Nghiên cứu công nghệ thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ hai loài nấm thượng hoàng (phellinus igniarius và phellinus nilgheriensis) ở việt nam, ứng dụng trong thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN TÂN THÀNH NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ THU NHẬN MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ HAI LOÀI NẤM THƯỢNG HOÀNG Phellinus igni

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN TÂN THÀNH

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ THU NHẬN MỘT SỐ HỢP CHẤT

CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ HAI LOÀI NẤM THƯỢNG HOÀNG

(Phellinus igniarius và Phellinus nilgheriensis) Ở VIỆT NAM,

ỨNG DỤNG TRONG THỰC PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Hà Nội 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN TÂN THÀNH

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ THU NHẬN MỘT SỐ HỢP CHẤT

CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ HAI LOÀI NẤM THƯỢNG HOÀNG

(Phellinus igniarius và Phellinus nilgheriensis) Ở VIỆT NAM,

ỨNG DỤNG TRONG THỰC PHẨM

Ngành: Công nghệ thực phẩm

Mã số: 9540101

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS TÔN THẤT MINH

2 GS.TS TRẦN ĐÌNH THẮNG

Hà Nội 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong Luận án này là trung thực và chưa được các tác giả khác công bố

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành Luận án đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận án đã được ghi rõ nguồn gốc

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong Luận án này

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Nguyễn Tân Thành

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các Thầy giáo hướng dẫn khoa học là PGS TS Tôn Thất Minh và GS.TS Trần Đình Thắng đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ và động viên

trong suốt thời gian thực hiện luận án

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới quý thầy, cô giáo Bộ môn Quá trình và thiết bị trong CNSH-CNTP, Viện Công nghệ sinh học và Thực phẩm-Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội cũng như bạn bè, đồng nghiệp tại bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Viện Công nghệ Hóa Sinh

và Môi trường, Trường Đại học Vinh đã hết sức giúp đỡ và hướng dẫn, chỉ bảo trong suốt thời gian thực hiện luận án

Tôi xin chân thành cám ơn PGS.TS Ngô Anh, Đại học Khoa học Huế đã giúp tôi định danh các mẫu nấm Tôi cũng bày tỏ lòng biết ơn GS.TS Tian-Shung Wu và GS.TS Ping-Chung Kuo, Đại học Quốc gia Cheng-Kung, Đài Loan đã giúp tôi đánh giá kết quả

Nhân dịp này, tôi cũng xin cảm ơn các anh chị, em trong phòng Đào tạo Sau đại học của Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã luôn ủng hộ tinh thần và giúp đỡ trong công việc tại phòng để tôi có thể hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cám ơn Trung tâm thực hành thí nghiệm, Trường đại học Vinh, các NCS, Học viên cao học ngành Hóa hữu cơ, các em sinh viên khóa 51, 52, 53 ngành Công nghệ thực phẩm đã giúp đỡ tôi thực hiện các nghiên cứu của mình

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, những người bạn đã động viên và khích lệ cho tôi có được sự chuyên tâm và động lực phấn đấu thực hiện luận án này

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Nguyễn Tân Thành

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC HÌNH xi

DANH MỤC SƠ ĐỒ xiii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của luận án 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 2

5 Những điểm mới của luận án 3

6 Cấu trúc của luận án 3

Chương 1 TỔNG QUAN 4

1.1 NẤM THƯỢNG HOÀNG 4

1.1.1 Vị trí nấm thượng hoàng trong phân loại nấm học 4

1.1.2 Đặc điểm hình thái quả thể của nấm thượng hoàng 5

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA NẤM THƯỢNG HOÀNG 5

1.2.1 Một số thành phần dinh dưỡng trong nấm thượng hoàng 5

1.2.2 Các nhóm chất trao đổi bậc 2 trong nấm thượng hoàng 7

1.2.2.1 Polysaccharide và protein-polysaccharide 7

1.2.2.2 Steroid 9

1.2.2.3 Terpenoid 11

1.2.2.4 Flavone, pyranone and furan 16

1.2.2.5 Styrylpyrone 18

1.2.2.6 Polychlorinate 21

1.2.2.7 Một số hợp chất khác 22

1.2.3 Hoạt tính sinh học của nấm thượng hoàng (Phellinus sp.) 22

1.2.3.1 Hoạt tính chống ung thư 23

1.2.3.2 Hoạt tính chống oxi hóa 23

1.2.3.3 Hoạt tính miễn dịch 24

1.3 CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT CÁC HOẠT CHẤT TRONG NẤM DƯỢC LIỆU 24

1.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng quá trình tách chiết các hoạt chất từ nấm dược liệu 24

1.3.2 Các phương pháp tách chiết phenolic, flavonoid trong nấm dược liệu 26

1.3.2.1 Phương pháp chiết tách bằng cồn 27

1.3.2.2 Phương pháp chiết tách bằng nước 28

1.3.2.3 Phương pháp chiết tách bằng methanol 29

1.4 CÔNG NGHỆ SẤY NGUYÊN LIỆU VÀ DỊCH CHIẾT TỪ NẤM DƯỢC LIỆU 29

1.4.1 Các phương pháp sấy 29

1.4.1.1 Phương pháp sấy nóng 29

1.4.1.2 Phương pháp sấy lạnh 29

1.4.2 Một số phương pháp để sấy nguyên liệu và dịch chiết từ nấm dược liệu 30

1.5 ỨNG DỤNG CỦA NẤM DƯỢC LIỆU TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG 31

1.5.1 Thực phẩm chức năng 31

1.5.2 Thực phẩm chức năng từ nấm dược liệu 32

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 34

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 34

2.1.2 Hóa chất 35

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 35

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.2.1 Phương pháp phân tích thành phần dinh dưỡng và thành phần hóa học 36

2.2.1.1 Xác định hàm lượng cellulose trong nguyên liệu 36

2.2.1.2 Phương pháp xác định acid amin trong nấm 36

2.2.1.3 Phương pháp xác định các vitamin trong nấm thượng hoàng 38

2.2.1.4 Xác định hàm lượng khoáng và kim loại trong nguyên liệu bằng phương pháp AAS 42 2.2.1.5 Xác định tổng hàm lượng phenolic 43

2.2.1.6 Xác định tổng hàm lượng flavonoid 45

2.2.1.7 Xác định thành phần hóa học của nấm bằng phương pháp LC/MS 45

2.2.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập các hợp chất 46

2.2.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 46

2.2.2.2 Sắc ký cột (CC) 46

2.2.2.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-High Perfomance Liquid Chromatography) 46

2.2.3.4 Phân lập các hợp chất 46

2.2.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất 48

2.2.3.1 Phổ tử ngoại (UV) 48

2.2.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 48

2.2.3.4 Dữ kiện vật lý của các hợp chất 48

2.2.4 Các phương pháp xác định hoạt tính sinh học 49

2.2.4.1 Xác định hoạt tính chống oxy hóa 49

2.2.4.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư 49

2.2.5 Quy hoạch thực nghiệm 50

2.2.6 Phương pháp tiến hành quá trình chiết xuất dịch nấm thượng hoàng 51

2.2.7 Phương pháp tiến hành quá trình sấy phun dịch chiết từ nấm thượng hoàng 51

2.2.6 Đánh giá cảm quan cho theo phương pháp cho điểm thị hiếu 52

2.2.7 Phương pháp thống kê xử lý số liệu 52

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53

3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA NẤM THƯỢNG HOÀNG 53

3.1.1 Hàm lượng cellulose trong nguyên liệu 53

3.1.2 Hàm lượng acid amin 53

3.1.3 Hàm lượng các loại vitamin trong nấm thượng hoàng 55

3.1.3.1 Hàm lượng vitamin E 55

3.1.3.2 Hàm lượng vitamin D2 55

3.1.3.3 Hàm lượng vitamin B3 56

3.1.4 Hàm lượng khoáng và kim loại trong nấm thượng hoàng 57

3.1.5 Hàm lượng tổng phenolic và flavonoid 58

3.1.6 Thành phần hóa học trong nấm thượng hoàng (P igniarius) 59

3.2 PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CHẤT VÀ HOẠT TÍNH CỦA MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG DỊCH CHIẾT NẤM THƯỢNG HOÀNG 60

3.2.1 Chiết các phân đoạn 60

3.2.2 Xác định cấu trúc của các hợp chất 61

3.3 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH CỦA CAO CHIẾT VÀ HỢP CHẤT SẠCH 84

3.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ P iganirius 84

3.3.2 Hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết nấm thượng hoàng (P igniarius và P nilgheriensis) 85

3.3.3 Hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết từ nấm thượng hoàng 86

3.4 XÂY DỰNG QUY TRÌNH TRÍCH LY DỊCH CHIẾT TỪ NẤM THƯỢNG HOÀNG 86

3.4.1 Khảo sát các phương pháp chiết 87

3.4.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất dịch nấm thượng hoàng (P igniarius) 88

