VSDC chuong 2 dinh duong va phat trien

Bài giảng Vi Sinh Đại Cương Chương 2 Dinh Dưỡng Và Phát Triển . Bài giảng vi sinh đại cương chính xác nhất . Bài giảng vi sinh đại cương chính xác nhất. Bài giảng vi sinh đại cương chính xác nhất. Bài giảng vi sinh đại cương chính xác nhất

Chương 2 Dinh dưỡng và Phát triển

Nutrients and Growth

Vi sinh học Đại cươngIntroduction to Microbiology

1

Johnson et al., 2010 BRS Microbiology and Immunology 5th ed.

Vi khuẩn sinh sản bằng cách trực phân (binary fission)

2

VK phân chia tế bào bằng cách trực phân

- Trong môi trường canh (broth)tăng số lượng tế bào  tạoSINH KHỐI (mass)

đo sinh khối bằng cách đo độ đục

- Trên môi trường thạch (agar),

1 tế bào phát triển  1 KHUẨN LẠC (colony)

 xác định số lượng VK bằng cách đếm khuẩn lạcđơn vị tính: CFU (colony-forming unit; đơn vị khuẩn lạc)

1

Photomicrograph of V cholerae O1 rugose and translucent colonies

Sun Nyunt Wai et al Appl Environ Microbiol 1998;64:3648-3655

layer that promotes

- biofilm development, and

- resistance to the effects of stressful agents

Smooth/láng Intermediate/trung gian Rough/xù xì

Cellular and colonial morphology of Erysipelothrix rhusiopathiae

(Courtesy National Animal Disease Center, Ames, Iowa.) (Straw et al., 2006)

5

Colonies of Mycoplasma hominis growing on A8 agar after 72 h of incubation.

Ken B Waites et al Clin Microbiol Rev 2005;18:757-789

Typical Mycoplasma colonies having the classic 'fried-egg' morphology

Khuẩn lạc hình trứng chiên ốp la

producing the opaque granular central zone (more dense) surrounded by a flat translucent peripheral zone on the surface

Bacterial growth is both deep penetrating into the agar and on the surface

7

Khuẩn lạc “swarming” (Swarming colonies)

Video-Swarming Proteus mirabilis HI4320 swarming across a 1.5% agar plate

10

Vi khuẩn Proteus mirabilis có rất nhiều flagella (hyperflagellated),

Các flagella kết lại với nhau tạo thành những cái “bè”, cùng chuyển độngtheo 1 hướng

D B Kearns, Nat Rev Microbiol 2010 Sep; 8(9): 634–644 Video-swarming 3

Timelapse movie of Proteus mirabilis swarming

9

- G, generation time, doubling time:

Thời gian một tế bào nhân thành hai tế bào; hay thời gian số lượng vi khuẩn trong quần thể tăng hai lần

- G thay đổi theo loài VK, điều kiện dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, nồng độ ô xy, …)

- Trong tự nhiên, VSV tăng sinh chậm hơn trong môi trường trong phòng thí nghiệm

11

Generation Time (G)

Một số VK có thời gian G ngắn khi phát triển trong mô cơ thể vật chủ:

- Pasteurella multocida (gây tụ huyết trùng)

- Yersinia pestis (gây dịch hạch)

Một số VK có thời gian G khá dài:

n = (log N – log No)/log 2 n = (log N – log No)/0,3

n = 3,3 (log N – log No) Ta có: G = t/n

Đồ thị tăng trưởng của vi khuẩn - Bacterial growth curve

Đồ thị tăng sinh của một quần thể vi khuẩn có 4 giai đoạn:

1 Giai đoạn thích nghi (Lag phase):

VK bắt đầu thích nghi với môi trường mới  hầu như không tăng sinh.

2 Giai đoạn tăng sinh (Logarithmic or exponential phase):

- Tăng số lượng t bào (tăng sinh khối) với một tốc độ ổn định, theo lũy thừa.

- Tế bào VK nhạy cảm với kháng sinh & các yếu tố sát trùng.

3 Giai đoạn ngừng tăng sinh khối (Stationary phase):

mật độ tế bào đạt đỉnh cao, môi trường cạn d dưỡng, hay có sự tích lũy chất độc  không tăng sinh khối

4 Giai đoạn chết (Death or decline phase):

15

Johnson et al., 2010 BRS Microbiology and Immunology 5th ed.

