Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu cây nghệ cầu lửa ( curcuma sp ), họ gừng ( zingiberaceae) ở đà bắc, hòa bình

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC ÁNH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA TINH DẦU CÂY NGHỆ CẦU LỬA Curcuma sp., HỌ GỪNG

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN NGỌC ÁNH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,

THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA TINH DẦU CÂY NGHỆ CẦU LỬA

(Curcuma sp.), HỌ GỪNG (Zingiberaceae)

Ở ĐÀ BẮC, HÒA BÌNH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2020

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

(Curcuma sp.), HỌ GỪNG (Zingiberaceae)

Ở ĐÀ BẮC, HÒA BÌNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện khóa luận tại bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược

Hà Nội, tôi đã nhận được rất nhiều sự hỗ trợ và giúp đỡ quý báu từ thầy cô, bạn bè và gia đình

Lời đầu tiên, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn

chân thành tới PGS.TS Nguyễn Hoàng Tuấn, người thầy đã luôn quan tâm hướng dẫn,

chỉ bảo tận tình và tạo điều kiện cho tôi từ những ngày đầu thực hiện khóa luận cho tới khi hoàn thành

Tôi xin chân thành cảm ơn DS.NCS Nguyễn Thanh Tùng đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi

để tôi có thể hoàn thành khóa luận

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể thầy cô trường Đại học Dược

Hà Nội nói chung, các thầy cô và anh chị kỹ thuật viên thuộc bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội nói riêng đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình nghiên cứu

Xin cảm ơn toàn thể anh chị, các bạn cùng nghiên cứu tại Bộ môn Dược liệu đã đồng hành, động viên tinh thần và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn ở bên động viên, ủng hộ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong những ngày tháng học tập, nghiên cứu tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 19 tháng 6 năm 2019

Sinh viên

Nguyễn Ngọc Ánh

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về họ Gừng (Zingiberaceae) 3

1.1.1 Vị trí phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật họ Gừng 3

1.1.3 Phân loại thực vật họ Gừng 3

1.2. Tổng quan về chi Curcuma L 6

1.2.1 Đặc điểm thực vật, sinh thái và phân bố chi Curcuma L 6

1.2.2 Phân loại chi Curcuma L ở Việt Nam 10

1.2.3 Thành phần hóa học chi Curcuma L 12

1.2.4 Giá trị sử dụng của chi Curcuma L 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu 17

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 17

2.2. Nội dung nghiên cứu 18

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 18

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 18

2.3. Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp giám định tên khoa học 18

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu hiển vi 18

2.3.3 Phương pháp hóa học 19

2.3.4 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 19

2.3.5 Phương pháp xác định hàm lượng nước trong dược liệu 19

2.3.6 Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu trong dược liệu 20

2.3.7 Phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ 20

2.3.8 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 21

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 23

3.1. Nghiên cứu về thực vật 23

3.1.1 Đặc điểm thực vật 23

3.1.2 So sánh đặc điểm thực vật của mẫu nghiên cứu với C sahuynhensis Škorničk &

N.S.Lý và C cotuana Luu, Škorničk & H.Đ.Trần 26

3.2. Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu mẫu nghiên cứu 31

3.2.1 Đặc điểm vi phẫu thân rễ 31

3.2.1 Đặc điểm vi phẫu lá 32

3.3. Nghiên cứu về đặc điểm vi học bột dược liệu 35

3.3.1 Đặc điểm bột thân rễ 35

3.3.2 Đặc điểm bột thân lá 36

3.4 Định tính hóa học 36

3.5 Xác định hàm lượng tinh dầu trong các bộ phận của cây Nghệ cầu lửa 38

3.6 Sắc ký lớp mỏng tinh dầu các bộ phận cây Nghệ cầu lửa 38

3.7 Sắc ký khí kết hợp khối phổ tinh dầu 40

3.8 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của tinh dầu 44

3.9 Bàn luận 44

3.9.1 Về thực vật 46

3.9.2 Về thành phần hóa học 44

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

4.1 Kết luận 48

4.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DD Dung dịch

DĐVN Dược điển Việt Nam

GC-MS Gas Chromatography - Mass Spectromectry

(Sắc ký khí kết hợp khối phổ)

HNU Herbarium of National University

(Bảo tàng Thực vật - Đại học Quốc gia)

HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

RT Thời gian lưu

RI Retention Index literature comparison

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Hệ thống phân loại thực vật họ Gừng ở Việt Nam sắp xếp theo

Bảng 1.3 Thành phần chủ yếu trong tinh dầu một số loài thuộc chi

Bảng 3.1 So sánh đặc điểm thực vật của mẫu nghiên cứu với C

sahuynhensis Škorničk & N.S.Lý và C cotuana Luu, Škorničk

& H.Đ.Trần trong các tài liệu

Bảng 3.8 Điểm khác biệt giữa mẫu nghiên cứu và C sahuynhensis

Škorničk & N.S.Lý & C cotuana Luu, Škorničk & H.Đ.Trần 45

Hình 3.6 Sắc ký đồ tinh dầu các bộ phận của mẫu nghiên cứu 39

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chi Nghệ (Curcuma L.) là một trong những chi lớn nhất trong họ Gừng

(Zingiberaceae), phân bố rộng khắp nhưng chủ yếu tập trung ở Nam Á, Đông Nam Á

và phía nam Trung Quốc Một số ít loài phân bố ở cả phía nam Australia và Nam Phi

[51] Trên thế giới hiện có khoảng hơn 120 loài thuộc chi Curcuma L., tuy nhiên, số

lượng loài chính xác vẫn chưa thể xác định [32] Ấn Độ và Thái Lan là hai quốc gia có

sự đa dạng loài lớn nhất, với ít nhất 40 loài, tiếp đến là Myanma, Bangladesh, Indonesia

và Việt Nam [31] Với địa hình đa dạng và khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa của Việt Nam,

phù hợp với sinh thái của đa số các loài Curcuma L., đã tạo điều kiện để chúng phát triển thuận lợi Tính đến nay ở Việt Nam đã có 29 loài thuộc chi Curcuma L được công

bố [3], [34], [38] Từ xa xưa, các loài thuộc chi Curcuma L đã được sử dụng làm gia vị,

thực phẩm, mỹ phẩm và làm thuốc chữa bệnh Trong y học, chúng được sử dụng trong điều trị bệnh dạ dày, kích thích tiêu hóa, bảo vệ cơ quan tiêu hóa (ruột, dạ dày, gan), chống viêm, làm lành vết thương, chống lão hóa, ngăn ngừa ung thư, chống oxy

hóa [46] Trong đó Nghệ vàng (C longa L.) là loài phổ biến được sử dụng nhiều nhất, tiếp đến là Nghệ đen (C zedoaria Rosc.) Các thành phần được cho là tạo nên tác dụng của đa số các loài Curcuma L là các curcuminoid và tinh dầu Bên cạnh nhóm các

curcuminoid có nhiều hoạt tính sinh học và có ứng dụng làm thuốc cao, tinh dầu nghệ cũng là một nhóm đang được quan tâm nghiên cứu và cũng có giá trị lớn trong lĩnh vực dược phẩm, y học và mỹ phẩm [17] Với những tiềm năng về giá trị sử dụng và số lượng

loài lớn như vậy, việc nghiên cứu về các loài thuộc chi Curcuma L là vô cùng cần thiết.

