Bước đầư NGHIÊN cút đặc điêm HÌNH THÁI, THẢNH PHÂN HOÁ học và một số tác DỤNG SINH học của một LOÀI LINH CHI (GANODERMA SP ) họ GANODERMATACEAE mọc HOANG ỏ lào

THIPTHAVIPHONE SOULINHO Bước ĐẦƯ NGHIÊN cút ĐẶC ĐIÊM HÌNH THÁI, THẢNH PHÂN HOÁ HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT LOÀI LINH CHI GANODERMA SP.* HỌ GANODERMATACEAE MỌC HOANG Ỏ LÀO Chu

THIPTHAVIPHONE SOULINHO

Bước ĐẦƯ NGHIÊN cút ĐẶC ĐIÊM HÌNH THÁI, THẢNH PHÂN HOÁ HỌC

VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT LOÀI LINH CHI

(GANODERMA SP.)* HỌ GANODERMATACEAE MỌC HOANG Ỏ LÀO

Chuyên ngành : Dược liệu - Dược học cá truyền

Để bày tó lòng kính trọng và lồng biết ơn sâu sác của mình, tồi xinchán thành cảm ơn;

TSKH, Trán Vãn Thanh

TS Nguyễn Viết Thân

Là những người thầy soi sáng, trực tiếp hướng dần và chi bảo tậntình cho tỏi trong suốt thời gian học tập nẹhiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn tới:

Ban Giám hiệu, các cán bộ phòng Đào tạo sau dại học, các hộ môncùng các phòng ban khác của trường Đai học Dược Hà Nội và các thầygiáo, cỏ giáo, kỹ thuật viên Bộ môn Dược Liệu dã hướng dẫn giúp dờ vằtạo mọi diều kiện thuận lơi cho Lôi trong quá trình học lập nghit'11 cứll

PGS TS Chu Đình kính là người thầy đã giúp đỡ tôi trong việc đo

phổ đổ xác đinh cấu trúc chất đã Iighiên cứu

Tôi cũng xin gửi lơi cảm ơn tới phòng Dược lý-viện Dược liệu,Viện nghiên cứu và phát triổn Phương Đông và toàn thể các bè bạn dồngnghiệp đã giúp đỡ tói trong quá trình thực hiôn luận văn này

Đạc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vỏ tận tới bố mẹ đã hốt lòng

ĐẶT VÂN ĐỂ 1

1.1 Vài nét lịch sử vé hệ thòng học họ Linh chi

1.2 Đặc điểm hình thái cơ bản của họ Gariodermataceae Donk 5

1.3 Thành phần hoá học của nám Linh chi 8

1.4 Cóng dụng trị liệu cơ bản của nấm Linh chi 11

PHẨN 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cút 16

g DL/kgTT

IR

Gram dược liệu trên một Kilỏgrain thc trọng.

Inphra Red Spcctroscopy

3.3 GỈả trị K( XỈOÔ cua T3 trền cấc hệ cỉung mỗỉ ơ cắc

Linh chỉ tren mô hình gày viêm gan cáp bằng CC1 4 48

3.3.2 Xác định độc tính cấp LD S0 của cao chiẻt nấm Linh chi 51

42

ĐẶT VẤN ĐỂ

Linh chi là mộr vị Ihuốc dược dùng khá phổ biến ỏ' Việt Nam vànhiêu nước trên thế giới như Trung Quốc, Nhật Bán An Độ, Hàn Quốc,Colombia Có rất nhiều tài liệu viết về tác dụng linh thiêng, huyền bícủa Linh chi trong việc điều trị các loại bệnh nan y Trong công trình

nghiềíì eứu của mình G§ Đỗ Tất Lợi vầ cộng gự nam 1994 đẫ gọi Linh

chi là một “siêu dược liệu” hơn cả Nhãn sâm (Panơx ginsenỊỜ [8].

Các sách y dược học cổ viết về Linh chi với lẽn “Cỏ thần liên’',

“Nấm trương thọ” Hiện nay nhiều tài liệu khoa học công bò về các tácdụng da dạng của dưực liệu này; chống gia tăng CholesteroL tàng tuầnhoàn máu, chổng xơ cứng động mạch, điều chỉnh huyết áp, nâng caohoạt động của gan, chống viêm gan mạn tính, nâng cao tính miễn dịchcủa cơ thể, giảm một mỏi về tinh thân, táng sảng khoái và thôm minhmản, [20] Nhièu cổng trình khoa học dã đẽ cập đến khả năng chốngoxy hoấ, chốmỉ ung thu, ức chế giải phóng histamin, ức chế kết dính tiểucầu, trự tim, chỉ thị phóng xạ môi trường, của nấm Linh chi