 Total count

 Viable count

17

1 Giai đoạn thích nghi (Lag Phase)

― Vi khuẩn trong môi trường mới  phải bắt đầu thích nghi

― Tế bào không phân chia, nhưng tăng biến dưỡng, có thể tăng kích thước

― Thời gian của Lag phase phụ thuộc:

- số lượng tế bào được cấy vào (inoculum)

- VK cần thời gian để:

• phục hồi do thương tổn tế bào hay bị shock do cấy chuyển;

• tổng hợp các coenzyme thiết yếu hay các yếu tố cần cho phân bào;

• tổng hợp các enzyme cần cho chuyển hóa các chất trong môi trường mới

― Rút ngắn lag phase: tăng số lượng VK cấy vào; dùng canh khuẩn đang ở giaiđoạn tăng sinh – Log phase(tế bào VK trẻ, đang phân chia).

18

17

2 Giai đoạn tăng sinh – Log phase or exponential phase

- VK phân chia với tốc độ ổn định  sinh khối tăng theo cấp số nhân

- Phân chia theo kiểu trực phân (phân biệt với “nảy chồi”)

- Tốc độ tăng trưởng phụ thuộc:

Thành phần & nồng độ dinh dưỡng trong môi trường;

Điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, thành phần không khí môi trường, v v ).

- Nhạy cảm với các yếu tố hóa học hay vật lý bất lợi:

• KS β-lactam, ức chế tổng hợp PG của thành tế bào;

• Tia UV, gây đột biến DNA.

Tác động mạnh ở giao đoạn này

19

3 Giai đoạn ngừng tăng sinh khối - Stationary Phase

- Tế bào không phân chia nhanh, vì:

• Chất dinh dưỡng cạn kiệt;

• Chất độc từ chuyển hóa tăng;

• Mật độ quá cao, không còn “chỗ”

- Không tăng sinh khối:

Số tế bào được sinh ra = số tế bào chết đi

4 Giai đoạn chết - Death or decline phase

- Số tế bào chất > số tế bào sinh ra

Sinh khối tế bào giảm

19

Đo sinh khối vi khuẩn

Trong nhiều trường hợp, cần biết số lượng tế bào VK hiện diện, ví dụ

số lượng vk chỉ danh ô nhiễmtrong nước,

trong thực phẩm sữa, thịt, v v )Một số phương pháp thường được dùng:

- Đếm khuẩn lạc (standard plate counts);

- Đếm trực tiếp (direct microscopic counts)

- Đo độ đục

- Most probable number (MPN)

- Real-time PCR (DNA concentration)

21

 PHƯƠNG PHÁP TRẢI ĐĨA (tran đĩa) - Plate spreading

- Tran huyễn dịch mẫu trên môi trường thạch (max 0,1 ml)

Đôi khi cần pha loãng mẫu để có thể đếm được số khuẩn lạc riêng biệt

(pha loãng thập phân – mỗi bước pha loãng mật độ giảm 10 lần).

- Số lượng khuẩn lạc trên đĩa petri ~ 25 – 250 CFU(colony forming units).

- Kết quả được biểu diễn: CFU /mL hay CFU/g mẫu

Copyright®2007 Pearson education, Inc., publishing as benjamin Cummings.

http://classes.midlandstech.edu/carterp/courses/bio225/chap06/lecture5.htm Retrieved 21/8/2014

25-250 khuẩn lạc trên 1 dĩa

Tính toán: Số vi khuẩn trong 1 ml mẫu ban đầu = Số khuẩn lạc trên dĩa x số lần pha loãng của mẫu x 10.

Ví dụ: Đếm được32khuẩn lạc ở độ pha loãng 1:10.000 (10 -4 )

 Số vi khuẩn trong 1 ml mẫu = 32x 10 x 10 4 = 3,2 x 10 6 CFUs/ml (3,200,000 CFUs/ml)

23

Đếm khuẩn lạc

 PHƯƠNG PHÁP ĐỖ ĐĨA – pour plate method

- Mẫu có thể được pha loãng(nếu cần);

- Cho 0,1 – 1 ml mẫu vào đĩa petri tiệt trùng(chưa có môi trường);

- Thạch được để nguội đến 45 oC, đổ vào đĩa đã có mẫu

vừa đổ thạch, vừa xoay tròn dĩa để trộn đều thạch với mẫu

- Kết quả được biểu diễn: CFU /mL hay CFU/g mẫu

- PP này cho phép cấy một thể tích mẫu lớn hơn 0,1 ml

• Tuy nhiên, VK phải chịu đựng nhiệt độ cao (45 o C) trong khoảng 1 thời gian ngắn

• Khó lấy khuẩn lạc để kiểm tra/nghiên cứu tiếp.

