Nghiên cứu thu hồi dịch thủy phân protein có hoạt tính sinh học từ đầu tôm thẻ chân trắng

Đề tài “Nghiên cứu thu hồi dịch thủy phân protein có hoạt tính sinh học từ đầu tôm thẻ chân trắng được đề xuất nhằm góp phần nâng cao hiệu quả sử dụng tài nguyên, đem lại giá trị kinh t

-

NGUYỄN THỊ DIỆP VÂN

NGHIÊN CỨU THU HỒI DỊCH THỦY PHÂN PROTEIN CÓ HOẠT

TÍNH SINH HỌC TỪ ĐẦU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

Nha Trang – 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

-

NGUYỄN THỊ DIỆP VÂN

NGHIÊN CỨU THU HỒI DỊCH THỦY PHÂN PROTEIN CÓ HOẠT

TÍNH SINH HỌC TỪ ĐẦU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:

1 TS NGUYỄN ANH TUẤN

2 ThS NGÔ THỊ HOÀI DƯƠNG

Nha Trang - 2013

LỜI CẢM ƠN

Đề tài này đã được hoàn thành nhờ sự giúp đỡ tận tình của rất nhiều thầy

cô giáo, bạn bè, gia đình và các tập thể trực thuộc trường Đại học Nha Trang Qua đây em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới tất cả các cá nhân và tập thể

đã giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tới thầy Nguyễn Anh Tuấn và cô Ngô Thị Hoài Dương đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ và tận tình chỉ bảo những kinh nghiệm quý báu để em có thể từng bước hoàn thành tốt đề tài

Em xin chân thành biết ơn các thầy, cô giáo trong khoa Công nghệ Thực phẩm đã dạy dỗ và truyền đạt cho em những kiến thức vô cùng quý báu trong suốt quá trình học tập

Em xin chân thành biết ơn Ban giám đốc và các anh, chị tại Phòng Khoa học Công nghệ, Trung tâm thí nghiệm thực hành, Công nghệ sinh học và Môi trường đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện

MỤC LỤC

Trang

Trang bìa phụ i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các bảng vii

Danh mục các hình viii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 NGUỒN NGUYÊN LIỆU CÕN LẠI TRONG CHẾ BIẾN TÔM VÀ PROTEIN THỦY PHÂN 3

1.1.1 Nguồn nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm và các hướng tận dụng 3

1.1.1.1 Nguồn nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm 3

1.1.1.2 Thành phần, tính chất của nguyên liệu còn lại sau chế biến tôm 5

1.1.1.3 Hướng tận dụng nguồn nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm 7

1.1.2 Quá trình thủy phân Protein 11

1.1.2.1 Cơ chế của quá trình thủy phân protein 11

1.1.2.2 Phương pháp thu nhận protein thủy phân 14

1.2 ENZYME PROTEASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU CÕN LẠI 15

1.2.1 Phân loại enzyme protease và nguồn thu nhận 15

1.2.1.1 Phân loại enzyme protease 15

1.2.1.2 Nguồn thu nhận enyme protease 17

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng hoạt động của enzyme protease 19

1.2.3 Hệ enzyme protease của tôm 23

1.2.4 Các nghiên cứu thu hồi protein thủy phân bằng enzyme 24

1.3 CÁC CHẤT CHỐNG OXY HÓA VÀ ỨNG DỤNG 28

1.3.1 Giới thiệu chất chống oxy hóa 28

1.3.2 Phân loại các chất chống oxy hóa 29

1.3.3 Khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân 30

1.3.4 Các phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân protein 32

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 33

2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm 33

2.1.2 Enzyme Protease 33

2.1.3 Hóa chất nghiên cứu 33

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 33

2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại enzyme xử lý đến khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân 33

2.2.2 Nghiên cứu chế độ thủy phân tối ưu để thu dịch thủy phân protein có hoạt tính sinh học cao 33

2.2.3 Nghiên cứu thử nghiệm khả năng chống oxy hóa lipit của dịch thủy phân protein thu được 33

2.2.4 Đề xuất qui trình thu hồi dịch thủy phân protein có hoạt tính sinh học 34

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 34

2.3.1 Phương pháp thu nhận mẫu 34

2.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 34

2.3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 34

2.3.2.2 Ảnh hưởng của loại enzyme đến khả năng chống oxy hóa của dịch thủy

phân protein 35

2.3.2.3 Nghiên cứu tối ưu chế độ thủy phân để thu dịch có khả năng chống oxy hóa 38

2.3.2.4 Ứng dụng thử nghiệm sản phẩm thủy phân thu được để hạn chế quá trình oxy hoá lipit 41

2.3.3 Phương pháp phân tích và xác định các chỉ tiêu 44

2.3.3.1 Xác định khả năng chống oxy hóa của dịch thu được bằng test DPPH 44 2.3.3.2 Xác định khả năng chống oxy hóa của dịch thu được bằng phương pháp tổng năng lực khử 45

2.3.3.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa bằng mô hình phản ứng Fenton trong hệ Lipit/Myoglobin/H2O2 45

2.3.3.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trên cơ thịt đỏ cá ngừ bằng hệ kích hoạt H2O2 và Fe2+ 47

2.3.3.5 Xác định chỉ số oxy hóa (TBARS) theo phương pháp Buege và Aust (1970) áp dụng trên cơ thịt đỏ cá ngừ 48

2.3.4 Phương pháp xử lí số liệu 49

2.3.5 Thiết bị 49

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 51

3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT CHẾ ĐỘ THU DỊCH THỦY PHÂN PROTEIN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC 51

3.1.1 Ảnh hưởng của loại enzyme đến khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân protein 51

3.1.2 Tối ưu quá trình thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Protamex 54

3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA LIPIT CỦA

DỊCH THỦY PHÂN PROTEIN TỪ ĐẦU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG 58

3.2.1 Khảo sát khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng trên mô hình phản ứng Fenton 58

3.2.2 Phản ứng xác định khả năng chống oxy hóa của dịch sử dụng hệ Fe2+ và H2O2 để kích hoạt quá trình oxy hóa của cơ thịt đỏ cá ngừ 60

3.2.3 Xác định chỉ số oxy hóa (TBARS) theo phương pháp Buege và Aust (1970) trên cơ thịt đỏ cá ngừ 62

3.3 ĐỀ XUẤT QUI TRÌNH THU HỒI DỊCH THỦY PHÂN PROTEIN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC 69

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

PHỤ LỤC 77

DANH MỤC BẢNG

Trang Bảng 1.1 Thành phần trọng lượng của một số loài tôm 4

Bảng 1.2 Thành phần hóa học cơ bản của của nguyên liệu còn lại tôm Penaeus

vannamei, Crangon crangon và Pandalus boreslis 5

Bảng 1.3 Thành phần hóa học của đầu và vỏ tôm thẻ chân trắng 6 Bảng 2.1 Ma trận bố trí thí nghiệm tối ưu chế độ thủy phân để thu dịch có khả năng chống oxy hóa 40 Bảng 3.1 Kết quả chống oxy hóa của dịch thủy phân protein đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Protamex 55 Bảng 3.2 Kết quả xử lý tối ưu hóa quá trình thủy phân protein bằng enzyme Protamex bằng DX6 56 Bảng 4.2 Kết quả DPPH và tổng năng lực khử của dịch thủy phân protein khi thủy phân bằng các enzyme khác nhau 78 Bảng 4.3 Tổng năng lực khử và DPPH của dịch thủy phân protein bằng enzyme Protamex 79 Bảng 4.4 Hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân protein trên mô hình phản ứng Fenton 80 Bảng 4.5 Hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân protein đo ở bước sóng 520nm 81 Bảng 4.6 Giá trị OD trung bình đo ở bước sóng 532 nm theo phương pháp Buege và Aust (1970) trên cơ thịt đỏ cá ngừ 82 Bảng 4.7 Hoạt tính chống oxy hóa dịch thủy phân theo phương pháp Buege và Aust (1970) trên cơ thịt đỏ cá ngừ 83

