BAI TIEU LUAN 1 HNIUMLO

Từ chủng Bacillus subtilis được phân lập từ đất nông nghiệp có khả năng sinhtổng hợp protease ngoại bào, trong nghiên cứu này tôi tiến hành xem xét các yếu tố ảnhhưởng đến quá trình sinh

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài này, lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến trường Đại học Tây Nguyên, Khoa KHTN&CN, các thầy cô đã tận tình hướng dẫn, giảng dạy trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và rèn luyện tại trường Đại học Tây Nguyên

Xin chân thành cảm ơn cô giáo hướng dẫn Trịnh Thị Huyền Trang đã hướng dẫn tận tình giúp em có thể hoàn thành báo cáo chuyên đề này

Xin chân thành cảm ơn Bộ môn Sinh học, Khoa KHTN&CN để tạo điều kiện cho

em mượn dụng cụ và phòng thí nghiệm để hoàn thành báo cáo chuyên đề này

Trong suốt quá trình thực hiện cũng như quá trình làm bài báo cáo chuyên đề em khó tránh khỏi những sai sót, rất mong thầy cô bỏ qua do trình độ lí luận cũng như kinh nghiệm còn hạn chế nên bài bài cáo không thể thiếu những sai sót Vì vậy, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của thầy cô để em học hỏi được nhiều kinh nghiệm

và hoàn thành tốt bài báo cáo sau natf Em xin chân thành cảm ơn!

DAL LAK , ngày 26 tháng 10 năm 2020

Sinh viên thực hiện

H NIU MLO

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 1

ĐẶT VẤN ĐẾ 3

I Tính cấp thiết của đề tài 3

II Mục tiêu của đề tài 4

1 Mục tiêu chung 4

2 Mục tiêu cụ thể 4

III Ý nghĩa của đề tài 4

1 Ý nghĩa khoa học 4

2 Ý nghĩa thực tế 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

I Tổng quan về vi khuẩn Bacilus subtilis 5

II Tổng quan về đất 6

CHƯƠNG 2: PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 7

I Phạm vi nghiên cứu 7

1 Đối tượng nghiên cứu 7

2 Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Sinh học, Trường Đại học Tây Nguyên 7

3 Vật liệu nghiên cứu 7

II Nội dung nghiên cứu 7

III Môi trường sử dụng nghiên cứu 7

IV Phương pháp nghiên cứu 7

1 Phương pháp phân lập, làm thuần và giữ giống Bacillus 7

2 Phương pháp xác định hoạt tính protease bằng vòng phân giải 7

3 Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp Anson cải tiến 8

4 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 9

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 10

1 Xác định hoạt tính protease bằng vòng phân giải 13

2 Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp Anson cải tiến 14

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 17

Tài liệu tham khảo 18

ĐẶT VẤN ĐẾ

I Tính cấp thiết của đề tài

Chè là một cây khỏe, mọc hoang và không cắt xén có thể cao tới 10m hay hơn nữa,

đường kích thân có thể tới mức một người ôm không xuể Đôi khi mọc thành rừng trênnúi đá cao Nhưng khi trồng tỉa thường người ta cắn xén để tiện việchái cho nên thườngngười ta cắt xén để tiện việc thu hái Lá mọc so le, không rụng Hoa to trắng, mọc ở kẽ

lá, mùi rất thơm, nhiều nhị Quả là một nang thường có 3 ngăn, nhưng chỉ còn một hạt

do các hạt khác bị teo đi Quả khai bằng lối cắt ngăn, hạt không phôi nhũ, lá mầm lớn,

có chứa dầu

Chè dùng làm thuốc hái vào mùa xuân, hái búp và lá non, vò rồi sao cho khô giống nhưcách chế biến chè hương để pha nước uống của nhân dân, cho nên ta có thể dùng chèlàm thuốc Không dùng chè đen hay chè mạn là những loại chè đã cho lên men rồi mớisấy khô hay phơi

Chè được dùng làm nước uống, làm thuốc kích thích d cafein và chữa lỵ theo như đơnsau đây chè hương 100g, cam thảo 10g, nước vừa đủ 100ml

Lấy chè và cam thảo đổ vào cho ngập, đun sôi trong nửa giờ, lọc lấy nước, bã còn lạithêm nước xâm xấp và đun sôi trong nửa giờ, lọc lấy nước, hòa hai nước lại, cô đặc chođến khi còn 100ml, thêm natri benzoat 0.3g hoặc cho thêm 0.03g nipagin vào để bảoquản, ngày dùng 4 lần mỗi lần 5-10ml