3.4.2.1 Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 88

3.4.2.2 Khảo sát nhiệt độ chiết xuất 89

3.4.2.3 Khảo sát thời gian chiết xuất 91

3.4.2.4 Khảo sát nồng độ dung môi 92

3.4.3 Tối ưu hóa quá trình tách chiết một số hợp chất trong nấm thượng hoàng 93

3.4.3.1 Thiết lập mô hình 93

3.4.3.2 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất nấm thượng hoàng (P igniarius) 97

3.4.3.3 Kiểm tra lại mô hình tối ưu hóa 98

3.4.4 Tối ưu hóa quy trình tách chiết một số hợp chất trong nấm thượng hoàng (P nilgheriensis) 98

3.5 XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẤY PHUN DỊCH CHIẾT DỊCH CHIẾT TỪ NẤM

THƯỢNG HOÀNG 99

3.5.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sấy dịch nấm thượng hoàng 99

3.5.1.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ bổ sung maltodextrin 99

3.5.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy 100

3.5.1.3 Ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch 101

3.5.2 Tối ưu hóa quá trình sấy phun dịch chiết từ nấm thượng hoàng (P gniarius) 102

3.5.2.1 Thiết lập mô hình 102

3.5.2.2 Tối ưu hoá quá trình sấy phun 104

3.5.2.3 Kiểm tra lại mô hình 105

3.6 ỨNG DỤNG NẤM THƯỢNG HOÀNG (P IGNIARIUS) TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM 107

3.6.1 Quy trình sản xuất bánh quy 107

3.6.2 Quy trình sản xuất cà phê hòa tan 109

3.6.3 Quy trình sản xuất Trà nấm thượng hoàng 111

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 115

TÀI LIỆU THAM KHẢO 116

TIẾNG VIỆT 116

TIẾNG ANH 117

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

13C-NMR Carbon-13 Magnetic Resonance

Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13

1H-NMR Proton Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

proton AAS Atomic Absorption Spectrophotometric Phổ hấp thụ nguyên tử

AES Atomic emission spectrocopy Quang phổ phát xạ nguyên tử

DEPT Distortionless Enhancement by

Polarisation Transfer

Phổ DEPT

EI-MS Electron Impact-Mass Spectroscopy Phổ khối va chạm electron

ESI-MS Electron Spray Ionzation-Mass

Spectroscopy

Phổ khối lượng phun mù electron

GAE Gallic acid equivalent Acid glilic tương đương

HepG2 Human hepatocyte carcinoma cell line Dòng tế bào ung thư gan

HIV Human Immuno-deficiency Virus Vi rút gây suy giảm miễn dịch ở

người

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ tương tác dị hạt nhân qua

nhiều liên kết H→C

HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HR-ESI-MS High Relution-Electron Spray Impact

J (Hz) Hằng số tương tác tính bằng Hz

PBMCs Peripheral blood mononuclear cell Tế bào đơn nhân máu ngoại vi

SC Scavenging capacity Khả năng trung hòa các gốc tự do TLC Thin Layer Chromatography Sắc kí lớp mỏng

δC Carbon chemical shift Độ chuyển dịch hóa học của

carbon

δ*C Carbon chemical shift Độ chuyển dịch hóa học của

carbon theo tài liệu tham khảo

proton

δ*H Proton chemical shift Độ chuyển dịch hóa học của

proton theo tài liệu tham khảo

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của quả thể nấm thượng hoàng P igniarius và P linteus 6

Bảng 1.2 Thành phần và hàm lượng acid amin trong quả thể nấm thượng hoàng 6

Bảng 1.3 Thành phần khoáng và kim loại trong quả thể nấm thượng hoàng P linteus 7

Bảng 1.4 Các hợp chất styrylpyrone từ các loài Phellinus và hoạt tính sinh học 18

Bảng 1.5 Phân loại các hợp chất phenolic dựa trên số lượng nguyên tử cacbon 26

Bảng 2.1 Ký hiệu các mẫu phân tích hàm lượng acid amin 38

Bảng 2.2 Ký hiệu các mẫu mang đi phân tích hàm lượng vitamin B3 41

Bảng 2.3 Chương trình vô cơ hóa mẫu trong lò vi sóng 43

Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu 50

Bảng 3.1 Hàm lượng cellulose trong nấm thượng hoàng 53

Bảng 3.2 Hàm lượng acid amin trong nấm thượng hoàng 53

Bảng 3.3 Hàm lượng acid amin trong mẫu nấm P igniarius theo các phương pháp sấy khác nhau 54

Bảng 3.4 Hàm lượng vitamin E trong nấm thượng hoàng 55

Bảng 3.5 Hàm lượng vitamin D2 trong nguyên liệu nấm thượng hoàng 56

Bảng 3.6 Hàm lượng vitamin D2 trong bột nấm thượng hoàng sau khi sấy đông khô 56

Bảng 3.7 Hàm lượng vitamin B3 trong nấm thượng hoàng 56

Bảng 3.8 Hàm lượng viatamin B3 trong nấm thượng hoàng sau khi chiết với các nồng độ ethanol khác nhau 57

Bảng 3.9 Hàm lượng một số kim loại trong nấm thượng hoàng 57

Bảng 3.10 Hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong nấm thượng hoàng 58

Bảng 3.11 Nhận dạng các hợp chất polyphenol từ dịch chiết nấm P igniarius 59

Bảng 3.12 Các hợp chất phân lập từ nấm thượng hoàng (P igniarius) 61

Bảng 3.13 Dữ liệu phổ 1 H- và 13 C-NMR của hợp chất PIE-1 (400 MHz, DMSO-d 6 ) 62

Bảng 3.14 Quy gán giá trị phổ NMR của hợp chất PIE-2 và PIE-3 73

Bảng 3.15 Số liệu phổ NMR của hợp chất PIE-4 75

Bảng 3.16 Bảng số liệu phổ NMR của hợp chất PIE-5 77

Bảng 3.17 Số liệu phổ 1 H-NMR và 13 C- NMR của hợp chất Inoscavin A 79

Bảng 3.18 Số liệu phổ 13 C- NMR của hợp chất Daidzin 81

Bảng 3.19 Số liệu phổ 1 H-NMR và 13 C- NMR của hợp chất Pterocarpin 82

Bảng 3.20 Kết quả phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR và DEPT của hợp chất 5-hydroxy-7-methoxyflavone 83

Bảng 3.21 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào 3 dòng ung thư của hợp chất phân lập từ loài P iganirius 85

Bảng 3.22 Hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết từ nấm thượng hoàng 85

Bảng 3.23 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào 3 dòng ung thư của dịch chiết từ nấm thượng hoàng 86

Bảng 3.24 Kết quả khảo sát các phương pháp tách chiết ảnh hưởng đến hàm lượng tổng

Phenolic và hàm lượng chất khô thu nhận từ 2 loài nấm thượng hoàng 87

Bảng 3.25 Kết quả khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi tách chiết 89

Bảng 3.26 Khảo sát nhiệt độ chiết xuất 90

Bảng 3.27 Khảo sát thời gian chiết xuất 91

Bảng 3.28 Khảo sát nồng độ dung môi 92

Bảng 3.29 Mức ảnh hưởng của các yếu tố 94

Bảng 3.30 Kết quả thí nghiệm tối ưu quy trình tách chiết các hợp chất từ loài P igniarius 94 Bảng 3.31 Bảng phân tích hồi quy của 3 hàm mục tiêu: Hàm lượng tổng phenolic (Y 1 ), hàm lượng tổng flavonoid (Y 2 ) và hiệu suất chất chiết thu nhận(Y 3 ) 95

Bảng 3.32 Điều kiện và hệ số quan trọng của các hàm mục tiêu 97

Bảng 3.33 Kết quả chiết xuất hàm lượng tổng phenolic, hàm lượng tổng flavonoid và lượng chất chiết thu nhận theo điều kiện tối ưu (P igniarius) 98

Bảng 3.34 Kết quả chiết xuất hàm lượng tổng phenolic, hàm lượng tổng flavonoid và lượng chất chiết thu nhận theo điều kiện tối ưu (P nilgheriensis) 98

Bảng 3.35 Mã hóa của các biến độc lập 102

Bảng 3.36 Thiết kế thí nghiệm và kết quả 102

Bảng 3.37 Kết quả phân tích hồi quy hàm lượng tổng phenolic và độ ẩm sản phẩm 103

Bảng 3.38 Điều kiện và hệ số quan trọng của các hàm mục tiêu 105

Bảng 3.39 Kết quả sấy phun dịch chiết nấm thượng hoàng theo điều kiện tối ưu 105

Bảng 3.40 Công thức sản xuất bánh quy bổ sung nấm thượng hoàng 108

Bảng 3.41 Công thức sản xuất cà phê hòa tan bổ sung nấm thượng hoàng 110

Bảng 3.42 Công thức sản xuất trà hòa tan bổ sung nấm thượng hoàng 111

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Quả thể nấm thượng hoàng (P igniarius) 5

