Nghiên cứu quy trình chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học từ lá cây Lá đắng (Vernonia Amygdalina Del.) và thử hoạt tính ức chế enzym αglucosidase in vitro

Tổng quan về cây lá đắng, quy trình chiết xuất tối ưu các loại cao chiết. Đánh giá và so sánh các hoạt tính sinh học trong các cao chiết của lá cây Lá đắng. Ứng dụng quy trình để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo và nâng cao giá trị sử dụng trong lĩnh vực thực thẩm chức năng và định hướng trong dược phẩm.

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc -

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2016 - 2017

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CÁC CHẤT

CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ CÂY LÁ ĐẮNG

(VERNONIA AMYGGDALINA DEL.)

VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG α- GLUCOSIDASE IN VITRO

Số hợp đồng: 2017.01.26/HĐ-KHCN

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Chi

Đơn vị công tác: Khoa Dược

Thời gian thực hiện: 09 tháng

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

-

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 201 -201

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CÁC CHẤT

CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ CÂY LÁ ĐẮNG

(VERNONIA AMYGGDALINA DEL.)

VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG α -GLUCOSIDASE IN VITRO

Số hợp đồng : 2017.01.26/HĐ-KHCN

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Chi

Đơn vị công tác: Khoa Dược

Thời gian thực hiện: 09 tháng

Các thành viên phối hợp và cộng tác:

i

MỤC LỤC

MỤC LỤC i, ii

DANH MỤC HÌNH iii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC PHỤ LỤC vi

TÓM TẮT KẾT QUẢ……… …vii

LỜI MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tìm hiểu về cây Lá đắng 2

1.2 Thành phần hóa học 4

1.3 Hoạt tính sinh học 13

1.3.1 Kháng khuẩn 13

1.3.2 Tiểu đường 15

1.3.3 Kháng oxy hóa 15

1.3.4 Chống ung thư 16

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Mục tiêu nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu 18

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Xử lý nguyên liệu 19

2.3.2 Phương pháp đo độ ẩm 19

2.3.3 Chiết cao tổng và cao phân đoạn 20

2.3.4 Khảo sát sơ bộ thực vật 22

2.3.6 Khảo sát điều kiện chiết 27

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29

3.1 Đánh giá nguyên liệu 29

3.2 Chiết cao 29

3.2.1 Chiết cao tổng ethanol 29

3.2.2 Chiết cao tổng nước 29

3.2.3 Chiết cao phân đoạn 30

3.3 Khảo sát sơ bộ thực vật 30

3.4 Khảo sát hoạt tính sinh học 31

3.4.1 Khả năng kháng oxy hóa DPPH 31

3.4.2 Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase 32

3.4.3 Khả năng kháng viêm 33

3.5 Khảo sát điều kiện chiết 34

3.5.1 Khảo sát yếu tố dung môi 34

3.5.2 Khảo sát yếu tố nhiệt độ 35

3.5.3 Khảo sát yếu tố tỉ lệ lỏng rắn 36

3.5.4 Khảo sát yếu tố thời gian 37

3.5.5 Khảo sát yếu tố số lần chiết 38

3.5.6 Khảo sát hoạt tính sinh học cao tối ưu 39

3.6 Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của cao dichloromethane 42

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

iii

Hình 1.2: Luteolin và luteolin 7-O-β-glucoside 7

Hình 1.3: Sesquiterpene lactones phân lập từ V amygdalina 10

Hình 1.4: Các vernonioside được phân lập từ cây lá cây Lá đắng 12

Hình 2.1: Tóm tắt nội dung nghiên cứu 19

Hình 2.2: Quy trình chiết phân đoạn 21

Hình 2.3: Phản ứng của gốc tự do DPPH và chất chống oxy hóa 23

Hình 2.4: Quy trình đánh giá khả năng kháng oxy hóa DPPH 24

Hình 2.5: Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase 26

Hình 3.1: Bột lá cây Lá đắng 29

Hình 3.2: So sánh IC50 của các mẫu cao và vitamin C 31

Hình 3.3 : So sánh I% ức chế enzyme α-glucosidase của các mẫu cao 33

Hình 3.4: So sánh IC20 của các mẫu cao 34

Hình 3.5: So sánh I% ức chế enzyme α-glucosidase của các mẫu cao theo dung môi 35 Hình 3.6: So sánh I% ức chế enzyme α-glucosidase của các mẫu cao theo nhiệt độ 36

Hình 3.7: So sánh I% ức chế enzyme α-glucosidase của các mẫu cao theo tỉ lệ rắn – lỏng 37

Hình 3.8: So sánh I% ức chế enzyme α-glucosidase của các mẫu cao theo thời gian 38

Hình 3.9: So sánh I% ức chế enzyme α-glucosidase của các mẫu cao theo số lần chiết 39

Hình 3.10: Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của cao tối ưu 40

Hình 3.11: Khả năng kháng oxy hóa DPPH của cao tối ưu 40

Hình 3.12: Khả năng kháng viêm của cao tối ưu 41

Hình 3.13: Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của các phân đoạn 43

