VSDC chuong 3 dinh danh va phan loai

Bài giảng Vi Sinh Đại Cương Chương 3 định danh và phân loại vi khuẩn. Bài giảng vi sinh đại cương chính xác nhất. Bài giảng vi sinh đại cương chính xác nhất. Bài giảng vi sinh đại cương chính xác nhất

Chương 3 Định danh & Phân loại Vi khuẩn

Identification & Classification of Bacteria

Vi sinh học Đại cươngIntroduction to Microbiology

1

Ba bước Phân lập & Định danh vi khuẩn từ mẫu

1 Lấy mẫu: đúng quy trình, đúng bệnh phẩm, và ghi rõ lịch sử mẫu.*

2 Đưa mẫu về nơi xét nghiệm, bảo quản mẫu hợp lý & thời gian vậnchuyển mẫu hợp lý để bảo đảm VSV vẫn sống & hạn chế vấy nhiễm.*

3 Phân lập VK nghi ngờ, định danh, và làm kháng sinh đồ

* Trách nhiệm của BSTY, người phụ trách tại chỗ.

1

- Mẫu (bệnh phẩm) được lấy trong điều kiện vô trùng:

dụng cụ lấy & đựng mẫu, người lấy mẫu (bao tay, khẩu trang)

- Loại mẫu phải phù hợp, đại diện cho diễn tiến bệnh

- Mẫu phải được lấy đúng thời điểm của diễn tiến bệnh

• Nên: giai đoạn cấp tính

- Nên lấy mẫu kiểm tra VK trước khi điều trị kháng sinh:

• Xác định VK gây bệnh  chọn KS phù hợp

• Ks có thể làm giảm số lượng VSV gây bệnh  có thể khó phát hiện

 Nếu đã điều trị KS, nên lấy mẫu lần 2 ngay trước lần dùng thuốc kế tiếp

1 Quy trình lấy mẫu

 Mẫu từ xác động vật chết phải được lấy:

• Khi xác còn mới, chưa bị phân hủy(hạn chế nguy cơ vấy nhiễm)

Ghi chú đủ thông tin về mẫu:

- Thông tin về động vật được lấy mẫu (tuổi, giới tính, loài, …);

- Loại mẫu, thời gian (ngày, giờ) lấy mẫu;

- Tất cả các ghi nhận về bệnh:

triệu chứng, thời gian triệu chứng bắt đầu thể hiện hay được thấy;

số lượng động vật có biểu hiện bệnh, …

- Đã điều trị? Điều trị như thế nào? Đã dùng KS? Loại KS gì?

- Chẩn đoán ban đầu có nghi bệnh gì?

5

Quy trình lấy mẫu

- Phải đảm bảo vsv còn sống & hạn chế vấy nhiễm

- Môi trường vận chuyển:

• không dinh dưỡng bán lỏng, chứa các muối và chất đệm (salts & buffer)

giữ VSV sống nhưng không tăng số lượng

• Tránh:

tổn thương tế bào, tổn thương chuyển hóa của vsv;

tăng sinh của vsv không mong muốn trong mẫu, hay vấy nhiễm vsv;

làm mẫu bị khô  vsv chết hay tổn thương

- Giữ mẫu ở khoảng 4oC trong thùng/bình không gài nắp chặt

- Chuyển mẫu tới phòng XN không quá 18-48 giờ sau khi lấy mẫu

2 Chuyển mẫu về nơi xét nghiệm

5

3 Phân lập, định danh, và thực hiện kháng sinh đồ

Phân lập (isolation) & Định danh (identification):

- Chọn môi trường, cấy ria trên thạch;

nếu VK nghi ngờ là VK tăng sinh chậm  có thể tăng sinh trong canh

• lấy bệnh phẩm phết kính, nhuộm Gram (direct smear)  lợi ích?

- Kiểm tra môi trường nuôi cấy mỗi 24 giờKiểm tra hình dạng khuẩn lạc  nhận định sơ bộ; nhuộm Gram

- Bắt KL nghi ngờ, cấy chuyển sang đĩa thạch khác để có VK thuần

- Tiến hành những p/ứng sinh hóa, phân tử cơ bản để định danh “loài” sơ bộ

- Làm kháng sinh đồ  mục đích?

7

• Chọn môi trường nào?

- Tùy theo nhận định/nghi ngờ ban đầu

Nếu không rõ ràng

dùng nhiều loại môi trường; môi trường phân biệt rộng;

- Môi trường thạch & môi trường canh :

• Thạch (agar): thu được các KL riêng biệt; định lượng sơ bộ;

chọn lựa hay phân biệt VK gây bệnh nghi ngờ với các VK khác(hệ vsv trong mẫu, vấy nhiễm).