Trong chuyến điều tra thực địa tại Hòa Bình, chúng tôi đã phát hiện một loài thuộc

chi Curcuma L tên địa phương là Nghệ cầu lửa có phần thân rễ được người dân địa

phương sử dụng trong điều trị bệnh đau dạ dày Qua tra cứu các tài liệu trên thế giới [26], [34] và Việt Nam [2], chúng tôi nhận thấy loài này mang những đặc điểm khác biệt với các loài đã mô tả trước đó ở Việt Nam và trong khu vực Do đó, khóa luận

“Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật

của tinh dầu cây Nghệ cầu lửa (Curcuma sp.), họ Gừng (Zingiberaceae) ở Đà Bắc,

Hòa Bình”được thực hiện với mục đích cung cấp thông tin cơ sở về loài này, góp phần

xây dựng hệ thống dữ liệu của chi Curcuma L., ứng dụng trong nghiên cứu phát triển và

kiểm nghiệm thuốc từ dược liệu

Để thực hiện mục đích trên, đề tài này được tiến hành với 4 mục tiêu sau:

 Mô tả đặc điểm hình thái, giám định tên khoa học, đặc điểm vi phẫu và đặc điểm

bột thân rễ và bột lá của mẫu nghiên cứu

 Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ trong mẫu nghiên cứu thông qua các phản

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về họ Gừng (Zingiberaceae)

1.1.1 Vị trí phân loại

Theo Hệ thống phân loại của Takhtajan 2009 [12], vị trí của họ Gừng

(Zingiberaceae) trong giới thực vật như sau:

Giới (Kingdom) Thực vật (Planta)

Ngành (Division) Ngọc lan (Magnoliophyta)

ở 2 bên gốc chỉ nhị hữu thụ, có khi tiêu giảm hoàn toàn Bộ nhụy 2 lá noãn, dính nhau tạo thành bầu dưới, 3 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn, có khi chỉ còn 1 ô Vòi nhụy hữu thụ 1, mang núm nhụy hình phễu xuyên qua khe giữa của 2 ô phấn và thò ra ngoài, 2 vòi còn lại không sinh sản, tiêu giảm ở gốc vòi hữu thụ Quả nang, ít khi là quả mọng Hạt có nội nhũ và ngoại nhũ [1]

các hệ thống phân loại trước đây, giải quyết được các mâu thuẫn của các hệ thống đó và ứng dụng nghiên cứu sinh học phân tử đế làm rõ mối quan hệ giữa các taxon Vì vậy, có thể nói rằng, đây là hệ thống phân loại hoàn thiện, tiên tiến nhất từ trước đến nay Theo

hệ thống phân loại này thì họ Gừng được xếp thành 4 phân họ là Siphonochiloideae, Tamijoideae, Alpinioideae và Zingiberoideae với 53 chi và 6 tông [2]

Ở Việt Nam, các chi trong họ Gừng được sắp xếp theo hệ thống này thành 2 phân

họ và 3 tông như bảng sau [2]:

Bảng 1.1 Hệ thống phân loại thực vật họ Gừng ở Việt Nam sắp xếp theo hệ thống

John Kress & cộng sự (2002) [2]

Phân họ 1 Alpinioideae Phân họ 2 Zingiberoideae

Tông 1 Alpinieae Tông 2 Zingibereae Tông 3 Globbeae

(Phân họ 1 Alpinioideae) (Tông 1 Alpinieae)

2A Cụm hoa trên ngọn thân có lá

3A Nhị lép bên tiêu giảm hay dạng răng, dạng dùi; quả hình cầu, bầu dục, hiếm khi

là hình thoi……….1 Alpinia 3B Nhị lép bên hình trứng ngược hẹp; quả dạng quả cải………… 2 Siliquamomum

2B Cụm hoa mọc từ thân rễ, riêng với thân có lá

4A Hoa nhiều, xếp sít nhau trên trục cụm hoa; các lá bắc xếp lợp lên nhau

5A Lá bắc con hình trứng, mở đến gốc………3 Hornstedtia

5B Lá bắc con hình ống, không mở

6A Các hoa xếp theo vòng tròn đồng tâm………4 Etlingera

6B Các hoa xếp dọc theo trục cụm hoa; cánh môi hình tròn, trứng hay hình bầu

dục……… ….5 Amomum

4B Hoa ít, xếp thưa trên trục cụm hoa; các lá bắc không xếp lợp lên nhau

7A Lá bắc con hình ống; phần trên đài xẻ một bên……….6 Geostachys

7B Lá bắc con mở đến gốc; phần trên đài xẻ thành 2-3 răng ngắn

8A Trục cụm hoa mảnh, dài, cong xuống; lá bắc bao 1 cụm nhỏ có 3-4

hoa……… …… 7 Elettaria 8B Trục cụm hoa rất ngắn, thẳng; lá bắc bao 1 cụm nhỏ có 1-2 hoa 8 Elettaiopsis

1B Nhị lép bên dạng cánh tràng, hiếm khi là dạng dùi (Phân họ 2 Zingiberoideae)

9A Bầu 3 ô, noãn đính trung trụ (Tông.2 Zingibereae)

10A Nhị lép bên dạng cánh tràng dính với cánh môi; vòi nhụy được bao bởi phần

phụ trung đới của bao phấn kéo dài……….….9 Zingiber

10B Nhị lép bên dạng cánh tràng không dính với cánh môi; vòi nhụy không được bao bởi phần phụ trung đới của bao phấn kéo dài

11A Cụm hoa được bao bởi lá bắc hình chuông……….10 Stahlianthus

11B Cụm hoa không được bao bởi lá bắc hình chuông

12A Các lá bắc dính với nhau ở nửa dưới làm thành dạng túi………11 Curcuma

12B Các lá bắc không dính với nhau ở nửa dưới và không thành dạng túi

13A Cụm hoa trên ngọn thân có lá

14A Lá bắc con hình ống……….…… 12 Hedychium

14B Lá bắc con không hình ống, mở đến gốc hay tiêu giảm

15A Lá bắc hình mũi mác hẹp, bao 1 cụm nhỏ có 1-4 hoa; gốc 2 thùy tràng

bên không dính với cánh môi………13 Caulokaempferia

15B Lá bắc dạng thuyền chỉ bao 1 hoa; gốc 2 thùy tràng dính với cánh

17B Cánh môi không lõm hình túi, mép thẳng, đầu xẻ thành 2

thùy……… … 16 Distichochlamys 16B Các lá bắc xếp xoắn………17 Kaempferia 9B Bầu 1 ô, noãn đính vách (Tông 3 Globbeae)

18A Cánh môi khía mép hay chia thùy, không có thùy giữa; cụm hoa trên ngọn thân

có lá……….………… 18 Globba

18B Cánh môi chia 3 thùy, thùy giữa nhỏ như chỉ, 2 thùy bên dạng cánh hoa; cụm

hoa mọc từ gốc thân……… …19 Gagnepainia

1.2 Tổng quan về chi Curcuma L

1.2.1 Đặc điểm thực vật, sinh thái và phân bố chi Curcuma L

1.2.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật và sinh thái của chi Curcuma L

Đặc điểm thực vật: Cây thân thảo, cao 1-2 m; rễ phần lớn hình ống; thân rễ có nhánh, dày, nạc, có mùi thơm Lá có phiến hình mũi mác rộng hay hình bầu dục dài, hiếm khi là hình dải hẹp; cuống lá thường dài; lưỡi ngắn Cụm hoa mọc thẳng từ thân rễ hay giữa các bẹ lá, hay sát bên thân có lá, đôi khi cụm hoa xuất hiện trước lá Các lá bắc dính với nhau ở 1/2 chiều dài phía dưới và làm thành hình túi, phần trên xòe ra, mỗi lá bắc chứa một cụm nhỏ có 2-7 hoa, các lá bắc có màu sắc; ở một số loài, lá bắc bất thụ

và lá hữu thụ có màu khác nhau; các lá bắc con mở đến gốc (đôi khi là hình dải) Phần dưới đài hình ống hay hình chuông ngắn; phần trên xẻ sâu 1 bên, đầu chia thành 2 hoặc

3 thùy hình răng nhỏ Phần dưới tràng hình phễu hẹp; phần trên chia thành 3 thùy hình trái xoan hay hình bầu dục dài, các thùy gần bằng nhau, đôi khi thùy giữa hơi dài hơn hai thùy bên, đầu thùy hình mũ Cánh môi có phần giữa dày giống như gân, hai bên mỏng hơn Nhị có chỉ nhị ngắn và rộng, thường thót lại phía đầu phần đính với bao phấn; bao phấn 2 ô, đính lưng, song song, gốc mỗi ô bao phấn kéo dài xuống phía dưới thành hình cựa ở phần lớn các loài, phần phụ trung đới đôi khi kéo dài lên phía trên thành mào

nhỏ Nhị lép hình mũi mác, trái xoan hay bầu dục, hiếm khi là hình dùi (Curcuma

stenochila Gagnep.) Bầu 3 ô Quả hình trái xoan, vỏ mỏng Chưa gặp quả ở các loài

thuộc chi Nghệ ở Việt Nam [2]

Sinh thái: Phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [46] Cây ưa bóng, mọc dưới tán rừng ẩm, ven suối, ven nương rẫy, sinh trưởng tốt trên đất giàu dinh dưỡng, đất phù sa nhiều mùn ẩm, thoát nước, không chịu được úng [2]

