Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn xuẫt có hoạt tính sinh học từ pectin phân lập từ cây cúc quỳ Tithonia diversifolia

đều cho thấy dịch chiết nước của cúc quỳ có nhiều hoạt tính đáng chú ý, gợi ý rằng pectin phân lập từ dịch chiết nước của cây này là đối tượng nghiên cứu hứa hẹn nhiều kết quả triển vọng

BÙI VŨ THỤC UYÊN

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN XUẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ PECTIN PHÂN LẬP TỪ

CÂY CÚC QUỲ TITHONIA DIVERSIFOLIA

Chu n ng nh H hữu cơ

s 8310630

TÓM TẮT UẬN V N THẠC S H HỌC

Đ N ng - Năm 2018

Người hướng dẫn ho học HD1: TS GIANG THỊ KIM LIÊN HD2: TS TRẦN THỊ THANH THỦY

Phản biện 1: Đặng Quang Vinh Phản biện 2: Nguyễn Trần Nguyên

Luận văn được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp

thạc sĩ Khoa học họp tại Đại học Đà Nẵng vào ngày 31 tháng 03

năm 2018

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Trung tâm Thông tin- Học liệu, Đại học Đà Nẵng

- Thư viện trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng

MỞ ĐẦU

1 ý do chọn đề t i

Các hợp chất thiên nhiên hiện nay và trong tương lai vẫn luôn

có vai trò vô cùng quan trọng trong việc cung cấp các dược chất mới hay là những chất dẫn đường để tạo ra các dược chất mới Polysaccharide, một trong những thành phần phổ biến trong các loài thực vật đã được sử dụng từ rất lâu và đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm, hóa mỹ phẩm Gần đây, các polysaccharide được quan tâm nhiều trong các ứng dụng y dược học nhờ các hoạt tính sinh học đặc biệt như hoạt tính chống ung thư, chống tiểu đường, hạ mỡ máu…Điều đáng nói là các polysaccharide thường thể hiện các hoạt tính tốt mà không có tác dụng phụ, không gây hại đến các tế bào bình thường Do đó, việc tìm kiếm các nguồn polysaccharide từ thực vật và các dẫn xuất mới có hoạt tính sinh học hiện đang được phát triển tương đối mạnh

Với điều kiện tự nhiên nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có một hệ sinh thái phong phú và đa dạng, có tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc với khoảng 3900 loài đã được sử dụng làm thuốc trong số 12000 loài đã được điều tra Trong số đó, nhiều loài vẫn còn chưa được nghiên cứu hoặc chưa được nghiên cứu đầy đủ về thành phần hoá học cũng như mối liên quan giữa cấu trúc hóa học và tác dụng dược lý của chúng Do đó, việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các cây thuốc nói riêng và cây cỏ nói chung nhằm tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học có giá trị là rất cần thiết

Hiện nay, nghiên cứu về polysaccharide nói chung và pectin nói riêng đang thu hút sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học trên thế giới Nhiều công trình về pectin và các dẫn xuất của chúng từ nhiều loài thực vật khác nhau như chè xanh, lá hồng… đã được công

bố Các ứng dụng trong y học cổ truyền và các nghiên cứu hiện đại

đều cho thấy dịch chiết nước của cúc quỳ có nhiều hoạt tính đáng chú ý, gợi ý rằng pectin phân lập từ dịch chiết nước của cây này là đối tượng nghiên cứu hứa hẹn nhiều kết quả triển vọng.Vì vậy việc nghiên cứu phân lập pectin và tổng hợp các dẫn xuất có hoạt tính sinh học từ cây cúc quỳ là rất cần thiết, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn Hơn thế nữa, đây là loài mọc phổ biến ở Tây Nguyên nên nguồn liệu rất sẵn có và dồi dào Định hướng ứng dụng nguồn pectin từ cúc quỳ mở ra khả năng nâng cao giá trị sử dụng của loài thực vật này