Trong kho tàng kiến thức chữa bệnh bằng Y học cổ truyền của cấccộng đồng dân tộc ở Nước Cộng hoà dãn chủ nhân dán Lào có sử dụngnhiêu loài nấm làm thuốc Trong đó có các loai Linh chi Các loài nấm nàychủ yếu là thu hái hoang dại, chưa có những nghiên cứu cơ bán vẻ nguồnnguy Ồn liệu, thành phần hoá học cũng như cơ chế tác dụng Để góp phổnđưa Linh chi vào việc sứ dụng phònc và chữa bệnh ỏ Cộng hoà dán chùnhân dân Lào trên cơ sở khoa học chúng tôi thực hiện đề tài “ Bước dầu

> Nghiên cứu vổ hình thái thực vật một số mẫu Linh chi thu hái ỡ Cộnghoà Dân chú Nhân dân I ào, chọn lấy một số mẫu đổ nghicn cứu.

PHẨN 1: TỔNG QUAN

LI Vài nct lịch sử vc hộ thông học họ Lình chi (Ganodermaiaceae Donk)

Nấm Linh chi đã được con ngươi sử dụng từ rất lâu, song những

nghiôn cứu vè chúng thực sự mới chỉ bắt đầu từ cuối thế kỷ XVIII Năm

1781, w Curtis mỏ tả máu nấm đáu tiên đặt nén móng cho các nghiêncứụ vệ nấm Linh chi sau này.[9, 10, 14]

Năm (188 ĩ) nhà nấm học người Phần Lan - Karst đã tách từ họ

Nấm Lỗ PoỉypoKtceưe ra một nhóm mới, xây dựng nên một chi độc lập

là Gcmoclcnna Karst Nhờ đó việc phân loại nấm Linh chi đã tiến một

hước quan trọng [10, 16, 14, 15]

Song song với chi Ganoderma Karst., vào năm 1905, Murrill lại phát hiện ra một nhóm nấm Poỉypore nữa và ông dề nghị xác lập một chi mói nữa là Amaurơdenna Murr và các loài cùa chi này cũng có dộ dồng

nhất cao trong cấu trúc bào tử đảm tương tự như các loài của chi

Ganoderma Karst [ 10,14]

Nhà nấm học người Hà Lan - Donk - đã nghiên cứu quá trình phân

hoa cưa hai loai Ganoderma Karst VƠI Ámauroderma Murr và thay

được mối quan hẹ chặt chẽ giữa chúng Nảm 1948, ông xây dựng nẽn họ

Linh chi Gcmotievnuuaceae Duuk tách ra từ họ nấm Lỏ ('Pvlyporaceae} với hai chi lởn là Ganoderma Karst và Amaurođermơ Murr Đảy chính

là bước quan trọng trong lịch sử phân loại hệ thống họ

Ganodennataceae [ 101

thống phân loại cưa họ Linh chi Năm 1971 Ainsvvorlh G c dựa vào đặcđiểm hình thái thể quá* cấu trúc bào tử đấm* đã dưa ra hệ thống phân loạimột cách hoàn chỉnh Cho đến nav hệ thống phân loại này đã và dangdược nhiều nha khoa học trên thế giới sử dụng [14] Chính vì vậy, nấm

Linh chi (Gatìodenna sp,) thuộc chi Ganoderma, họ Linh chi

(Ganơeỉermaỉaceae), bộ nấm lỗ (Aphyỉìophoruỉes), lớp nấm đảm {ỉỉãsiđiômỹcêíêsị, ĩĩgaĩĩh nam dam {Bãsidịõmvcõíỉnã} va thuộc giối nẳĩĩĩ (Mỵcetaìỉữ).

Nhữna năm gần dãy trẽn thị trường đỏ ne dược, nấm Linh chi và cácchế phẩm của nó dược lưu hành và tiêu thụ một cách rộng rãi, chủ yếu là

Ganodermơ luàdum và Ganoderma ịaponicum, hái loại dã dùng làm

thuốc từ lâu dời và hiện dược nghiên cứu tương dối dầy dú Trên thực tế,kết quả thống kê cho thấy chung loại Linh chi rất phong phú ưốc tínhtoàn thế giới có 104 loài Linh chi Riêng Trung Quốc cổ 84 loài* trong

đó chi có 12 loài dược dùng làm thuốc như Xích chi, Tử linh chi, Hác

linh chi (G ơtmm), Bạc thụ chi (G capéỉnxê), Mật vãn bạc chi (G ĩemie), Tùng sam linh chi [G ỉsiigae) Loài Ganoderma appĩanatum (Pers) Pat.

