.1 Đại cương 25
1.3.2 Các chất kháng vi sinh vật 26
1.3.3 Các chất gây độc tế bào ung thư 27
1.3.3.1 Taxol 27
1.3.3.2 Các xanton 29
1.3.3.3 Các chất từ Penicillium sp nội sinh ở cây Hopea hainanensis 29
Trang 4iv
1.3.3.4 Các chất từ nấm Stemphylium globuliferum nội sinh ở cây thuốc
Mentha pulegium 29
1.3.3.5 Các chất từ nấm Ampelomyces sp nội sinh ở cây thuốc Urospermum picroides 30
1.3.4 Các chất chống oxy hóa 30
1.3.5 Các chất kháng kí sinh trùng 31
1.3.6 Các chất ức chế miễn dịch 33
1.3.7 Các chất chữa bệnh tiểu đường 33
1.3.8 Các độc tố 34
1.3.9 Các enzym thủy phân ngoại bào 36
1.3.9.1 Đại cương 36
1.3.9.2 Mối liên quan giữa enzym với vai trò của nấm nội sinh trong cây chủ 37
1.4 Nấm nội sinh trên cây thuốc 38
1.5 Các nghiên cứu nấm nội sinh ở Việt Nam 40
1.6 Giới thiệu chi Trichoderma 41
1.6.1 Đại cương 41
1.6.2 Sinh học và ứng dụng của Trichoderma 41
1.6.3 Phân bố địa lý của Trichoderma 43
1.7 Giới thiệu hai cây thuốc 44
1.7.1 Khổ sâm - Croton tonkinensis Gagnep - họ Euphorbiaceae 44
1.7.2 Bùm bụp - Mallotus apelta Lour - họ Euphorbiaceae 46
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 48
2.1 Vật liệu 48
Trang 5v
2.1.1 Mẫu cây 48
2.1.2 Vi sinh vật kiểm định 49
2.1.3 Các dòng tế bào 49
2.1.4 Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 49
2.2 Môi trường 50
2.2.1 Môi trường phân lập nấm nội sinh 50
2.2.2 Môi trường nuôi và giữ các chủng nấm nội sinh 50
2.2.3 Các môi trường thử hoạt tính enzym 51
2.2.4 Môi trường nuôi VSVKĐ và tế bào 52
2.3 Phương pháp 52
2.3.1 Phân lập NNS từ mẫu cây 52
2.3.2 Phân loại nấm bằng phương pháp hình thái học 53
2.3.3 Phân loại nấm bằng phương pháp sinh học phân tử 53
2.3.4 Thu nhận cặn chiết từ dịch lên men của các chủng NNS 54
2.3.5 Tách các chất từ cặn chiết của dịch lên men chủng Trichoderma konilangbra KS14 55
2.3.6 Xác định cấu trúc các hợp chất tách được 56
2.3.7 Xác định các hoạt tính sinh học của các chủng NNS 57
2.3.7.1 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật 57
2.3.7.2 Xác định hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư 59
2.3.7.3 Xác định hoạt tính chống oxy hoá 61
2.3.7.4 Xác định hoạt tính các enzym ngoại bào 63
2.3.8 Khảo sát tác dụng của các chế phẩm Trichoderma konilangbra KS14 63
đối với cây khổ sâm 63
Trang 6vi
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 65
3.1 Phân lập nấm nội sinh từ cây thuốc 65
3.1.1 Các chủng nấm nội sinh từ cây khổ sâm 65
3.1.2 Các chủng nấm nội sinh từ cây bùm bụp 66
3.2 Sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật của các chủng NNS phân lập được 68
3.3 Phân loại các chủng nấm nội sinh bằng phương pháp hình thái và bằng phương pháp sinh học phân tử 73
3.3.1 Phân loại các chủng NNS bằng phương pháp hình thái 73
3.3.1.1 Chủng KS6 73
3.3.1.2 Chủng MB8 74
3.3.1.3 Chủng KS14 75
3.3.1.4 Chủng KS15 76
3.3.1.5 Chủng KS17 77
3.3.1.6 Chủng KS18 77
3.3.1.7 Chủng KS19 78
3.3.1.8 Chủng MR2 79
3.3.1.9 Chủng KS24 80
3.3.1.10 Chủng KS33 81
3.3.2 Phân loại chủng nấm nội sinh KS14 bằng phương pháp sinh học phân tử…… 85
3.4 Hoạt tính sinh học của cặn chiết và của dịch lên men các chủng nấm nội sinh đã được lựa chọn 87
3.4.1 Hoạt tính kháng VSV của các cặn chiết etylaxetat 87 3.4.2 Hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư của các cặn chiết etylaxetat 90
Trang 7vii
3.4.3 Hoạt tính chống oxy hoá của các cặn chiết etylaxetat 92
3.4.4 Hoạt tính enzym ngoại bào của dịch nuôi các chủng nấm lựa chọn 93
3.5 Tìm hiểu các điều kiện nuôi thích hợp cho hoạt tính kháng VSV của chủng nấm T konilangbra KS14 96
3.5.1 Ảnh hưởng của môi trường lên men 96
3.5.2 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi 97
3.5.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi 99
3.5.4 Ảnh hưởng của nguồn cácbon và nguồn nitơ 100
3.6 Bản chất hóa học của các hợp chất tách được từ dịch lên men của chủng NNS T konilangbra KS14 103
3.6.1 Hợp chất KS14-1 103
3.6.2 Hợp chất KS14-2 105
3.6.3 Hợp chất KS14-3 107
3.6.4 Hợp chất KS14-4 109
3.6.5 Hợp chất KS14-5 111
3.7 Hoạt tính sinh học của các hợp chất tách được từ chủng T konilangbra KS14 113
3.7.1 Hoạt tính kháng VSV 113
3.7.2 Hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư 115
3.7.3 Hoạt tính chống oxy hoá 116
3.7.4 So sánh hoạt tính của sorbixilin và ergosterol peroxit với ent-7β-hydroxy-18-axetoxy-kaur-16-en-15-on 117
3.8 Tác dụng của chế phẩm T konilangbra KS14 đối với cây khổ sâm 120
KẾT LUẬN 124
KIẾN NGHỊ 126
Trang 8viii
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 127 TÀI LIỆU THAM KHẢO 129 PHỤ LỤC