Cúc quỳ (Tithonia diversifolia) họ Cúc (Asteraceae) là một

trong những cây thuốc được sử dụng trong y học cổ truyền Châu Mỹ

để điều trị nhiều bệnh khác nhau như sốt rét, chống u Cây có nguồn gốc từ Mehico hiện nay phân bố rộng khắp trong các khu vực cận nhiệt đới và nhiệt đới, chẳng hạn như Châu Phi, Trung Mỹ và Đông Nam Á Ở Việt Nam, cây cúc quỳ hiện nay đã được tự nhiên hóa, mọc phổ biến ở rất nhiều nơi, đặc biệt là ở vùng Tây Nguyên Các nghiên cứu cho thấy dịch chiết nước của cây cúc quỳ, là dịch chiết chứa nhiều polysaccharide, cụ thể là pectin, có nhiều hoạt tính đáng quan tâm Tuy nhiên, cho đến nay cấu trúc và hoạt tính sinh học của pectin hiện vẫn chưa được nghiên cứu Luận văn này tập trung

giải quyết nội dung: “Nghiên cứu tổng hợp một s dẫn xuẫt có

hoạt tính sinh học từ pectin phân lập từ cây cúc quỳ Tithonia

diversifolia”

2 ục ti u nghi n cứu

Phân lập pectin đồng thời bán tổng hợp dẫn xuất có hoạt tính

gây độc tế bào từ cây Tithonia diversifolia, là hướng chưa từng được

nghiên cứu nhằm đóng góp vào kho tàng hóa học các hợp chất thiên nhiên của Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung, tạo cơ sở khoa học để có thể đề xuất khả năng ứng dụng và khai thác loài này phục

vụ ngành y, dược, thực phẩm chức năng

4 Nội dung nghi n cứu

4.1 Thu thập tài liệu, thông tin

Thu thập các tài liệu đã công bố trong nước và trên thế giới liên

quan đến cây Cúc quỳ Tithonia diversifolia, qui trình phân lập

pectin, bán tổng hợp dẫn xuất Sulfat, Selen hoá và hoạt tính sinh học của chúng

4.2 Tiến hành thực nghiệm

Trên cơ sở so sánh các phương pháp tổng hợp, dựa trên những khảo sát về các tác nhân, điều kiện và hiệu suất phản ứng với những điều kiện khả thi về thiết bị, phòng thí nghiệm chúng tôi đã lựa chọn phương pháp thích hợp để nghiên cứu phân lập pectin, bán tổng hợp dẫn xuất Sulfat hóa, Selen hoá Các sản phẩm sẽ được chứng minh cấu trúc bằng các phương pháp phổ IR, MS và NMR, khảo sát hoạt tính sinh học Qua đó lựa chọn được điều kiện và quy trình tối ưu cho quá trình phân lập pectin, bán tổng hợp dẫn xuất Sulfat, Selen hoá

- Thu thập mẫu thực vật và xác định tên khoa học

- Xử lý mẫu và chiết mẫu thực vật

- Phân lập và xác định cấu trúc pectin từ dịch chiết

- Tổng hợp các dẫn xuất Sulfat hóa và Selen hóa của pectin

- Thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập và tổng hợp được

5 Ý nghĩ ho học v thực tiễn củ đề t i

Tìm ra các hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào trong thành

phần hóa học của cây nghiên cứu, tạo cơ sở cho việc ứng dụng vào

thực tế

Đóng góp vào kho tàng hóa học các hợp chất thiên nhiên của

Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung

6 B cục luận văn

Nội dung luận văn chia làm 3 chương

Mở đầu : (04 trang)

Chương 1: Tổng quan (08 trang)

Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (14 trang)

Chương 3: Kết quả và thảo luận (18 trang)

Kết luận và kiến nghị : 01 trang

Tài liệu tham khảo: 06 trang, gồm: 56 tài liệu trong đó có 05 tài

liệu tiếng việt, 48 tài liệu tiếng anh và 03 websites

CHƯƠNG 1 TỔNG QU N 1.1 CÂY CÚC QUỲ (TITHONIA DIVERSIFOLIA)