Lá chè chứa cafein, tanin, caroten, riboflavin, acid ascorbic, acid nicotinic, acid malic vàacid oxalic, theophyllin, xanthin, kaempferol, quercetrin, tinh dầu

Ngoài ra, lá chè còn có saponin triterpen, các flavonoid

Chè có tác dụng ức chế sự tăng đường huyết chống đái tháo đường, có khả năng chốngoxy hóa Tanin trong chè khi tiếp xúc với niêm mạc ống tiêu hóa sẽ làm giảm hấp thucác chất sắt, calci nên dẫn đến táo bón Cafein, theophyllin có tác dụng kích thích thầnkinh, tăng sức lao động, lợi tiểu

Tính vị:

Chè có vị đắng chát, tính mát

Tác dụng

Có tác dụng thanh nhiệt giải khát, tiêu cơm, lợi tiểu, định thần, làm cho đầu não đượcthư thái, da thịt mát mẻ, khỏi chóng mặt xây xẩm, bớt mụn nhọt, và cầm tả lỵ

Chú ý: Không uống chè khi đói sẽ gây cảm giác cồn cào, hoa mắt, chóng mặt Không

uống ngay sau bữa ăn vì trong chè có chứa tanin, nếu sau khi ăn uống chè xanh thì chấtsắt và protein trong thức ăn sẽ kết hợp với chất tanin, làm giảm khả năng hấp thu chấtdinh dưỡng của cơ thể Không nên uống trước khi đi ngủ vì chè gây kích thích thần kinhgây khó ngủ Người bị táo bón nên hạn chế uống nhiều nước chè Phụ nữ có thai cũngkhông nên uống nhiều nước chè để tránh nguy cơ bị thiếu máu, mất ngủ

Từ chủng Bacillus subtilis được phân lập từ đất nông nghiệp có khả năng sinhtổng hợp protease ngoại bào, trong nghiên cứu này tôi tiến hành xem xét các yếu tố ảnhhưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease ngoại bào như: thành phần môi trường, nhiệt

độ, thời gian nuôi cấy…Kết quả này sẽ làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo nhằmthiết lập quy trình sản xuất chế phẩm protease ngoại bào từ Bacillus subtilis có hiệu quảkinh tế cao

Chính vì vậy, dưới sự hướng dẫn của ThS Trịnh Thị Huyền Trang chúng tôi tiến

hanh thực hiện đề tài “ Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng tổng hợp protease”

II Mục tiêu của đề tài

- Cung cấp dẫn liệu khoa học về vi khuẩn Bacilus subtilis sinh enzyme protease

có trong đất nông nghiệp

- Bước đầu đánh giá các chủng vi khuẩn Bacilus subtils có trong đất nông nghiệplàm cơ sở cho nhiều nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn Bacilus subtils làm chế phẩmsinh học có khả năng tổng hợp protease

2 Ý nghĩa thực tế

- Tạo ra các chế phẩm vi sinh phục vụ cho sản xuất nông nghiệp ở Tây Nguyêncũng như nền nông nghiệp nước ta

- Việc nghiên cứu này góp phần vào việc tạo ra các chế phẩm sinh học để phòng

từ các bệnh gây nên, góp phần quan trọng trong việc ứng dụng các biện pháp sinhhọc phòng trừ bệnh có hiệu quả tốt và an toàn với môi trường tự nhiên và sứckhỏe con người

3 Giới hạn của đề tài:

Do thời gian có hạn nên chúng tôi bước đầu nghiên cứu các chủng vi khuẩnBacilus subtils có trong đất nông nghiệp và tuyển chọn các vi khuẩn có khả năngtổng hợp protease

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I Tổng quan về vi khuẩn Bacilus subtilis

Bacillus subtilis là tên khoa học của "trực khuẩn suptilit" Đây là một loài vikhuẩn có hình que (nên mới gọi là trực khuẩn), gram dương, ưa khí không bắtbuộc Bacillus subtilis (viết tắt: B subtilis) còn được gọi là trực khuẩn cỏ hoặc trựckhuẩn rơm vì hay được tìm thấy trong cỏ, rơm và cả đất; tuy nhiên chúng phát triểnnhiều trong ống tiêu hóa của người và nhiều loài gia súc, nhất là động vật nhai lại, có lợicho người nên cũng gọi là lợi khuẩn suptilit Loài này được chú ý nhiều vì có lợi và

là sinh vật mô hình trong nhiều nghiên cứu khoa học, nhất là trong di truyền học, đồngthời cũng là đối tương thuận lợi để sản xuất một số protein cho con người trong côngnghệ sinh học, giống như E coli đã được dùng làm "công xưởng" sản xuất

ra insulin và somatostatine trong kỹ thuật di truyền

Trong điều kiện không thuận lợi, B subtilis thường tồn tại ở trạng thái bào tử, cólớp vỏ khá dày và cứng chịu đựng được điều kiện môi trường khắc nghiệt Hiện tượngnày đã được ứng dụng để tạo nên các chủng B subtilis có lợi nhằm bảo quản lâu dài vàchế tạo thành sản phẩm như một loại thuốc điều trị bệnh cho con người