Đếm khuẩn lạc

23

Đo sinh khối vi khuẩn

25

PP đếm khuẩn lạc:

Ưu điểm:

- Định lượng VK một cách dễ dàng (CFU/g hay ml)

- Có thể xác định vi khuẩn (dựa vào hình dạng khuẩn lạc)

- Đếm được các loại VK khác nhau trên cùng 1 môi trường

Đo sinh khối vi khuẩn

Đếm VK trực tiếp - Direct microscopic counts

- Đếm tổng số tế bào VK sống và chết

- Dùng buồng đếm (Petroff-Hausser counter)

- Chỉ đếm được mẫu có số lượng VK cao (> 107 VK/ml)

Đo sinh khối vi khuẩn

27

Copyright®2007 Pearson education, Inc., publishing as benjamin Cummings.

http://classes.midlandstech.edu/carterp/courses/bio225/chap06/lecture5.htm Retrieved 21/8/2014

29

Đo sinh khối vi khuẩn

Xác định số lượng VK dựa vào sự hiện diện của VK trong các mẫu pha loãng

- Mẫu được pha loãng (thập phân).

- Cấy mỗi nồng độ mẫu vào một nhóm 2-3-4- hay 5 ống canh chọn lọc.

- Sau khi ủ, chọn 3 nhóm có mức pha loãng liên tiếp sao cho:

• nhóm thứ nhất, tất cả các ống canh đều có VK kiểm tra mọc, hay các nhóm “phía trước” không có ống canh nào (-) tính; và

• nhóm thứ ba, không có ống canh nào có VK kiểm tra mọc, hay các nhóm “phía sau” không có ống canh nào (+) tính.

- Thể tích mẫu cao hơn pp đỗ đĩa hay tran đĩa.

- Có thể dùng cho mọi loại mẫu (nước sạch, nước thải, thực phẩm)

- Có điều kiện cho các vk bị tổn thương phục hồi & tăng sinh

- Dễ dàng thực hiện trong một phòng thí nghiệm bình thường;

không đòi hỏi các thiết bị tốn kém; môi trường thường không quá đắt

- Dễ dàng đọc kết quả

- Nếu mức pha loãng đúng, số ống mỗi nhóm nồng độ 3 - 5,

độ chính xác của kết quả cao

Most probable number (MPN, pp pha loãng tới hạn)

31

 Khuyết điểm:

- Đối với mẫu sạch, cần dùng thể tích lớn của mẫu (50 ml, 100 ml)

- Để xác định giống hay loài, cần tiến hành một vài bước nuôi cấy và các phản ứng khác

- Nếu muốn phân lập, phải cấy chuyển sang môi trường thạch

33

Most probable number (MPN, pp pha loãng tới hạn)

- Dựa vào mật độ tế bào vi khuẩn trong một chất lỏng trong(nước muối sinh lý hay canh nuôi cấy)

- Nhanh, không tổn thương VK;

- Không thể kiểm tra mẫu có ít hơn 107cells/ml

- Không phân biệt VK sống hay chết

34

Đo sinh khối vi khuẩn

Đo độ đục – Turbidimetric Methods

33

Dùng máy quang phổ spectrophotometer

- Đo mật độ quang (optical density, OD)

35

Đo độ đục

Dùng thang McFarland chuẩn (Barium chloride)

- So sánh độ đục của mẫu với thang chuẩn

0.5 McFarland standard tương đương

~ 1 - 2 x 108 CFU/ml E coli (BD BBLTM)

McFarland standards No 0.5, 1 and 2

Đo độ đục

35

Nuôi cấy vi khuẩn

Cần cung cấp tất cả chất cần thiết cho yêu cầu năng lượng và sinh tổng hợp

Các điều kiện nuôi cấy:

nhiệt độ; thành phần khí (nồng độ O2, thành phần các khí khác)

pH, áp suất thẩm thấu.