• Canh (broth):

Tăng sinh VK nghi ngờ có số lượng ít trong mẫu;

Tăng sinh VK “khó tính”, hay mọc chậm

8

Phân lập, định danh 7

• Phết kính và nhuộm Gram mẫu (bệnh phẩm)Phết kính trực tiếp/Direct smear: lấy mẫu phết kính & nhuộm Gram.

 Nhận định đầu tiên về sự hiện diện của VSV gây bệnh

Nhuộm Gram: là bước đầu tiên định danh VK trong mẫu

Gram dương ? Gram âm ? hình dạng tế bào ? bào tử (nếu có) ?

 giúp chọn lựa thuốc/liệu trình điều trị sớm, trong vòng 24 giờ(trước khi có kết quả nuôi cấy);

 Giúp đánh giá việc chọn lựa môi trường nuôi cấy có đúng hay không

Các loại bệnh phẩm thường được nhuộm Gram:

- Đàm, ngoáy tai, vết nhiễm trùng trên da, v v

Phân lập, định danh

Gram stain of a sputum Streptococcus pneumoniae with with several neutrophils.

Direct smear and Gram staining

Gram stain of N meningitidis with associated PMNs.

Gram stain of S pneumoniae with WBCs.

Cerebrospinal fluid (CSF) smears

http://www.cdc.gov/com

Gram stain of H influenzae

12

Examination of Gram stains of bacterial skin infections

(Rebecca Buxton, 2007; asmscience.org)

Streptococcus pyogenes and Staphylococcus aureus Mixed infections

11

• Kiểm tra hình dạng khuẩn lạc trên thạch

- Mỗi VK phát triển thành một khuẩn lạc

- Quan sát hình dạng khuẩn lạc:

hình dạng, kích thước, màu sắc, mùi, các loại KL khác nhau

13

Phân lập, định danh

• Nuôi cấy gốc VK thuần

- Cần thu gốc VK thuần  để định danh chính xác  tại sao ?

- Ngoài ra, cần một lượng lớn sinh khối vk để làm các test khác nhau

• Lấy 1 ít sinh khối của một KL và ria trên thạch;

• Bước này có thể lặp lại vài lần tới khi có 1 KL thuần để giữ gốc

 Công việc này được gọi là “phân lập” vi khuẩn

 vk phân lập được gọi là “một gốc VK phân lập” (isolate)

- Gốc VK thuần được dùng định danh & giữ gốc VK

Phân lập, định danh 13

Obtain a pure culture

Giữ gốc thuần:

- Giữ vk trên thạch nghiêng, @4oC, vài tuần

- Giữ trong canh chứa 15-30% glycerol, @-20 hay -70oc, nhiều năm

Bacterial culture is grown on an agar slant Bacterial/yeast culture in glycerin stock

 Các phản ứng định danh VK đến mức “loài” (species)

- Di động

- Kiểm tra các tính chất biến dưỡng dựa vào sản phẩm được sinh ra:

• Sử dụng đường glucose, lactose, mannose, … (lên men, sinh acid, sinh khí),

• Khử sulfate sinh H2S, khử nitrate, …

- Hoạt tính enzyme (catalase, oxidase,…), dung huyết (hemolysis), …

- Các p/ứng miễn dịch (immunological or serological tests  phân biệt ?

- Các kỹ thuật phân tử (PCR, fingerprinting, hybridization)

16

Phân lập, định danh 15

 Kiểm tra hoạt tính enzyme

- Thực hiện: lấy 1 ít VK từ 1 môi trường thạch(không phải thạch máu) trét lên một miếnggiấy lọc tẩm chất thử và tẩm vừa đủ ướt

- Kết quảDương tính: mẫu VK có màu xanh dương đậm;

Âm tính: không đổi màu (sau khoảng 20 giây)Oxidase test

- Kết quảDương tính: mẫu sủi bọt;

Âm tính: không sủi bọt

Catalase test

17

- Thực hiện: trộn VK với huyết tương thỏ.