Bảng 1.1: Flavonoid có trong cây 5

Bảng 1.2: Diterpenoid lactone trong cây 7

Bảng 1.3: Các vernonioside phân lập bằng HPLC 11

Bảng 1.4: Các hợp chất có trong lá cây Lá đắng 12

Bảng 3.1: Kết quả lượng cao tổng ethanol thu được 29

Bảng 3.2: Kết quả chiết cao phân đoạn 30

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát thực vật sơ bộ 30

Bảng 3.4: Sơ bộ thực vật của các cao phân đoạn 32

Bảng 3.5: Giá trị IC50, IC20 của cao tối ưu và cao tổng EtOH, nước 41

Bảng 3.6: Các phân đoạn của cao dichloromethane sau khi chạy cột 42

Phụ lục 1: Hoạt tính kháng DPPH của cao EtOH tổng 47

Phụ lục 2: Hoạt tính kháng DPPH của cao Hexane 47

Phụ lục 3: Hoạt tính kháng DPPH của cao DCM 47

Phụ lục 4: Hoạt tính kháng oxy hóa DPPH của cao EtOAc 48

Phụ lục 5: Hoạt tính kháng oxy hóa DPPH của cao n-Butanol 48

Phụ lục 6: Hoạt tính kháng oxy hóa DPPH của cao phân đoạn nước 48

Phụ lục 7: Hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng nước 49

Phụ lục 8: Hoạt tính kháng oxy hóa của vitamin C 49

Phụ lục 9: Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của các cao 50

Phụ lục 10: Khả năng kháng viêm của cao tổng EtOH 50

Phụ lục 11: Khả năng kháng viêm của cao DCM 50

Phụ lục 12: Khả năng kháng viêm của cao EtOAc 51

Phụ lục 13: Khả năng kháng viêm của cao BuOH 51

Phụ lục 14: Khả năng kháng viêm của cao phân đoạn nước 51

Phụ lục 15: Khả năng kháng viêm của cao tổng nước 52

Phụ lục 16: Khảo sát yếu tố dung môi (1) 52

Phụ lục 17: Khảo sát yếu tố dung môi (2) 52

Phụ lục 18: Khảo sát yếu tố nhiệt độ 53

Phụ lục 19: Khảo sát yếu tố tỉ lệ rắn – lỏng 53

Phụ lục 20: Khảo sát yếu tố thời gian 54

Phụ lục 21: Khảo sát yếu tố số lần chiết 54

Phụ lục 22: Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của cao tối ưu 55

Phụ lục 23: Khả năng kháng oxy hóa DPPH của cao tối ưu 55

Phụ lục 24: Khả năng kháng viêm của cao tối ưu 56

Phụ lục 25: Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của các phân đoạn 56

vii

1 Lá dược liệu khô đạt độ ẩm: 9,2% Lá dược liệu khô độ ẩm: < 12%

2 Cao tổng ethanol: 43,6 g Cao tổng ethanol 20 g

Hoạt tính kháng oxy hóa theo phương pháp DPPH:

Cao dichloromethane hoạt tính cao nhất IC50: 176,7

µg/mL

5

Hoạt tính ức chế enym α-glucosidase: Cao phân

đoạn dichloromethane có khả năng ức chế cao nhất:

I% = 94,3%

Giá trị IC50 của cao tổng và cao thành phần

6

Hoạt tính kháng viêm: Cao phân đoạn

dichloromethane có hoạt tính cao nhât IC20 = 74

µg/mL

7

Phân lập được 7 phân đoạn từ cao dichloromethane

và thử hoạt tính ức chế enym α-glucosidase, trong

đó phân đoạn F2 có khả năng ức chế cao nhất ( ở

Cao tối ưu:

+ Hoạt tính kháng oxy hóa: IC50 = 51,9 µg/mL

+ Hoạt tính kháng viêm: IC20 = 164 µg/mL

+ Hoạt tính ức chế enym α-glucosidase: IC50 = 480

µg/mL

Thời gian đăng kí: Từ tháng 4/2017 đến tháng 1/2018

Ngày nộp báo cáo: 18/01/2018

Nước ta có điều kiện khí hậu thuận lợi, đất đai màu mỡ là điều kiện để phát triển

hệ thực vật phong phú, đa dạng Bên cạnh các thuốc hóa dược, đây là nguồn dược liệu quý giá có giá trị sử dụng cao và giá trị kinh tế to lớn

Từ lâu, con người đã biết tận dụng nguồn dược liệu quý giá từ thiên nhiên Các bài thuốc cổ truyền được bào chế từ các loại thảo mộc khác nhau đã được truyền lại qua các thời kỳ Ngày nay, các nhà khoa học đang nỗ lực tách chiết, phân lập các hoạt chất trong cây cỏ tự nhiên, đồng thời tiến đến việc nghiên cứu tổng hợp và tìm cách sản xuất đại trà để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao về dược phẩm cho việc bảo vệ sức khỏe của người dân