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Phản ứng thủy phân protein 11

Hình 1.2 Sơ đồ phản ứng thủy phân xúc tác bởi protease 13

Hình 1.3 Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa 29

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 34

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định mức độ ảnh hưởng của enzyme đến thủy phân và khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân protein 37

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí chế độ thủy phân để thu dịch có khả năng chống oxy hóa 39

Hình 2.4 Sơ đồ qui trình thu hồi sản phẩm thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa 41

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm bước đầu thử nghiệm khả năng chống oxy hóa của sản phẩm dịch thủy phân từ đầu tôm 43

Hình 2.6 Thiết bị ổn nhiệt Memmert 50

Hình 2.7 Thiết bị đo UV-vis 50

Hình 2.8 Máy vortex 50

Hình 3.1 Ảnh hưởng của loại enzyme đến khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân protein 52

Hình 3.2 Hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng trên mô hình phản ứng Fenton đo ở bước sóng 520 nm 59

Hình 3.3 Kết quả chống oxy hóa của dịch thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng trên hệ Fe2+ và H2O2 đo ở bước sóng 520 nm 61

Hình 3.4 Biểu đồ biểu diễn giá trị OD trung bình đo ở bước sóng 532 nm (theo phương pháp Buege và Aust) 63

Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn chênh lệch giá tri OD so với mẫu đối chứng đo ở bước sóng 532 nm (theo phương pháp Buege và Aust) 65 Hình 3.6 Hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng trên cơ thịt đỏ cá ngừ (theo phương pháp Buege và Aust) 67 Hình 3.7 Sơ đồ qui trình thu hồi protein dịch thủy phân có hoạt tính sinh học cao 69

LỜI MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu, tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đông lạnh giáp xác chiếm từ 70 - 80% công suất chế biến Sản lượng tôm nguyên liệu ngày một gia tăng như hiện nay sẽ là nguồn cung cấp nguyên liệu khá dồi dào cho các ngành công nghiệp tận dụng nguồn nguyên liệu còn lại sau chế biến tôm để sản xuất ra các sản phẩm có giá trị khác

Tùy thuộc vào loài và các biện pháp xử lý mà lượng nguyên liệu còn lại sau chế biến tôm có thể vượt quá 60% khối lượng sản phẩm [1] Mặt khác, tỷ lệ này cũng phụ thuộc vào giống loài, giai đoạn sinh trưởng của chúng Đối với tôm thẻ, lượng đầu tôm chiếm khoảng 28%, vỏ chiếm 9% trọng lượng tôm [6]

Tuy nhiên, hiện nay lượng nguyên liệu còn lại này chủ yếu chỉ được sử dụng để làm nguyên liệu cho quá trình sản xuất chitin mà chưa chú trọng thu hồi các thành phần khác có giá trị, trong đó có protein Các nghiên cứu cho thấy trong đầu tôm có chứa tới 50% hàm lượng protein [4] với các thành phần axit amin không thay thế và có giá trị cao về mặt sinh học, vì thế việc nghiên cứu thu hồi dịch thủy phân protein có giá trị sinh học từ đầu tôm là hết sức cần thiết

Đề tài “Nghiên cứu thu hồi dịch thủy phân protein có hoạt tính sinh học từ đầu tôm thẻ chân trắng được đề xuất nhằm góp phần nâng cao hiệu

quả sử dụng tài nguyên, đem lại giá trị kinh tế cao cho ngành thủy sản và giảm thiểu ô nhiễm môi trường trong chế biến thủy sản và sản xuất chitin tại Việt Nam Kết quả của đề tài cũng sẽ là cơ sở để khuyến khích áp dụng công nghệ thân thiện với môi trường trong thu hồi protein có giá trị sinh học từ đầu tôm thẻ chân trắng

2 Mục đích của đề tài

Đề xuất qui trình sản xuất cho phép thu hồi dịch thủy phân protein có hoạt

tính sinh học từ đầu tôm thẻ chân trắng

3 Nội dung của đề tài

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại enzyme xử lý đến khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân;

- Nghiên cứu chế độ thủy phân tối ưu để thu dịch thủy phân protein có hoạt tính sinh học cao;

- Nghiên cứu thử nghiệm khả năng chống oxy hóa lipit của dịch thủy phân protein thu được;

- Đề xuất qui trình thu hồi dịch thủy phân protein có hoạt tính sinh học

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 NGUỒN NGUYÊN LIỆU CÕN LẠI TRONG CHẾ BIẾN TÔM VÀ PROTEIN THỦY PHÂN

1.1.1 Nguồn nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm và các hướng tận dụng

1.1.1.1 Nguồn nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm

Nguyên liệu còn lại sau quá trình chế biến tôm chủ yếu gồm có: đầu, vỏ Ngoài ra, trong quá trình sản xuất còn có các dạng phế liệu như tôm đứt gãy đuôi, phần thịt vụn do bóc nõn không đúng qui trình kỹ thuật, tôm biến đen, biến

đỏ nhưng số lượng ít Tuỳ thuộc vào từng loài, sản phẩm chế biến khác nhau mà lượng nguyên liệu còn lại sau quá trình chế biến tôm sẽ khác nhau

Có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy tỷ lệ của nguyên liệu còn lại sau quá trình chế biến tôm từ 30 - 70%, trung bình khoảng 50% so với khối lượng tôm chưa chế biến [13] Trong đó, phần đầu thường chiếm 34 - 45% và phần vỏ

10 - 15% so với lượng tôm nguyên liệu đưa vào chế biến [13] Tuy nhiên, tỷ lệ này tùy thuộc vào giống, loài được liệt kê ở bảng 1.1 và giai đoạn sinh trưởng của chúng [12], [13]

Những năm gần đây, sản lượng tôm thẻ ngày càng tăng nên lượng nguyên liệu còn lại sau quá trình chế biến tôm cũng tăng lên đáng kể Tuy nhiên, việc tận dụng nguyên liệu còn lại sau quá trình chế biến tôm mới chỉ dừng lại ở sản xuất chitin - chitosan mà chưa tận thu và sử dụng có hiệu quả nguồn protein, nhất là protein ở trên đầu tôm chiếm tới 47,4 ± 1,8% so với trọng lượng nguyên liệu còn lại sau quá trình chế biến tôm (theo bảng 1.2)

Nếu lượng protein này không được tận dụng mà đem thải bỏ sẽ gây ra ô nhiễm môi trường trầm trọng hoặc đem xử lí chất thải thì chi phí sẽ rất lớn nhưng nếu biết tận dụng triệt để protein của nguồn nguyên liệu còn lại sau quá

trình chế biến tôm này sẽ đem lại nguồn lợi nhuận khổng lồ cho ngành thủy sản

Nó không chỉ đem lại giá trị kinh tế cao, sử dụng có hiệu quả nguồn tài nguyên

mà còn có ý nghĩa bảo vệ môi trường [24]