Hình 2.1 Nấm thượng hoàng Phellinus igniarius 34

Hình 2.2 Nấm thượng hoàng Phellinus nilgheriensis 34

Hình 2.3 Khảo sát bước sóng của chất chuẩn vitamin E 38

Hình 2.4 Đồ thị đường chuẩn vitamin E 39

Hình 2.5 Đồ thị đường chuẩn vitamin D2 40

Hình 2.6 Đồ thị đường chuẩn vitamin B3 42

Hình 2.7 Đồ thị đường chuẩn acid gallic 44

Hình 2.8 Đồ thị đường chuẩn flavonoid 45

Hình 3.1 Sắc ký đồ LC-MS của dịch chiết ethanol nấm P igniarius ở Việt Nam 59

Hình 3.2 Các hợp chất polyphenol từ dịch chiết P igniarius 60

Hình 3.3 Phổ HMBC của hợp chất PIE-1 62

Hình 3.4 Phổ khối lượng (HR-ESI-MS) của hợp chất PIE-1 63

Hình 3.5 Phổ 1 H-NMR của hợp chất PIE-1 64

Hình 3.6 Phổ 1 H-NMR của hợp chất PIE-1 64

Hình 3.7 Phổ 1 H-NMR của hợp chất PIE-1 65

Hình 3.8 Phổ 13 C-NMR và DEPT135 của hợp chất PIE-1 65

Hình 3.9 Phổ 13 C-NMR và DEPT135 của hợp chất PIE-1 66

Hình 3.10 Phổ 13 C-NMR và DEPT135 của hợp chất PIE-1 66

Hình 3.11 Phổ 13 C-NMR và DEPT135 của hợp chất PIE-1 67

Hình 3.12 Phổ HMBC của hợp chất PIE-1 (igniarine) 67

Hình 3.13 Phổ HMBC của hợp chất PIE-1 (igniarine) 68

Hình 3.14 Phổ HMBC của hợp chất PIE-1 (igniarine) 68

Hình 3.15 Phổ HSQC của hợp chất PIE-1 (igniarine) 69

Hình 3.16 Phổ HSQC của hợp chất PIE-1 (igniarine) 69

Hình 3.17 Phổ HSQC của hợp chất PIE-1 (igniarine) 70

Hình 3.18 Phổ NOESY của hợp chất PIE-1 (igniarine) 70

Hình 3.19 Phổ NOESY của hợp chất PIE-1 (igniarine) 71

Hình 3.20 Phổ COSY của hợp chất PIE-1 (igniarine) 71

Hình 3.21 Phổ COSY của hợp chất PIE-1 (igniarine) 72

Hình 3.22 Ảnh hưởng của phương pháp chiết xuất đến hàm lượng phenolic và hàm lượng chất chiết thu nhận 88

Hình 3.23 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng tổng phenolic 89

Hình 3.24 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tổng hàm lượng phenolic, flavonoid và lượng chất chiết thu nhận 90

Hình 3.25 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng tổng phenolic, flavonoid và lượng chất chiết thu nhận 92

Hình 3.26 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng tổng phenolic, flavonoid và

lượng chất chiết thu nhận 93

Hình 3.27 Ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng tổng phenolic, hàm lượng tổng

flavonoid và hiệu suất chất chiết thu nhận 96

Hình 3.28 Bề mặt đáp ứng của hàm lượng tổng phenolic, tổng flavonoid và hàm lượng chất

trình sấy phun dịch chiết từ nấm Thượng hoàng (P igniarius) 104

Hình 3.34 Ảnh hưởng đơn yếu tố đến hàm lượng tổng phenolic và độ ẩm sản phẩm 104 Hình 3.35 Mức độ đáp ứng sự mong đợi của quá trình sấy phun dịch chiết từ nấm thượng

hoàng (P igniarius) 105

Hình 3.36 Kết quả đánh giá thị hiếu sản phẩm bánh quy bổ sung bột nấm thượng hoàng 107 Hình 3.37 Sản phẩm bánh quy bổ sung bột nấm thượng hoàng 109 Hình 3.38 Kết quả đánh giá thị hiếu sản phẩm cà phê hòa tan bổ sung bột nấm thượng

hoàng 109

Hình 3.39 Sản phẩm cà phê hòa tan bổ sung nấm Thượng hoàng 110 Hình 3.40 Kết quả đánh giá thị hiếu sản phẩm trà hòa tan bổ sung bột nấm thượng hoàng111 Hình 3.41 Sản phẩm trà hòa tan bổ sung nấm thượng hoàng 112

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Quy trình chuẩn bị chạy sắc ký HPLC 37

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ nấm P igniarius 47

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ quy trình sản xuất bột nấm thượng hoàng 106

Sơ đồ 3.2 Quy trình sản xuất bánh quy bổ sung nấm thượng hoàng 106

Sơ đồ 3.3 Quy trình sản xuất cà phê sữa hòa tan bổ sung nấm thượng hoàng quy mô phòng thí nghiệm 110

Sơ đồ 3.4 Quy trình sản xuất trà hòa tan bổ sung bột nấm thượng hoàng quy mô phòng thí nghiệm 112

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Nấm Thượng hoàng (hay còn gọi là nấm Hoàng sơn) tên chỉ các loài trong chi

Phellinus, thuộc họ Hymenochaetaceae (ở Trung Quốc gọi là Songgen, Hàn Quốc gọi là

Sang Hwang, Nhật Bản gọi là Meshima) Đây là một loại nấm quý trong tự nhiên đã được người Nhật Bản, Hàn Quốc sử dụng rộng rãi trong việc điều trị, tăng cường khả năng của

hệ thống miễn dịch, giúp giảm lượng cholesterol và đường trong máu Trong nấm thượng hoàng có chứa nhiều thành phần hóa học như acid amin, vitamin, khoáng, carbonhydrat và một số hợp chất có hoạt tính sinh học như polysaccharid, protein-polysaccharide, steroid, terpenoid, flavone, styrylpyrone, furane và polychlorinat [81] Các loại nấm này cũng hiệu quả đối với nhiều bệnh, bao gồm việc tăng lưu thông máu, ngăn ngừa và điều trị bệnh tim, tăng khả năng giải độc và bảo vệ gan, chống lại bệnh dị ứng và tiểu đường, giảm căng thẳng Nấm có chức năng chống ung thư mạnh và ngăn ngừa sự phát triển của khối u Năm

1976, nhóm nghiên cứu của TS Chihara tại Trung tâm nghiên cứu ung thư Nhật Bản kiểm tra và so sánh tỷ lệ kháng ung thư trên chuột của dịch chiết nước nóng 27 loại nấm thuốc

thì nấm Phellinus linteus đã được xếp hạng số 1 với một tỷ lệ ức chế tế bào u báng (Sarcoma 180) ở chuột là 96,7% Phellinus igniarius được xếp thứ 3 với tỷ lệ là

87,4%.[28]

Ngày nay, ngày càng nhiều các nhà khoa học tập trung nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài nấm nhằm phát hiện các hoạt chất có dược tính mạnh đối với các căn bệnh nan y như viêm gan, kháng viêm ung thư, HIV, tăng hệ miễn dịch, chống oxy hóa… Việc đưa vào sử dụng rộng rãi các chế phẩm được tách chiết từ nấm sẽ giúp con người khỏe mạnh, phòng chống được nhiều căn bệnh tiềm ẩn, nguy hiểm [4], [9], [10]

Hiện nay, tổng sản lượng của các loài phellinus trên thế giới chỉ khoảng 30 tấn/năm,

chủ yếu từ thu hái hoang dại Trên thế giới cũng chỉ có 4 nước trồng loài nấm này là Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan Ở Việt Nam, Trung tâm linh chi và nấm dược liệu

TPHCM đã bước đầu nghiên cứu và nuôi trồng thành công loài nấm thượng hoàng P

linteus trong bịch mạt cưa gỗ cao su, năng suất khoảng 140 kg/năm, sản phẩm nấm sau khi

thu hoạch được bảo quản bằng cách sấy khô để đưa bán ra thị trường trong nước và xuất khẩu thô ra nước ngoài