Thành phần hóa học:

- Dinh dưỡng:

nguồn cung cấp carbon, nitrogen, sulfur, phosphate;

muối vô cơ; vi khoáng; yếu tố tăng trưởng (growth factors), …

- Năng lượng:

• chất cung cấp năng lượng (hay chất cho điện tử);

Nhiệt độ nuôi cấy tối ưu:

 VK ưa lạnh [psychrophiles; cryophiles (cryo = cold)]

Có thể tăng sinh ở T rất thấp, (-15) – (+20) °C;

Nhiệt độ tối ưu khoảng 15ºC hay thấp hơn

- VK có nhiệt độ tối ưu @20 – 40 oC, nhưng vẫn tăng sinh ở 0 oC

psychrotolerant

- Protein cấu trúc bậc II & bậc III đặc biệt

linh hoạt (flexible) ở nhiệt độ thấp;

ít a a kỵ nước, ít nối H & nối ion,

ít liên kết giữa các vùng trong phân tử

38

37

• Để giữ VK ở tủ đông (vd, -20 oC, -70 oC), thêm vào huyễn dịch VSV các chất “cryoprotectant”:

glycerol hay dimethyl sulfoxide (DMSO) để hạ điểm đóng băng

ngăn tạo tinh thể trong tế bào

Để giữ VSV một gian dài: giữ trong 10 % DMSO hay 30 % glycerol:

- làm lạnh nhanh (snap freeze)

giữ ở -80 oC (đông sâu) hay -196 oC (ni tơ lỏng)

Có thể giữ vài thập kỷ hay lâu hơn

- tránh “thaw & refreeze” mẫu – rã đông rồi đông lại

39

VK ưa lạnh

 VK chịu lạnh (psychrotrophs)

- VK phát triển tốt ở nhiệt độ 15 – 20 oC

- Nhưng “chịu được” (có thể tăng sinh) ở nhiệt độ thấp (nhiệt độ tủ lạnh)

vd, các VK có thể tăng sinh trong ngăn mát tủ lạnh, làm hư thực phẩm

Nhiệt độ nuôi cấy tối ưu

 VK ưa ấm (mesophile)

Tăng sinh ở nhiệt độ trung bình;

thích hợp nhất là ~ thân nhiệt người và động vật có XS (35 – 37oC)

Bao gồm hầu hết các VSV gây bệnh

39

 VK ưa nhiệt (thermophile & hyperthermophile)

- VK ưa nhiệt có thể phát triển ở ~ 45 -80 °C; tối ưu khoảng 55°C

- VK siêu ưa nhiệt có thể tăng sinh ở > 80°C

- Nhiều thermophiles & hyperthermophiles là các archaea

- Một số cấu trúc đặc biệt giúp proteingiữ cấu hình bậc 2, bậc 3 ở nhiệt độ cao

- Sử dụng các enzyme của các VK này trong công nghệ sinh học

Ví dụ, enzyme polymerases dùng trong PCR (polymerase chain reaction),tổng hợp DNA thực hiện ở nhiệt độ cao (72oC)

41

Nhiệt độ nuôi cấy tối ưu

Temperature and growth response in different temperature classes of microorganisms.

(Madigan et al., 2012; p 135)

42

Nhiệt độ nuôi cấy tối ưu

41

 pH

Hầu hết VK thích pH trung tính (7,2 – 7,6);

biến thiên 2 – 3 đơn vị pH (có thể phát triểu được)

- VK ái toan(ưa a xít, acidophile) hay VK chịu được pH thấp (acidotolerant)

- VK ưa kiềm (alkalophiles) hay chịu được pH cao(alkalotolerant).

Ưu trương (hypertonic):

Ứng dụng:

Làm mức, ngâm muối  bảo quản thực phẩm;

nước muối sát trùng

43

Halophiles (salt-loving; vi khuẩn ưa mặn/muối):

Có thể sống trong môi trường có nồng độ muối cao

VK biển phát triển tốt trong 1 – 4 % NaCl

extreme halophile, cần 15 – 30% NaCl;

- Facultative halophile có thể phát triển khi có hay không có [NaCl] cao.

Vd, phân lập Staphylococcus trong môi trường có 7,5 – 10 % NaCl.

45

Áp suất thẩm thấu

 Yêu cầu ô xy (O 2 )

Sv khai thác năng lượng từ dưỡng chất qua quá trình hô hấp hay lên men

hiếu khí: chất nhận điện tử là O2(chất ô xy hóa)

LÊN MEN Không hô hấp, không dùng ô xy

Khử NADH và pyruvate thành một số chất hữu cơ:

VK lên men đường  a xít; nấm men lên men đường  rượu

46

45

- VK hiếu khí (obligate aerobe):

Dùng O2là chất nhận điện tử trong quá trình hô hấp hiếu khí

ví dụ Pseudomonas, Mycobacterium

- VK yếm khí tuyệt đối (obligate anaerobes): có ô xy sẽ chết.