Bảng 1.1 Thành phần trọng lượng của một số loài tôm [15]

Vì vậy, việc quan tâm nghiên cứu tận dụng lượng protein nguyên liệu còn lại sau quá trình chế biến tôm, đặc biệt là trên đầu tôm là rất cần thiết vì vừa sử dụng có hiệu quả nguồn tài nguyên, giảm được sự ô nhiễm môi trường do nguồn nguyên liệu còn lại sau quá trình chế biến tôm thải ra, vừa góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế và đưa ngành thủy sản phát triển bền vững

1.1.1.2 Thành phần, tính chất của nguyên liệu còn lại sau chế biến tôm

Hiện nay, việc nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) thương phẩm

phát triển mạnh nên nguồn nguyên liệu còn lại sau chế biến tôm thẻ chân trắng thu được rất nhiều

Trong đó, thành phần protein trong nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm thẻ chân trắng tương đối cao, gần 50% [18] Vì vậy, nguồn protein trong nguồn nguyên liệu còn lại sau chế biến tôm cần được quan tâm nguyên cứu và tận dụng

có hiệu quả

Thành phần hóa học của nguồn nguyên liệu còn lại sau chế biến tôm thay đổi theo giống loài (được mô tả ở bảng 1.2), khu vực sống, mức dinh dưỡng, độ trưởng thành, phương pháp gia công chế biến

Bảng 1.2 Thành phần hóa học cơ bản của của nguyên liệu còn lại tôm

Penaeus vannamei, Crangon crangon và Pandalus boreslis [24]

STT Chỉ tiêu

phân tích

Penaeus vannamei

Crangon crangon

Pandalus boreslis

1 Khoáng (%) 24,6 ± 0,8 27,1 ± 0,1 29,2 ± 0,2

2 Chitin (%) 18,3 ± 0,9 17,8 ± 0,9 17,0 ± 0,3

3 Protein (%) 47,4 ± 1,8 40,6 ± 5,4 41,9 ± 0,2

4 Lipit (%) 4,7 ± 0,3 10,0 ± 0,2 10,2 ± 0,4

Mặt khác, thành phần hóa học của đầu và vỏ tôm trong nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm cũng khác nhau Theo bảng 1.3 cho thấy đầu tôm thẻ chân

trắng (Penaeus vannamei) có hàm lượng protein cao hơn đáng kể so phần vỏ Vì

vậy, trong quá trình sản xuất chitin từ phế liệu tôm thẻ cần lưu ý đến đặc điểm này nhằm thu hồi và sử dụng có hiệu quả nguồn protein này

Bảng 1.3 Thành phần hóa học của đầu và vỏ tôm thẻ chân trắng

- Protein trong đầu tôm tồn tại ở 2 dạng:

+ Dạng tự do: dạng này tồn tại trong nội tạng tôm hay trong cơ thịt

+ Dạng liên kết: đây là protein không hòa tan, thường liên kết với chitin, calci carbonate, với lipit tạo thành lipoprotein, sắc tố tạo proteincarotenoid như một phần thống nhất quyết định tính bền vững của vỏ tôm

- Enzyme:

Trong nguyên liệu còn lại sau chế biến tôm có chứa một một lượng không nhỏ enzyme nội tại, chủ yếu là enzyme protease tồn tại trong nội tạng nên chủ yếu nằm trong đầu tôm

Hoạt độ enzyme của protease của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/g tươi Trong đầu tôm có chứa enzyme tiêu hóa chymotrypsin và một vài loại

enzyme khác có mặt trong nguyên liệu còn lại sau chế biến tôm như alkaline phosphatase, -N-acetyl glucosaminse, chitinase cũng được ứng dụng nhiều trong thực tế

- Chitin: tồn tại dưới dạng liên kết với protein, khoáng và những hợp chất hữu cơ khác

- Khoáng: trong thành phần đầu tôm có chứa một lượng muối vô cơ, chủ yếu là calci carbonate

- Sắc tố: sắc tố trong đầu tôm cũng như vỏ tôm chủ yếu là astaxanthin Chất này kết hợp với protein một cách chặt chẽ, nhờ liên kết này mà thành phần astaxanthin trong vỏ được bảo vệ, khi liên kết giữa astaxanthin và protein không còn nữa thì astaxanthin dễ dàng tách ra khỏi đầu tôm và bị oxy hóa thành astaxin

1.1.1.3 Hướng tận dụng nguồn nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm

Tận dụng nguồn nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm không những mang lại giá trị kinh tế cao cho ngành mà còn sử dụng nguồn nguyên liệu tôm có hiệu quả và bảo vệ môi trường

Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu còn lại từ các khâu chế biến tôm cần được thu hồi và bảo quản thích hợp, cần phải thu gom riêng những loại khác nhau như đầu, vỏ… do thành phần và tiềm năng sử dụng, giá trị sử dụng của chúng rất đáng kể Ngoài ra, nên tiến hành ngay các công đoạn tiếp theo như cấp đông hay

sấy khô để chế biến phế liệu thành bán thành phẩm ổn định

Nguồn nguyên liệu còn lại sau chế biến tôm dễ hỏng một phần vì chứa hàm lượng protein khá cao, các enzyme phân giải protein và một phần do quá trình phân hủy của vi sinh Lượng protein ở đầu tôm mất đi vì bị ươn thối có tới trên 10%, đồng thời có thể làm giảm chất lượng sản phẩm tôm Mặt khác, nguồn

nguyên liệu còn lại sau chế biến tôm không được tận dụng hết thì gây ảnh hưởng trầm trọng đến môi trường, đồng thời sử dụng tài nguyên không hiệu quả

Những năm gần đây, những hướng khai thác sử dụng nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm như sau:

a Sản xuất chitin - chitosan

Sản xuất chitin - chitosan được phát triển mạnh những năm gần đây, đã

mở ra một hướng tận dụng cho nguồn nguồn nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm Nhưng việc sản xuất chitin - chitosan bằng phương pháp hóa học vừa không tận thu hết sắc tố và protein trên phế liệu vừa ảnh hưởng đến môi trường do hàm lượng protein và hóa chất cao trong nước thải Việc sử dụng phương pháp sinh học để sản xuất chitin - chitosan đã và đang được quan tâm và nghiên cứu, thông qua việc sử dụng enzyme protease để tách protein giúp thu được protein thủy phân, các sắc tố trong dịch thủy phân và chitin - chitosan

b Sản xuất chế phẩm protein

Nguồn protein trong dịch thủy phân thường được tận thu bằng ba phương pháp chủ yếu là dùng nhiệt, pH và các chất trợ lắng Sản phẩm protein thu được thường được tận dụng bổ sung vào thức ăn gia súc Tuy nhiên, một số nghiên cứu gần đây cho thấy dịch thủy phân thu được khi thủy phân nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm bằng các enzyme khác nhau có hoạt tính sinh học Điều này

mở ra hướng tận dụng cao hơn cho sản phẩm thủy phân và có thể ứng dụng sản phẩm thủy phân này trong thực phẩm và các lĩnh vực khác