Lá đắng là một loài cây dân dã, mọc ở nhiều nơi trên Thế Giới, đặc biệt là châu Phi và các nước Đông Nam Á Ở Việt Nam, Lá đắng được trồng nhiều ở các tỉnh Tây Nguyên, Trung Bộ, Nam Bộ như Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông và Lâm Đồng, Quảng Nam, Bình Phước, Bình Dương, Đồng Nai, Tây Ninh, Bà Rịa-Vũng Tàu, Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Cần Thơ, Y học dân gian các nước đã dùng Lá đắng để trị các bệnh đường tiêu hóa, sốt, cảm cúm, tiểu đường, sốt rét, giun sán, đau lưng, đau thần kinh do phong thấp, cao huyết áp, viêm họng, viêm phổi, viêm amidan… Ngày nay, Lá đắng được biết đến với khả năng kháng viêm, kháng oxy hóa cao, trị bệnh tiểu đường và chống ung thư tốt thông qua một số công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên Thế Giới

Ở Việt Nam, hiện nay vẫn chưa có công trình nghiên cứu hoàn chỉnh nào về hoạt tính sinh học của cây Lá đắng Vì thế, đó là một điều đáng tiếc nếu chúng ta bỏ qua một nguồn dược liệu thiên nhiên sẵn có và nhiều tiềm năng như vậy Đó là lý do tôi chọn đề

tài “Nghiên cứu quy trình chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học từ lá cây Lá đắng (Vernonia Amygdalina Del.) và thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase in vitro” được

trồng tại Đăk Lăk” với những mục tiêu:

- Xây dựng quy trình chiết xuất tối ưu các loại cao chiết

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tìm hiểu về cây Lá đắng

Loài này được Delile miêu tả khoa học lần đầu vào năm 1826, có tên Tiếng Anh

là Bitter Leaf hay Vernonia Tree Dân gian thường gọi là cây Lá đắng do vị đắng của

nó, hay cây mật gấu miền Nam

Phân bố

Là cây bụi mọc nhiều ở châu Phi, châu Á, vùng có khí hậu nhiệt đới như Nam Phi, Nigeria, Cộng hòa Trung Phi, Congo, Angola, Ethiopia, Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc, Việt Nam Cây có nguồn gốc từ châu Phi, di thực đến nước ta qua các nước châu Á Ở nước ta, Lá đắng được trồng nhiều ở các tỉnh Tây Nguyên, Trung Bộ, Nam Bộ như Quảng Nam, Bình Phước, Bình Dương, Đồng Nai, Tây Ninh, Bà Rịa-Vũng Tàu, Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Cần Thơ, Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông và Lâm Đồng

Mô tả khoa học

Là loại cây bụi rậm, mọc thẳng đứng, sống nhiều năm, phần gốc phân nhánh, trên

nhánh thông thường không phân chia thành các cành con, cành khi còn non có bì không

rõ rệt, phủ một lớp lông mềm mịn ngắn màu trắng, về sau lớp lông này dần rụng hết, thân cây cứng, chi nhánh giòn, có màu xanh, cây có thể cao tới 4 m

Lá hình mũi mác, thuôn dài, màu xanh đậm vừa, đỉnh và đáy lá thon, diện tích có thể lên tới 28×10 cm, nhưng thường là 10-15×4-5 cm, mặt trên lá có lông thưa thớt, mặt dưới lá lông mềm, nhạt và nhiều, mép lá có răng thưa rất nhỏ, có khi gần như liền mạch, cuống lá ngắn

Hoa: cụm hoa hình rổ, đường kính 3 – 5 mm, tụ thành cụm nơi đầu cành, hoa màu trắng cho đến trắng phấn nhạt, đôi khi có cả màu tím hoặc phớt tím, hồng phớt hoặc hồng phấn, cuống hoa mảnh, dài khoảng 10 mm, có lông mềm ngắn màu trắng, có mùi thơm ngọt ngào, đặc biệt vào buổi tối Hoa lưỡng tính Cây nở hoa giữa tháng 12- tháng

3 và tháng 7, tháng 8

Hình 1.1: Lá, hoa và cây lá đắng

Mùa thu hoạch

Vào mùa mưa, người ta thu hoạch bằng cách cắt chồi lá để cây ra chồi mới, chồi mới ra sẽ được thu hoạch vài tuần sau đó Vào mùa nắng, chỉ lá được thu hoạch

Công dụng dân gian

Trong y học dân gian của nhiều nước, cây Lá đắng được sử dụng để trị các loại bệnh khác nhau: [1]

Người Nigeria dùng Lá đắng để nấu soup Ngoài ra lá và rễ được dùng để trị đau bụng, rối loạn tiêu hóa, vệ sinh răng miệng, ngứa, nhiễm ký sinh trùng, nấm ngoài da, sốt thương hàn, đau đầu, tiểu đường, táo bón, trĩ

- Ở Trung Quốc người ta cho rằng lá cây này có vị đắng, tính hàn, có công dụng

buốt, đau mắt đỏ, cao huyết áp, đái tháo đường, mỡ máu cao

- Người dân nhiều nước ở Đông Nam Á còn sử dụng thường xuyên lá cây này

để trị liệu nhiều loại ung thư như: ung thư vú, ung thư hầu họng, ung thư tiền

liệt tuyến, ung thư phổi, ung thư kết tràng

- Nam Phi: Lấy bộ phận rễ để chữa rối loạn kinh nguyệt và hiếm muộn

- Ấn Độ: Dùng lá cây để chữa tiểu đường Họ dùng cành và rễ hỗ trợ điều trị sốt, cảm cúm, ho khan