Việc khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học, các thành phần dinh dưỡng trong nấm thượng hoàng bằng các công nghệ chế biến hiện đại, tạo ra được các sản phẩm giàu hoạt chất để ứng dụng sản xuất các loại thực phẩm chức năng có khả năng hỗ trợ, nâng cao sức khỏa là hướng đi đúng và cần thiết Xuất phát từ thực tế nghiên cứu và sự cấp thiết

trên, chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu công nghệ thu nhận một số hợp chất có hoạt

tính sinh học từ hai loài nấm thượng hoàng (Phellinus igniarius và Phellinus nilgheriensis) ở Việt Nam, ứng dụng trong thực phẩm”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng được cơ sở dữ liệu về thành phần dinh dưỡng và thành phần hóa học của

hai loài nấm thượng hoàng (Phellinus igniarius và Phellinus nilgheriensis) ở khu vực Bắc

trung bộ, Việt Nam

- Đề xuất được quy trình công nghệ tối ưu về chiết xuất và sấy phun dịch chiết từ hai loài nấm thượng hoàng; xây dựng một số quy trình sản xuất một số sản phẩm thực phẩm có

bổ sung nấm thượng hoàng

3 Nội dung nghiên cứu

- Thu mẫu và xác định tên khoa học của 2 loài nấm thượng hoàng ở Việt Nam (P

igniarius và P nilgheriensis)

- Nghiên cứu thành phần hóa học (các vitamin, acid amin, các kim loại, hàm lượng

tổng phenolic, flavonoid) từ nấm thượng hoàng thu hái từ tự nhiên

- Phân lập, xác định cấu trúc và thử hoạt tính sinh học các hợp chất thu được từ nấm

thượng hoàng (P igniarius) ở Việt Nam

- Xây dựng quy trình công nghệ chiết xuất và sấy phun dịch nấm thượng hoàng (P

- Kết quả nghiên cứu về thành phần dinh dưỡng và thành phần hóa học trong hai loài

nấm thượng hoàng (P igniarius và P nilgheriensis) là đóng góp khoa học có độ tin cậy

cao, góp phần làm phong phú thêm về cơ sở dữ liệu về chất lượng nguyên liệu, thành phần hóa học của các loài nấm lớn ở Việt Nam

- Đã phân lập và xác định cấu trúc của 9 hợp chất trong nấm thượng hoàng (P

igniarius) trong đó đã tìm ra một chất mới thuộc nhóm chất triterpenoid Đã thử hoạt tính

gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư HepG2, MCF7, Lu và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết và hợp chất sạch, kết quả cho thấy các hợp chất sạch có khả năng kháng các dùng tế bào ung thư trên

- Đã đề xuất được công nghệ (chiết xuất và sấy phun) thu nhận một số hợp chất từ

hai loài nấm thượng hoàng (P igniarius và P nilgheriensis) ở Việt Nam

4.2 Ý nghĩa thực tiễn:

- Các kết quả nghiên cứu của đề tài về công nghệ thu nhận một số hợp chất sinh học

từ nấm thượng hoàng sẽ tạo nên các sản phẩm có giá trị kinh tế cao, có tác dụng chống oxy hóa, có khả năng ngăn chặn và chữa bệnh Đây là việc làm cần thiết, phù hợp với xu thế của thời đại, đóng góp cho sự phát triển của kinh tế - xã hội và bảo vệ sức khỏe cộng đồng

- Kết quả nghiên cứu của đề tài là tài liệu tham khảo khoa học đáng tin cậy và có giá trị; là tài liệu phục vụ cho giảng dạy, nghiên cứu khoa học và cho cả sản xuất sau này

5 Những điểm mới của luận án

- Đây là nghiên cứu đầy đủ về thành phần dinh dưỡng (acid amin; vitamin E, D2, B3;

kim loại…) từ hai loài nấm thượng hoàng (P igniarius và P nilgheriensis) thu hái ở Việt

Nam

- Đã phân lập và xác định cấu trúc của 9 hợp chất trong nấm thượng hoàng

(Phellinus igniarius) là: igniarine 1), meshimakobnol B 3), inoscavin A

(PIE-6), daidzin (PIE-7), ergosterol (PIE-4), pterocarpin (PIE-8), ergosterol peroxit (PIE-5), meshimakobnol A (PIE-2) và 5-hydroxy-7-methoxyflavone (PIE-9) Trong đó hợp chất igniarine (PIE-1) là hợp chất mới Đã thử hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào

ung thư HepG2, MCF7, Lu và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết và hợp chất sạch

- Tối ưu hóa quy trình công nghệ chiết xuất và sấy phun dịch nấm thượng hoàng (P

igniarius và P nilgheriensis) Đề xuất quy trình chế biến một số sản phẩm thực phẩm bổ

sung nấm thượng hoàng như: bánh quy, trà nấm và cà phê hòa tan có tính chất cảm quan hấp dẫn người dùng

6 Cấu trúc của luận án

Luận án bao gồm 127 trang với 51 bảng số liệu, 50 hình và 06 sơ đồ với 155 tài liệu tham khảo Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (03 trang), tổng quan (30 trang), nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu (19 trang), kết quả và thảo luận (60 trang), kết luận và đề xuất nghiên cứu tiếp tục (02 trang), danh mục công trình công bố (01 trang), tài liệu tham khảo (12 trang) Ngoài ra còn có phần phụ lục

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 NẤM THƯỢNG HOÀNG

Chi Phellinus thuộc họ Hymenochaetaceae phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu

Mỹ, châu Phi và Đông Á (đặc biệt là Trung Quốc, Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc), ở Việt Nam có khoảng 26 loài Chúng được sử dụng để phòng và chữa rối loạn chức năng tiêu hóa, tiêu chảy, xuất huyết, dị ứng, bệnh tiểu đường và ung thư [155] Trong các nghiên cứu

nhằm sử dụng nấm Phellinus vào phương pháp điều trị trong Tây y, nhiều nhà nghiên cứu

đã nghiên cứu hoạt tính sinh học của các dịch chiết từ quả thể (hoặc sợi nấm) của nấm

Phellinus ở in vitro và in vivo [155]

Nhiều báo cáo khoa học đã tập trung vào hoạt tính sinh học của các loài nấm này [114], [115], [133] trong khi các phân đoạn và xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học,

chức năng chống ung thư, và các cơ chế dược lý của P linteus đã được báo cáo tổng kết

năm 2008 [155] Đây là tổng quan đầy đủ các tài liệu tham khảo từ năm 1999 đến tháng 6

năm 2011 về tinh chế các sản phẩm tự nhiên và khả năng ứng dụng chữa bệnh của loài P

linteus, đặc biệt là hợp chất có phân tử lượng nhỏ có hoạt tính sinh học, cũng như các tác

dụng dược lý chống ung thư, tăng cường hệ miễn dịch, chống oxy hóa, kháng viêm, chống tiểu đường và hoạt tính kháng khuẩn

Chi Phellinus có một số loài (P linteus, P ribis, P igniarius) đã được dùng trong

việc chữa bệnh ung thư, tiểu đường, nhiễm trùng do vi khuẩn và virus, và viêm loét [80],

[81] P linteus được sử dụng như một thành phần bổ sung vào các loại thực phẩm ở khu

vực Đông Á [155] Các nghiên cứu về sự phân lập các hợp chất polysaccharide và polysaccharide, steroid, terpenoid, flavone, styrylpyrone, furane và polychlorinat [80], [81], [155]

protein-Trong vài thập kỷ qua, một số lượng lớn các hợp chất hóa học đã được phân lập

nấm Phellinus Thành phần chính của chúng là các polysaccharide - thành phần chính gây

ra hoạt động chống ung thư của nấm Phellinus Ngoài ra còn có các thành phần khác như

flavones, coumarins, ergosterols, acid agaricic, acid béo, triterpenes, acid aromatic, acid amin, oxidase xylose, urease, catalase, esterase, sucrase, men lactase cellulase [54], [112]

1.1.1 Vị trí nấm thượng hoàng trong phân loại nấm học

Theo tác giả Trịnh Tam Kiệt (2011) [15], nấm Thượng hoàng thuộc:

Theo thống kê thì có hơn 150 loài nấm thuộc chi Phellinus như: P linteus, P

igniarius, P nilghenriensis, P baumii, P pini, P andinus, P gilvus, P nigricans, P rhabarnarinus, P ribis, P rimosus, P merrilii…

1.1.2 Đặc điểm hình thái quả thể của nấm thượng hoàng

Quả thể của các loại nấm này thường có kích thước khoảng 7-10 x 11-15 x 5-8 cm, nhiều năm, không cuống, dạng quạt đến thon dài, gỗ cứng Mặt trên có màu nâu hạt dẻ, có khi có lông mịn, mờ Nấm thượng hoàng thường mọc ở những vùng rừng sâu núi cao hiểm trở, các khu rừng nguyên sinh, tuổi nấm có khi đến vài chục năm Loài nấm này thường phát triển trên thân hoặc gốc cây dâu tằm

Hình 1.1 Quả thể nấm Phellinus igniarius

(Nguồn http://www.amanitacesarea.com/phellinus-igniarius.html)