Cũng thường dược dùng với tên Gổ Linh chi, tên liếng Anh ỉầ Anàetỉỉ

Lingĩhi, ở Bốc Mỹ còn gọi là Artist’ conk Đây là một loại nấm phá gỗ

rất mạnh, sống nhiều năm, hằng năm lớp thụ tầng mới mọc bên dưới lớplhụ tầng cũ cùa năm trước nỗn trồng chất lổn nhau, còn gọi là nấm đa

niên nhiều tầng Quá thể cua Ganoderma appìanatum Pat (tức cái nấm,

cợ quan sinh sản hữu tính của nấm) thường có quạt hay nứa hình tròn,dường kính từ 6-100 cm, dày từ 3-8 cm, không có vỏ bóng trẽn mạt mũ

Lồi gổ ghẻ trôn mật mũ nấm, hoá gỗ, hoá sùng, sấn sùi lạo nên vỏ cĩi kỹ.Nấm đa niên mọc gần mặt đất hoặc đôi khi trên thân cây, có dặc tính vừa

ký sinh vừa hoại sinh Hàng năm vào mùa thích hợp, tiếp tục tăng trướngrộng ra, Lớp thụ tầng mới dược tạo thành nằm dưới lớp thụ tầng cũ, đồnghướng hoặc khổng Theo một số tài liệu nếu bô dọc từ mặt trẽn xuốngdưới dếm các lớp thụ tầng có thể biết được tuổi của nấm Các loại Linh

chi da niên nhỉểư lắng ngoài G npplanmm cồn cớ G ỉormnmi G.

sưhtornaỉnm, G.ỷnỉveìhtm

ờ Việt Nam, nấm Linh chi phân bố chủ yếu ờ Cao nguyên Lâm

Đổng và rnột sỏ vùng thuộc khí hậu nhiệt đới Theo những nghiên cứucủa các nhà ktioa học (Trịnh Tam Kiệt, Lê Xuân Thám, Đàm Nhận,Phạm Quang Thu, Trán Văn Mão) ở Việt Nam cố trôn 40 loài Linh chi

trong đó chiếm im thế và tluĩờng gặp là nấm Linh chi (Ganơdevmu

applanatum PaL).

1.2 Đậc điểm hình thái cơ bản của họ Ganodennataceae Donk

Nấm Linh chi là một loài thực vật bậc thấp thuộc ngành Nấm

(Btísidiomyívim) nén cố đặc điểm chung của ngành lầ dược cấu lạo bởi

các tế bào có nhăn thật không có diệp Lục, nhận thức ăn từ môi trườngbên ngoài bằng cách hấp thu (sống dị dưỡng) [27], Ngoài ra còn có cácđặc điểm riông [3, 9, 13, 10, 19, 18]:

+ Sợi nấm gồm nhicu đoạn ngăn cách với nhau bởi các vách ngăn

+ Cuống thể quá biến dị lớn: Các loại da niên thường không cuônghoặc cuống ngán, còn cốc loài có cuống thì rất phong phu: Từ loài cócuống rất ngán (0,5cm), rất mảnh (0,2cm) cho đến dài cỡ hàng 5 - LOcmhoặc rái dài (20 - 25cm) to và mập (đường kính có thẻ tới 3,3cin) [3].Cuống nấm có thể phán nhánh hoạc không, màu sắc thay đổi khác nhautuỳ từng loài Cuống thường đính bôn, đôi khi đính gần tâm do quá trình

liên tắn ĩiìầ Ihầnh.

+ Mũ nấm: Dạng thận, gần tròn đổi khi xoè thành hình quạt hoặc ítnhiều dị dạna Trên mật 111Ũ có vân gựn dồng tâm và cỏ tia rãnh phóng

xạ, màu sắc từ vàng nâu - vàng cam - dỏ nâu - đỏ tím - nâu đen nhắn,bóng, lang nhu' veeni sẫm màu dần khi già Lớp vỏ lang phủ suốt trênmặt mũ và chạy dài theo cuống nấm Kích thước tán bi ch động lừ 2 -30em, dày 0,8-2,5cm tuv từng loài Phan đính vói cuống hoặc gồ lênhoặc lốm xuồng

+ Thịt nấm dày tír 0,4 - l,8cm màu vàng kem - nâu nhạt - trắng.Nấm mềm dai khi tươi, khi khò chắc, cứng và nhẹ Nệ sợi kiểu trimitic,đầu tận cùng của lớp sợi phình hình chuỳ, màng rất dày, đan kết vào

nhau tạo thành lớp vó láng phú trên mặt mũ.