- Tại Congo: Lấy lá và vỏ rễ chữa bệnh kiết lỵ, viêm loét dạ dày, nhiễm giun, sốt rét

- Khu vực Tây Phi: Lá cây Lá đắng giúp lợi tiểu, chữa tiểu đường, táo bón, nhiễm trùng da

- Ethiopia: dùng lá để trị các bệnh rối loạn dạ dày, vết thương ở da, tiêu chảy, ghẻ, viêm gan, viêm amiđan, sốt, sán dây và nhiễm giun

- Người Cameroon dùng lá ngâm uống mỗi ngày để trị sốt rét và các bệnh đường ruột

- Ở Uganda: lá và rễ dùng để trị co giật, ho, đau tử cung, gây co tử cung, chảy máu sau sinh, nạo phá thai, kinh nguyệt không đều, vô sinh, đau bụng nhiễm trùng do vi khuẩn và nấm

1.2 Thành phần hóa học

Theo như các nghiên cứu trước đây, trong cây Lá đắng có chứa các chất như alkaloid, flavonoid, sesquitertene, tannin, saponin, terpene, steroid, coumarin, phenolic acid, lignan, xanthone, anthraquinone, edotide

Theo như kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả trường Đại học Calabar, trong dịch chiết thân và rễ của cây Lá đắng ước tính có chứa saponin (13.21±21 và 28.52±0.03 %), flavonoid (1.02±0.04 và 0.51±0.05 %), alkaloid (7.02±0.04 và 6.11±0.02 %) hydrocyanic acid (3.41±0.02 và 1.18±0.05 %) Phân tích nồng độ vitamins có trong dịch chiết thân và rễ là: vitamins A (21.5±0.35 và 30.90±0.20 IU/100 g), C (49.00±4.4 và 10.30±2.5 mg/ 100 g) và E (106.20 ±1.90 và 35.83±1.90 IU/100 g), thiamin (0.50±0.00

và 0.37±0.00 mg/100 g) và niacin (0.03±0.005 và 0.05±0.002 mg/100 g) Các yếu tố khoáng chất như selen, đồng, crom, kẽm và sắt cũng có mặt với số lượng nhỏ [2]

Flavonoids

Các flavonoids đã được tìm thấy trong cây Lá đắng là:

Bảng 1.1: Flavonoid có trong cây [3]

H 3 CO

Flavone-1’, 2’-methylether Flavone O

O MeO

H 3 CO

OCH3

Nhóm các tác giả của trường đại học Ibadan, Nigeria nghiên cứu dịch chiết cây Lá đắng được thu hái ở khu vực Ibadan, Nigeria đã định tính được 3 flavones là luteolin,

luteolin 7-O-β-glucuronoside và luteolin 7-O-β-glucoside 600 g bột dược liệu được

chiết với 3-4 L hệ dung môi methanol:nước (3:7), cao chiết được phân lập bằng sắc kí cột LiChroprep RP18 thu được 3 phân đoạn: phân đoạn 1 MeOH:nước (3:7), phân đoạn

2 MeOH: nước (4:6), phân đoạn 3 MeOH: nước (5:5) Phân đoạn 1 tiếp tục thực hiện sắc kí cột LiChroprep RP18 thu được phân đoạn 1A, 1A trích ly với EtOAc, phân đoạn EtOAc tiếp tục chạy sắc kí cột Polyamide, sau đó kết tinh lại trong MeOH thu được 240

mg luteolin 7-O-β-glucuronoside Phân đoạn 2 tiếp tục thực hiện sắc kí cột LiChroprep

RP18 thu được phân đoạn 2A, 2A tiếp tục chạy cột Polyamide thu được 2B, 2B được

trích ly với EtOAc sau đó kết tinh lại trong MeOH thu được 48 mg luteolin

7-O-β-glucoside Phân đoạn 3 được chiết với EtOAc sau đó nạp vào cột Cellulose, phân đoạn 40% MeOH được trích ly lại với EtOAc sau đó kết tinh lại trong MeOH thu được 8 mg luteolin nằm trong pha EtOAc [4]

OH OH HO

HO

O

OH O

O

OH OH

O

OH

HO HO OH

Luteolin 7-O-ß-glucoside

Hình 1.2: Luteolin và luteolin 7-O-β-glucoside

Diterpenoid lactone

Các diterpenoid lactone đã được tìm thấy trong Vernonia Amygdalina Del là:

Bảng 1.2: Diterpenoid lactone trong cây [3]

HO HO

HO HO

OH HO

14-deoxy-11,

12-didehydroandrographolide

Diterpenoid lactone

O

O

H

H HO

Sesquiterpene lactone

Nhiều loại sesquiterpene lactones đã được phân lập từ Vernonia Amygdalina Del

như: vernolide, vernodalol, vernolepin, vernodalin, vernomygdin, hydroxyvernolide, vernodalinol, vernomenin, vernolic, 7,24(28)-stigmastadien-3β-ol; 11, 13-dihydrovernodalin; 11, 13-dihydrovernorodeline; 4, 15-dihydrovernodalin; 1, 2, 3, 15,