1.2.1.2 Phân bố các loài thuộc chi Curcuma ở Việt Nam

Chi Nghệ (Curcuma L.) là một trong những chi lớn nhất trong họ Gừng (Zingiberaceae) Ở Việt Nam, từ năm 2015 có 27 loài Curcuma L [3], phân bố rải rác

từ Bắc vào Nam Sau đó, vào năm 2017 có thêm 2 loài mới được công bố, đó là Curcuma

singularis Gagnep vào tháng 3/2017 [38] và Curcuma cotuana Luu, Škorničk &

H.Đ.Trần vào tháng 10/2017 [34], bổ sung thêm vào danh sách loài trong chi Curcuma

L ở Việt Nam

Như vậy, đến nay có khoảng 29 loài Nghệ được công bố ở Việt Nam Các loài được liệt kê dưới bảng sau:

Bảng 1.2 Các loài thuộc chi Curcuma L ở Việt Nam

TK

1 C alismatifolia

Gagnep

Nghệ lá từ cô Quảng Ninh (Uông Bí), Kon Tum

(Đắk Glei), Tây Ninh, Tp Hồ Chí Minh, An Giang (Châu Đốc)

[2]

2 C sparganifolia

Gagnep

Nghệ lá hắc tim lang

Miền nam Việt Nam [2]

3 C kwangsiensis

S.G Lee & C.F

Liang

Nghệ rừng Điện Biên (Điện Biên Phủ), Kon

Tum (Đắk Glei: Đắk Choong)

[2]

4 C cochinchinensis

Gagnep

Nghệ nam bộ, Gừng gầy

Lạng Sơn, Quảng Trị (Hải Lăng), Kon Tum (Đắk Glei), Gia Lai (KBang), Đắk Lắk (Yok Đôn), Bà Rịa-Vũng Tàu

[2], [8]

5 C thorelii Gagnep Nghệ thorel Sơn La (Mộc Châu), Thừa

Thiên-Huế, Đắk Lắk, Tp Hồ Chí Minh

[2], [8]

6 C harmandii

Gagnep

Nghệ harmand Hòa Bình (Đà Bắc), Nam Bộ [2]

7 C longa L Nghệ, Nghệ

nhà, Nghệ trồng, Uất kim, Khương hoàng,

Co hem, Co khản mỉn (Thái)

Lạng Sơn, Vĩnh Phúc, Hà Nội, Ninh Bình, Đắk Lắk, Đồng Nai, Kon Tum

[2], [8]

8 C rhomba K

Larsen & J Mood

Nghệ hoa cựa cong

Mới thấy ở Đắk Lắk (Dray Sup) [2]

Nghệ hoa vàng Lào Cai (Sa Pa), Thái Nguyên (Đại

Từ), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Ninh Bình (Cúc Phương), Thanh Hóa (Bá Thước), Kon Tum (Đắk Glei,

Mọc hoang và được trồng ở Sơn La (Mộc Châu), Hà Giang, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Bình Phước,

Tp Hồ Chí Minh

[2], [8]

15 C zedoaria (Berg.)

Rosc

Nghệ đen, Nga truật, Ngải tím, Bồng nga truật, Tam nại, Ngái

Mọc hoang dại và được trồng nhiều nơi ở Việt Nam

[2], [8]

17 C trichosantha

Gagnep

Nghệ sâm Cao Bằng [2]

18 C elata Roxb Mì tinh rừng Thanh Hóa, Gia Lai (Mang Yang),

Lâm Đồng (Dran, Lang Biang)

[2], [8]

19 C aromatica

Salisb

Nghệ trắng, Nghệ rừng, Ngải trắng, Uất kim

Được trồng và mọc hoang dại nhiều nơi ở Việt Nam: Sơn La (Mộc Châu), Yên Bái (Văn Chấn), Cao Bằng (Nguyên Bình), Hà Nội (Ba Vì, Bắc Từ Liêm, Nam Từ Liêm), Ninh Bình (Cúc Phương), Lâm Đồng (Bảo Lộc)

[2], [8]

Hy Lạp)

Tỉnh Phú Yên, dọc bờ sông Đà Rằng

Škorničk & Lưu

Vườn Quốc gia Bù Gia Mập - tỉnh Bình Phước [24]

25 C pygmaea

Škorničk & Šída f

Đắk Lắk, chưa ghi nhận ở nơi khác [30]

Huyện Đức Phổ, tỉnh Quảng Ngãi [26]

Ngải Cơ Tu Quảng Nam (Tây Giang) [34]

1.2.2 Phân loại chi Curcuma L ở Việt Nam

 Khóa định loại các loài thuộc chi Curcuma L ở Việt Nam như sau [2]:

1A Cụm hoa giữa các lá

2A Gốc bao phấn có cựa

3A Phiến lá hình dải hay mũi mác hẹp, chiều dài hơn chiều rộng 9-10 lần hay hơn 4A Lá bắc bất thụ ở phía trên, màu hồng tím, lá bắc hữu thụ ở phía dưới màu xanh

lục; cánh môi màu tím 1 C alismatifolia

4B Tất cả các lá bắc đều có màu tím hồng; cánh môi màu vàng ở giữa, không có

màu tím 2 C sparganifolia

3B Phiến lá hình trái xoan, bầu dục rộng hay hình trứng, chiều dài hơn chiều rộng 1,3-3,5 lần

5A Mặt dưới phiến lá có lông

6A Cây cao đến 1 m; phiến lá dài 30-60 cm; trung đới không kéo dài thành mào

8A Trung đới không kéo dài lên phía trên thành mào

9A Tất cả các lá bắc đều chứa hoa, màu xanh 6 C harmandii

9B Có lá bắc chứa hoa, có lá bắc không chứa hoa, màu trắng-xanh hay trắng

hồng 7 C longa

8B Trung đới kéo dài lên phía trên thành mào

10A Cây cao 0,6-1,1 m 8 C rhomba

10B Cây cao 20-40 cm

11A Cây cao đến 20 cm; cánh môi màu trắng, gân giữa màu vàng

9 C pierreana 11B Cây cao 35-40 cm; cánh môi màu vàng 10 C stenochila

2B Gốc bao phấn không có cựa

12A Phiến lá hình dải, chiều dài hơn chiều rộng 6-18 lần 11 C gracillima

12B Phiến lá hình trứng hay xoan, chiều dài hơn chiều rộng không quá 3-4 lần

12 C parviflora

1B Cụm hoa mọc ở bên, riêng với thân có lá

13A Dọc hai bên gân giữa lá mặt trên màu nâu đỏ

14A Lá không cuống; thân rễ cắt ngang có màu xanh xám 13 C aeruginosa

14B Lá có cuống, cuống dài 1-30 cm; thân rễ cắt ngang màu vàng hay vàng da cam 15A Lá bắc chứa hoa dài 2,8-3 cm, ngắn hơn chiều rộng

14 C zanthorrhiza 15B Lá bắc chứa hoa dài 4-5 cm, hình trái xoan hay mũi mác 15 C zedoaria

13B Dọc hai bên gân giữa lá mặt trên không có màu nâu đỏ

16A Cây cao đến 50 cm; phiến lá dài 15-30 cm

17A Cuống lá dài 12-15 cm; thùy tràng dài 1,2-1,5 cm; cánh môi hình bầu dục, dài

10-11 mm 16 C angustifolia

17B Cuống lá không có; thùy tràng dài đến 8 mm; cánh môi gần tròn, đường kính

6-8 mm 17 C trichosantha

16B Cây cao 1 m hay hơn; phiến lá dài 30-100 cm

18A Lá bắc bất thụ ở dưới, màu trắng xanh; lá bắc hữu thụ ở trên, màu trắng hồng

(3 C kwangsiensis)

18B Lá bắc bất thụ ở trên, màu trắng hồng hay trắng tím, lá bắc hữu thụ ở dưới, màu xanh

19A Lá bắc hữu thụ gần tròn, đường kính 5-6 cm 18 C elata 19B Lá bắc hữu thụ hình trái xoan, cỡ 4,5-5 × 2-2,5 cm 19 C aromatica

1.2.3 Thành phần hóa học chi Curcuma L

Qua nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài trong chi Curcuma L

các nhà khoa học đã phát hiện được rất nhiều chất chuyển hóa khác nhau Trong số hơn

100 loài thuộc chi này, C longa L (Nghệ vàng) là loài được nghiên cứu nhiều nhất, tiếp đến là C zedoaria Rosc (Nghệ đen) và C amada Roxb [46] Tuy nhiên, những nghiên cứu tổng quát về thành phần hóa học của các loài thuộc chi Curcuma L còn ít