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

VỀ DẪN XUẤT SELEN HÓA

CHƯƠNG 2 NGUYÊN IỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN IỆU

2.2 H CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.2.1 H chất

2.2.2 Thiết bị

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp phân lập chất hữu cơ

2.3.2 Phương pháp bán tổng hợp chất hữu cơ

2.3.3 Phương pháp tinh chế

2.3.4 Phương pháp xác định th nh phần h học củ polysaccharide

2.3.5 Phương pháp xác định cấu trúc h học các hợp chất hữu cơ

2.3.6 Phương pháp hảo sát hoạt tính gâ độc tế b o

2.4 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU

2.4.1 Phân lập v tinh chế pectin

2.4.2 Tổng hợp dẫn xuất Sulf t h từ pectin

2.4.3 Tổng hợp dẫn xuất Selen h từ pectin

2.5 QUY TRÌNH TỔNG HỢP

2.5.1 Phân lập v tinh chế pectin

2.5.2 Qu trình tổng hợp v tinh chế dẫn xuất pectin Sulf t hóa

2.5.3 Qu trình tổng hợp v tinh chế dẫn xuất Selen h

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO UẬN 3.1 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC PECTIN

dựng từ trước Thành phần monosaccharide của TDP phân lập từ cây cúc quỳ được trình bày ở bảng 3.2

Kết quả phân tích này tương đồng với một số tác giả chỉ ra rằng monosaccharide chính trong polysaccharides từ thành tế bào là axit galacturonic, tiếp theo là rhamnose Hàm lượng lớn axit galacturonic và rhamnose cho thấy sự có mặt của homogalacturonan

và rhamnogalacturonan trong TDP Sự có mặt đáng kể của arabinose chỉ ra sự tồn tại của các chuỗi arabinan trên mạch nhánh Ngoài ra, một lượng đáng kể arabinose có thể chứng minh sự tồn tại của arabinan phân nhánh cao trong mạch của TDP Kết quả này cho phép khẳng định TDP phân lập từ cây cúc quỳ có thành phần cấu trúc của pectin

Hình 3.1 Sắc í đồ HP C củ dịch thủ phân mẫu TDP 3.1.2 Phổ hồng ngoại củ TDP

Phổ hồng ngoại của TDP phân lập từ cúc quỳ được trình bày trên hình 3.2

Đối với pectin, vùng dao động trong khoảng 1200-1800 cm-1

trên phổ IR được xem là vùng “vân tay” của mẫu Tại đây, ta có thể quan sát trạng thái đặc trưng của các nhóm carboxylic (khoảng 1750-

1350 cm-1) Dải dao động ở vùng 1733 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm C=O của gốc carboxylic acid không được ion hóa

(tồn tại dưới dạng methyl hóa hay gốc acid) Sự ion hóa gốc này (tạo thành muối) dẫn đến việc suy giảm tín hiệu này trên phổ và làm xuất hiện tín hiệu dao động hóa trị của COO- tương ứng trong vùng 1600-

1650 (bất đối xứng) và 1400-1450cm-1 (đối xứng)

Hình 3.2 Phổ hồng ngoại củ pectin từ câ cúc quỳ

Mức độ ester hóa (DE) được định nghĩa là tỷ số giữa số lượng nhóm ester so với tổng số nhóm acid và nhóm ester và được đánh giá trực quan thông qua cường độ tín hiệu của dải 1733 cm-1

Hình 3.2 cho thấy pectin thu được từ cây cúc quỳ là loại pectin có mức độ este hóa (mức độ methyl hóa) thấp

3.1.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H NMR và 13 C NMR

củ TDP

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của mẫu TDP thu được từ cúc quỳ được trình bày trên hình 3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của mẫu pectin thu được từ cúc quỳ được trình bày trên hình