11, 13, 2’, 3’-octahydrovernodalin and epivernodalol [1, 3, 5]

Tác giả Xuan Luo đã phân lập và tinh chế vernodalinol (hay

(4aR,5R,6S,7S,8aR)-

8a-ethenyloctahydro-5-hydroxy-7-[[2-(hydroxymethyl)-1-oxo-2-propen-1-yl]oxy]-α,4-bis(methylene)-3-oxo-1H-2-benzopyran-6-acetic acid) bằng cách chiết 6 kg bột lá khô

bằng 30 L ethanol 85%, sau đó thực hiện quá trình chiết phân đoạn bằng các dung môi: n-hexane, ethyl acetate, n-butanol và nước, thu được 88,6 g cao n-butanol, cao n-butanol được phân lập bằng sắc kí cột Silicagel (300-400 Mesh), dung môi sử dụng đi từ Chloroform đến methanol, ở phân đoạn 80% chloroform 20% methanol phát hiện có vết màu nâu trên sắc kí bản mỏng (Rf =0,6), phân đoạn này được kết tinh trong MeOH thu được 120 mg tinh thể, dùng các phương pháp 1D, 2D NMR, IR, UV, HR-MS để xác định cấu trúc của vernodalinol [6]

Ngoài ra, nhóm các tác giả của trường Đại học Wisconsin, Madison cũng đã tìm được hai sesquiterpene lactone là vernodalin và vernomygdin bằng cách chiết 400 g bột

lá bằng chloroform, sau đó chiết phân đoạn bằng các dung môi ether dầu hỏa và methanol, phân đoạn methanol thu được (7,8 g) tiếp tục chạy sắc kí cột silicAlt CC-7 (Mallinckrodt, 600 g) thu được các phân đoạn: E (86 mg), F (359 mg), G (132 mg), H (866 mg), I (64 mg), J (187 mg), and K (177 mg) Phân đoạn H chạy sắc kí cột Silicagel (Merck, 200 g), ở phân đoạn methanol-acetone-chloroform (1: 10: 190) thu được một chất không màu (730 mg) được xác định bằng phổ MS là Vernodalin Phân đoạn F chạy sắc kí cột silicagel (100 g), ở phân đoạn methanolacetone-chloroform (1: 10: 90) thu được hai chất, chất thứ nhất (200 mg) được kết tinh trong acetone-petroleum ether, được xác định đó là vernolide bằng các phổ IR và NMR, chất thứ hai cũng được kết tinh trong acetone-petroleum được xác định là vernomygdin (30 mg) [7]

O

Vernodalin

O O

R O

O OCH 3 OH

Vernodalepin

O

O

H OH

O O

O O

O

O H

1,2,3,15,11,13,2',3'-octahydrovernodalin

O

O

H O O 11,13-dihydrovernodalin

có vị đắng đặc trưng, vernonioside A1,vernonioside A2, vernonioside A3, vernonioside

A4 là thành phần đóng góp vào đặc điểm này trong khi vernonioside B1, B2, B3 không gây ra vị đắng [1]

Nghiên cứu của nhóm tác giả Mitsuo Jisaka đến từ Nhật đã tìm thấy trong dịch

chiết của Vernonia Amygdalina Del các loại vernonioside là vernonioside A1, vernonioside A2, vernonioside A3 và vernonioside B1 Nhóm tác giả thực hiện ngâm dầm 800 g bột lá khô bằng methnol ở nhiệt độ thường thu được 94,9 g cao, tiếp tục phân tán cao trong hệ dung môi n-hexane:MeOH:nước (5: 9: 1) lấy phân đoạn nặng hơn và tiếp tục chiết với EtOAc:nước (1:1), phân đoạn nặng hơn tiếp tục chiết với n-butanol, phân đoạn butanol được phân lập bằng sắc kí cột pha đảo ODS sillicagel với hệ MeOH-Nước thu được các phân đoạn chính và chạy HPLC để được các vernonioside tinh khiết

ở các phân đoạn như sau: [8]

Bảng 1.3: Các vernonioside phân lập bằng HPLC [8]

Vernonioside A4

HPLC phân đoạn methanol-nước 6:4

(Fr2)

Rf: 0,47 methanol-nước (18:7) Vết màu vàng sau khi phun vanillin-sulphuric acid và cấp nhiệt

Vernonioside B3

HPLC phân đoạn methanol-nước 8:2

R 2

O O

R3

OH

OH OH

Vernonioside A 4 : R=OGlc Vernoniol A 4 : R=OH

GlcO

O HO

OH

OH

O OMe

O

O OH

OH

OMe MeO

1.3 Hoạt tính sinh học

O O

OH

OMe OH

H

O O

OH

OMe OH

H

O O

OH

OMe OH

H

O O

OH

OH OH

như alkaloid, tannin, flavonoid, tinh dầu Một số nghiên cứu cho thấy Lá đắng có hoạt tính kháng khuẩn cao

Theo nghiên cứu của Akinpelu, dịch chiết methanol 60% của cây Lá đắng được trồng ở Nigeria, có khả năng ức chế sự tăng trưởng của các vi khuẩn gram dương như