- Sản xuất thức ăn chăn nuôi

Hiện nay, ở nước ta phần lớn nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm sử dụng để sản xuất thức ăn chăn nuôi Rất nhiều thức ăn chăn nuôi bán chạy hiện nay có chứa bột tôm và nó chiếm 30% thành phần thức ăn Bột tôm được chế

biến tốt có chứa acid amin tương tự như amin trong đậu tương hay trong bột cá Chất lượng bột phụ thuộc vào chất lượng nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm

và phương pháp chế biến

Tuy nhiên, tận dụng theo hướng này mới chỉ giải quiết được 1/3 số nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm Do vậy việc xử lý và chế biến nguyên liệu còn lại sau chế biến tôm có ý nghĩa rất quan trọng trong việc sản xuất bột tôm có chất lượng cao Nếu công nghệ chế biến không phù hợp thì nó cũng ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng của sản phẩm do các chất béo và acid béo thiết yếu sẽ bị ảnh hưởng

Hiện nay có 2 phương pháp được áp dụng phổ biến trong sản xuất bột tôm

là phương pháp sấy khô và phương pháp ủ xi lô:

+ Phương pháp sấy khô bằng nhiệt: Phương pháp có ưu điểm là đơn giản,

có thể chế biến nhanh lượng nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm và tính kinh

tế cao Nhược điểm là chất lượng kém, giá trị dinh dưỡng không cao

+ Phương pháp ủ xilô: ở phương pháp này người ta sử dụng acid hữu cơ

và vô cơ trong việc ủ nhằm tăng tác động của enzyme khử trùng và hạn chế sự phát triển của vi sinh vật Sau khi ủ tiến hành trung tính bằng các chất kiềm, chất

ủ được làm thức ăn chăn nuôi Phương pháp này có ưu điểm là chất lượng tốt nhưng giá thành cao và phức tạp

- Sản xuất bột đạm đầu tôm

Bột đạm đầu tôm được sản xuất từ nguồn nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm và những nguồn nguyên liệu tôm chất lượng thấp như tôm đứt gãy, tôm

đã bắt đầu biến màu và tôm nhỏ, tôm vụn Đây là một nguồn protein động vật tốt cho gia súc Bột đầu tôm có khoảng 33 - 34% protein, trong đó có 4 - 5% lyzin,

2,7% methionin Ngoài ra, bột đầu tôm giàu canxi 5,2%, photpho 0,9% và các nguyên tố vi lượng khác [1]

Bột đầu tôm hiện nay được chế biến bằng cách thủ công Nếu là tôm lớn thì người ta dùng tay để bóc vỏ và đầu ra khỏi thân tôm Phần thịt tôm được sấy hoặc phơi khô là phần chính phẩm, còn phần vỏ và đầu được phơi nắng là phần phụ phẩm được dùng cho chăn nuôi Còn nếu là tôm loại nhỏ thì tôm được cho vào bao 50 kg rồi dùng cây để đập dập cho đầu tôm tách khỏi thân tôm Phần thân tôm được tách riêng bằng cách cho tất cả lên một sàn lớn, rồi dùng tay chà xát để tách riêng ra từng phần một

Bột đầu tôm có những phần đen với những màu khác nhau như: vàng nhạt, hồng, cam và có mùi rất đặc trưng Có hai loại bột đầu tôm, loại có nhiều vỏ và loại có nhiều thịt Bột đầu tôm chứa nhiều vỏ là loại bột sử dụng làm thức ăn cho chăn nuôi như thức ăn cho tôm, cá Bột đầu tôm có nhiều thịt và được sản xuất với công nghệ cao hơn được ứng dụng trực tiếp làm thực phẩm cho người

Các sản phẩm như bột canh tôm hay các sản phẩm surimi có bổ sung bột tôm vừa tăng giá trị dinh dưỡng vừa tạo mùi đặc trưng của sản phẩm Ứng dụng bày không chỉ nâng cao được giá trị cho nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm

mà còn đa dạng hóa được sản phẩm thực phẩm

c Tách chiết astaxanthin

Astaxanthin: là sắc tố chủ yếu trong vỏ tôm, astaxanthin là dẫn xuất của carotenoid, thường ở dạng liên kết với acid béo (ester hóa) hay với protein tạo nên một phức hợp chặt chẽ có màu xanh của tôm Khi liên kết này bị phá vỡ thì astaxanthin dễ dàng bị oxy hóa thành astaxin [4]

Mặt khác, trong đầu tôm ngoài thành phần chitin và protein chiếm tỷ lệ khá cao cần được thu hồi, trong phế liệu vỏ tôm còn chứa sắc tố astaxanthin tuy

với hàm lượng nhỏ nhưng có giá trị kinh tế rất lớn (khoảng 2.500 USD/kg) Đây

là một carotenoid có tác dụng kích thích sinh trưởng, tăng cường sức đề kháng, đồng thời tạo ra sắc tố màu đỏ cam rất đẹp ở tôm, cua, cá hồi, cá hồng…làm tăng giá trị kinh tế của các mặt hàng này Astaxanthin còn được ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm… Vì vậy, việc thu hồi astaxanthin trong phế liệu

vỏ tôm, cua đang được các nhà khoa học thế giới quan tâm [8] Biện pháp này cũng là một hướng đi đem lại giá trị cao cho nguồn nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm tại Việt Nam

1.1.2 Quá trình thủy phân Protein

1.1.2.1 Cơ chế của quá trình thủy phân protein

Protein là một chuỗi polymer dài, bao gồm các nhóm amino gắn với nhau bởi các liên kết peptide Phản ứng liên quan tới việc phá vỡ chuỗi các nhóm amino này thành các mạch, nhánh nhỏ hơn sử dụng nước được gọi là sự thủy phân protein

Trong suốt quá trình phản ứng, liên kết peptide sẽ được tách ra do sự tấn công nuclephilic bởi phân tử nước, tạo thành acid cacboxylic và amin

Trong môi trường nước, sự thủy phân protein sẽ xảy ra như trong hình 1.1

Nhóm cacboxyl và nhóm amino tự do hình thành sau quá trình thủy phân

sẽ nhiều hơn hay ít ion hóa hơn, phụ thuộc vào pH của phản ứng thủy phân Từ đây sẽ hình thành anion RCOOH- và cation R-NH3+

Theo Alder - Nissen, thêm nước vào trong quá trình thủy phân protein có liên quan đến sự tấn công nucleophilic, các nhóm amino tự do (-NH2) có thể cũng hoạt động như nucleophilic phản ứng trực tiếp với protein để tách các liên kết peptide Phản ứng này cũng được xem như sự vận chuyển các peptide sinh ra anion RCOOH - và cation R-NH3+

Vì vậy, trong quá trình thủy phân protein các nhóm amino tự do hình thành hỗ trợ cho sự phá vỡ, cắt mạch protein Enzyme sẽ thúc đẩy phản ứng thủy phân dẫn tới việc cắt chuỗi mạch peptide triệt để hơn và hình thành nhiều phân

tử nhỏ hơn như peptide mạch ngắn, amino acid Enzyme mà xúc tác cho phản ứng thủy phân protein là protease

Enzyme protease là chất xúc tác sinh học mang bản chất là protein có tính đặc hiệu cao, nó có khả năng tương tác lên các liên kết peptide (-CO-NH-) trong phân tử protein và cơ chất tương tự, làm cho các liên kết này bị suy yếu và dễ dàng bị đứt ra khi có yếu tố nước tham gia Thông thường enzyme tác dụng và chuyển hóa cơ chất phải trải qua ba giai đoạn [25]:

Giai đoạn 1: Enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức

hợp enzyme - cơ chất (ES) không bền, phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng thấp, các liên kết yếu tạo thành giữa enzyme và cơ chất trong phức hợp ES

là tương tác tĩnh điện, liên kết hydrogen, liên kết vandecvan

Giai đoạn 2: Là giai đoạn tạo phức chất hoạt hóa xảy ra sự biến đổi cơ

chất, dưới tác dụng của một số nhóm chức trong trung tâm hoạt động của

enzyme làm cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động, một số liên kết trong cơ chất bị kéo căng ra và mật độ electron trong cơ chất bị thay đổi