Theo y học phương Đông, nấm thượng hoàng có khả năng điều hòa miễn dịch mạnh

và tăng chức năng miễn dịch Nấm cũng hiệu quả đối với nhiều bệnh, bao gồm việc tăng lưu thông máu, ngăn ngừa và điều trị bệnh tim, tăng khả năng giải độc và bảo vệ gan, chống lại bệnh dị ứng và tiểu đường, giảm căng thẳng Đặc biệt, nấm thượng hoàng có công dụng chống ung thư mạnh và ngăn ngừa sự phát triển của khối u [155] Dịch chiết nước nóng của 27 loài nấm thì nấm thượng hoàng cho tỉ lệ ức chế các khối u là cao nhất 96,7% so với nấm mèo là 42,6%, nấm vân chi là 77,5%, nấm linh chi là 64,9% [28]

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA NẤM THƯỢNG HOÀNG

1.2.1 Một số thành phần dinh dưỡng trong nấm thượng hoàng

Các nghiên cứu về thành phần dinh dưỡng của nấm Thượng hoàng cho thấy đây là một loại nấm có giá trị dinh dưỡng và có nhiều hợp chất có chứa hoạt tính sinh học Tuy

nhiên, phụ thuộc vào vị trí địa lý, tuổi đời của nấm nên hàm lượng của các thành phần này

có sự khác nhau Các nghiên cứu về hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm thượng hoàng thì tương đối nhiều nhưng nghiên cứu về thành phần dinh dưỡng trong nấm thượng hoàng thì còn ít Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng của một số loại nấm thượng hoàng ở Hàn Quốc được thể hiện qua bảng dưới đây:

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của quả thể nấm thượng hoàng P igniarius và P

Thành phần, hàm lượng acid amin và kim loại trong quả thể nấm thượng hoàng

(Phellinus linteus) của nhóm nghiên cứu Lee và cộng sự được thể hiện ở bảng 1.2 và 1.3

sau đây:

Bảng 1.2 Thành phần và hàm lượng acid amin trong quả thể nấm thượng hoàng

Phellinus linteus (mg/100g nấm khô) [88]

Acid amin Dịch chiết ethanol

(mg/100g nấm khô)

Dịch chiết nước (mg/100g nấm khô)

Bảng 1.3 Thành phần khoáng và kim loại trong quả thể nấm thượng hoàng P linteus [86]

Thành phần/chỉ tiêu Dịch chiết ethanol Dịch chiết nước

Kim loại (mg/100g nấm khô)

Từ dịch chiết nước chứa polysaccharide (PIP) từ sợi nấm P igniarius Cấu trúc của

PIP1 được xác định gồm các monosaccharide của glucose, galactose, và mannose Tỉ lệ mol là 3.70:4.06:1.00 Khối lượng phân tử 17 kD

Một heteropolysaccharide mới PIP60-1 (1) được phân lập từ quả thể nấm P

igniarius có khối lượng phân tử 17.1 kDa và thành phần gồm L-fucose, glucose,

D-mannose, D-galactose và 3-O-Me-D-galactose với tỉ lệ 1:1:1:2:1 [147]

Từ dịch chiết nước của quả thể P ribis đã phân lập được một polysaccharide là

PRP (2) [95] Ngoài ra, từ dịch chiết nước của P igniarius còn phân lập được một

heteropolysaccharide là PISP1 (3) Nó có thành phần bao gồm fucose, galactose, mannose,

và 3-O-Me-galactose với tỉ lệ 1:2:1:2

PIP60-1 (1)

PRP (2)

PISP1 (3)

Ge và cộng sự [39] đã phân lập được một polysaccharide hòa tan trong nước có tên

là PBF6 3-O-metyl-galactose lần đầu tiên được phân lập bởi Yang và cộng sự [149] Từ quả thể của nấm P linteus bằng cách sử dụng sắc ký ion, sắc ký khí kết hợp với quang phổ

khối và NMR Ge và cộng sự đã xác định một polysaccharide, có tên là PBF1, có khung

của D-glucopyranosyl liên kết β-(1→6) với một D-glucopyranosyl liên kết β-(1→3) Một hợp chất khác gọi là PBF2 chứa khung β-(1 →6)-D-glucopyranose [40] Kim và cộng sự [67] đã phân lập một acid proteoglycan từ P linteus bằng phương pháp sắc ký anion

cellulose DEAE Phân tích thêm cho thấy proteoglycan gồm 72,2% polysaccharides và 22,3% protein và phần polysaccharide chủ yếu bao gồm mannose, galactose, glucose, arabinose cũng như xylose và phần protein chứa rất nhiều acid glutamic…Một fucoglucan,

PBF4 bao gồm L-fucose và D-glucose (1:4) đã được phân lập từ quả thể của nấm P

linteus, các hợp chất này có hoạt tính kích thích khả năng miễn dịch, hoạt tính chống ung

thư và khả năng quét các gốc tự do Cấu trúc thông tin cho thấy nó chứa bộ khung

α-(1→4)-D-glucopyranose với một α-(1→2) -L-Fucp [40]

1.2.2.2 Steroid

Nhóm nghiên cứu của Wu et al [145] đã nghiên cứu thành phần hoá học của môi

trường lỏng và sợi nấm của P linteus bằng cách sử dụng phương pháp sắc ký Xác định được bốn steroid bao gồm homopregnene (3R, 4S, 5S, 17R, 20R-3, 17,20-trihydroxy-4-

methylpregn-8-en-7-one) và ba dẫn chất heptanorergosterane (phellinignincisterol A (4), phellinignincisterol B (5), phellinignincisterol C (6), và chín sesquiterpene tremulane gồm

(+) - (3S, 6R, 7R) -tremulene-6, 11, 12-triol, (+) - (3S, 6S, 7S, 10S) -tremulene-10, 11, 12 (2S, 3S, 6S, 7S, 9R) -tremul-1 (10) - (3S, 6R, 7R, 10S) -tremulene-6, 10, (2S, 3S, 6S, 7S, 9S) -tremul-1 (10) -ene-11, 12, 15-triol, (-) - (2R, (2S, 3S, 4S, 6S, 7S) -tremul-1 (10) -ene (3S,

6S, 7S, 9R) tremul1 (10) ene 11, 12, 14triol; 4, 11, 12triol, (+) (2S, 3R, 6S, 7S)

-tremul-1 (10) -ene-2, 12-diol; (+) - (1R, 6S, 7S) tremul-2-ene-12 (11) -lactone cũng như một số hợp chất khác đã được phân lập từ quả thể P igniarius [145], [154]

Năm 1969, Efimenko công bố phân lập được ergosterol (7) từ P pini var abietis

[34], Sau đó, nhiều công trình công bố phân lập được các steroid khác từ Phellinus

Năm 2006, Đặng Ngọc Quang và cộng sự đã phân lập được một steroid mới là

25-hydroxy-ergosta-7,24(28)-dien-3-β-ol (8), có tên gọi là phellinol, cùng với senexonol (9)

và ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (10) [113], các hợp chất này có khả năng ức chế các

lopopolysaccharide và dùng để sản xuất nitric oxide

Phellinignincisterol A (4) Phellinignincisterol B (5) Phellinignincisterol C (6)

Ergosterol (7) 25-hydroxy-ergosta-7,24(28)-dien-3 β-ol (8) Năm 2007, các steroid bao gồm episterol (11), dehydroperoxide ergosterol (12),

ergosterol peroxide (13), 6-O-methyl cerevisterol (14) phân lập từ loài P linteus [97]

Ergosterol peroxide (13) 6-O-methyl cerevisterol (14)

Năm 2009, 5-ergosta-7,22-diene-3-one (15) được công bố phân lập từ loài P

gilvus bởi Liu và các cộng sự, hợp chất này có hoạt tính hạ đường huyết [94]

Ở Việt Nam, Lê Mai Hương và cộng sự đã phân lập từ P adamantinus tại vườn

quốc gia Cúc Phương được 4 hợp chất steroid: ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-on (10), ergosta-4,7,22-trien-3,6-dion (16), ergosterol peroxide (13), cerevisterol (ergosta-7,22E-

diene-3β,5α,6β-triol) (17) được tìm thấy lần đầu tiên ở chủng nấm này Chất ergosterol

peroxide có hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư cơ vân (RD) và hoạt tính

kháng chủng vi khuẩn tụ cầu vàng Staphylococcus aureus [55]

5-ergosta-7,22-diene-3-one

(15)

Ergosta-4,7,22-trien-3,6-dion

Nhóm nghiên cứu của Wu và cộng sự đã phân lập từ P.igniarius được bốn steroid

Các hợp chất terpenoid được phân lập từ nấm Phellinus chủ yếu là các lớp chất

sesquiterpenoid, diterpenoid và triterpenoid

- Sesquiterpenoid

Ayer và cộng sự (1993) [23] nghiên cứu từ loài P tremulae đã phân lập một nhóm

các tremulane thuộc lớp chất sesquiterpenoid bao gồm tremulenolide A (26), tremulenolide B (27), tremulenedial (28), tremulenedial dibenzyl acetal (29)