+ Bào tầng là một lớp ống dày từ 0,2 - 17cm, gồm các ống nhỏtháng, miẹng tròn, tráng - vung ánh xanh

+ Sợi đơn bào mang dảm đơn bào cổ 4 bào tứ đám hình trứng - trứngcụt đính ngọn

SUỐI, màng trong sần sùi mụn cóc, gai nhọn - gò trống Đặc biệt, dừ hìnhthái bên ngoài của nấm biến đổi rất đa dạng, song vồ cấu tạo của bào tửđảm thì có độ ổn dịnh rất cao [11,12, 10]

Gác bào tử đảm đon bào, trong diều kiện thuận lợi, nảy mầm lạo ra

hệ sợi sọ cấp rối qua các giai doạn phát triển tạo tán nấm Tán nấm hìnhthành bào tầng rồi lại phát tán bào tử đảm tạo thành chu trình sống củanấm Linh chi [3, 6, 12]

Chu trình sống này tương tự như chu trình sòng của những nấm đảmkhác,[13 ,10, 18]:

Hình 1.1: Sơ đổ chu trình sống của nấm Linh chi

Nấm Linh chi có thể mọc trẽn cây gỗ (thường là thuộc bộ ĐậuFabales) sống hay đã chết Thể quả gập rộ vào mùa imra (từ tháng 5 -tháng 11), có thể trôn thân cây, quanh gốc cây hoặc từ các rỗ cây thíchhợp với hỏng rợp, ánh sáng khuyếch tán nhẹ với nhiệt độ ôn hoà Nèn

ở các vùng núi đồi cao trên 1250 m so với mực nước biển, thường có

các chủng thích hợp nhiệt độ thấp từ 21- 26° như các vùng Đông Bắc,

vùng Phía Đông miền Trung vầ vùng eao nguyên Nam Lào, lương

đồng với Đà Lạt, Sapa, Tam Đáo, Tày Nguycn ớ Việt nam 114,36,371

1.3 Thành phản hoá học của nấm Linh chi

Trong khi ớ Tây Âu, các nhà khoa học hần như chỉ đi sâu vào

n chi én cứu họ thống học, đicu tra cơ bản và các dặc diem sinh học củacác nấm Linh chi thì ở các nước châu Ả, các nhà khoa học lại dẫn đầu vénghiên cứu thành phần hoá học, trồng và bào chế các loại thuốc từ nấmLinh chi theo cả hướng Tầy dược và Đông dược Thực tế mội sớ Lite giả

đa quan tâm phán tích thành phần cấu tạo lớp vỏ láng ớ các loài

Ganodenna và Amaurơdcrma vào thập niên 20 đã phái hiện các crgoslcrol

và các enzym phenoloxydase, peroxydase ớ G ìucidiưn (Krebs G., 1911;

Subramanian s 1961) [ 10]

Đãc biệt, trong khoảng 20 năm gần dây nhiều cơ sở nghiên cứu củamột số nước dã xác định thành phần và cấu trúc hoá học của nấm Linhchi và thu được một số' kết quả sau [3, 2, 6, 10, 14]:

- vế định lượng lổng quát, nám Linh chi có chúa cẩc chát sau [3J:

Lignin 13 - 14%, hợp chất cổ nitơ 1,6 - 2,1%, chất béo (kế cả dạn lĩ xà

phòng hoa) 1,9 - 2%, hợp chất phenol 0.08 - 0,1% (có thể tới 0,4% trongcao), hợp chất sterol toàn phần 0,14 - 0,16% (có thể có tới 0,52 trongcao), saponin toàn phần 0,3 - 1*22%, hàm lượng ergosterol 0,3 - 0,4%,chất khử 4 - 5 %, xellulose 54 -56%, nước 12-13% (trong cao mềm của

Việt Nam thi tới 22321), Ĩfeẽ5 những aèng trình nghiên eứu eủa eấe

nhà khoa học Trung Quốc (Viện nghiên cứu Linh chi hoang dại củaTrung Quốc), đã phát hiện trong hỗn hợp 6 loại nấm Linh chi có chứa

hàm lượng germanỉum cao hơn hàm lượng germaniim trong Nhân sâm

từ 5 đến 8 lần Điều này đã ngầu nhiên trùng hợp với các nhà khoa học

Mỹ 1980 cũng đã có thuốc điều trị ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến,

ung thư hạch lympho hằng thuốc cố nguổn gốc germaniỉim

(SpĩrogcrmaD), trùng lìcrp với Nhạt bản là Gc-132 lổng hợp Carboxy-Ethyl-Gcrmanium) và trùng hợp với thuốc của Nga (LiènXó cũ)

(Dcsqưioxyd-1991 có thuốc VIOP 11 có chửa gcrmanium.