B.cereus, B pumilus, B subtilis, E cloacae, S aureus và M kristinae, đồng thời cũng

có khả năng chống lại các vi khuẩn gram âm như Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas

aeruginosa, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae và E.coli Dịch chiết ethanol từ cây

cũng cho thấy hoạt tính chống lại vi khuẩn gram âm (E coli và Salmonella typhi) và gram dương (Clostridium sporogenes, Staphylococcus pyogenes và S aureus) [10]

Các chất như saponins, flavonoids, alkaloids được tìm thấy trong cây cũng có khả năng kháng khuẩn trong việc làm lành vết thương Theo nghiên cứu của Jisaka cho thấy vernolepin và vernomenin sở hữu tác dụng kháng khuẩn đối với B subtilis và M lutea

4, 15 dihydrovernodalin chứng minh hoạt động kháng khuẩn cao nhất đối với B subtilis

và M lutea khi so sánh với vernolepin, vernolide, vernodalin và vernomenin Vernodalol cũng có khả năng kháng khuẩn đối với B cereus, S epidemidus, S aureus, M kristinae

và S.pyrogens (vi khuẩn gram dương) [3]

Hai loại sesquiterpene lactones được tìm thấy trong Vernonia Amygdalina Del là:

vernolide và vernodalol được thử nghiệm chống lại 10 chủng vi khuẩn và 5 loài nấm, cả hai hoạt chất đều thể hiện khả năng diệt khuẩn đáng kể khi chống lại các vi khuẩn gram dương, tuy nhiên lại thiếu hiệu quả với các vi khuẩn gram âm Trong thử nghiệm kháng nấm, vernodile thể hiện khả năng hoạt động cao với giá trị LC50 là 0,2; 0,3 và 0,4 mg/mL

với Penicillium notatum, Aspergillus flavus, Aspergillus niger và Mucor hiemalis, vernodalol thể hiện khả năng ức chế Aspergillus flavus, Penicillium notatum và

không có hiệu quả chống lại Fusarium oxysporum, một loại vi khuẩn được biết đến là

có khả năng chống lại nhiều tác nhân hóa học [11]

Theo nghiên cứu của Aliyu Ibrahim Yar’adua, Lawal Shuaibu và Abdullahi Nasir, dịch chiết nước nóng từ cây Lá đắng có khả năng kháng khuẩn đối với vi khuẩn theo

thứ tự như sau: Klebsialla pneumonia >Pseudomonas aeroginosae > Staphylococcus

aureus, Salmonella typhi > Escherichia coli >Streptococcus [12]

1.3.2 Tiểu đường

Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh rằng cây lá cây Lá đắng có thể trị bệnh tiểu đường, cụ thể như sau:

Nghiên cứu của J Atangwho trên dịch chiết lá Vernonia Amygdalina Del thử

nghiệm trên chuột cho thấy lượng đường trong máu giảm nhiều nhất khi sử dụng dịch phân đoạn chloroform (33,3%) Sau 14 ngày thử nghiệm ở chuột mắc bệnh, đáp ứng cao nhất của phân đoạn chloroform ở máu (23,5%) và huyết thanh (21,4%) Bằng phương pháp GC-MS, người ta tìm thấy trong dịch chiết chloroform các hợp chất: linoleic acid (4.72%), α-linolenic acid (10.8%) and phytols (12.0%) [13]

Thử nghiệm in vitro trên dịch chiết cây lá cây Lá đắng có khả năng ức chế hai loại

enzyme gây ra tiểu đường tuýp 2 là α-glucosidase và α-amylase ở nồng độ 4-16 μg/mL Khả năng ức chế α-glucosidase của dịch chiết cây Lá đắng là cao hơn so với khả năng

ức chế α-amylase của dịch chiết cây Lá đắng [14]

Một nghiên cứu khác trong việc giảm hàm lượng đường trong máu của dịch chiết

nước từ lá Vernonia Amygdalina Del trên thỏ cho thấy: lượng đường huyết lúc đói ở thỏ

đã giảm từ 96 mg% xuống còn 48 mg% trong vòng 4 giờ Ở thỏ đã bị tiểu đường, lượng đường trong máu giảm từ giá trị 520 mg% xuống còn 300 mg% trong vòng 8 giờ Sự giảm đường huyết này không liên quan đến sự tiết insulin [15]

1.3.3 Kháng oxy hóa

Nhiều nghiên cứu cho thấy lá Vernonia Amygdalina Del có khả năng kháng oxy hóa khá cao trong thử nghiệm in vitro cụ thể như sau:

Nghiên cứu của nhóm tác giả Mbang A Owolabi đánh giá hoạt tính kháng oxy

hóa in vitro của dịch chiết nước và ethanol từ lá Vernonia Amygdalina Del Khả năng

chống oxy hóa của mỗi dịch chiết được đánh giá bằng các phương pháp khác nhau Tổng lượng phenolic và flavonoid và khả năng kháng oxy hóa của nó cũng được đánh giá Khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết cồn (10.09 ± 1.63 mM) cao hơn so với butylated hydroxyanisole (BHA) (9.31 ± 1.17 mM ) và dịch chiết nước (8.75 ± 1.28 mM) [16] Nhóm các tác giả của trường đại học Ibadan, Nigeria sau khi đã định tính được 3