2 có rất nhiều điểm tương đồng với phổ 1H-NMR của polysaccharide giàu arabinan phân lập từ Opuntia ficus-indica. Vùng các tín hiệu anome trên phổ cho thấy các tín hiệu ở độ dịch chuyển hóa học 5,18, 5,03 và 5,01 được gán tương ứng cho α-(1→5) arabinofuranosyl, α-(1→2) rhamnopyranosyl, và α- (1→4)-galactopyranosylacid Sự có mặt của proton H6 của các đơn vị

rhamnose thể hiện qua các tín hiệu cộng hưởng ở độ dịch chuyển 1,12 và 1,23 Tín hiệu ở 1,12 ppm tương ứng với gốc rhamnose liên kết (1 →2) với một galacturonic acid còn tín hiệu ở 1,23 ppm là của gốc rhamnose liên kết (2 →1) với một galacturonic acid và tạo nhánh

ở O-4.Tín hiệu có cường độ cao ở 3,70 ppm là tín hiệu của nhóm methyl liên kết với gốc GalA Kết quả thu được hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trước đây đã xác định rằng thành phần cấu trúc của pectin chủ yếu chứa các đơn vị galacturonic acid (GalA) Rhamnose (Rha) là thành phần nhỏ trong mạch chính của pectin trong khi các đường khác như arabinose (Ara), galactose (Gal), và xylose (Xyl) nằm trên các mạch nhánh

Hình 3.3 Phổ 1 H N R củ TDP từ câ cúc quỳ

Hình 3.4 Phổ 13 C N R củ TDP từ câ cúc quỳ

Trên hình 3.4, phổ 13C NMR của pectin cho thấy các tín hiệu anome đặc trưng của rhamnose và glacturonic acid trong các khối cấu tạo của mạch chính rhamnogalacturonan ở 100,1 và 98,6 ppm được gán tương ứng cho C1 của các đơn vị (1→2)- rhamnose và (1

→4)-galacturonic acid Các tín hiệu ở 175,9 và 175,2 ppm đặc trưng cho các nhóm chức carboxylic C6 tương ứng của các đơn vị (1 →4)- galacturonicacid và galacturonicacid(1→2)-rhamnose Trong khi đó, tín hiệu ở 17,2 ppm đặc trưng cho các nhóm methyl của các đơn vị rhamnose Bên cạnh đó, phổ 13C NMR của pectin còn thể hiện những tín hiệu đặc trưng của các đơn vị (1 →5) arabinose qua các cộng hưởng có độ dịch chuyển hóa học 108,5, 83,4, 78,3,84,9 và 67,6 ppm tương ứng với C-1 − C-5

Kết quả thu được cho thấy pectin từ cúc quỳ là loại pectin giàu arabinan với các dữ liệu phổ phù hợp với các nghiên cứu trước đây

đã xác định rằng thành phần cấu trúc của pectin chủ yếu chứa các đơn vị galacturonic acid (GalA) Rhamnose (Rha) là thành phần nhỏ trong mạch chính của pectin và arabinose (Ara) là thành phần đường

Hình 3.5 Sắc í đồ thẩm thấu gel - GPC củ mẫu TDP từ câ

cúc quỳ 3.1.5 Hoạt tính ch ng oxi hóa

Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc hydroxyl tự do của pectin

từ cúc quỳ được trình bày trên hình 3.6

Khi nồng độ pectin tăng, khả năng quét gốc tự do của pectin tăng dần

và đạt đến 88% khi nồng độ pectin đạt 10 mg/ml Giá trị IC50 tương ứng của pectin và vitamin C lần lượt là 4,73 mg/ml và 1,30 mg/ml Kết quả này cho thấy có thể xem pectin là một nguồn chất chống oxi hóa từ tự nhiên đầy hứa hẹn

Hình 3.6 Khả năng quét g c h drox l tự do củ TDP từ cúc quỳ

0 20

3.2 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC DẪN XUẤT SU F T H TỪ PECTIN

3.2.1 Cấu trúc củ dẫn xuất pectin Sulf t h

Khối lượng phân tử trung bình khối lượng (Mw), khối lượng phân tử trung bình số(Mn), khối lượng phân tử trung bình z (Mz) và đặc trưng về chỉ số phân tán PDI = MW/Mn của các mẫu được trình bày trong Bảng 3.3