Cùne với những tiến bộ cửa khoa học kỹ thuật và bằng các phương

phấp hiện đai; Phổ hồng ngoại (IR)ị phổ lồ ngoại (UY)5::: - §ấ£ kỷ khí

khối phổ liên hợp (GC - MS), phổ cộng hương từ hạt nhằn (đánh dấu với'H và 1 'C-NMR) và dặc biệt là kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC) vàphổ kế plasma (ICP) từ những năm 1980 đen nay, người ta đã xác định

Báng 1.1: 'Ihành phần hoá học của nấm Linh chi

Các nhóm hoạt chất, chính này gặp khá phổ biến ở các [oài

Ganodemữ Karst và ờ cả các loài Amcmroderma Mưư Các nhà khoa học

Nhật Bản (Kino K.el ul.1989 - 1991) đã chứng minh các nhổm hoạt chất

có bản chất Prolein nổi bậi nhất là Linhihi-8 có tác dụng chống dị ứng

phổ rộng và diều hoà miễn dịch rất hun hiệu 1121

Nhỏm Alcaloid có hàm lượng rát đáng kể trong thể quả của

Gduckium, Aìcaìoid \'A Gỉucosỉd' 1,82 - 3,06% [14].

1.4, Còng dung trị liệu cơ bán của nấm Linh chi

Đại đa số nhân đán Lao ít biết tới tác dụng quan trọng cúa loài nấmLinh chi Chỉ có một số vùng dân tộc thiểu số, nằm trong vùng có nấm

này mọc thì mới biếl sử dụng chúng vào việc ehăiĩi sốc sức khoe và điểu

trị một số bệnh cơ bản như: hạ sốt, suy dinh dưỡng,

Đến nay do phương Liệu thông tin đại chúng quảng cáo về tác dụng,công dụng của nấm Linh chi mới phẩn nào được khai thác và dem radùng khá phổ biến Phân lớn họ sử dụng làm thuốc bằng cách phối hợpvới thang thuốc hổ dưỡng, ngâm rượu đổ uống, sắc uống hoặc chế thành

một loại thực phẩm Thậm chí thu hái không có tổ chức để bán cho người

Hàn quốc, Trung quốc và bết kể những người nào cần sử dụng tới

Tuy nhiôn, cho đến hicn nay, việc khai thác nấm Linh chi ứ Cộnghoà Dân chủ Nhân dân Lào chưa có sự can thiệp cưa các cơ quan đéhướnụ dẫn cụ Lhẽ về phương phấp thu hái Cụ thế hơn là chưa có hộ

thống tầi liệu khoa học nào dề cặp tới việc khai thắc hợp lý cũng như

viộc bảo tổn đổ nghiôn cứu giữ gìn và phát triển nguổn nguyên liệu làmthuốc rĩĩ Loài nấm này

Năm 1988 tại Nhật Bản đã có 300 bệnh nhân bị nhược cơ dược diều

vành ló ra triển vọng với tỷ lộ tiến triển tốt trên 85,7% Hàng loạt cáchoạt chất của nấm Linh chi đã chứng tỏ có tác dụng kìm hãm sinh tổng

hợp choỉesterol ơ Việt Nam, Bùi Chí Hiếu và cộng sự (năm 1993) đã cố

cuộc thí nghiệm trên chuột và kết quá cho tliấv lượng Cholesterol giámlới 50% khi áp dụng liền lượng 0,4g Linh chi trôn một kilổgram thổ trọngtrong 30 ngàv

Trôn invitro, hiệu quá kìm hãm quá trình kết dính tiểu cấu bói dịchchiết nưốc của nấm Linh chi được chứng minh rố bởi nhiổu cồng trìnhnghiên cứu Đến nấm 1990 lại được các nhà khoa học Tao j và Feng K.tiến hành thử nghiệm với 33 bệnh nhâri xơ cứng động inạch và cho kếtquả khả quan Nhổm Nucleosid có các dẫn xuất cúa Adenosin có lácdụng thư giãn cơ, giảm đau và úc chốsựkểl dính tiểu cáu [10,16,14, 30]

- Vẻ khá năng chống oxy hoá của nám Linh chi, Iigay từ thập niên

80, ờ Trung Quốc các nhà khoa học đã chứng minh khả nang khư gốc tự

do của nhóm hydroxyl với dặc tính (antioxidant), chống lão hoá của

G.luciditm ị2.2, 3| à Viột Nam, Tiến sĩ Nguyễn Quang Thường và cộng

sự - Trường Đại học Dược Hà Nội đã chứng minh bằng thực nghiệm rằngnấm Linh chi cố chưa cấc hoạt chải chống ỏxy hõắ chung cố klì ẩ nẵiĩg