Theo nghiên cứu của Wusen và các công sự năm 2017, cho đến thời điểm nghiên

cứu có tổng cộng 720 hợp chất đã được phân lập và xác định từ 32 loài Curcuma L

được nghiên cứu thành phần hóa học đã công bố trên các tài liệu Hầu hết các hợp chất này được phân lập từ thân rễ khô, một số khác từ thân rễ tươi và các bộ phận trên mặt đất Về mặt hóa học các hợp chất này có thể được chia thành 5 nhóm: diphenylalkanoid, dẫn xuất phenylpropen, terpenoid, flavonoid và các nhóm khác [46]

- Diphenylalkanoid: đây là nhóm lớn bao gồm rất nhiều chất được phát hiện từ chi

Curcuma L với tổng cộng 102 diphenylalkanoid đã được công bố Dựa trên độ dài của

chuỗi carbon giữa 2 vòng thơm, các diphenylalkanoid có thể được phân loại thành nhóm các diphenylheptanoid, nhóm diphenylpentanoid và các diphenylalkanoid khác [46]

Trong đó, các diphenylheptanoid thường được gọi là curcuminoid và chứa bộ

khung aryl-C7-aryl Những hợp chất này có rất nhiều trong chi Curcuma L với tổng số

khoảng 96 curcuminoid được biết đến Curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin, còn được gọi là curcumin I, II và III tương ứng, là các curcuminoid thường gặp nhất trong chi Điển hình được nghiên cứu nhiều nhất là

curcumin, nguồn chủ yếu từ C longa L (Nghệ vàng) [46]

Các diphenylpentanoid bao gồm 2 gốc phenyl nối nhau bởi chuỗi 5-carbon Ba

hợp chất loại này đã được tìm thấy trong rễ và thân rễ của C longa L [16], [50]

- Dẫn xuất phenylpropen: 16 loại monomeric và 3 loại dimeric dẫn xuất phenylpropen

thu được từ các loài Curcuma L đã được công bố [46]

- Các terpenoid (thành phần chính của tinh dầu): đây là nhóm bao gồm nhiều hợp chất

nhất được phân lập từ các loài trong chi Curcuma L Tổng cộng 526 terpenoid đã được công bố từ 32 loài Curcuma L (chiếm 74,7% trên tổng số hợp chất) Các loại tinh dầu

từ Curcuma L chủ yếu là monoterpen và sesquiterpen, ngoài ra một số dạng diperten,

serterpin và triterpen cũng đã được phân lập [17] Trong đó, sesquiterpen có cấu trúc đa dạng và phong phú nhất Bên cạnh các curcuminoid, đây cũng là thành phần đang được nhiều sự quan tâm nghiên cứu

- Monoterpen: các acyclic monoterpenoid (β-terpineol, trans-linalool oxid, elsholtzia

keton,…), các menthan monoterpenoid (o-, m-, p-menthan), các bicyclic monoterpenoid [46]

- Sesquiterpen: (2Z,6E)-farnesol, (E)-β-farnesen, cis-sesquisabinen hydrat,

trans-sesquisabinen hydrat, trans-sesquisabinen, curcumenon, furanodien, curdion,…

Tinh dầu của các loài trong chi Curcuma L chủ yếu được thu bằng phương pháp

cất kéo hơi nước từ thân rễ tươi hoặc khô Thành phần tinh dầu thường được xác định

bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ Một số loài Curcuma L ở Việt Nam đã được phân tích thành phần tinh dầu được tóm tắt trong Bảng 1.3 Hàm lượng cũng như sự có mặt

của các thành phần tinh dầu cụ thể phụ thuộc nhiều yếu tố như: kiểu gen, giống, khác biệt địa lý, khí hậu, mùa vụ, phương pháp trồng trọt, phân bón, thời gian thu hoạch, giai đoạn sinh trưởng, cất trữ, chiết xuất và phương pháp phân tích [17] Do đó các kết quả

phân tích thành phần tinh dầu của một loài Curcuma L thường dao động về cả thành

phần và hàm lượng Tuy nhiên, sự khác biệt cũng có thể do sự nhầm lẫn giữa các loài hoặc thành phần

Bảng 1.3 Thành phần chủ yếu trong tinh dầu một số loài thuộc chi Curcuma L ở

- Khu bảo tồn thiên nhiên Chạm Chu, tỉnh Tuyên Quang,

curdion 36,8%

C longa L [7],

[19]

- Trung tâm nghiên cứu cây trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội Viện Dược liệu (Thân rễ)

- - Tỉnh Thừa Thiên Huế (Lá)

curcumol 29,5 % neocurdion 28,2 % β-elemenon 5,5 % β-pinen 5,1 %

C singularis

Gagnep (Thân

rễ) [37]

Xã So Pai, huyện Kbang, tỉnh Gia Lai

camphor 25,83%

germacron 8,00%

- Flavonoid: Mặc dù flavonoid phân bố rộng rãi trong giới thực vật và đóng vai trò như

hoạt chất chính trong nhiều dược liệu, nhưng chỉ có khoảng 14 flavonoid được công bố

từ chi Curcuma L Ví dụ, trong thân rễ một số loài như C longa L chứa quercetin, C

zeodaria Rosc chứa naringenin; từ lá bắc trên của C alismatifolia Gagnep phân lập

được malvidin 3-rutinosid (hợp chất anthocyanin) [46]

- Các nhóm khác:

Alcaloid: Trong rễ của C longa L chứa một alcaloid nhân quinolin danh pháp cụ

thể là 2-(20-methyl-10-propenyl)-4,6-dimethyl-7-hydroxyquinolin [46] Hai alcaloid

khác là aurantiamid và curcuminol I được phân lập từ rễ khô của C aromatica Salisb

[35]

Ngoài các thành phần nêu trên, còn nhiều hợp chất khác được phân lập từ chi

Curcuma L như là acid béo, coumarin (scopoletin trong thân rễ khô của C mangga

Valeton & Zijp), glycosid tim, tanin, saponin, acid amin, đường khử, steroid… [43], [46]

1.2.4 Giá trị sử dụng của chi Curcuma L

Chi Curcuma L từ lâu đã là nguồn nguyên liệu sử dụng cho thực phẩm nhằm tạo

màu và vị tại châu Á, đồng thời cũng dùng làm các thuốc cổ truyền, thuốc nhuộm, nước

hoa, mĩ phẩm và cây cảnh Một số loài nghệ ở Bangladesh, Malaysia, Ấn Độ, Nepal, Thái Lan được sử dụng trong y học để chữa viêm phổi, viêm phế quản, bệnh lậu, tiêu chảy, kiết lị, nhiễm trùng vết thương và áp-xe, côn trùng cắn [17], [37] Giá trị sử dụng

của chi Curcuma L là vô cùng lớn, trong đó thân rễ là bộ phận được sử dụng nhiều nhất

với hoạt chất ứng dụng chủ yếu là các curcuminoid và các thành phần của tinh dầu

Các curcuminoid đa dạng hoạt tính sinh học và an toàn Trong đó, curcumin là được nghiên cứu nhiều nhất và curcumin cho thấy nhiều hoạt tính sinh học như: tác dụng bảo vệ đường tiêu hóa (dạ dày, ruột), bảo vệ gan, kích thích tuyến tụy tiết các men tiêu hóa, bảo vệ tim mạch, tác dụng chống lại sự suy giảm trí nhớ, giảm lipid máu, đặc biệt

là chống viêm, chống oxy hóa Ngoài ra curcumin còn có tác dụng trong điều trị ung thư, đái tháo đường, chống lại nấm mốc, vi khuẩn và virus gây bệnh [7], [23]

Tinh dầu của các loài Curcuma L có nhiều đặc tính dược lý trong điều trị bệnh,

bao gồm chống viêm, chống ung thư, chống tăng sinh khối u, giảm cholesterol, đái tháo đường, bảo vệ gan, chống tiêu chảy, đầy hơi, lợi tiểu, chống thấp khớp, hạ huyết áp, chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống virus, côn trùng cắn, chống độc, chống huyết khối,

ức chế enzym tyrosinase (enzym tham gia tổng hợp melanin) và ức chế

cyclooxygenase-1 (COX-cyclooxygenase-1) Ngoài ra, dầu của các loài Curcuma L cũng được biết đến với khả năng

tăng cường chức năng miễn dịch, thúc đẩy lưu thông máu, tăng tốc đào thải độc tố và kích thích tiêu hóa [17], [37]