Trực khuẩn này ban đầu được Christian Gottfried Ehrenberg đặt tên là Vibriosubtilis ("Subilis" là tiếng Latin có nghĩa là 'tốt'), nhưng sau đó được FerdinandCohn phân loại lại nên đổi tên chi thành Bacillus

Mỗi cá thể B subtilis có chiều dài 1,5 – 10 µm, đường kính (chiều ngang) 0,25 –

1 µm, hai đầu tròn, có thể có 8 – 12 lông nhỏ B subtilis thường tồn tại đơn lẻ, nhưngcũng tạo thành "quần thể" hình chuỗi ngắn, có khả năng di động trong môi trường nướcnhờ hoạt động của các lông giống như trùng roi Bào tử hình bầu dục nhỏ, kích thước từ0,8 – 1,8 µm, được bao bọc bởi vỏ gồm nhiều lớp màng với các thành phần lipoprotein,peptidoglycan… có khả năng chịu được pH thấp, có khả năng chịu nhiệt (ở 100oC trong

180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng, có thể sống vàinăm đến vài chục năm

Khi nhuộm Gram, B subtilis bắt màu tím (Gram +) Về phương thức sống, banđầu các nhà khoa học xếp nó vào nhóm sinh vật hiếu khí bắt buộc,[11] do nó

có catalaza dương tính; nhưng đến năm 1998 thì xác định lại rằng loài này có thể sống kịkhí (không cần ôxy) Bởi thế, B subtilis thuộc nhóm loài sinh vật hiếu khí và kị khí tùynghi Trong nghiên cứu, môi trường thuận lợi nhất cho loài về nhiệt độ tối ưu là 37oC, về

pH khoảng 7,0 – 7,4

Trong môi trường có loài vi khuẩn khác, khả năng cạnh tranh của B subtilis khácao vì nó có tác dụng ức chế-cảm nhiễm hạn chế phát triển hoặc tiêu diệt một số loài vikhuẩn khác (như vi khuẩn gây bệnh Vibrio harveyi).

B subtilis thường được tìm thấy ở rơm, rạ và lớp trên cùng của đất cũng nhưtrong ruột của nhiều loài động vật Một nghiên cứu năm 2009 đã cho biết mật độ củaquần thể này ở đất là khoảng 106 / gram; còn trong phân người là khoảng 104 / gram

[12] Số lượng bào tử được tìm thấy trong ruột của con người quá cao chỉ được quy choviệc tiêu thụ thông qua ô nhiễm thực phẩm Ở ong mật, loài trực khuẩn này được cho làtạo điều kiện tốt cho thích nghi sinh thái và sức khỏe

Ở ngoài cơ thể cộng sinh (rơm, rạ, mặt đất) nó sống tự do và như là sinh vật hiếukhí bắt buộc; còn khi nội cộng sinh trong cơ thể sinh vật khác thì nó lại kị khí

Mỗi cá thể B subtilis có thể sinh sản theo cơ chế phân bào để tạo ra hai tế bào conhoặc tạo ra một nội bào tử (endospore) duy nhất có thể tồn tại tới hàng chục năm và chịuđược các điều kiện bất lợi như khô hạn, nhiễm mặn, bức xạ và dung môi có pH bất lợi

Khi nơi ở thuận lợi, nó phân bào theo kiểu nguyên phân, trong đó nhiễm sắc thểcủa nó nhân đôi theo cơ chế nhân đôi của nhiễm sắc thể nhân sơ

Khi nơi ở có nhiều bất thuận làm nó không thể phân bào, thì nó "sinh sản" theo cơchế bào tử hoá (sporulation) và hoá thành bào tử