ức chè quá trình oxv hoá ờ chuôi khi gây stress ỏ nhiệt độ cao đã làm

giám 25,5% lượng MDA ơ não chuột (P < 0,01) Đây chính là cơ sở dểkhảng định giá trị của nấm Linh chi - vị thuốc trường sinh của ngườigià [21]

- Hiệu qua chống ung thư của nấm Linh chi đã được chứng minh từ

được kết hợp với trị liệu bằng Linh chi đã kco dài dược thời gian sốngcho bệnh nhân, tý lệ người sống trên 5 năm cao hơn nhỏm không sửdụng kết hợp Linh chi Hiệu quá chống ung thư cùng thể hiện rõ với các

tế hào ưng thư khoang miệng, ung thư gan, đặc hiệt kết hợp với laxol từcầy Thông đỏ

- Đối với bệnh vẻ hô hấp: Nấm Linh chi dem lại kết quả tốt trongdieu trị viêm phế quản dị ứne cho gan 80% các trường hợp Ị 6, 14] Ngoài

ra, dịch chiết nước của nấm Linh chi còn được chứng minh làm giảm mộtmỏi trong điều kiện thiến oxy [35]

- Bệnh gan và tiết niệu cũng dược diểu trị bằng chế phẩm tờ nấm Linhchi Bènh viện Son Đông - Trung Quốc dùng “Xúp” Linh chi đổ giải dộc và

bổ ean có kết quả tốt 090%) cho 70.000 bệnh nhâm (Lui Xing lia, 1994).Tác giá còn cho ráng nấm Lỉnh chi còn có tác dụng dối với dường tiết niệu,điều hơà rối loạn Luẩn hoàn não, tránh các cơn kịch phát nghẽn mạch vàlàm dịu thần kinh Trong 319 trường hợp, tỷ lệ khỏi bệnh đạt 89%, tác già

đã được trao tăn2 huân chương han2 hai cho những kêì quả nghiện cứu này

Đối với bệnh đái tháo đường ở người cao tuổi, nấm Linh chi giúp ổnđịnh đường huyết Đây là một hướng nyhĩên cứu của tác giẳ Nhật Bẳn đãnghiên cứu xác định các chất Heteroglycan-Canodcran B trong nhóm

Polysacchand của Linh chi cổ Nhổm nàv làm táng được hàm lượng

Insulin trone máu nhờ có sự kìm hãm quy Irình sinh tồng họp glycơgen

thực nghiệm cùa các acid ganoderic A, B, c và H [22].

Bên cạnh dó, các tài liệu tham khảo cho thấy nhiều acid béo tạo nênthành tố chính của nấm Linh chi đã được định danh trong dịch chiếtelher Nhữnn acid nàv có đặc tính bảo vệ hồng cầu và ngừa được ung loét[5]

Như đã trình bày trong phấn 2.3 Viện nghiên cứu Lình chi hoang dạiTrung Quóe đã phát hiện: trong hỗn hợp dịch chiết toàn phân của 6 loạinấm Linh chi (Thanh chi; Hổng chi; Hoàng chi; Bạch chi; Hắc chi và Tửchi) có hàm lượng nguyên tố Germanium cao Chính nguyên tốGermaniiim có trong Linh chi đó đã làm cho Linh chi trớ thành một VIthuốc ức chế dược virus Mà căn nguyên cua một sô bệnh ung Lhư đại đa

số trường hợp là do virus gây ra Nên Linh chi có thể kìm hãm được một

số bẹnh ung thư đó Cơ chế của tác dụng này được giải thích: KhiGemnanium vào cơ thế kích thích các tế bào có thẩm quyển miễn dịchsản sinh ra interíeron (mà interferon là thành phẩn miên dịch đặc trách

ức chế và diệt virus), inieríeron trong mắu lãng cao lới mội ngưỡng nhài

định, nó có thể bảo vộ con người tránh được tác động cua virus Điều đỏ

dã dược lý giải bới Harrison’s tạp chí khoa học thế giới ngày

21-11-1997 trang 1447-1450 và Nguyên lý V học nội khoa năm 1998 trang1770-1804, thông báo “Đã có bệnh nhân nhiễm virus H1V vẫn sống tới

Tuy nhiên trong điều trị cung nhu Nhản sám, tác dụng của tổ hợpsaponin có trong Linh chi có hiệu quả hơn so với saponin riêng rẽ Do vậycho đến nay hầu hết các chế phẩm có chúa Linh chi đéu sở dụng ở dạngdịch chiết toàn phần Sau đây là một số chê phẩm có chứa Linh chi danglưu hành trên thị trường:

Hình 1.2: Một số chế phẩm của Linh chi lưu hành trẽn thị trường.