Giai đoạn 3: Là giai đoạn tạo ra sản phẩm của phản ứng và enzyme được

giải phóng ra dưới dạng tự do như ban đầu

Hình 1.2 Sơ đồ phản ứng thủy phân xúc tác bởi protease

Trong đó:

E: Kí hiệu cho enzyme

S: Kí hiệu cho cơ chất

P và P+ biểu thị kết quả các peptide có kích thước khác nhau được tách ra Mặt khác, enzyme protease được sử dụng để thủy phân protein bởi vì so với chất xúc tác vô cơ, enzyme có những đặc tính ưu việt là [30]:

- Phản ứng thực hiện gần như có hiệu quả 100% và không kèm theo phụ phẩm thừa

- Đồng thời có thể xảy ra nhiều phản ứng độc lập khác nhau, không bị rối bởi các sản phẩm phụ

- Vận tốc phẩm ứng nhanh hơn, cường độ xúc tác mạnh hơn

- Điều kiện phản ứng ôn hòa, đại đa số xảy ra ở môi trường trung tính Các điều kiện hoạt động của enzyme ôn hòa, không quá khắc khe nhiệt độ chỉ yêu cầu 35 - 600C với môi trường trung tính, trong khi đó chất xúc tác vô cơ đòi hỏi tới cả 1000

C tại môi trường acid hoặc kiềm

- Các phản ứng chịu sự điều hòa hợp lý và tiết kiệm nhất, tiêu tốn năng lượng là tối thiểu

E + S ES EP + H – P+ E + P – OH + H – P+

H2O

- Một đặc tính rất quan trọng nữa của enzyme là trong quá trình thực hiện phản ứng nó không bị phá hủy Khi phản ứng xúc tác kết thúc, chúng được tự do

và tiếp tục xúc tác các phân tử cơ chất mới

Vì vậy, enzyme protease ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong kỹ thuật, công nghệ và đời sống

Tóm lại, quá trình thủy phân protein diễn ra như sau:

enzyme enzyme enzyme

Protein polypeptide peptide acid amin

Do vậy, tùy thuộc vào mức độ thủy phân, thời gian thủy phân mà người ta

có thể thu được peptide hay acid amin

Các đặc tính của protein thủy phân được đánh giá thông qua độ thủy phân

và cấu trúc của peptide tạo thành Điều này phụ thuộc vào tính chất tự nhiên của protein và tính đặc hiệu của enzyme sử dụng, cũng như việc kiểm soát các thông

số của quá trình thủy phân như nhiệt độ, thời gian, pH… Giá trị dinh dưỡng của protein thường được giữ nguyên hay tăng lên bởi enzyme thủy phân, khi mà tiến hành dưới các điều kiện phản ứng nhẹ nhàng Protein bị cắt mạch thành các đơn

vị nhỏ hơn như peptide hay acid amin

Tỷ lệ giữa enzyme và cơ chất xác định tốc độ thủy phân, ban đầu tốc độ thủy phân là cao nhất sau đó giảm dần theo thời gian Phản ứng thủy phân tạm dừng khi không còn nhiều liên kết peptide sẵn có cho enzyme Độ thủy phân tối

đa có thể đạt được phụ thuộc vào tính chất tự nhiên của protein và đặc trưng của enzyme

1.1.2.2 Phương pháp thu nhận protein thủy phân

Một số phương pháp thu nhận protein phổ biến hiện nay:

a Phương pháp cơ học

Nguyên lý là sử dụng cơ học để tách một phần protein ra khỏi nguyên liệu

vỏ đầu tôm Hiệu quả của phương pháp này không cao Tuy nhiên, quá trình này

đã loại bỏ một phần protein tự do trong đầu tôm vì vậy giảm thiểu được hóa chất

sử dụng cho các công đoạn tiếp theo

b Phương pháp hóa học

Một số công trình trên thế giới đã nghiên cứu xử dụng NaOH vì các ưu điểm đơn giản, không đòi hỏi thiết bị máy móc nhưng protein bị ảnh hưởng tới chất lượng trầm trọng bởi kiềm mạnh

c Phương pháp sinh học

Nguyên lý là sử dụng hệ enzyme có sẵn trong đầu tôm hoặc bổ sung enzyme để thủy phân protein đầu tôm thành các peptide, acid amin và thu hồi chúng

d Phương pháp hóa lý

Nguyên lý dựa trên sự kết tủa protein bằng cách dùng acid để điều chỉnh

pH dung dịch chứa protein về điểm đẳng điện của protein (pH = 4 - 5,5), sau đó dùng phương pháp lắng, lọc để thu hồi protein Phương pháp này có ưu điểm đơn giản, dễ làm, có thể thu hồi protein với hiệu suất cao

1.2 ENZYME PROTEASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU CÕN LẠI

1.2.1 Phân loại enzyme protease và nguồn thu nhận

1.2.1.1 Phân loại enzyme protease

Nhóm enzyme protease xúc tác cho các quá trình thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng

là các acid amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển acid min

Phân loại enzyme protease có thể căn cứ vào các tiêu chí sau [2]:

- Cơ chế phản ứng của enzyme tham gia

- pH tối thích cho hoạt động của enzyme như protease acid, protease kiềm, protease trung tính

- Nguồn thu các enzyme protease

- Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme

Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidease phân chia thành 2 loại:

+ Aminopeptidease: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide

+ Carboxypeptidease: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidease được chia thành 4

nhóm [25]:

+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin Nhómchymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm 2 loại enzyme vi khuẩn subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính

và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papain,

bromelin, một vài proteinase động vật và proteinase ký sinh trùng Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như : pepsin, chymosin, cathepsin, renin

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy

ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm: + Protease acid: pH = 2 – 4

+ Protease trung tính: pH = 7 – 8

+ Protease kiềm: pH = 9 – 11

1.2.1.2 Nguồn thu nhận enzyme protease

Nguồn thu nhận enyme protease chủ yếu từ 3 nguồn cơ bản sau:

a Nguồn động vật

Đây là nguồn enzyme được sử dụng từ rất lâu đời và có chứa nhiều enzyme nhất Enzyme đuợc tách ra từ các mô như: tụy tạng, dạ dày, ruột và nội tạng của một số loài thủy sản (mực, cá…) thường là trypsin, chymotrypsin, pepsin, cathepsin…

Ví dụ: trong dạ dày bê tồn tại enzyme thuộc nhóm protease tên là rennin thường được sử dụng phổ biến trong công nghệ phomat

b Nguồn thực vật

Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin Papain thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả,

chồi dứa, vỏ dứa Các protease thực vật sử dụng trong công nghệ làm mềm thịt

và trong mục tiêu tiêu hóa Ficin thu đƣợc từ nhựa cây cọ (Ficus carica) Enzyme đƣợc sử dụng thủy phân protein tự nhiên

Bacillus subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus và một số giống thuộc

chi Clostridium Trong đó, B.subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất

[2]

+ Nấm:

Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lƣợng lớn protease đƣợc

ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A

terricola, A.fumigatus, A.saitoi, Penicillium chysogenum… Một số nấm mốc

khác nhƣ: A.candidatus, P.cameberti, P.roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp

protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng sản xuất phomat

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng hoạt động của enzyme protease

Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất protein, xúc tác cho các phản ứng bên trong và ngoài cơ thể Hoạt động của enzyme phụ thuộc chặt chẽ vào nhiều yếu tố khác nhau như: nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ enzyme và cơ chất, chất ức chế, chất hoạt hóa… Tất cả các yếu tố trên nếu thích hợp thì vận tốc phản ứng do enzyme sẽ là tối đa

a Ảnh hưởng của nhiệt độ:

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến tính chất của enzyme Nhiệt độ cao làm biến tính không thuận nghịch enzyme Bản chất của enzyme là protein nên khi tăng hay giảm nhiệt độ thường ảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme và enzyme chỉ thể hiện hoạt tính cao nhất ở một giới hạn nhiệt độ nhất định Nhiệt độ thấp làm biến tính thuận nghịch enzyme, tức là khi đưa enzyme từ nhiệt độ thấp lên nhiệt độ bình thường, thì enzyme sẽ phục hồi khả năng xúc tác của mình nên người ta thường bảo quản enzyme ở nhiệt độ thấp Giá trị nhiệt độ

mà enzyme bắt đầu mất hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn Giá trị nhiệt độ mà enzyme thể hiện cao nhất khả năng xúc tác gọi là nhiệt độ tối thích Cùng một enzyme nhưng lấy từ các nguồn khác nhau thì vùng nhiệt độ tối thích cũng khác nhau

Thông thường đối với đa số enzyme thì nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 40 - 500

Cvà nhiệt độ lớn hơn 700C đa số enzyme bị mất hoạt tính Do vậy nhiệt độ 700C gọi là nhiệt độ tới hạn của enzyme

Trong khoảng nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ của enzyme, nếu nhiệt độ tăng 100C thì tốc độ thủy phân của enzyme tăng từ 1,5 - 2 lần Nhiệt độ thích hợp đối với một enzyme có thể thay đổi khi có sự thay đổi về pH và cơ chất

b Ảnh hưởng của pH:

Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi của pH bởi vì pH của môi trường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến

độ bền của enzyme Mỗi enzyme chỉ hoạt động ở một vùng pH nhất định gọi là

pH tối thích, pH tối thích của đa số enzyme nằm trong vùng trung tính, acid yếu hoặc kiềm yếu, chỉ rất ít enzyme hoạt động mạnh trong vùng acid hay kiềm

Nguyên liệu còn lại sau quá trình chế biến tôm có thể bị thủy phân bởi enzyme protease có sẵn trong đầu tôm vì thế chúng ta phải chọn enzyme nào đóng vai trò là enzyme chính xúc tác cho quá trình thủy phân để tạo môi trường

có pH thích hợp cho nó hoạt động và hạn chế ảnh hưởng của các enzyme khác Tại pH tối thích thì enzyme lẫn cơ chất đạt đến trạng thái ion hóa thích hợp nhất khiến cho chúng dễ dàng kết hợp với nhau nên vận tốc phản ứng tăng lên

c Ảnh hưởng của thời gian:

Thời gian thủy phân kéo dài hay rút ngắn đều ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình thủy phân và chất lượng của sản phẩm Thời gian tác dụng kéo dài, enzyme có điều kiện để cắt mạch triệt để dẫn đến sự biến đổi sâu sắc của cơ chất Nhưng nếu kéo dài thời gian thủy phân quá mức sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật hoạt động làm sản sinh ra nhiều sản phẩm cấp thấp như: NH3, H2S, indol, scaptol… đồng thời khi kéo dài hiệu quả kinh tế kém Khi rút ngắn thời gian thủy phân, sự thủy phân protein chưa triệt để dẫn tới hiệu suất thủy phân thấp, gây lãng phí nguyên liệu và gây khó khăn cho khâu lọc rửa để thu dịch protein

d Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc:

Khi thủy phân diện tích tiếp xúc giữa enzyme protease và nguyên liệu còn lại sau chế biến tôm cũng ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ thủy phân Để tạo điều kiện cho enzyme protease hoạt động tốt người ta thường xay nhỏ nguyên liệu,

khi diện tích tiếp xúc giữa enzyme protease với protein càng lớn thì quá trình thủy phân càng dễ dàng và ngược lại

e Ảnh hưởng của nồng độ enzyme:

Trong điều kiện thừa cơ chất, nếu càng tăng nồng độ enzyme protease thì quá trình thủy phân xảy ra càng mãnh liệt Khi nồng độ enzyme bão hòa với nồng độ cơ chất, dù tăng nồng độ enzyme bao nhiêu đi nữa vận tốc của quá trình thủy phân rất ít thay đổi

f Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất:

Khi enzyme protease kết hợp với cơ chất là nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm sẽ tạo thành phức trung gian enzyme và cơ chất Phức chất này sẽ kéo căng liên kết peptide, chuyển hóa thành sản phẩm dịch đạm và giải phóng enzyme

Quá trình này cứ tiếp tục xảy ra đến khi cơ chất hết, nếu nồng độ cơ chất thích hợp với lượng enzyme sẽ làm cho quá trình thủy phân diễn ra đều đặn, nhanh chóng

g Ảnh hưởng độ tươi của nguyên liệu:

Thành phần hóa học của đầu tôm ngoài chitin, protein, astaxanthin, còn có một lượng lớn enzyme nội tạng tại thuộc họ protease Theo các nghiên cứu của các nhà khoa học trường Đại học Nha Trang đã chứng minh rằng hoạt độ enzyme protease của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/g

Các enzyme này chủ yếu tồn tại trong nội tạng của đầu tôm nguyên liệu tươi Chính vì vậy mà độ tươi nguyên liệu có ảnh hưởng lớn tới hoạt động của protease nguyên liệu càng tươi thì lượng enzyme càng nhiều hoạt động càng mạnh và ngược lại

Do vậy chất lượng của nguyên liệu là mối quan tâm hàng đầu của các nhà nghiên cứu về thủy phân protein để đảm bảo chất lượng sản phẩm mà còn ảnh hưởng nhiều tới hiệu quả thủy phân của protease [14]

h Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung vào hỗn hợp thủy phân:

Nước là yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến phản ứng thủy phân Nó có khả năng điều chỉnh phản ứng thủy phân, bởi lẽ nước là môi trường tăng cường quá trình phân cắt các liên kết nhị dương, là môi trường khuyếch tán enzyme và cơ chất tạo điều kiện cho tốc độ phản ứng xảy ra Do vậy quá trình thủy phân nguyên liệu đầu tôm nếu ta bổ sung nước với tỷ lệ thấp sẽ hạn chế được hoạt động của vi sinh vật nhưng đồng thời ức chế hoạt động của enzyme làm giảm hiệu suất thủy phân Nhưng nếu bổ sung nước với tỷ lệ quá cao, vi sinh vật hoạt động và phát triển phân hủy sản phẩm thành các sản phẩm thứ cấp Vì vậy, ta phải xác định tỷ lệ nước bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân

j Ảnh hưởng của chất hoạt hóa:

Chất kích hoạt là những chất có khả năng làm tăng hiệu lực xúc tác của enzyme hoặc chuyển enzyme từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động Mỗi enzyme đòi hỏi cho mình chất hoạt hóa riêng

Vai trò của chất hoạt hóa: Phục hồi một số nhóm chức hoạt động yếu hoặc không hoạt động thành hoạt động Chất hoạt hóa có tác dụng cắt một số đoạn

peptide đang ức chế hoạt động của enzyme để hình thành lại trung tâm hoạt động của enzyme và enzyme trở nên hoạt động Chất hoạt hóa có thể làm cho các ion kim loại, phi kim làm cầu nối giữa enzyme và cơ chất hoặc làm tăng diện tích tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất

Các chất hoạt hóa có khả năng cắt đứt một vài đoạn peptide đang kìm hãm

sự hình thành trung tâm hoạt động của enzyme Chất hoạt hóa có thể kết hợp vào các điểm dị không gian giúp trung tâm hoạt động biến đổi theo hướng có lợi và chất xúc tác Chất kích hoạt có thể là ion kim loại kiềm: Ba2+, Ca2+, Cl-, Br-, I-… những ion này có vai trò làm cầu nối giữa enzyme với cơ chất, tăng diện tích tiếp xúc giữ enzyme với cơ chất, ổn định cấu trúc không gian cần cho sự xúc tác Ngoài ra, chất hoạt hóa còn có vai trò phục hồi nhóm chức chưa hoạt động hoặc hoạt động ít trở nên hoạt động mạnh mẽ hơn

1.2.3 Hệ enzyme protease của tôm

Sự tiêu hóa và trao đổi chất protein, các hợp chất nitơ khác giữa các loài giáp xác khác nhau rất nhiều Các enzyme tiêu hóa đặc biệt là enzyme tiêu hóa protein ở giáp xác nói chung và của tôm nói riêng khá giống với enzyme có trong dạ dày của cá Protease ở tôm không có dạng pepsin, chủ yếu ở dạng trypsin và có khả năng hoạt động rất cao Ngoài ra, còn có enzyme chymotrypsin, actacine Qua một số nghiên cứu cho thấy enzyme ở tôm nói chung là các protein kiềm tính Các enzyme này có tính chất chung của enzyme:

- Hòa tan trong nước, dung dịch nước muối và một số dung môi hữu cơ nên dựa vào tính chất này để tách chiết chúng

- Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hòa, ethanol, aceton để thu chế phẩm enzyme

- Hoạt tính của enzyme có thể tăng hay giảm dưới tác dụng của các chất hoạt hóa hoặc chất ức chế

- Độ hoạt động của enzyme chịu ảnh hưởng lớn bởi các yếu tố: nhiệt độ,

pH môi trường

Protease của tôm cũng như các loài động vật thủy sản khác là các enzyme nội bào, tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hóa đến nội tạng và cơ thịt Do đặc điểm hệ tiêu hóa nội tạng của tôm nằm ở phần đầu nên hệ enzyme tập trung nhiều nhất ở phần đầu

- Trypsin: Có trong dịch vị tụy tạng, khả năng tác dụng của trypsin khá mạnh với các loại protein có phân tử lượng thấp ở các liên kết peptide Trypsin

từ ruột tôm có pH thích hợp là 7,8 ở 38o

C

- Peptidease, ereptase và các loại khác: Tham gia thủy phân liên kết peptide và các polypeptide Khả năng tác dụng cũng như tính đặc hiệu của enzyme này phụ thuộc vào bản chất của các nhóm nằm liền kề bên mối liên kết peptide

- Cacbonhydrase: Enzyme này xúc tác thủy phân các glucid và glucozit Ngoài ra, trong đầu tôm có chứa enzyme tiêu hóa chymotrypsin [14] được sử dụng trong điều trị ung thư, ngoài ra trong vỏ tôm còn có một số

enzyme khác như alkaline photphatase, β-N-acetylglucosamidase, deacetylase,

chitinase [1] cũng được ứng dụng nhiều trong thực tế Đa số các enzyme nội tại trong phế liệu tôm là các enzyme có khả năng xúc tác cho các phản ứng thủy phân cắt mạch protein, cho nên khi tiến hành quá trình thủy phân protein trên đầu tôm cũng cần quan tâm đến enzyme nội tại này

1.2.4 Các nghiên cứu thu hồi protein thủy phân bằng enzyme

Qua các nghiên cứu cho thấy từ đầu tôm có thể sản xuất ra nhiều loại sản phẩm hữu ích khác như chitin - chitosan, chiết các hợp chất mang màu, thu nhận enzyme và trong đầu tôm còn chứa một lượng thịt có thể tận dụng để thu hồi protein từ đầu tôm có chứa các hợp chất sinh học Vì vậy, đã có nhiều nghiên cứu tập trung các hướng này để thu hồi protein từ đầu tôm và ứng dụng trong một số lĩnh vực như thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và phân bón

Hoạt tính sinh học của dịch thủy phân protein đã được nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm và qua khảo sát đã thu được một số kết quả khả quan như sau:

- Các nghiên cứu trong nước:

Phạm Thị Liên (2005) đã nghiên cứu tách chiết axtaxanthin, protein và chitin trong sản xuất để đạt hiệu quả kinh tế cao hơn [10]

Ngô Thị Hoài Dương và cộng sự (2010) [7] đã tiến hành nghiên cứu thu hồi protein từ đầu tôm, các chất có hoạt tính sinh học và khả năng chống oxy hóa, kết quả cho thấy trong phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng của Việt Nam có chứa một lượng đáng kể các chất có hoạt tính sinh học như acid amin, acid béo, khoáng đa lượng Sản phẩm thủy phân protein từ phế liệu đầu tôm bằng enzyme Alcalase cho thấy có khả năng chống oxy hóa Vì thế cần thu hồi các chất có hoạt tính sinh học trong phế liệu tôm để tăng cường khả năng tận dụng phế liệu

từ tôm [8]

Đặng Thị Hiền (2008) đã sử dụng enzyme Alcalase để tiến hành thủy phân phế liệu tôm và tận thu protein và axtaxanthin trong công nghệ sản xuất chitin – chitosan [9]

Trang Sỹ Trung (2007) đã sử dụng enzyme Flavourzyme để tiến hành thủy phân phế liệu tôm Tại nhiệt độ 50o

C, 6 giờ, pH= 6,5, tỷ lệ enzyme bổ sung là 0,1%, thì hiệu suất thu hồi protein khoảng 92 - 95% [18]

Nguyễn Minh Trí và cộng sự (2009) đã nghiên cứu tách protein từ đầu tôm thẻ trong sản xuất chitin, sau đó dùng dịch này cô đặc và bổ sung vào chượp trong sản xuất nước mắm [17]

- Các nghiên cứu trên thế giới:

Năm 2007, bằng các phép thử về khả năng chống oxy hóa, một nhóm các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra chất chống oxy hóa có trong Mungoong, một món ăn truyền thống của người Thái Lan được làm từ dịch chiết từ nguyên liệu còn lại của tôm Qua nghiên cứu, người ta nhận thấy rằng Mungoong chứa các chất chống oxy hóa Dịch hòa tan từ sản phẩm này có hoạt tính chống oxy hóa cao bởi các test thử DPPH, ABTS radical scavenging activities và FRAP Hoạt tính chống oxy hóa phụ thuộc vào nồng độ dịch hòa tan từ sản phẩm này

Năm 2009, nhóm các nhà khoa học người Thái Lan đã nghiên cứu sản phẩm lên men của tôm và giáp xác, đây là các sản phẩm truyền thống của Thái Lan Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng sản phẩm lên men này có hàm lượng protein cao, và hầu hết các sản phẩm có hoạt tính sinh học, đặc biệt là khả năng chống oxy hóa tự nhiên và có lợi ích cho sức khỏe