II Tổng quan về đất

Đất trong thuật ngữ chung là các vật chất nằm trên bề mặt Trái Đất, có khả năng

hỗ trợ sự sinh trưởng của thực vật và phục vụ như là môi trường sinh sống của các dạng

sự sống động vật từ các vi sinh vật tới các loài động vật nhỏ

V.V.Dokuchaev, nhà khoa học người Nga tiên phong trong lĩnh vực khoa họcđất cho rằng: Đất như là một thực thể tự nhiên có nguồn gốc và lịch sử phát triển khácnhau, là thực thể với những quá trình phức tạp và đa dạng diễn ra trong nó Đất được coi

là khác biệt với đá Đá trở thành đất dưới ảnh hưởng của một loạt các yếu tố tạo thànhđất như khí hậu, cây cỏ, khu vực, địa hình và tuổi Theo ông, đất có thể được gọi là cáctầng trên nhất của đá không phụ thuộc vào dạng; chúng bị thay đổi một cách tự nhiênbởi các tác động phổ biến của nước, không khí và một loạt các dạng hình của các sinhvật sống hay chết

Đất vô cùng quan trọng cho mọi loại hình sự sống trên Trái Đất, vì nó hỗ trợ sựsinh trưởng của thực vật, các loài thực vật lại cung cấp thức ăn và ôxy (O2) cũng nhưhấp thụ điôxít cacbon (CO2) đồng thời tạo ra thức ăn cho con người

Các loại đất tiến hóa tự nhiên theo thời gian bởi các hoạt động của thực vật, độngvật và phong hóa Đất cũng chịu ảnh hưởng bởi các hoạt động sống của con người Con

người có thể cải tạo đất để làm cho nó thích hợp hơn đối với sự sinh trưởng của thực vậtthông qua việc bổ sung các chất hữu cơ và phân bón tự nhiên hay tổng hợp, cũng nhưcải tạo tưới tiêu hay khả năng giữ nước của đất Tuy nhiên, các hoạt động của con ngườicũng có thể làm thoái hóa đất bởi sự làm cạn kiệt các chất dinh dưỡng, ô nhiễm cũngnhư làm tăng sự xói mòn đất.

CHƯƠNG 2: PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I Phạm vi nghiên cứu

1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ mẫu đất cây chè nông nghiệp có khảnăng sinh tổng hợp protease ngoại bào được thu nhận tại Trường Đại Học Tây Nguyên

2 Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Sinh học, Trường Đại

học Tây Nguyên

3 Vật liệu nghiên cứu

- Dụng cụ, thiết bị: Đĩa petri, pipet, pipetman, bình tam giác, ống nghiệm, cân điện

tử, tủ ấm, tủ lạnh, máy ly tâm, nồi hấp, tủ sấy, máy đo OD,máy lắc

- Hóa chất: Dung dịch đệm Phosphate, NaCl, Peptone, Agar, Thuốc thử Foling,HCl, Tyrosine, Casein, NaOH và Thuốc thử TCA

II Nội dung nghiên cứu

Sàng lọc sơ bộ vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease củađất trồng

III Môi trường sử dụng nghiên cứu

- Môi trường phân lập và làm thuần ( LB-Agar): 10g Peptone, 5g Yeast Extract, 5gNaCl, 12g Agar (g/l)

- Môi trường giữ giống ( Peptone).(g/l):

- Môi trường thử hoạt tính ( LB-Agar có bổ sung 1% casein): 10g Peptone, 5gYeast Extract, 5g NaCl,12g Agar, 1% casein (g/l)

- Môi trường nhân giống:

 Môi trường LB lỏng : 10g Peptone, 5g Yeast Extract, 5g NaCl (g/l)

 Môi trường LB lỏng có bổ sung 1% casein: 10g Peptone, 5g Yeast Extract, 5gNaCl,, 1% casein (g/l)

IV Phương pháp nghiên cứu

1 Phương pháp phân lập, làm thuần và giữ giống Bacillus

Trước khi phân lập, mẫu đất được phơi nắng vừa làm khô vừa loại bỏ tế bào sinhdưỡng chỉ giữ lại những tế bào sinh bào tử Bacillus Pha loãng mẫu đến nồng độ thíchhợp ( 10-4, 10-5 và 10-6) bằng nước muối sinh lý ( 0.9%), cấy trải trên môi trường LB-Agar, nuôi cấy trong 37oC trong 24h Chọn khuẩn lạc đặc trưng cho Bacillus và tiếnhành cấy ria trên môi trường LB-Agar, cho tới khi quan sát thấy khuẩn lạc đơn trên môitrường [16]

Cấy khuẩn lạc đơn trên môi trường LB-Agar vào ống thạch nghiêng môi trườngPeptone và tiến hành ủ 37oC trong 24h

2 Phương pháp xác định hoạt tính protease bằng vòng phân giải

Nguyên tắc: khi bổ sung enzyme protease vào trong lỗ thạch, chúng sẽ khuếch

tán ra môi trường thạch xung quanh, thủy phân casein có trong môi trường đĩa, sau một

thời gian nhất định sẽ xuất hiện vòng phân giải màu trong suốt quanh lỗ thạch này Dựavào số đường kính vào phân hủy và đường kính lỗ thạch mà ta xác định được đườngkính vòng phân giải, từ đó xác định được hoạt tính.