Một số tác dụng dược lý của chi Curcuma L trong y dược học:

- Chống ung thư: Hiệu quả và cơ chế chống ung thư của curcumin đã được nghiên

cứu sâu rộng về cả in vitro và in vivo [21], [22] Ngoài tác dụng chống ung thư do

curcumin và các chất tương tự, hàng loạt các hợp chất tinh khiết khác và dịch chiết trong

chi Curcuma L cũng được sàng lọc và thử nghiệm khả năng chống ung thư Ví dụ, furanodienon (C phaeocaulis Valeton) [33], germacron-13-al (C phaeocaulis Valeton) [15],…

Ngoài ra, một số tinh dầu hay dịch chiết thu được từ C aeruginosa Roxb., C

aromatica Salisb., C longa L và C zedoaria Rosc có thể gây độc trên tế bào ung thư

Tuy nhiên, tác dụng của các dịch chiết này là tương đối thấp và các thành phần dịch

chiết vẫn chưa được phân tích rõ [46] Dịch chiết n-hexan của C ochrorhiza Valeton,

sesquiterpen zerumbon và zederon đã cho thấy khả năng gây độc tế bào ung thư trong

bệnh bạch cầu tăng lympho bào cấp tính [13]

- Chống viêm: Các hợp chất và dịch chiết từ nhiều loài thuộc chi Curcuma L ức

chế quá trình tạo nitric oxid (NO) và các cytokin như TNFα (yếu tố hoại tử khối u alpha),

interleukin 6 và prostaglandin E2 (PGE2) trong thử nghiệm in vitro Một số hoạt chất

cho thấy tác dụng chống viêm trong các thử nghiệm như curcumin, zedoalacton B,

β-turmeron, xanthorrhizol, carrageenan,… [46]

- Chống oxy hóa: Hoạt tính chống oxy hóa của các loài Curcuma L., đặc biệt là C

longa L., đã được đánh giá bằng nhiều phương pháp và chủ yếu là do thành phần

curcuminoid và sesquiterpenoid [45], [52] Ở các loài Curcuma L., dịch chiết từ thân rễ

tươi và lá có đặc tính chống oxy hóa cao và đặc biệt là dịch chiết từ C longa L [14],

[20] Ngoài ra, tinh dầu thân rễ các loài C aromatica Salisb., C zedoaria (Berg.) Rosc.,

C aeruginosa Roxb., C alismatifolia Gagnep.,…có tác dụng chống oxy hóa trên thử

nghiệm in vitro [17]

- Tác dụng khác

Ức chế sự phát triển của nấm, vi khuẩn và virus (tinh dầu C longa L kháng khuẩn,

một số sequiterpenoid từ C aromatica Salisb ức chế hoạt động virus cúm, ), chống lão

hóa (xanthorrhizol), chống Alzemer, trừ sâu bệnh (keton, turmeron, curcumin,

demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin từ C longa L.), [46]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu bao gồm phần trên mặt đất (lá, hoa) và phần dưới mặt đất

(thân rễ) của cây Nghệ cầu lửa (Curcuma sp.) có nguồn gốc tại xã Hiền Lương, huyện

Đà Bắc, tỉnh Hòa Bình được thu hái vào ngày 15/08/2019

Sau khi thu hái, mẫu được làm khô tự nhiên trong bóng râm; mẫu lá và thân rễ được giữ ở dạng tươi để cất tinh dầu Một phần lá và thân rễ được bảo quản trong ethanol 60° để làm vi phẫu thực vật Một phần mẫu được để khô tự nhiên, bảo quản trong túi nilon sạch, sử dụng để định tính sơ bộ các hợp chất hữu cơ khác (lá, thân rễ) và làm mẫu

vi phẫu học bột (lá, thân rễ)

Tiêu bản thực vật khô gồm thân rễ, bẹ lá, cuống lá, phiến lá và cụm hoa được lưu giữ tại Bảo tàng thực vật (HNU), khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội với mã số tiêu bản là HNU 022972 (Phụ lục 2)

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

2.1.2.1 Hóa chất, dung môi

 Dùng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật: nước cất, nước Javen, acid acetic 5%, cloralhydrat 75%, xanh methylen, đỏ son phèn, glycerin

 Dùng trong định tính sơ bộ các thành phần hóa học: NaOH 10%, FeCl3 5%, HCl đặc, H2SO4 đặc, TT Diazo, TT Fehling A & B, Na2CO3, chì acetat 10%, dd gelatin 1%,

TT Mayer, TT Dragendorff, TT Bouchardat, acid picric…

 Dùng trong SKLM:

• Dung môi: Ethanol, ethyl acetat, n-hexan, nước cất…

• Bản mỏng Silicagel 60 - F254 của Merck

• Dao lam, phiến kính, lam kính

• Dụng cụ khác: Bát sứ, chày, cối, thuyền tán, khay tráng men,…

 Máy móc, thiết bị:

• Máy xay

• Tủ sấy MEMMERT (Đức), bếp điện

• Cân kĩ thuật SATORIUS TE412

• Bộ dụng cụ cất tinh dầu theo Dược điển Mỹ (USP29)

• Kính hiển vi LEICA DM 1000

• Hệ thống sắc ký bản mỏng bán tự động CAMAG (HPTLC)

• Máy sắc ký khí kết hợp khối phổ Agilent Technologies (GC-MS)

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật

 Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu, giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

 Mô tả đặc điểm vi học của mẫu nghiên cứu:

• Vi phẫu: Lá, thân rễ

• Bột: Lá, thân rễ

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

 Định tính sơ bộ các hợp chất hữu cơ có trong mẫu

 Xác định hàm lượng tinh dầu trong lá, thân rễ

 Định tính các thành phần hóa học trong tinh dầu lá, thân rễ bằng SKLM

 Xác định thành phần cấu tử của tinh dầu trong lá, thân rễ bằng phương pháp sắc

ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp giám định tên khoa học

Giám định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích các đặc điểm hình thái, đặc

điểm của bộ phận sinh sản; so sánh, đối chiếu với loài Curcuma L., đối chiếu với Khóa

định loại thực vật trong tài liệu [2]; cùng với sự hỗ trợ của các chuyên gia phân loại thực vật tại Bảo tàng thực vật (HNU) để xác định tên khoa học của loài

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu hiển vi

 Đặc điểm vi phẫu: Mẫu dược liệu (lá, thân rễ) được cắt, nhuộm, lên tiêu bản theo

các bước như tài liệu [11], mô tả đặc điểm vi phẫu và chụp ảnh

 Đặc điểm bột: Lá, thân rễ của dược liệu được sấy khô, nghiền nhỏ thành bột bằng thuyền tán, rây qua rây 180 lấy bột mịn, lên tiêu bản và quan sát, mô tả đặc điểm của bột và chụp ảnh [11]

• Pha tĩnh: Bản mỏng Silicagel 60 - F254 của Merck

• Pha động: Hệ dung môi khai triển toluen – ethyl acetat (97:3)

Sau khi khai triển sắc ký, sấy nhẹ bản mỏng cho bay hơi hết dung môi Quan sát và chụp ảnh sắc ký đồ ở bước sóng 254 và 366 nm Phun TT hiện màu vanilin/ethanol/H2SO4 đặc, chụp ảnh sắc ký đồ sau khi hiện màu ở ánh sáng thường, dưới bước sóng 254 và 366 nm

2.3.5 Phương pháp xác định hàm lượng nước trong dược liệu

Hàm lượng nước trong dược liệu được xác định bằng phương pháp cất với dung môi [9]:

 Rửa sạch ống hứng và ống sinh hàn với nước rồi làm khô

 Thêm 200 ml toluen và khoảng 2 ml nước vào bình cầu khô Cất khoảng 2 giờ,

để nguội trong 30 phút rồi đọc thể tích nước cất được ở ống hứng (V1), chính xác đến 0,05 ml

 Thêm vào bình cầu một lượng m (g) mẫu thử đã cân chính xác tới 0,01 g có chứa khoảng 2-3 ml nước Thêm vài mảnh đá bọt Đun nóng nhẹ trong 15 phút; khi toluen bắt đầu sôi thì điều chỉnh nguồn cấp nhiệt để cất với tốc độ khoảng 2 giọt dịch cất trong