PHẦN 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHẢP NGHIÊN cứu.

Một sô' mẫu nấm và nấm Linh chi chuẩn Ganodenna applanamm

Pat.đơực cung cấp từ viện nghiên cứu và phát triển Phương Đông.

Nguyồn liệu sau khi thu về được tiến hành phơi khô, báo quảntrong túi polyethylen

2.2 Phương pháp nghiên cứu:

Các mẫu thu được chúng tôi tiến hành so sánh bằng cấu phươngpháp khác nhau:

2.2.1 Về đạc điểm thực vật

- Sử dụng phương pháp hiển vi, nghiên cứu các lát cắt ngang, cắtdộc cua thê qua

2.2.2 Vé thành phán hná học -■■■ —

-Định tính nhóm chất hàng phương pháp hoá học theo các phươngpháp ghi ở cức tài liệu I 17,23,3,7]

-Đinh lính bằng phương phấp Sắc ký lớp mỏng

-Chiết xuất nhóm chất chính theo [17,23,7,32]

-Phân lập một số chất chính trong dược liệu [heo các phương phápghi ở [3] và cá cải tiến

-Nhặn dạng chất phân lập được bàng cức phương pháp:

2.2.3.1 Thử độc tính eấp của dược liệu theo phươne pháp Karber ghi trong [33,1,4]

Behrens-2.2.3.2 Thủ khả nâng chống oxy hoấ theo phương pháp gây vì emgan cấp bàng CC1.I ghi trong [25,31,34,28]

* Nguvên lác cùa phương pháp đươc ghi tóm tát như sau:

CC1 là chất gây tổn thương gan kinh điển Khi vào cơ thể, nó biến

135

• Đo phổ 'H -NMR

2.2.3 Vế tác tlụng sinh học

sự sán sinh MDA (malonyl dialdehyd) MDA phản ứng với acidIhiobacbituric lạo ra hợp chất Trimethyl màu hồng Đo cường độ màu

của dung dịch sau phán ứng ở bước sóng 'L - 532 nm Hoạt độ chống oxy

hoá được tính bằng phần trăm (%) MDA bị ức chế ở mẫu thứ so với mẫuđối chứng (coi HTCO cứa mầu đối chứng bằne không)

Hình 3.5: Ảnh mặt cắt dọc phần Hình 3.6: Ảnh mặt cắt dọc phần

điíối mẫu hẵm đươi kính lốp trên mẫu nấm ổữcri kíiìh lưp

PHẦN 3: THỤC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Nghiên cứu vẻ đặc điểm thực vật của nám Linh chi thu hái ổ CHDCND Lào.

Trong quá trình điểu tra, thu mẫu nấm Linh chi hoang dại ỏCHDCND Lào chúng tòi thu dược nhiều mẫu có hình dạng, kích thướckhác nhau Trong phạm vi đc tài chung tôi chi nghiên cứu một số mẫu cónhững dặc diếni chưng dược mó tả ở phần 3.1.1 đây là dạne rất phổ hiến,

có ớ nhiêu địa phương của Lào

3.1.1 Nghiên cứu vé hình thái bcn ngoài

Các mẫu nấm nghiên cứu là một loại nấm sống nhiều năm mật cấtngang nám phân thành nhiều tầng, tuy thuộc vào tuổi nấm mà mặt cắt có

SỐ tầng khác nhau Quả thể (túc mũ nấm) thường có quạt hay nưa hìnhtròn, đường kính từ 40-60 cm, dày lừ 3-8 cm, khổng cuống, mầu từ nâuđến nâu đen., đcn sẫm các vân lăng trưởng đồng tâm có thể nổi rõ hoặckhồng tạo thành những mẩu lồi gổ ghề trên mạt mũ nấm, hoá gỗ, hoásừng, sần sùi tạo nên vẻ cũ kỹ (Hình 3.3: Ảnh bề mặt trên mẫu nghiêncứu) Mặt dưới nấm thường có màu nâu nhạt, nhẩn (Hình 3.4: Anh bémặt dưới máu nghiên cứu) Nấm sống nhiều năm, mọc gẩn mặt đất hoặcđòi khi trên thân cây, cỏ đặc lính vừa ký sinh vừa hoại sinh Hàng nămvào mùa thích hợp, tiếp tục tăng trưởng rộng ra, lớp thụ tâng mới dượclạo thành nam dưới lớp thụ láng cũ