Năm 2010, Trong nghiên cứu về thành phần hóa học của P igniarius, Wu và cộng

sự đã phân lập được 9 tramulen bao gồm (+)-(3S, 6R, 7R)-tremulene-6,11,12-triol (30), (+)-(3S, 6S, 7S, 10S)-tremulene-10,11,12-triol (31), (+)-(3S, 6R, 7R, 10S)-tremulene- 6,10,12-triol (32), (-)-(2S, 3S, 6S, 7S, 9R)-tremul-1(10)-ene-11,12,14-triol (33), (-)-(2S, 3S, 6S, 7S, 9S)-tremul-1(10)-ene-11, 12, 15-triol (34), (-)-(2R, 3S, 6S, 7S, 9R)-tremul-1(10)- ene-11,12,14-triol (35), (-)-(2S, 3S, 4S, 6S, 7S)-tremul-1(10)-ene- 4,11,12-triol (36), (+)- (2S, 3R, 6S, 7S)-tremul-1(10)-ene-2,12-diol (37), (+)-(1R, 6S, 7S)-tremul-2-ene-12(11)- lactone (38) [144] Ngoài ra, ba sesquiterpenoid là 11,12-O-isopropyldrimene (39),

3,11,12-trihydroxydrimene (40), 11,12,13α-trihydroxydrimene (41) cũng được phân lập

Năm 2014, Yin và cộng sự công bố khi phân lập được 5 hợp chất mới từ P

igniarius: 6,11,12-trihydroxytremul-1(10)-ene (42), 11,12-dihydroxyl-7

-peroxy-hydroxyl-tremul-1(10)-ene (43), 6,12-dihydroxytremulene (44), 10

,12-dihydroxy-tremulene (45), and 12,15-dihydroxy-,12-dihydroxy-tremulene (46) [152] Điều này chứng tỏ các hợp

chất tremulane sesquiterpene đặc trưng cho các loài Phellinus

6,11,12-trihydroxytremul-1(10)-ene (42) 11,12-dihydroxyl-7

-peroxy-hydroxyl-tremul-1(10)-ene (43)

6,12-dihydroxytremulene (44) R2 = α-OH, R1 = R3 = R4 = H (45)

R1 = OH, R2 = R3 = R4 = H (46)

Ngoài ra, các hợp chất sesquiterpenoid có cấu trúc khung drimane như phellinuin

A–G (47-53) tiếp tục được Liu và cộng sự phân lập được từ P tuberculosis, cho thấy loại

khung này cũng là thành phần chủ yếu của Phellinus [49]

Các hợp chất sesquiterpenoid được phân lập từ Phellinus còn có: 12-hydroxy-

-cadinol (54), 3,12-dihydroxy--cadinol (55), 3,6-dihydroxyspiroax-4-ene (56) từ P

igniarius [153], eudesm-1, 6, 11-triol (57) từ P igniarius [122], và phellinuin J (58) từ

P tuberculosus [51]

12-hydroxy--cadinol (54) 3,12-dihydroxy--cadinol (55) 3,6-dihydroxyspiroax-4-ene (56)

Eudesm-1, 6, 11-triol (57) Phellinuin J (58)

Các sesquiterpenoid mạch thẳng cũng được tìm thấy trong thành phần của nấm

Phellinus như: phellinuin H (59), phellinuin I (60),

3,7,11-trimethyldodeca-1,10-diene-3,6,7-triol (61), 3,7,11-trimethyldodeca-2,10-diene-1,6,7-triol (62), 2,3,6,7,10,11-pentaol (63), 3,7-dimethyl-6-octene-1,2,3-triol (64), 3,7-dimethylocta-1,6-dien-3,8-diol (65) [50]

- Diterpenoid

Wang và cộng sự [137] đã phân lập và xác định một diterpene:

12-hydroxy-7-oxo-5, 8, 11, 13-tetraene-18, 6-abietanolide (66) và sterol stigmasta-7, 22-diene-3β, 5α, 6α-triol

(67) bằng phương pháp quang phổ

Năm 2011, Jang và cộng sự [58] đã phân lập được hợp chất 8,14-labdadien-13-ol

(68) và acid dehydroabietic (69) từ quả thể của P pini

8,14-labdadien-13-ol (68) Acid dehydroabietic (69)

- Triterpenoid

Trong năm 2009, 4 chất lanostan-triterpenoid gilvsins A-D cùng với hai hợp chất

được biết là 24-methylenelanost-8-ene-3β, 22-diol (70) và 5α-ergosta-7, 22-dien-3-one (71) đã được tìm thấy trong quả thể nấm P igniarius [140]

Wang và cộng sự [135] thu được bốn lanostane-triterpenoid có tên igniarens A-D

(72-75) từ dịch chiết EtOH của nấm nuôi cấy P linteus Thêm vào đó, ba sesquiterpenes

mới bao gồm phellilins A-C (76-78) đã được phân lập từ chiết xuất ethanol của nấm nuôi

cấy của P linteus [53]

Năm 1986, Gonzalez và cộng sự [45] đã phân lập được hai triterpenoid acid

javeroic (79) và acid phellinic (80) từ loài P pomaceus Ngoài ra, Gonzalez cũng đã phân

lập được một furanoid triterpene là 23.26-dioxo-lanosta-8(9),23,25-trien-3.22-dione

(pomacerone) (81) [46] Ba triterpenoid bao gồm natalic (82), torulosic (83) và acid

albertic (84) đã được phân lập từ loài nấm P torulosus [47]

Natalic (82) Torulosic (83) Acid albertic (84)

Các lanostane-triterpenoid được phân lập từ P gilvus bao gồm các gilvsin A–D

Feng và cộng sự (2016) [36] đã phân lập thành công ba lanostane triterpenoid bao

gồm phellibarin A-C (93-95) từ quả thể nấm P rhabarbarinus

Phellibarin A (93) Phellibarin B (94) Phellibarin C (95)

1.2.2.4 Flavone, pyranone and furan

Có tổng 35 flavone, pyranone và furan đã được tách ra từ P linteus Trong số đó có

bốn flavone (phelligrin A và B, meshimakobnol A và B), 15 pyranone (phelligridimer A, phelligridins A-J, baumin, phellinin C cũng như phellinin B1 và B2 và năm chất furan (phellinusfrans A và B, phellifuropyranone A, phellinstatin cũng như phelliusin A) đã được

phân lập từ quả thể của P linteus Mo và cộng sự [103] đã phân lập được 7 flavones bao

gồm naringenin, sakuranetin, aromadendrin, folerogenin, eriodictyol coumarin và

scopoletin từ P linteus Và 2 hợp chất mới xác định là 5, 7, hydroxylbenzyldihydroflavone và 5, 7, 4'-trihydroxyl-8-O- hydroxylbenzyldihydroflavone

4'-trihydroxyl-6-O-Từ dịch chiết MeOH của P linteus, Nagatsu và cộng sự [106] đã phân lập được

meshimakobnol A và meshimakobnol B

Các sắc tố polyphenol của P linteus chủ yếu là pyranones bao gồm bộ khung hepidin và bộ khung benzopyrone Một chất ức chế β-secretase hispidin (C13H10O5) đã

được phân lập từ dịch nước nuôi cấy của P linteus [110] Từ cao chiết Etylaxetate của P

igniarius đã phân lập được phelligridins A-J và phelligridins G [104], [139], [138] Lee và

cộng sự phân lập từ quả thể nấm P linteus được ba hợp chất có tên là interfungins A-C [82], [83] Một số furan đã được báo cáo tồn tại trong Phellinus theo một số nghiên cứu

gần đây Một furanpyrone phellifuropyranone A, một tripelymer phellinstatin của anhydin cũng như phellinusfrans A và phellinusfrans B cũng được phân lập [72], [91], [63] Hai dẫn xuất của furan dạng phellinusfurans stereomeric A và B, phelliusin A cũng được báo cáo [99], [56], [151]

Meshimakobnol B: R = H (98)

Phelligridin B (99)

Phelligridin C (100) Phelligridin D (101)

Phellinusfuran A (102)

Phellinstatin (103)

Phelligridin A (104)

Năm 2003, Mo và cộng sự [103] đã phân lập được 5 hợp chất flavonoid từ P

igniarius bao gồm naringenin (105), sakuranetin (106), aromadendrin (107), folerogenin

(108) và eriodictyol (109)

Naringenin (105) Sakuranetin (106) Aromadendrin (107)

Hai hợp chất benzylated dihydroflavone là phelligrin A (110) và B (111) cũng đã

được phân lập từ loài này P igniarius [102]

Phelligrin A (110)

Phelligrin B (111) Hai dẫn xuất furane, phellinusfuran A (112) và B (113) đã được phân lập từ quả thể

nấm P linteus [101]