(thực hiện trên phiến kính hay ủ trong ống)

Kiểm tra hoạt tính enzyme

19

Dương tính: đông huyết tương

Âm tính: không đông huyết tương

 Kiểm tra các tính chất biến dưỡng dựa trên sản phẩm được sinh raIMViC tests để kiểm tra nhóm trực khuẩn Gram âm đường ruột

I sinh tryptophanase, chuyển tryptophan  indol

MR lên men glucose, sinh acid

VP lên men glucose, sinh acetoin

SC citrate - nguồn C duy nhất; NH4+nguồn N duy nhất(Simmon citrate)

https://en.wikipedia.org/wiki/IMViC#mediaviewer /File:IMViC_Results.jpg

20 19

Phenol red là chỉ thị màu:

- Trung tính hay kiềm: đỏ; acid: vàngSau 24 giờ:

- Đỏ/Đỏ: không lên men đường (đỏ đậm do

NH3từ quá trình ô xy hóa khử a-min)

- Đỏ/Vàng: lên men glucose, không lên men lactose (hay succrose)

- Vàng/Vàng: lên men glucose vàlactose/succrose

- Nứt/bể thạch: lên men đường sinh khí

- Đen: sinh H2S (tạo FeS, màu đen)

TSI (Triple Sugar Iron Agar) testkiểm tra khả năng lên men các đường lactose, sucrose, glucose, vàsinh hydrogen sulfide (H2S)

Kiểm tra các tính chất biến dưỡng

 Kiểm tra dựa trên phản ứng miễn dịch (immunological test)

- Dựa trên p/ứng kháng nguyên - kháng thể (antigen : antibody reaction)vd., phản ứng ngưng kết (agglutination)

- VK (hay VSV) có thể được phân nhóm dựa vào kháng nguyên bề mặt

Vd., kháng nguyên lông H (flagella), kháng nguyên O (của LPS), kháng nguyên K (capsule)

Salmonella và E coli – có vài ngàn típ kháng nguyên “O”

- Test huyết thanh học (serological test)Dựa vào phản ứng miễn dịch giữa KT trong huyết thanh với KN của VK

23

Phản ứng NGƯNG KẾT - Agglutination

Agglutination with Salmonella H antiserum.

Statens Serum Institut (SSI), Denmark

Immunological tests

ELISA enzyme-linked immunosorbent assay

WESTERN BLOT (protein immunoblot)

of E coli O157:H7 and E coli DH5α.

The labelled antibody recognized H7 of

E coli O157:H7.

Reidt U et al., 2008

Phân lập, định danh 25

 Các test phân tử (molecular tests)

- Nhanh chóng phát hiện VSV

- Có thể không cần qua nuôi cấy phân lập

• VK tăng sinh chậm,

• VSV khó hay không thể nuôi cấy, virus

- Khi cần kết quả chẩn đoán nhanh

Một số phương pháp :

- PCR (polymerase chain reaction)

- PCR & sequencing (xác định thứ tự nucleotide)

vd có thể sequencing 16S rRNA để phân biệt loài

- Các kỹ thuật dấu vân tay (fingerprinting) dùng enzyme cắt giới hạn

PCR (polymerase chain reaction)

Gel Lane* Wound type Genera/species cultured

A Non-healing surgical wound Enterobacter, Pseudomonas

B Venous leg ulcer None

F Venous leg ulcer Pseudomonas,

Staphylococcus

G Chronic wound Enterococcus (Group B),

Escherichia coli, Staphylococcus aureus

H Venous leg ulcer Pseudomonas

I Diabetic foot ulcer Enterococcus (Group D)

J Diabetic foot ulcer Citrobacter freundii,

Staphylococcus aureus

K Decubitus ulcer Staphylococcus aureus

L Diabetic foot ulcer Staphylococcus

M Non-healing surgical wound Pseudomonas, Staphylococcus

PCR/DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis) profiles of amplified bacterial DNA from chronic wound samples (Cunnigham et al 2001-2010) 31

Các test phân tử (Molecular Tests)

Xác định vi khuẩn từ mẫu, không qua phân lập

MẫuTăng sinh hay không tăng sinh

Classification of bacteria (Phân loại)

“The primary purpose of nomenclature of microorganisms is to permit us to know as exactly as possible what another clinician, microbiologist, epidemiologist or author is referring to when describing an organism responsible for infection of an individual

or outbreak.”