Cách tiến hành: tế bào chủng vi khuẩn cấy từ ống giữ giống vào vào môi trườngnuôi cấy LB lỏng ở 37oC trong 24h Sau 24h, lấy 3ml dịch nuôi cấy đem ly tâm ở6000/phút/15 phút, thu dịch nổi Dùng pipet vô trùng nhỏ 100µl dịch enzyme thô vàocác khoan lỗ trên đĩa môi trường LB-Agar có bổ sung 1% casein Ủ các đĩa khảo sát ở

37oC trong 12h và quan sát vòng phân giải trên đĩa

Kiểm tra hoạt tính protease: Thuốc thử là TCA Nếu vi khuẩn có sinh protease sẽtạo vòng trong suốt quanh lỗ khoan, phần còn lại có màu trắng đục do phản ứng củacasein với TCA

Đánh giá khả năng sinh protease bằng cách đo đường kính vòng phân giải D-d(cm) Trong đó là: D: đường kính vòng phân giải (cm), d: đường kính lỗ thạch (0.9cm)

 D-d ≥ 2,5cm: chủng vi khuẩn có hoạt tính protease rất mạnh

 D-d ≥ 2,0cm: chủng vi khuẩn có hoạt tính protease mạnh

 D-d ≥ 1,5cm: chủng vi khuẩn có hoạt tính protease trung bình

 D-d < 1,0cm: chủng vi khuẩn có hoạt tính protease yếu

3 Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp Anson cải tiến.

 Dựng đường chuẩn Tyrosine: từ dung dịch Tyrosine chuẩn 1µM/ml xây dựngđường chuẩn với dung dịch Tyrosine có nồng độ từ 0.2 – 1,0 µM/ml

Bảng 1: Lập đường chuẩn tyrosine

Lắc mạnh sau 5-10 phút để yên tiến hành đo OD ở bước sóng 660nm

( 1mol = 103 mmol = 106µmol)

Ống số 1 là ống kiểm chứng (KC) Các ống khác là ống thí nghiệm (TN)

Dựng đường chuẩn Tyrosine biểu diễn sự biến thiên mật độ quang ∆ OD¿ ODTN –

ODKC) theo lượng Tyrosine

 Xác định hoạt tính Tyrosine ( hoạt tính chung) trong mẫu đất

Nuôi cấy chủng vi sinh vật trong môi trường LB lỏng có bổ sung 1% casein , tốc

độ lắc 150 vòng/phút nuôi trong 4 ngày Sau đó đem ly tâm 8000 vòng/phút/10 phút vàxác định hoạt tính protease (UI/ml)

- Ống B là ống thử không, thực hiện tương tự như ống A nhưng cho TCA 5% vàotrước rồi sau đó mới cho enzyme

- Đem ống A và B đi lọc lấy dịch lọc, hút 1ml dịch lọc từ hai ống nghiệm chuyểnsang ống nghiệm mới, bổ sung 2ml NaOH 0,28N và 0.6 ml thuốc thử Folin, lắcđều rồi để yến 15 phút, đo OD ở bước sóng 660nm

- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

- Dựa vào kết quả đo OD xác định được lượng sản phẩm tạo thành qua đó biết đượchoạt tính protease của enzyme Casein được chuẩn bị trong đệm NPB 0,1M pH 7,đệm acetate 0,1M pH 5, lắc đều và để qua đêm ở nhiệt độ 4-6oC trước khi sửdụng

Kết quả:

Một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu thủy phân casein trong thời gian 1phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong TCA ở điều kiện thí nghiệm ( 35,5oC: đệm NPB0,1M pH 7, đệm acetate 0,1M pH 5), phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD

ở bước sóng 660nm tương ứng với 1µM Tyrosine trong đường chuẩn

H đ P (UI/ml) = µM Tyrosine V L t vTrong đó :

- HđP: Hoạt độ enzyme proetase (UI/ml)

- V: Tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử không (ml)

- v: Thể tích dịch lọc đem phân tích (ml)

- t: Thời gian thủy phân ( phút)

- L: Độ pha loãng enzyme

- µM Tyrosine: Lượng µM Tyrosine/ml/phút

4 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu

Các thí nghiệm được thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên và lặp lại ít nhất ba lần Cáckết quả ghi nhận được phân tích thống kê với độ tin cậy 95% ( p <0.05) bằng phần mềmMinatab 17 Đồ thị được biễu diễn bằng phần mềm Microsoft Excel 2019