1 giây Khi đã cất được phần lớn nước sang ống hứng thì nâng tốc độ cất lên 4 giọt dịch

cất trong 1 giây Tiếp tục cất cho đến khi mực nước cất được trong ống hứng không tăng lên nữa

 Dùng 5 ml đến 10 ml toluen rửa thành trong ống sinh hàn rồi cất thêm 5 phút nữa Sau đó, tách bộ cất ra khỏi nguồn cấp nhiệt, để cho ống hứng nguội đến nhiệt độ phòng Nếu còn những giọt nước còn đọng trên thành ống sinh hàn thì dùng 5 ml toluen

để rửa kéo xuống Khi lớp nước và lớp toluen đã được phân tách hoàn toàn, đọc thể tích nước trong ống hứng (V2)

 Hàm lượng nước trong dược liệu được tính theo công thức sau:

𝑋% = 100 (𝑉2 − 𝑉1)

𝑚

Trong đó: V1: số ml nước cất được sau lần cất đầu;

V2: số ml nước cất được sau lần cất thứ hai;

m : số g mẫu đã cân đem thử

2.3.6 Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu trong dược liệu

Sử dụng bộ dụng cụ định lượng tinh dầu theo Dược điển Mỹ (USP29) Tiến hành:

 Mẫu thân rễ, lá của dược liệu sau khi thu hái được bảo quản trong túi nilon để trong bóng râm

 Các mẫu dược liệu được chia nhỏ Cân chính xác một lượng mẫu nhất định đem

đi cất tinh dầu, một lượng phù hợp đem xác định hàm ẩm

 Cho dược liệu vào nồi cất, thêm nước ngập dược liệu khoảng 3–4 cm

 Lắp đặt bộ dụng cụ cất tinh dầu và tiến hành cất kéo hơi nước, cất cho đến khi thể tích tinh dầu không tăng lên nữa (thời gian cất khoảng 5–6 giờ) Đọc thể tích tinh dầu sau khi cất

 Xác định hàm lượng tinh dầu theo tỉ lệ phần trăm thể tích trên khối lượng dược liệu khô tuyệt đối theo công thức:

𝐻% = 𝑉 10

4

𝑀 (100 − 𝑋)

Trong đó: H%: hàm lượng tinh dầu (%); X: độ ẩm của dược liệu (%);

V: thể tích tinh dầu cất được (ml); M: khối lượng dược liệu đem cất (g)

2.3.7 Phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ

Sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS) gồm có thiết bị sắc ký khí kết nối với detector khối phổ Mẫu sau khi tách trên cột phân tích của thiết bị sắc ký khí sẽ được

detector khối phổ nhận biết Hiện nay, phương pháp này được áp dụng phổ biến để định tính (dựa vào thời gian lưu) hay định lượng (dựa vào chiều cao hay diện tích peak) tinh dầu

Hệ thống máy sắc ký GC-MS được thực hiện trên hệ thống GC: Agilent Technologies 7890 A và hệ thống MS: Agilent Technologies 5975 C, cột sắc ký DB-5MS với chiều dài cột 30 m, đường kính cột 0,25 mm, kích thước hạt nhồi 0,25 μm (30 m/0,25 mm/0,25 μm) Khí mang Helium, tốc độ khí mang 1 ml/phút Tinh dầu được pha

loãng với dung môi n-hexan, thể tích tiêm mẫu 1 microlit, chế độ chia dòng 1:50

Cài đặt các thông số nhiệt độ thích hợp: 60°C trong 15 phút, sau đó tăng dần lên 180°C (tốc độ 3°C/phút), tổng thời gian phân tích 70 phút

Các thành phần trong tinh dầu được xác định dựa trên so sánh độ trùng lặp về phổ khối các chất có sẵn trong thư viện và dựa trên giá trị RI được so sánh với các dữ liệu

có trong thư viện NIST và cơ sở dữ liệu đã được công bố Chỉ số RI được tính toán dựa trên thời gian lưu thực tế các pic trong mẫu phân tích và thời gian lưu các alkan trong dãy đồng đẳng alkan C9-C20 được tiến hành ở cùng điều kiện sắc ký theo công thức:

𝑅𝐼 = 100 𝑛 + 100 𝑅𝑇𝑥 − 𝑅𝑇𝑛

𝑅𝑇𝑛+1− 𝑅𝑇𝑛

Trong đó: ₋ RTx: Thời gian lưu của chất phân tích;

₋ RTn : Thời gian lưu của alkan liền trước pic phân tích;

₋ RTn+1: Thời gian lưu của alkan liền sau pic phân tích;

₋ n: Số nguyên tử carbon của alkan liền trước pic phân tích.

2.3.8 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Vật liệu và phương pháp [6], [36], [47], [48]

Chủng vi sinh vật kiểm định:

Chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm:

- Vi khuẩn Gr(-): Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

- Vi khuẩn Gr(+): Bacillus subtillis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538

- Nấm sợi (mốc): Aspergillus niger ATCC 9763, Fusarium oxysporum ATCC 48112

- Nấm men: Candida albicans ATCC 10231, Saccharomyces cerevisiae ATCC 16404

Chủng chuẩn (nguồn ATCC, Manassas, Mỹ) được cung cấp bởi Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương và lưu giữ tại phòng Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên)

Pha dịch vi sinh vật: Dùng que cấy vô trùng lấy 1 quai khuẩn lạc của chủng vi sinh

vật pha hòa tan vào 10ml nước muối sinh lý vô trùng và trộn đều bằng máy trộn vortex được huyền dịch vi sinh vật Đánh giá nồng độ vi sinh vật bằng cách so sánh với chuẩn 0,5 McFarland (đo ở λ =550nm) được huyền dịch nồng độ 150 x106 CFU/mL

Môi trường: Saboraud 4% Dextrose Agar (SDA; Merck, Damstaadt, CHLB Đức)

cho nấm men và nấm mốc Tryptic Soy Agar (TSB- Merck) cho vi khuẩn

Kháng sinh chuẩn

- Gentamycin cho vi khuẩn Gr(-), doxycyclin cho vi khuẩn Gr(+) và nystatin cho nấm sợi và nấm men Kháng sinh được cung cấp bởi Viện kiểm nghiệm Tp Hồ Chí Minh

- Từ dung dịch mẹ, pha dung dịch gốc bằng nước cất vô trùng Từ dung dịch gốc pha loãng ½ đến nồng độ cần dùng: gentamycin (16 - 8 - 4 IU/mg), doxycylin (0,4 - 0,2

- 0,1 IU/mg) và nystatin (12 - 6 - 3 IU/mg)

Thử nghiệm và đánh giá kết quả

Pha mẫu với DMSO 10% trên phiến 96 giếng (template plate) theo nồng độ giảm dần (log2 cho 5 thang nồng độ) Nhỏ mẫu từ phiến template lên phiến 96 giếng (phiến test) và bổ sung dịch vi sinh vật để được dải nồng độ mẫu từ 200-100-50-25,5-12,5 µg/ml (lặp lại 3 lần ở mỗi nồng độ) với mẫu thô (cao chiết) và 50-25-12,5-6,25 µg/mL

với mẫu chất tinh sạch Để trong tủ ấm ở 37°C trong 24h đối với vi khuẩn và 30°C/48h

Mẫu được xác định có hoạt tính khi giá trị MIC ≤ 200 µg/mL đối với mẫu cao chiết

≤ 50 µg/mL đối với mẫu tinh sạch

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN

3.1 Nghiên cứu về thực vật

3.1.1 Đặc điểm thực vật

Cây thân thảo sống lâu năm cao 0,5–0,8 m (A) Thân rễ phân nhánh, khỏe, chắc nạc; thân rễ chính (L) hình trứng hoặc trứng hẹp, 3–5 × 0,5–1 cm, bề mặt có vảy mỏng, bên ngoài màu nâu nhạt, bên trong vàng nhạt, có mùi thơm dịu đặc trưng Rễ dạng sợi mọc từ nách lá của thân rễ, dài 5–9 cm Rễ phình lên thành củ, hình trứng, kích thước 2,0–3,5 × 0,7–1,2 cm, bên ngoài màu nâu nhạt, bên trong trắng hơi trong, cách 3–6 cm

từ thân rễ

Thân giả cao khoảng 15–25 cm, mọc thẳng từ thân rễ chính, do các bẹ lá ôm nhau tạo thành, màu xanh nhạt, nhẵn không có lông Lá mọc hằng năm, 5–7 lá, chồi lá có 3–