S Finegold, 1993

33

PHÂN LOẠI

- Phân loại dựa vào: hình dạng, tính chất sinh hóa, kiểu gene

- Các kỹ thuật hiện đại, đặc biệt là các kỹ thuật phân tử hỗ trợ

“tiêu chuẩn vàng” trong phân loại VK (bacterial taxonomy) làxác định thứ tự nucleotide gene mã hóa 16S r RNA

(sequencing 16S rDNA)

 nhiều giống/loài mới được tách ra từ giống/loài cũ

- Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology:

“The Bible” của phân loại VK,

mô tả tính chất kiểu hình, kiểu gene của tất cả vi khuẩn

33

- International Code of Nomenclature of Bacteria (ICNB) hay Bacteriological Code (BC): hệ thống quản lý tên khoa học của vi khuẩn và Archaea, liệt kê các qui định

về đặt tên vi khuẩn (trong hệ thống phân loại chính thức)

- Tạp chí International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM) công bố một loài/giống mới (mô tả kiểu hình, kiểu gene)

- Tên vi khuẩn mới phải được ICSP xem xét & phê chuẩn theo các quy định, sau đóđược công bố trên IJSEM

“type strain” (chủng tiêu biểu của loài) phải được gửi giữ ở ít nhất 2 nơi giữ giốngđược thế giới công nhận ở hai quốc gia khác nhau

35

Phân loại

International Committee on Systematics of Prokaryotes (ICSP)

Ủy ban Quốc tế Hệ thống Prokaryotes

36 35

Virus taxonomy finds its rootsInternational Committee on Taxonomy of Viruses

37

 Hệ thống phân loại sinh vật:

Domain  Phylum  Class  Order  Family  Genus  Species

Loài (species): tập hợp các VK có tính chất giống nhau

cấp phân loại quan trọng nhất

Dưới loài (subspecies): một nhóm VK trong một loài

cấp phân loại chính thức thấp nhất

Cách viết: họ - giống/chi – loài – dưới loài: nghiêng

 Phân loại không chính thức:

Type (típ): một nhóm cá thể trong loài có 1 tính chất chung nào đóStrain (chủng): một dòng hay một gốc VK phân lập (của 1 loài nào đó)

Ví dụ,Domain: BacteriaPhylum: FirmicutesClass: BacilliOrder: LactobacillalesFamily: StreptococcaceaeGenus: StreptococcusSpecies: Streptococcus agalactiae

Streptococcus bovisStreptococcus canisStreptococcus suisStreptococcus capriaeStreptococcus equiStreptococcus pyogenesStreptococcus pneumonia

Phân loại

 Loài (species)

- Cấp phân loại quan trọng nhất

- VK cùng 1 loài: > 97% chuỗi 16S rDNA giốngnhau (đúng thứ tự nucleotide)

- Tên loài: tên kép

vd, loài Strepcococcus suisStrepcococcus: tên giống,suis: tên xác định loài

Cách viết tên loài trong một tài liệu khoa học:

Viết lần đầu tiên trong bài: Strepcococcus suis;

từ lần thứ hai: S suis (viết tắt tên giống)

39

 Các nhóm nhỏ hơn của subspecies (Infrasubspecific ranks)Tập hợp các chủng được phân biệt bởi một tính chất nào đó.

- Phân loại không chính thức; nhưng rất hữu dụng trong thực tế

Tên gọi Đồng nghĩa Cơ sở phân loạiBiovar Biotype Tính chất sinh lý, sinh hóaSerovar Serotype Tính chất kháng nguyênPathovar Pathotype Đặc tính gây bệnhPhagovar Phage type Khả năng bị bacteriophage (virus) phân giảiMorphovar Morphotype Một số tính chất hình dạng

41

Ví dụ, giống Salmonella có 2 loài:

- Salmonella enterica

- Salmonella bongoriSalmonella enterica, có 6 dưới loài, có hơn 2500 serovar

Ví dụ,Salmonella enterica subsp enterica serovar Choleraesuis

 Salmonella Choleraesuis; hoặc S CholeraesuisSalmonella enterica subsp enterica serovar Typhi

Salmonella Typhi; hoặc S Typhi

Các nhóm nhỏ hơn của subspecies 41

Cây di truyền (cây tiến hóa, cây phả hệ)Phylogenetic tree or evolutionary tree

- Sơ đồ phân nhánh  một “cây" phân nhánh

- Biểu diễn mối quan hệ tiến hóa (di truyền) giữa các nhóm sinh vật(biological entities)

Figure 16.14 Rooted forms of a phylogenetic tree are shown (Madigan et al., 2012, p 459).

- “Chóp” của mỗi nhánh là giống/loài (hay chủng);

- Các chấm tròn tại mỗi gốc biểu diễn “tổ tiên” chung

45

Phylogenetic tree of hemagglutinin (HA) segments from 36 avian influenza samples.

V:

Vietnam strains EMA:

Middle Eastern- African strains 45