Phellinusfuran A (112) Phellinusfuran B (113) Phellinone (114) Inotilone (115)

Phellinone (114) là một dẫn xuất của furanone cũng đã được phân lập từ loài P

linteus [150] Ngoài ra, năm 2015 một dẫn xuất khác của furane được phân lập từ loài P

linteus là inotilone (115) [90]

1.2.2.5 Styrylpyrone

Các hợp chất màu styrylpyrone là những hơp chất chính thường gặp trong thành

phần hóa học của các loài Phellinus thuộc họ Hymenochaetaceae [37].Năm 1889, hợp chất

hispidin (116) phân lập từ loài Inonotus hispidus là hợp chất styrylpyrone đầu tiên phân lập

được từ tự nhiên Cho đến nay, các hợp chất chuyển hóa bậc hai styrylpyrone vẫn tiếp tục

được phân lập từ các loài Phellinus cho thấy hoạt tính sinh học như kháng ung thư, kháng

virut, kháng viêm, chống đông tụ tiểu cầu, chống oxi hóa khử và trị bệnh tiểu đường Các hợp chất styrylpyrone còn có trong thành phần hóa học của các họ thực vật hạt kín như Piperaceae, Lauraceae, Annonaceae, Ranuculaceae, Zingiberaceae… đóng vai trò rất quan trọng trong việc chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn, khả năng giảm đau và có hoạt tính sinh học mạnh đối với các dòng tế bào ung thư [24]

Bảng 1.4 Các hợp chất styrylpyrone từ các loài Phellinus và hoạt tính sinh học của chúng

Hispidin (116) Inonotus hispidus,

I xeranticus, Phellinus igniarius, P.pini, P ribis,

P linteus, P baumii

Chống oxi hóa, gây độc tế bào, kháng viêm, kháng virut, chống giảm trí nhớ

[22], [43], [63]

Bisnoryangonin (117) Gymnopilus aeruginosa Chống oxi hóa [43]

3,14′-Bihispidinyl (118) I hispidus, I xeranticus, P

[37], [43], [63]

Phelligridimer A (123) P igniarius Chống oxi hóa [137]

Squarrosidine (124) Pholiota squarrosa Kháng viêm [65]

[45], [65]

Phelligridin A (126) P igniarius Gây độc tế bào [79]

Phelligridin B (127) P igniarius Gây độc tế bào [79]

Phelligridin C (128) P igniarius, P linteus Gây độc tế bào [79]

Phelligridin D (129) P igniarius, P linteus, Gây độc tế bào [75], [76],

P Baumii [79]

Phelligridin E (130) P igniarius, I obliquus Gây độc tế bào [76], [79]

Phelligridin F (131) P igniarius, I xeranticus Gây độc tế bào [79]

Phelligridin G (132) P igniarius, I obliquus Chống oxi hóa, gây

[69]

Interfungin A (138) I xeranticus, P linteus,

P Baumii

Chống oxi hóa, chống tiểu đường

[81]

Davallialactone (139) I xeranticus, P igniarius,

P Baumi

Chống oxi hóa, chống tiểu đường, kháng viêm

[29]

Phelligridimer A (123)

Fasciculine A R = H (121) Fasciculine B R = OH (122)

Các hợp chất polychlorinate chlorophellin A-C (142-144) và drosophilin A (145)

đã được phân lập từ dịch chiết methanol của Phellinus ribis [78] Và dẫn xuất methyl ether

của drosophilin A (146) cũng đã được phân lập từ loài Phellinus fastuosus [129]

Chlorophellin B (143) Chlorophellin C (144)

1.2.2.7 Một số hợp chất khác

Ngoài các thành phần trên, một loạt các hợp chất khác cũng thu được từ nấm

Phellinus Mười hai hợp chất đã được tách ra và xác định cấu trúc bao gồm phellinin A1

(152), A2 phellibaumin A-E, methyl-phelligrin A (151) và B, isomethyl-phelligrin A và B

(148-149) Samchai và cộng sự [117] nghiên cứu dịch chiết dichloromethane của P linteus

thu được 2 dẫn xuất indol bao gồm este metyl methyl 7-metoxyindol-3-carboxylic,

1-methylindole-3-carboxaldehyde và một hợp chất phenolic (E) -4- (3, 4-dihydroxyphenyl)

but-3-en-2-one dựa trên phân tích phổ NMR và dữ liệu phổ khối Hai hợp chất styrylpyrones

phellinins A1, A2 đã được phân lập từ môi trường nuôi cấy Phellinus sp KACC93057P

[84] Wu và cộng sự [145]đã phân lập và xác định 11 hợp chất mới, và đặt tên chúng là phellibaumin A-E, methyl-phelligrin A and B, isomethyl-phelligrins A and B, (22E, 24R)-

6β-oxethyl-ergosta-7, 22-diene-3β, 5α-diol and (22E, diol từ P baumin Pilát Ngoài ra còn có các lớp chất như polyphenol [42], sphingolipid và

24S)-6β-oxethyl-ergosta-7-ene-3β,5α-tyrosinase [64], dẫn xuất của indole [126], courmarin [103] và acid carboxylic…

Phelibaumin B (147) Isomethyl-pheligrins A (148) Phelibaumin C (149)

Isomethyl- phelligrins B (150) Methyl- phelligrins A (151)

Phellinin A1 (152)

1.2.3 Hoạt tính sinh học của nấm thượng hoàng (Phellinus sp.)

Hoạt tính sinh học quan trọng nhất của Phellinus là chống ung thư được xác minh

từ nhiều nghiên cứu thực nghiệm về dược lý Năm 1968, Ikekaw và cộng sự [57] lần đầu

tiên phát hiện ra rằng chất chiết xuất từ quả thể của nấm P linteus có thể ức chế tế bào

sarcoma chuột (S180) với tỷ lệ 96,7% Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng polysaccharide là thành phần chính gây ra tác dụng chống ung thư [118] Ngoài hoạt tính chính là chống ung thư ra thì các hợp chất sinh học trong nấm thượng hoàng cũng có hoạt tính khác như hoạt tính chống oxi hóa, hoạt tính miễn dịch…

1.2.3.1 Hoạt tính chống ung thư

Polysaccharides từ P linteus có thể làm ức chế tế bào ung thư tế bào gan hepG2

người Kết quả cho thấy các polysaccharide có nồng độ 0-1,0 mg/mL đã giảm đáng kể sự gia tăng tế bào HepG2 50% [136] Xue và cộng sự [146] phân lập một polysaccharide hòa

tan trong nước từ nấm P linteus có hoạt tính miễn dịch và chống ung thư invitro Điều trị

endo-polysaccharide từ P igniarius làm tăng IL-2 và IL-18 huyết thanh ở chuột cấy H22

và S180 ở liều 500 mg/kg và 250 mg/kg [27] Kết quả cho thấy P igniarius có tác dụng

tăng cường của miễn dịch cho tế bào Một nghiên cứu khác cho thấy dịch chiết ethanol từ

quả thể P igniarius có hoạt tính chống hoại tử và chống đông huyết khối trên tế bào ung thư gan SK-Hep-1 và các tế bào nội mạch của chuột [124] Hispolon của từ P linteus cũng

có hiệu ứng chống lan truyền trên tế bào ung thư gan của người Hep3B [52]

Protein polysaccharide từ P linteus với nồng độ 125-500 mg/mL ức chế sự phát

triển và hình thành khuẩn lạc của SW480 các tế bào ung thư ruột kết của người [93]

Polysaccharides chiết xuất từ P linteus (125-1000 μg/mL) cũng có thể ức chế sự tăng sinh

tế bào và giảm biểu hiện β-catenin trong tế bào SW480 [124] Jeon và cộng sự [59] phân lập một hợp chất chống ung thư atractylenolid I từ chiết xuất etyl axetat của P linteus nuôi

cấy trên gạo nâu và atractylenolide I sau đó được sử dụng để đánh giá tác động ức chế trên các tế bào HT-29 Theo kết quả, atractylenolid I có biểu hiện độc tính mạnh đối với tế bào

HT-29 Sohn và cộng sự [121] phát hiện ra rằng chiết xuất methanol của P baumii đã giảm

46,3% sự gia tăng tế bào trên tế bào HCT116 ở người

1.2.3.2 Hoạt tính chống oxi hóa

Một số lượng lớn các nghiên cứu cho thấy trong nấm Phellinus có tính sinh học

khác nhau bao gồm chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch, tác dụng hạ đường huyết, chống viêm, chống co giật …

Rất nhiều các thành phần hóa học có hoạt tính chống oxy hoá đã thu được từ

Phellinus Hispidin được phân lập từ dịch nuôi cấy nấm của P linteus để đánh giá hiệu quả

chống oxy hoá của nó Các kết quả chỉ ra rằng 1.0mM hispidin có tác dụng chống oxy hoá đối với gốc tự do, gốc hydroxyl và gốc DPPH với tỷ lệ 56,8%, 95,3% và 85,5% [64], [80]