- VK yếm khí, nhưng chịu được ô xy (aerotolerant anaerobes)

VK yếm khí, không dùng O2, nhưng có O2không chết, vẫn tăng sinh

vd Lactobacillus spp.

- VK yếm khí tùy nghi:

có O2 - hô hấp hiếu khí; không O2 – hô hấp yếm khí hay lên men

- VK vi hiếu khí: cần một lượng ít O2

- Capnophiles: cần O2 (nồng độ thấp), nhưng cũng cần CO2.

47

Yêu cầu về O2

- VK yếm khí bắt buộc (obligate anaerobes)

• Không tăng sinh, hay bị chết khi có O2;

có thể do không thể khử độc các sản phẩm có tính ô xy hóa cao từ O2thiếu enzyme superoxide dismutase, catalase, cytochrome-C oxidase

ví dụ, VK giống Clostridium, các VK sinh khí CH4(archaea methanogen)

• Sử dụng năng lượng theo 1 trong 2 cách:

Hô hấp yếm khí: dùng các chất khác làm chất nhận điện tử.

VK khử nitrate, dùng NO3-làm chất nhận điện tử  NO2- hay NO N2O

VK khử sulphate, dùng SO42-làm chất nhận điện tử  S, H2S

Lên men đường.

Yêu cầu về O2

47

49 Johann Dréo; https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Nitrogen_Cycle.svg

as electron

acceptors

to anaerobic

N fixers

N2  NH4+

Nitrogen cycle

- VK yếm khí tùy nghi (facultative anaerobes)

Có thể phát triển trong điều kiện có hay không có O2:

• có ô xy  hô hấp hiếu khí

• không có ô xy  hô hấp yếm khí hay lên men

Khi có ô xy, thích hô hấp hiếu khí (Pasteur effect)

do dùng ít glucose hơn (sử dụng glucose hiệu quả hơn)

- VK vi hiếu khí (microaerophilic bacteria)

Cần O2nhưng ở mức thấp,

vì một số enzyme không chịu được O2(oxygen-sensitive, oxygen-latile)

ví dụ Campylobacter, Helicobacter tăng sinh tối ưu ở 5% O2

- Capnophiles:

VK phát triển tốt trong CO2.cần O2 với nồng độ thấp;

ví dụ Haemophilus influenza.

51

Yêu cầu về O2

 Các dạng độc chất sinh ra từ ô xy

- O2 là chất ô xy hóa mạnh và chất nhận điện tiển trong hô hấp hiếu khí

- Đối với VK yếm khí bắt buộc, O2không phải là chất độc, nhưng các sản phẩm chuyển hóa từ O2 có thể gây tổn thương tế bào

- Các gốc ô xy hóa mạnh sinh ra từ O2 trong quá trình hô hấp là:

O2-(superoxide anion);

H2O2 (hydrogen peroxide);

OH● (hydroxyl radical)

Ô xy hóa các chất hữu cơ, kể cả các thành phần tế bào

Yêu cầu về O2

51

 VK hiếu khí hay aerotolerant có các enzyme phân hủy các gốc ô xy hóa này  H2O + O2Catalase: 2 H2O2  2 H2O + O2

Peroxidase: H2O2+ NADH + H +  2 H2O + NAD + Superoxide dismutase: 2 O2- + 2 H +  H2O2+ O2

 Catalase test

Catalase xúc tác: 2 H2O2 2 H2O + O2

• Staphylococcus, họ enterobacteriaceae, Campylobacter jejuni, Lactobacillus  (+) tính

phiến kính  sủi bọt  (+) tính.

Madigan et al., 2012; p 146

(+) tính (-) tính

53

Yêu cầu về O2

 Nuôi cấy VK yếm khí hay VK thích CO 2 (capnophiles)

Các VK (yếm khí) khác nhau nhạy cảm O2 khác nhau

- Dùng chất khử O 2 (thành H2O)

trong môi trường nuôi cấy:

ví dụ: môi trường thioglycolate

- Hệ thống Gas-pak:

Dùng một túi có chứa các chất tạo phản ứng ô xy hóa

môi trường KK trong hộp:

Nuôi cấy VK yếm khí

- Tủ cấy yếm khí (anaerobic chamber, anaerobic workstation)

không O2, chỉ có N2, H2, CO2

dùng nuôi cấy các VK yếm khí tuyệt đối; rất nhạy với ô xy

- Sau khi autoclave hay đun sôi  môi trường không còn O2;môi trường canh còn nóng phải cho ngay vào tủ cấy yếm khí,

 khi môi trường nguội,