4 lá trong thời kì ra hoa Bẹ lá dài 13–15 cm, hình lòng máng, màu xanh lá cây, bóng

nhẵn Lưỡi nhỏ (M) dài 3–5 mm, xẻ thành hai thùy nhọn, mỏng, trong mờ, màu trắng

hơi xanh, lâu ngày bị khô rụng Cuống lá dài 15–25 cm, có hình lòng máng, màu xanh

lá cây, bóng nhẵn Phiến lá kích thước khoảng 30–35 × 8–12 cm, hình trứng hẹp hay hình bầu dục, không đối xứng hoàn toàn, ngọn lá nhọn, gốc lá hơi xiên, mép lá nguyên, mặt trên phiến lá màu xanh lá cây, mặt dưới màu xanh nhạt, cả hai mặt lông rất thưa thớt Gân chính phồng lồi ở mặt dưới, lõm ở mặt trên, cứng chắc, hẹp dần về phía ngọn

lá Gân bên xếp hình lông chim, song song với nhau

Cụm hoa (B) hình trụ, mọc từ thân rễ hay giữa các bẹ lá, thường hoa xuất hiện sau

khi có lá, đôi khi xuất hiện cùng lá hay trước lá Cuống cụm hoa dài 5–11 cm bị che khuất một phần bởi thân khí sinh, phần tiếp xúc với ánh sáng màu xanh nhạt Cụm hoa bông dài 7–15 cm, đường kính 5–7 cm (đo ở giữa cụm hoa), gồm 16–25 lá bắc xếp lợp

Lá bắc (N) hình trứng rộng hoặc hình mác, 3,0–5,5 × 1,5–4,0 cm, gốc lá rộng ngọn lá hẹp, đỉnh tù cong xuống, phần dưới màu trắng kem đến xanh nhạt, về phía đỉnh màu hồng san hô hoặc đỏ đậm dần, hai mặt nhẵn, 1/3–1/4 lá bắc ôm với trục chính; mỗi lá bắc chứa một cụm hoa nhỏ gồm 2-3 hoa Lá bắc con có hình tam giác hẹp, 2,0–5,0 × 0,5–1,0 mm, trong mờ, nhẵn, đôi khi tiêu biến hoàn toàn Hoa không đều (D, E & F),

lưỡng tính, mẫu 3, dài 4,5–5,5 cm Lá đài (K) hàn liền dạng ống túi dài 20–22 mm, đỉnh

xẻ thành 3 thùy không đều, các thùy có đỉnh tròn, xẻ xuống mỗi bên 3,0–5,0 mm, màu

trắng hồng hơi trong, hai mặt nhẵn Tràng hoa (N) hình ống chia 3 thùy; ống hoa dạng

phễu hẹp dài 2,5–3,0 cm trong đó 1,5–2,0 cm ngay trên bầu nhụy có hình trụ rỗng hẹp

màu trắng kem, phần còn lại về phía đỉnh hình phễu màu phớt đỏ, mặt trong màu trắng, phủ lông thưa thớt; thùy lưng tràng rộng, hình bầu dục dài, 20–22 × 6–11 mm, hai cạnh bên cuộn nhẹ vào trong, đỉnh có đầu nhọn dài 2,0–3,0 mm, mặt ngoài màu đỏ cam nhạt, mặt trong màu trắng kem đến vàng nhạt, cả hai mặt có lông mịn; thùy bên hình mũi mác gần như tam giác, hai cạnh bên cong lồi, 15–18 × 6–8 mm, đỉnh thùy gần tròn có mũi nhọn, trong mờ, mặt ngoài màu đỏ cam nhạt, mặt trong có một dải màu vàng nhạt ở giữa

chạy dọc trên nền phớt cam đỏ Cánh môi (N) 20–23 × 15–16 mm, dạng trứng ngược

với một đường xẻ dài 5,0–6,0 mm, phần đáy màu trắng kem về phía đỉnh chuyển sang vàng với một dải màu vàng đậm ở giữa chạy dọc từ đáy tới đỉnh; nhị lép ở hai bên 18–

21 × 11–13 mm, hình trứng không đều, màu vàng tươi với phần đáy vàng nhạt Nhị hữu

thụ 1 (G), dài 15-20 mm; chỉ nhị (N) dẹt ngắn và rộng, thót lại phía đầu phần đính với

bao phấn, chiều dài 6–7 mm, gốc rộng 5–6 mm và đỉnh rộng 2-3 mm (vị trí đính với

bao phấn), màu vàng nhạt, phủ nhiều lông tiết; bao phấn (G) 2 ô dài 1,0 cm, đính lưng,

hình chữ L, có cựa và mào; ô phấn hình trứng hẹp 6,0–8,0 × 0,5–1,0 mm, nứt dọc, hạt phấn trắng; cựa do ô phấn kéo dài tạo thành, dài 3,0-3,5 mm, đỉnh nhọn; trung đới màu vàng đến vàng cam về phía chỉ nhị màu vàng nhạt dần, màu vàng tại cựa và mào sẫm hơn, lông tiết phủ dày; mào do trung đới kéo dài tạo thành dài 1,0–1,2 mm, dày nạc,

đỉnh tròn không có khía Bầu dưới gồm 2 vòi nhụy lép (J) dài 4–5 mm, màu kem, đỉnh

tròn; 1 vòi nhụy (I) dài 2–3 cm, dạng sợi mảnh, trắng, nhẵn; núm nhụy (H) 1,2 × 1,0

mm, hình quạt, một cạnh có lông, màu vàng nhạt; bầu nhụy 3 ô, đính noãn trung trụ, 3–

5 × 2–4 mm, bên ngoài phủ lông dày Chưa nhìn thấy quả

Hình 3.1 Ảnh chụp cây và một số bộ phận của cây Nghệ cầu lửa (Curcuma sp.)

(A) Toàn cây; (B) & (C) Cụm hoa; (D) Hoa; (E) & (F) Hoa nằm trong lá bắc; (G) Chi tiết

bộ nhị (không có chỉ nhị); (H) Núm nhụy; (I) Bộ nhụy và bao phấn; (J) Bầu nhụy và vòi nhụy lép; (K) Đài hoa; (L) Thân rễ và mặt cắt thân rễ; (M) Lưỡi nhỏ; (N) Tương quan một số bộ

phận của hoa: Lá bắc, đài hoa, các thùy tràng, cánh môi và nhị bất thụ, ống hoa và bộ nhị, ống

hoa, bộ nhụy (từ trái qua phải) Mẫu: No NHTuan 030

3.1.2 So sánh đặc điểm thực vật của mẫu nghiên cứu với C sahuynhensis Škorničk

& N.S.Lý và C cotuana Luu, Škorničk & H.Đ.Trần

Bảng 3.1 So sánh đặc điểm thực vật của mẫu nghiên cứu với C sahuynhensis Škorničk &

N.S.Lý và C cotuana Luu, Škorničk & H.Đ.Trần trong các tài liệu

Đặc điểm Mâu Mẫu nghiên cứu

Hình trứng hoặc trứng hẹp, mùi thơm dịu

Hình trứng hoặc trứng hẹp, mùi thơm dịu

Rễ củ

Hình trứng, bên ngoài màu nâu nhạt, bên trong trắng hơi trong, cách 3-6 cm từ thân rễ

Hình thoi, bên ngoài màu nâu nhạt, bên trong trắng trong, cách 8-15 cm từ thân

rễ

Hình bầu dục, bên ngoài màu nâu nhạt, bên trong trắng hơi trong, cách 7 cm từ thân rễ

Thân giả

Cao 15-25 cm, mọc thẳng từ thân rễ chính, màu xanh nhạt, nhẵn không có lông

Cao 10-15(-20) cm, màu xanh lá cây

Cao 10-20 cm, màu xanh nhạt

Lưỡi

nhỏ

Hai thùy nhọn, mỏng, trong mờ, màu trắng hơi xanh dần chuyển nâu, khô rụng

Hai thùy, mỏng, trong mờ, màu trắng xanh, nhẵn, rìa có lông

Hai thùy nhọn, mỏng, trong mờ, màu trắng xanh dần chuyển nâu, khô rụng

Cuống

lá

Hình lòng máng, màu xanh, bóng nhẵn

Hình lòng máng, màu xanh, bóng nhẵn

Hình lòng máng, màu xanh, bóng nhẵn

Phiến

lá

30–35 x 8–12 cm,

Hình trứng hay hình bầu dục, không đều,

có lông rất thưa thớt

Gân chính phồng lồi ở mặt dưới, lõm ở mặt trên, cứng chắc, hẹp dần về phía ngọn lá