Dịch chiết 70% ethanol của quả thể nấm P linteus được nghiên cứu cứu chống oxy hoá thu

được kết quả đáng chú ý là ổn định gốc DPPH với IC50 là 22,07 μg/mL và ức chế sự peroxid hóa lipid với IC50 là 48,45 μg/mL [91] Ngoài ra, Park và cộng sự [111] cho thấy

dịch chiết trong nước từ nấm nuôi cấy P baumii có thể đào thải gốc DPPH, ức chế quá

trình peroxid hóa lipid và làm tăng hoạt tính của các enzyme chống oxy hóa Phelligridin G

và phelligridimer A từ P igniarius cho thấy có hoạt tính chống oxy hóa với mức IC50 là 10,2 μM ở chuột nhắt [150], [64]

1.2.3.3 Hoạt tính miễn dịch

P linteus đã được chứng minh là một chất điều hòa miễn dịch mạnh Năm 1996,

Kim và cộng sự làm sạch một polysaccharide từ môi trường bào tử của P linteus và quan

sát hiệu quả điều chỉnh miễn dịch của nó trong ống nghiệm (100 mg/kg) và trong cơ thể

(0,01 đến 0,1 mg/mL) [68] Các nghiên cứu cho thấy các polysaccharide phân lập từ P

baumii đã làm tăng đáng kể sự tăng sinh của lymphocyte B gây ra bởi LPS [26]

Polysaccharide từ quả thể Phellinus cho thấy tác dụng ức chế miễn dịch đối với các tế bào PBMCs và tổng hợp IFN-γ [73] Một polysaccharide là β-D-glucan cũng được phân lập từ

P baumii [41] Các Polysaccharides phân lập từ P linteus và P igniarius (L.) Quel cho

thấy khả năng điều hòa hệ miễn dịch rất cao và khả năng hỗ trợ điều trị cao [108]

1.3 CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT CÁC HOẠT CHẤT TRONG NẤM DƯỢC LIỆU 1.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng quá trình tách chiết các hoạt chất từ nấm dược liệu

- Ảnh hưởng của dung môi trích ly: Lựa chọn dung môi là công việc đầu tiên và hết sức quan trọng trong việc trích ly các loại chất trong nguyên liệu cần trích ly, dựa vào tính hòa tan chọn lọc, độ phân cực của các dung môi để tiến tành lựa chọn dung môi hợp lý cho quá trình trích ly

Nghiên cứu về lựa chọn dung môi cho quá trình tách chiết các hoạt chất có hoạt

tính sinh học trong nấm linh chi (G lucidum) tác giả Nguyễn Thị Minh Tú [11] đã khảo sát

các loại dung môi từ ít phân cực cho đến phân cựu mạnh như: n-hexan, chloroform, ethanol 96%, ethanol 70%, ethanol 45% và nước Kết luận với dung môi nước thì hiệu suất thu hồi là cao nhất so với các dung môi khác

Nghiên cứu về tổng hàm lượng phenolic trong nấm linh chi đen với các dung môi chiết khác nhau như ete dầu hỏa, ethyl axetat, methanol và nước thì Nguyễn Hoa Du [7] và cộng sự đã xác định tổng hàm lượng mg GAE/g nấm khô khi chiết bằng dung môi nước là cao nhất (4,064 - 4,793mg GAE/g nấm khô)

Theo Wang (2014) [141], khi nghiên cứu về các khả năng chống oxy hóa và tổng hàm lượng phenolic của 20 loại nấm ăn được trích ly từ các dung môi như aceton, ethanol, nước và nước nóng thì cho kết quả với khả năng chống oxy hóa thì trích ly từ nước nóng cho lại hàm lượng cao nhất, còn với tổng hàm lượng phenolic thì chiết bằng nước sẽ cho lại kết quả cao nhất

Theo khảo sát của Tan M.C và cộng sự [128] về ảnh hưởng của các loại dung môi

trích ly đến hàm lượng phenolic tổng trong cây henna (Lawsonia inermis) , nghiên cứu cho

thấy với 5 loại dung môi tiến hành khảo sát thì hàm lượng phenolic tổng số khi chiết bằng acetone 60% là cao nhất, tiếp theo là ethanol 60%, methanol 60%, nước và nước nóng là thấp nhất

- Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ có tác dụng tăng tốc độ khuếch tán và giảm độ nhớt, phần tử chất hoà tan chuyển động dễ dàng khi khuếch tán giữa các phần tử dung môi, tuy nhiên nhiệt độ là một yếu tố có giới hạn, vì khi nhiệt độ quá cao có thể xảy ra phản ứng khác không cần thiết gây khó dễ cho quá trình công nghệ …

Khảo sát về ảnh hưởng của nhiệt độ tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học

trong nấm linh chi (Ganoderma lucidum), trong nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Minh

Tú [11] đã khảo sát nhiệt độ tách chiết ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi chất chiết, theo tác giả thì nhiệt độ tách chiết càng cao thì hàm lượng chất chiết thu hồi càng tăng Cũng trên

đối tượng là nấm linh chi (G lucidum) của Việt Nam, Trung Quốc và Hàn Quốc, nhóm tác

giả Nguyễn Tuấn Anh và cộng sự [12] đã khảo sát trên 2 loại dung môi là nước và cồn, ở hai mức nhiệt độ là 80°C và 100°C đối với nước và chiết ở 78°C đối với cồn thì các tác giả kết luận với dung môi nước và ở nhiệt độ 100°C thì khối lượng cao nấm linh chi thu được cao hơn so với chiết ở nhiệt độ 80°C

Nghiên cứu về thành phần dinh dưỡng trong bột nấm mèo (Auricularia

auricula-judae) của nhóm tác giả Trịnh Thanh Tâm (2011) [16] đã nghiên cứu trích ly dịch chiết từ

nấm mèo bằng dung môi Sodium carbonate (ở các nồng độ khác nhau) với các nhiệt độ khác nhau 50°C, 60°C, 70°C và 80°C, khảo sát cho thấy ở nồng độ 1000ppm với nhiệt độ 70°C và thời gian 100 phút thì hiệu suất trích ly đạt 35,93%, đây là điều kiện trích ly tốt nhất ở nồng độ này

Khảo sát về ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian trích ly ảnh hưởng đến hàm lượng

phenolic tổng của cây móng tay (Lawsonia inermis), tác giả Tan M.C và cộng sự (2013)

[128] đã đưa ra kết quả: khi chiết với dung môi acetone ở nhiệt độ 25°C, 35°C, 45°C, 55°C thì ở nhiệt độ 55°C sẽ cho hàm lượng phenolic tổng là cao nhất 5554,15 ± 73,04 mg GAE/100g DW

- Ảnh hưởng của thời gian trích ly: Khi thời gian tăng lên lượng chất khuếch tán tăng Nhưng thời gian phải có giới hạn, khi đạt dược mức độ trích ly cao nhất nếu kéo dài thời gian dài sẽ tốn năng lượng, không mang lại hiệu quả kinh tế

Cũng theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Minh Tú [11] đã khảo sát thời gian tách chiết ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi chất chiết, thời gian tách chiết càng lâu thì hàm lượng chất chiết thu hồi càng tăng Trong nghiên cứu về chất lượng chế phẩm bột nấm mèo của tác giả Trịnh Thanh Tâm và cộng sự [16] cũng đã tiến hành khảo sát thời gian trích ly

để mang lại hiệu suất trích ly tối đa đó là 55 phút, 70 phút, 85 phút, 100 phút và 115 phút Kết quả cho thấy từ 55 phút đến 85 phút thì hiệu suất trích ly tăng khá nhanh, từ 85 phút trở đi thì hiệu suất có tăng lên nhưng không đáng kể

Cũng theo tác giả Tan M.C và cộng sự [128] thì khi chiết với dung môi acetone ở các mức thời gian như 30 phút, 90 phút, 180 phút, 270 phút, 360 phút và 450 phút thì hàm lượng phenolic tổng tăng từ 30 phút (4478,22 ± 17,08 mg GAE/100g DW) đến 270 phút (4739,71 ± 10,08 mg GAE/100g DW) đến 360 phút thì lại giảm xuống thấp nhất (4380,21

± 78,51 mg GAE/100g DW)

Thời gian chiết ảnh hưởng khá lớn đến tổng hàm lượng phenolic, favonoid và tanin

trong một số loài nấm ăn như Lentinus ciliatus, S commune, H conica, Pleurotus sp và

P ostreatus (loại nuôi cấy), khi nghiên cứu về thời gian trích ly các loại này, Yim H.S và

cộng sự [151] đã tiến hành khảo sát ở các thời gian khác nhau: 60, 150, 330 và 420 phút