Bảng 3.3 Kh i lƣợng phân tử củ pectin v các dẫn suất Sulf t

h v h m lƣợng Sulf t

Mẫu

Hàm lƣợng

Giá trị Mw của các mẫu Sulfat hóa cũng tăng nhẹ so với pectin ban đầu Điều này có thể là do các gốc hydroxyl trong phân tử pectin

đã được thay thế bằng các gốc Sulfat Tuy nhiên so với mẫu TDP-S1 (thời gian phản ứng 30 phút), mẫu TDP-S2 (thời gian phản ứng 90 phút) có các giá trị Mw, Mn, Mz và Mw/Mn giảm đi nhưng hàm lượng DS tăng lên, điều này có thể giải thích là khi thời gian phản ứng Sulfat hóa tăng, một mặt giúp tăng hàm lượng Sulfat trong dẫn xuất nhưng mặt khác lại thủy phân một phần phân tử

Hình 3.7 Phổ FT-IR củ mẫu TDP (tr n) v TDP-S (dưới)

Phổ IR của TDP và TDP-S được trình bày trên Hình 3.7 So sánh hai phổ này, chúng tôi thấy rằng, phổ của TDP-S thể hiện sự xuất hiện mới của tín hiệu hấp thụ tại vùng 800-880cm-1 đặc trưng cho nhóm Sulfate ở vị trí axial, đồng thời có sự giảm cường độ hấp thụ của tín hiệu tại ~3261-3370cm-1 là đặc trưng cho dao động của nhóm OH

So sánh phổ 13C-NMR của TDP và TDP-S (Hình 3.8), ta thấy trên phổ 13C-NMR của TDP-S xuất hiện tín hiệu mới ứng với độ chuyển dịch hóa học ở δ=77,2 ppm, được gán cho carbon ở vị trí C-2 của rhamnose, có sự dịch về phía trường thấp hơn so với tín hiệu C-2

của vị trí carbon không thế, điều đó chứng tỏ mẫu TDP-S bị Sulfate hóa tại vị trí C-2 của rhamnose

Hình 3.8 Phổ 13 C-N R củ các mẫu TDP (tr n) so với TDP-S (dưới)

Như vậy, các phân tích cấu trúc trên đây cho thấy quá trình tạo dẫn xuất Sulfat hóa của pectin đã được thực hiện

3.2.2 Hoạt tính ch ng ox h củ pectin v dẫn xuất Sulf t h

Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc hydroxyl tự do của pectin

từ cúc quỳ và dẫn xuất Sulfat hóa được trình bày trên hình 3.9

Từ đồ thị cho thấy, trong khoảng nồng độ nghiên cứu từ 0,01 –

5 mg/mL, khi nồng độ pectin TDP và dẫn xuất TDP-S tăng, khả năng quét gốc tự do của pectin và các dẫn xuất tăng dần Hoạt tính của dẫn quét gốc hydroxyl của mẫu TDP-S1 là cao nhất so với pectin và TDP-S2 Tại nồng độ nghiên cứu 5 mg/mL, khả năng quét gốc hydroxyl tự do của các mẫu TDP-S1, TDP-S2 lần lượt là 55,3, và

47,8% trong khi đó khả năng quét gốc tự do của pectin ở nồng độ này chỉ đạt 42,8% Kết quả cho thấy rằng quá trình Sulfat hóa giúp tăng cường hoạt tính chống oxy hóa của pectin

Hình 3.9 Khả năng quét g c h drox l tự do củ pectin v các

dẫn xuất Sulf t h 3.2.3 Xác định hả năng gâ độc tế b o ung thƣ củ pectin

v dẫn xuất Sulf t h

Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các mẫu TDP-S1, TDP-S2

và TDP được khảo sát bằng các thử nghiệm SBR trên các dòng tế bào MKN7 Kết quả thử nghiệm được trình bày trên bảng 3.4

Bảng 3.4 Hoạt tính gâ độc tế b o ung thƣ KN7 củ các mẫu

TDP và TDP-S Nồng độ