Dora (2011) đã nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân protein từ nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm bằng các enzyme protease từ vi sinh vật bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RMS) Ông đã nghiên cứu sử dụng các enzyme Alcalase, Neutrase và Flavourzyme cho quá trình thủy phân protein trong nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm So sánh hoạt động thủy phân của các enzyme này, ông kết luận rằng Alcalase cho kết quả thủy phân tốt nhất

Dùng phương pháp bề mặt đáp ứng, phương án central composit (CCD) để tối

ưu quá trình thủy phân protein từ nguyên liệu còn lại trong chế biến tôm, ông đã đưa ra được chế độ thủy phân tối ưu là nhiệt độ thủy phân 59,37oC, ở pH = 8,25, thời gian thủy phân 84,42 phút, nồng độ enzyme/cơ chất 1,84%, cho độ thủy phân 33,13% Protein thủy phân thu được có giá trị dinh dưỡng cao, chứa hàm lương protein cao (72,3%), acid amin (529,93 mg/g) với các acid amin thiết yếu [20] đã nghiên cứu thu hồi protein trong quá trình sản xuất chitosan chất lượng cao dùng trong mỹ phẩm Trong quá trình thủy phân, tác giả dùng enzyme thương mại có sẵn (Alcalase) và protein thủy phân được thành các acid amin thiết yếu với hàm lượng cao, tuy nhiên chúng không làm ảnh hưởng tới chất lượng chitosan Hàm lượng protein thu được 68,5% cao hơn so với việc thu hồi theo phương pháp thông thường là 12,8% Ngoài ra, sau khi ly tâm để thu hồi

protein còn thu được một lượng astaxanthin để bổ sung vào thức ăn cho cá hồi

Gildberg và Stenberg (2001) thu được 68,5% protein từ phế liệu tôm

Pandalus borealis sau 2 giờ thủy phân với enzyme Alcalase

Wenhong Cao và các cộng sự (2006) đã nghiên cứu thu hồi protein của

đầu tôm thẻ chân trắng bằng cách cho đầu tôm tự thủy phân và điều chỉnh nhiệt

độ bằng cách nâng nhiệt độ dần dần từ 400C đến 700C, cứ sau 30 phút thì tăng lên 50C, pH tự nhiên [26]

Józef Synowiecki và cộng sự (1999) nghiên cứu ứng dụng Alcalase để khử

protein của phế liệu vỏ tôm Crangon crangon nhằm thu hồi Chitin và protein

[24]

Rao và Steven (2005) đã sản xuất được chitin bằng cách ủ xilo đầu và vỏ tôm là 4,5% và 13% với đầu tôm đã khử được 83% protein và 88% khoáng, khử được 66% protein và 63% khoáng từ vỏ tôm

Y Xu & C Gallert & J Winter (2008) đã nghiên cứu Chitin tinh chế từ vỏ

Penaeus monodon và Crangon crangon bằng cách sử dụng một quá trình có hai

giai đoạn lên men kỵ khí để thủy phân potein sau đó khử khoáng thông qua quá trình lên men acid lactic [27]

1.3 CÁC CHẤT CHỐNG OXY HÓA VÀ ỨNG DỤNG

1.3.1 Giới thiệu chất chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa là một loại hóa chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxy hóa chất khác Phản ứng oxy hóa là loại phản ứng hóa học trong đó electron được chuyển sang các chất oxy hóa, có khả năng tạo các gốc tự do sinh

ra phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào sinh vật Chất chống oxy hóa ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxy hóa bằng cách oxy hóa chính chúng Để làm vậy người ta hay dùng các chất khử (như thiol hay polyphenol) làm chất chống oxy hóa [29]

Chất chống oxy hóa được định nghĩa là tất cả những chất mà khi ta bổ sung chúng với hàm lượng nhỏ vào những đối tượng dễ bị oxy hóa thì sẽ ngăn chặn đáng kể phản ứng oxy hóa xảy ra [27] Những đối tượng dễ bị oxy hóa ở đây bao gồm thực phẩm, các tế bào sống, protein, lipit và cacbonhydrate, AND Định nghĩa này nhấn mạnh hơn tầm quan trọng của các chất chống oxy hóa [28]

Các chất chống oxy hóa thường được nhắc đến trong cơ thể sống và trong thực phẩm từ ß-carotene và metallothionein đến các histidine chứa dipeptide (carnosine, homo carnosi, anserine), acid phytic, taurine, bilirubin, ostrogen, creatinine, polyamine và melatonin Trong thực vật, các chất chống oxy hóa là các phenol như là quercetin, carnosol, thymol, acid carnosic, hydroxytyrosol, tannins, catechins, rutin, morin, acid ellagic… [27]

Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa: Chất chống oxy hóa là chất dinh dưỡng, có thể làm sạch các gốc tự do bằng cách đưa lên một electron Khi một phân tử gốc tự do nhận thêm một electron từ một phân tử chống oxy hóa, các gốc

tự do trở nên ổn định và không còn khả năng gây hại

Ngoài ra, chất chống oxy hóa còn giúp hạn chế sự phân hủy các hydroperoxide

Hình 1.3 Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa 1.3.2 Phân loại các chất chống oxy hóa

Các chất chống oxy hóa được phân loại theo nhiều cách khác nhau tùy vào tính chất và ứng dụng của nó Tuy nhiên trong thực tế hiện nay thường phân loại các chất chống oxy hóa theo ba cách sau:

a Dựa vào tính chất hóa học

Các chất chống oxy hóa được chia thành hai loại là tan trong nước hoặc tan trong dầu:

- Các chất chống oxy hóa tan trong nước như: vitamin C, beta-caroten…

- Các chất chống oxy hóa tan trong dầu như: vitamin E, các hợp chất phenol như là quercetin, thymol, carnosol…

b Dựa vào nguồn cung cấp cho cơ thể

Các chất chống oxy hóa được chia các chất chống oxy hóa thành hai loại là:

- Các chất được tổng hợp trong cơ thể

- Các chất được đưa vào cơ thể qua thức ăn và các loại thực phẩm bổ sung

c Dựa vào nguồn gốc

Chất chống oxy hóa trong thực phẩm bao gồm hai nhóm chính:

- Chất chống oxy hóa tự nhiên: Nhóm vitamin (vitamin C, vitamin E),

alkaloid, selen, polyphenol, carotenoid, peptide…

- Chất chống oxy hóa tổng hợp: BHT (butylated hydroxytoluen), BHA (butylate hydroxyanisole), TBHQ (tertbutyl hydroquinone)

1.3.3 Khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân

Hoạt tính sinh học của dịch thủy phân protein đã được nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm và qua khảo sát đã thu được một số kết quả khả quan như sau:

Năm 2009, nhóm các nhà khoa học người Thái Lan đã nghiên cứu sản phẩm lên men của tôm và giáp xác, đây là các sản phẩm truyền thống của Thái Lan Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng sản phẩm lên men này có hàm lượng protein cao, và hầu hết các sản phẩm có hoạt tính sinh học, đặc biệt là khả năng chống oxy hóa tự nhiên và có lợi ích cho sức khỏe

Năm 2007, bằng các test thử về khả năng chống oxy hóa, một nhóm các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra chất chống oxy hóa có trong Mungoong, một món ăn truyền thống của người Thái Lan được làm từ dịch chiết từ phế liệu của tôm Qua nghiên cứu, người ta nhận thấy rằng Mungoong chứa các chất chống oxy hóa Dịch hòa tan từ sản phẩm này có hoạt tính chống oxy hóa cao bởi các