Gân bên xếp hình lông chim, song song với nhau

20–38 × 9–16 cm

Hình trứng hay hình bầu dục, không đều,

có lông thưa thớt dọc gân chính và mép lá

Gân chính màu xanh, mặt trên nhẵn, mặt dưới có lông rất thưa thớt

38,5 x 13,0 cm

Hình bầu dục hay hình trứng, không đều, nhẵn

Gân chính màu xanh, hai mặt nhẵn

Mọc cùng khoảng thời gian với 1-2 lá đầu tiên

Màu xanh nhạt, nhẵn

Màu xanh nhạt, lông thưa thớt

lá rộng ngọn lá hẹp, đỉnh tù cong xuống, phần dưới màu trắng kem đến xanh nhạt, về

Gồm 10-23 lá bắc, Hình thoi hoặc hình trứng (gốc lá rộng ngọn lá hẹp), phần dưới màu trắng đến xanh nhạt, về phía

đỉnh có màu hồng

Gồm 16-24 lá bắc Hình trứng (gốc lá rộng ngọn lá hẹp), phần dưới màu trắng

kem, về phía đỉnh có

màu đỏ đậm dần, hai

mặt nhẵn

Hoa

Đài

hoa

Hình ống, xẻ thành 3 thùy không đều, các thùy có đỉnh tròn, xẻ

xuống mỗi bên 3-5

Hình ống, 3 thùy, các

đường xẻ dài 7 mm,

màu đỏ trong, nhẵn, các thùy đôi khi có lông thưa thớt

Ống

hoa

Tràng hoa hình ống chia 3 thùy;

Ống hoa dạng phễu hẹp 2,5-3,0 cm, trong

đó 1,5-2,0 cm ngay trên bầu nhụy có hình trụ rỗng hẹp màu

trắng kem, phần còn

lại về phía đỉnh hình

phễu màu phớt đỏ, mặt trong màu trắng,

phủ lông thưa thớt

Ống hoa dài 1,8-2,8

cm, có 1,3-1,8 cm ngay trên bầu nhụy hình trụ rỗng hẹp,

mặt ngoài màu trắng hoặc phớt hồng, phủ

nhiều lông, mặt trong

trắng đỉnh màu

vàng nhạt, về phía

gốc lông càng thưa thớt

Ống hoa dài 3,5 cm,

mặt ngoài màu trắng

kem chuyển đỏ dần

về phía đỉnh, phủ lông, mặt trong nhẵn

ở gốc và phủ lông ở phía đỉnh

Thùy

lưng

tràng

Hình trứng-tam giác, hai cạnh bên cuộn nhẹ vào trong, đỉnh có đầu nhọn dài 2,0-3,0 mm,

mặt ngoài màu đỏ cam nhạt, mặt trong màu trắng kem đến vàng nhạt

Màu trắng hoặc vàng nhạt với các tia đỏ hồng, đỉnh có

đầu nhọn dài 1 mm

Hai cạnh cuộn vào trong, màu đỏ trong, nhẵn, đỉnh có

đầu nhọn dài 1mm

Thùy

bên

Thùy bên gần như tam giác, hai cạnh bên cong lồi, đỉnh thùy gần tròn, trong mờ,

mặt ngoài màu đỏ

cam nhạt, mặt trong

có một dải màu vàng nhạt ở giữa chạy dọc trên nền phớt cam

đỏ

Hình tam giác, đỉnh

nhọn đến tù, màu

trắng hoặc vàng nhạt với các tia đỏ hồng, nhẵn

Hình gần như tam giác hai cạnh cong lồi, có đỉnh hơi cuộn vào trong, nhẵn,

phía đỉnh chuyển sang

vàng với một dải màu vàng đậm ở giữa chạy

dọc từ đáy tới đỉnh

Dạng trứng ngược với một đường xẻ dài 2-7 mm, phần đáy

dải 6 mm, trên nền

màu cam có một dải

màu sáng hơn và dày hơn ở giữa, phần đáy màu nhạt hơn

vàng tươi, phần đáy

vàng nhạt, mặt trên phủ lông che chở ngắn

Hình trứng đến hình

thoi không đều, màu

cam, phần đáy nhạt

hơn, mặt trên nhẵn, mặt dưới ở gần đáy

có lông che chở ngắn

mm, màu vàng nhạt,

phủ nhiều lông tiết

Chỉ nhị dài 4-5 mm,

màu trắng kem đến vàng nhạt, phủ nhiều lông tiết

Chỉ nhị dài 7 mm,

màu cam nhạt, phủ

nhiều lông tiết

Bao phấn 2 ô dài 1,0

cm, hình chữ L, có cựa và mào

Ô phấn hình trứng hẹp nứt dọc, hạt phấn trắng

Ô phấn nứt dọc, hạt phấn trắng

Ô phấn nứt dọc, hạt phấn trắng

Trung đới màu vàng đến vàng cam về phía chỉ nhị màu vàng nhạt dần, lông tiết phủ dày

Trung đới màu vàng đến vàng cam nhạt, lông tiết phủ dày

Trung đới màu cam

về phía chỉ nhị màu nhạt hơn, lông tiết phủ dày

Hai cựa do ô phấn kéo dài tạo thành, dài 3,0-

Mào do trung đới kéo dài tạo thành dài 1,0-1,2 mm, dày nạc, màu

Bầu nhụy 3 ngăn, đính

noãn trung trụ, màu

trắng kem, phủ lông dày

Bầu nhụy 3 ngăn,

đính noãn trung trụ,

màu trắng kem, thường nhẵn (ít khi

Dạng sợi mảnh, trắng, nhẵn

Dạng sợi mảnh, trắng, nhẵn

Hình phễu, màu vàng

Quả

Quả

Chưa nhìn thấy quả Quả nang mẫu 3 đính

noãn trung trụ, hình cầu, trắng, nhẵn

Chưa nhìn thấy quả

Hạt

Chưa nhìn thấy hạt Màu nâu nhạt, sáng

bóng, có một lớp vỏ trắng mờ bao quanh

Chưa nhìn thấy hạt

Từ phần mô tả thực vật, hình ảnh (Hình 3.1.), bảng so sánh các đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu với các loài có hình thái gần nhất với mẫu nghiên cứu là C sahuynhensis Škorničk & N.S.Lý [26] và C cotuana Luu, Škorničk & H.Đ.Trần [34] trong cùng

section Ecomata từ các bài báo quốc tế đã công bố; cùng với việc tham khảo khóa định

loại chi Curcuma L trong “Thực vật chí Việt Nam” [2], nhận thấy loài này có đặc điểm

khác với tất cả các loài đã công bố

3.2 Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu mẫu nghiên cứu

3.2.1 Đặc điểm vi phẫu thân rễ

Quan sát vi phẫu dưới kính hiển vi, thấy các đặc điểm vi phẫu thân rễ (Hình 3.3.)

như sau:

Vi phẫu cắt ngang thân rễ có thiết diện hình tròn, chia là 2 vùng rõ rệt Vùng vỏ từ bên ngoài vào, chiếm hơn 1/3 bán kính vi phẫu; vùng trung trụ nằm bên trong Quan sát

từ ngoài vào trong:

Vùng vỏ: Bần (1) bao gồm 68 lớp tế bào hình chữ nhật nhỏ, xếp sát nhau, đều đặn, song song, vách ngoằn ngoèo Mô mềm vỏ nhiều lớp tế bào hình đa giác xếp sít

nhau, không có khoảng gian bào Bó dẫn (2) nhiều, nằm rải rác trong vùng mô mềm vỏ,

cắt ngang hình trứng, kích thước không đều Mỗi bó dẫn gồm 412 mạch gỗ nằm trong

và libe bao quanh ở ngoài

Vùng trung trụ: Trụ bì (3) là lớp tế bào ngoài cùng của trụ giữa, gồm một hàng tế

bào hình đa giác, xếp thành dãy bắt màu xanh phân chia ranh giới vùng vỏ và vùng trung trụ Mô mềm tủy là các tế bào gần tròn hoặc đa giác xếp sít nhau, tương tự mô mềm vỏ

Bó dẫn vùng tủy (4) tương tự như các bó dẫn vùng vỏ gồm libe và gỗ Rải rác trong cả