ở vị trí 3’, 4’ ở vòng B [4]

Nghiên cứu của J Atangwho thử hoạt tính kháng oxy hóa DPPH đã cho kết quả khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết được xếp thứ tự như sau cao nước (IC50 = 0.1367 ± 0.001 mg/mL) > cao methanol (IC50 = 0.2172 ± 0.004 mg/mL) > cao petroleum ether (IC50 = 0.4650 ± 0.012 mg/mL) > cao chloroform (IC50 = 0.4925 ± 0.003 mg/mL) [13]

Trong nghiên cứu dịch chiết nước của lá cây Lá đắng, nhóm tác giả đến từ trường Đại học Lagos, Nigeria đã xác định được thành phần hóa học có trong lá cây trong đó flavonoids chiếm tỷ lệ cao nhất (hình 3), flavonoids là chất có khả năng chống oxy hóa, chống dị ứng, vi khuẩn, chống viêm và chống ung thư Kết quả khả năng bắt gốc tự do DPPH theo nồng độ của dịch chiết như sau: ở nồng độ 25% là 20%, ở nồng độ 50% là 27%, ở nồng độ 75% là 33% [17]

Nhóm các tác giả Adewole E1, Ojo A, Ogunmodede O.T, Adewumi D F đã tiến hành đo độ hấp thu DPPH của dịch chiết methanol từ cây Lá đắng ở Nigeria Kết quả hoạt động chống oxy hóa của dịch chiết ở các nồng độ khác nhau là: tại 0,4 mg/mL, khả năng ức chế được tìm thấy là 76,08%, ở 0,3 mg/mL là 55,86%, 0,2 mg/mL là 39,09%

và ở 0.1 mg/mL là 22,96% [18]

1.3.4 Chống ung thư

Vernonia Amygdalina Del được biết đến như một loại dược liệu trị ung thư vú

Trong một nghiên cứu trước đây cho thấy dịch chiết nước từ lá cây Lá đắng ở Nigeria

đã làm giảm hoạt động tăng sinh của tế bào ung thư vú ER+ [11]

Nghiên cứu của Izevbigie EB, Bryant JL, Walker A trên dịch chiết nước từ lá của

Vernonia Amygdalina Del đã cho thấy dịch chiết có thể ức chế sự tăng trưởng đối với tế

bào MCF-7, do đó Vernonia Amygdalina Del có thể tác động đến hoạt động và quá trình

tổng hợp DNA, tăng trưởng tế bào của tín hiệu điều tiết ngoại bào protein kinase 1 và 2 Khi điều tra trên tế bào với các nồng độ khác nhau (3-100mg/mL), dịch chiết nước cho thấy khả năng ức chế protein kinase 1 và 2, quá trình tổng hợp DNA và sự tăng trưởng

tế bào trong một thời gian phụ thuộc vào nồng độ, kể cả khi có hoặc không có huyết thanh Điều này chứng tỏ Lá đắng có khả năng ức chế protein kinase 1 và 2 trong việc

điều trị ung thư vú Ở nồng độ 12 μg/mL dịch chiết Lá đắng đã ức chế 40% sự gia tăng

tế bào ung thư so với tế bào ung thư không điều trị [19]

Một nghiên cứu khác của Fang Cheng Wong thấy rằng Vernonia Amygdalina Del

có thể ức chế tế bào MCF-7 và MDA-MB-231 phụ thuộc vào thời gian và liều lượng Giá trị IC50 của dịch chiết Vernonia Amygdalina Del đối với tế bào MCF-7 là 100, 66

và 56 μg / mL ở thời điểm 24, 48 và 72 giờ, giá trị IC50 của dịch chiết Vernonia

Amygdalina Del đối với tế bào MDA-MB-231 là 83, 53, 46 µg/mL ở thời điểm 24, 48

và 72 giờ Ngoài ra, khoảng 70% các ca ung thư vú được chẩn đoán hiện ER-α, một phát hiện rất quan trọng là Vernonia Amygdalina Del ức chế sự biểu hiện của ER-α, nêu bật

ý nghĩa tiềm năng lâm sàng của Vernonia Amygdalina Hơn nữa, Vernonia Amygdalina

thể hiện sự đồng bộ khi kết hợp với doxorubicin, cho thấy rằng nó có thể bổ sung cho hóa trị hiện hành Nhìn chung, nghiên cứu này cho thấy các ứng dụng tiềm năng của

Vernonia Amygdalina là một loại thuốc chống ung thư để điều trị ung thư vú [20]

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu

Đề tài khảo sát các hoạt tính sinh học của cây Lá đắng trong cao tổng và các cao thành phần, đồng thời tối ưu quy trình chiết để thu được cao có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase cao nhất Đối tượng nghiên cứu là lá cây Lá đắng được thu hái ở Đăk Lăk, vào tháng 4 năm 2017

2.2 Nội dung nghiên cứu

Từ mục tiêu đề ra, đề tài xây dựng nội dung nghiên cứu như sau:

- Chuẩn bị nguyên liệu, đánh giá tính chất của nguyên liệu

- Chiết cao tổng ethanol, cao tổng nước

- Khảo sát sơ bộ thực vật

- Chiết lần lượt các cao phân đoạn từ cao tổng ethanol: hexane, ethyl acetate, buthanol, nước

n Khảo sát hoạt tính sinh học của các cao tổng và các cao thành phần

- Chọn cao thành phần có hoạt tính cao nhất, phân lập thành các phân đoạn nhỏ và khảo sát hoạt tính của các phân đoạn đó

- Tối ưu quy trình chiết để hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase cao nhất

- Khảo sát hoạt tính sinh học của cao sau tối ưu

Nội dung nghiên cứu được tóm tắt như sau:

Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Hình 2.1: Tóm tắt nội dung nghiên cứu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Độ ẩm được xác định bằng máy đo độ ẩm Satorius MA 35

Cách tiến hành: Cân 2 g nguyên liệu trải thành một lớp mỏng trên đĩa nhôm, cho vào máy đo độ ẩm Nguyên liệu được sấy ở 105 oC đến khối lượng không đổi Kết thúc

đo khi màn hình máy hiện chữ END vả đọc độ ẩm trên máy Độ ẩm được xác định bằng công thức:

W(%) =khối lượng đầu − khối lượng sau

khối lượng đầu × 100 Phép đo dược thực hiện 3 lần và lấy kết quả trung bình Từ độ ẩm (W), khối lượng

Lá tươi

Xử lý nguyên liệuChiết cao tổng ethanolChiết cao phân đoạnKhảo sát hoạt tính sinh họcTối ưu quy trình chiếtKhảo sát hoạt tính sinh học của cao sau tối ưu

2.3.3 Chiết cao tổng và cao phân đoạn

2.3.3.1 Cao tổng ethanol

Nguyên liệu trước khi chiết được cho vào máy Satorius để đo độ ẩm Nếu độ ẩm

dưới 12% thì tiến hành chiết kiệt

Bột lá cây Lá đắng được chiết kiệt với ethanol bằng phương pháp chiết lỏng – rắn như sau:

 200 g bột lá cây Lá đắng được chiết bằng cồn tuyệt đối, tỉ lệ rắn lỏng là 1:5, đun cách thủy nhiệt độ 45 oC, tốc độ khuấy 450 vòng/phút, trong 45 phút

 Sau đó lọc chân không, dịch chiết được cô quay chân không thu cao tổng ethanol, cao tổng được bảo quản trong lọ kín ở -21 oC

 Bã dược liệu được thực hiện lại 5 lần quá trình chiết như trên

 Bã dược liệu được thực hiện lại quá trình chiết như trên 5 lần

2.3.3.3 Cao phân đoạn

Cao tổng ethanol được pha loãng bằng nước cất và chiết lỏng – lỏng bằng các dung môi từ không phân cực đến phân cực (n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, n- buthanol, nước) để tách các cụm hoạt chất khác nhau Mỗi dung môi được chiết kiệt, lọc

và loại dung môi bằng cô quay chân không đến khối lượng không đổi, thu được các cao thành phần

Quá trình chiết phân đoạn được mô tả bằng sơ đồ sau:

Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

EtOAc

DCM

Bột lá cây Lá đắng

Chiết

Lọc EtOH

Dịch chiết

Bay hơi dung môi

Cao tổng EtOH Nước

Cao n-hexane

Dịch chiết DCM Phần còn lại

Bay hơi dung môi

Cao DCM Chiết

Dịch chiết EtOAc Phần còn lại

Bay hơi dung môi

Cao EtOAc Chiết

Dùng thuốc thử đặc trưng để định tính alkaloid là Dragendorff và Bouchardat như sau:

 Nhỏ một đến hai giọt thuốc thử Dragendorff vào 3 mL dịch chiết dược liệu: cho tủa vàng cam đến đỏ

 Nhỏ một đến hai giọt thuốc thử Bouchardat vào 3 mL dịch chiết dược liệu: cho tủa nâu

có màu hồng đến tía

Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Polyphenol

 Phản ứng tạo phức với FeCl3: 2 mL dịch chiết được khuấy với 2 mL nước cất và vài giọt dung dịch FeCl3 được thêm vào Tùy vào số lượng vị trí nhóm OH trong phân tử mà cho màu lục, xanh, nâu đỏ

Tanin

 Kết tủa với gelatin: dịch chiết khi thêm vào dung dịch gelatin 1% có chứa 10% NaCl sẽ có tủa

2.3.5 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

2.3.5.1 Phương pháp đánh giá khả năng kháng oxy hóa DPPH

Nguyên tắc

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là hợp chất có màu tím được phát hiện ở bước sóng 517 nm Khi các điện tử lẻ của các gốc tự do DPPH kết hợp với hydro từ chất chống oxy hóa thì sẽ hình thành nên DPPH–H lúc này màu sắc chuyển từ màu tím sang màu vàng Sự biến đổi màu này tương ứng với lượng electron kết hợp với DPPH Do

đó, khả năng làm sạch gốc tự do của một chất càng cao thì sự hấp thu quang phổ được

đo ở 517 nm của phản ứng DPPH có giá trị càng giảm và ngược lại Thông qua việc so sánh độ hấp thu của mẫu cao với mẫu trắng, có thể xác định được lượng gốc tự do DPPH