* Cắt dọc mũ nám chúng tôi quan sát thấy:

síi vào nhau theo hướng thẳng đứng (Hình 3.5: Ảnh mặt cắt dọc phẩn

dưới mũ nấm dưới kính lứp)

Hình3,3: Ảnh mặt trên Hình3.4: Ảnh mặt dưới mãư nghiên cớu mảu nghi&n cứu

Hình 3.7: Ảnh mặt cắt ngang

phần dưới mũ nấm Hình 3.8: Ảnh mặt cắt ngang phần ưên mũ nấm

Hình 3.9: Ảnh mặt trên mãu AI

Hình 3.10: Ảnh mặt dưới mẫu AI

Hình 3.11:

ở các tâng trên sợi nấm cứng-x.ổp xếp lộn xộn lạo thành các lớp theochiồu ngang, mđu ngà và sẫm xen kẽ (Hình 3.6: Anh mặt cắt dọc phầntrôn mũ nám dưới kính lúp)

* Cất ngang mũ nấm, chúng tỏi quan sát thấy:

Mặt cắl ngang phẩn duới có nhiều chấm tràng sáng rất mịn

(Hình3.7: Ảnh mặt cắt ngang phần dưới I11Ũ nấm) Phần trcn có nhữngsợi nấm hoá sừng rắn chác sếp thành bỏ xen kẽ các dám sợi xốp máusáng (Hình 3.8: Ảnh mặt cắt ngang phần trên mũ nấm)

Quan sát so sánh với mẫu nấm thu từ Viện nghiên cứu và phát triểnPhương Đông chiìiig lôi thấy các đặc điếm hình thái hên ngoài của mẫu

nehicn cứu tương lự hình thái bcn ngoài của mẫu AI (IGanoderma

appìatuĩtum Pal.) (Xem: Hình 3.9; Ilình 3.10; Hình 3.1 1)

3.1.2 Nghiên cứu về hình thái dưới kỉnh hiển vi

- Quan sát sợi và bào tú đám của nấm dưới kính hiển vi chúng tôithu được kéi quả sau:

= Quan sái mẫu nẩm nghiên cứu thúng tỏi thây lìíio lủ'dằm mầu nâu

sẫm hình ưứng, lõm một đầu, ư giữa cỏ dạng giọt dầu lớn Sựi dài mầunâu sắm và mau vàng, quan sái trện kính hiến vi lởn hơn chúng tôi thấysợi có gờ dẩv (thành dầv) và có các vách ngăn sáng (Hình 3.12: Ánh sợi

Hình 3.12: Ánh sợi và bào tử các mẫu LLấm nghiên cứu dưới kính hiển vi

Hỉnh 3.13: Ảnh sợi và bào tử mẫu nấm A1 dưới kính hiển vi

3.1.4 Sắc ký lóp mòng hiệu nâng cao (HPTLC)

Đc bổ sung lư liệu góp phấn phân biệt các loại nấm, ti-ôư chuẩn hoánguyên liệu bằng sắc ký lớp mỏng Chúng tôi sử dụng phương pháp sắc kýlớp mòng hiệu nâng cao Đây là phương pháp rất có hiệu quả khi áp dụngchơ dược liệu cú tliànli phán hoạt chất chưa được xác định

Trong quá trình liến hành lất cả các dấu hiệu ư sắc ký dỏ đều dượcxem xét và ghi nhận

Chiối xưàì trong cùng một điều kiện các mãu Linh chi bàng Methanol:

Lấy khoáng 2,5g bòt mẫu Linh chi cho vào bình cầu đáy tròn dungtích 500ml có lấp sinh hàn hổi lưu cho thèm vào đó 50ml Methanoỉ, dunhồi lưu cách iluiỷ trong 3 giờ Lọc lấy dịch chiết, cất thu hổi dung mồi dưới

- Dịch chiết được chấm lẽn bản mỏng theo vệt kích thước 0,6cm bằng

máy eMm §ấe ký LINOMÂT ĩ sứ dựng phần mém điều khiển Wỉncai.

Tatal Halgm 2 2*3.20 Totai Araa: 24331.3

Hình 3.17: sắc ký lớp mỏng dịch chiếĩ mẫu nghiên cứu

Nhũn XỐI:

Kết quá nghiên cứu các đặc điổm như: hình thái mặt cắt nấm, đặcdiểm sợi hào lử nấm dưới kính hiển vi được phân tích, so sanh dựa vàokhoá phân loại mới nhất về Linh chi của Trưng Quốc, trong tài liệu

"những nghiên cứu mới về Linh chi1' của lấc giả "Lam Chí Bân”[24], kếthợp các kết quả phân lích trên sắc ký dồ cúa sắc ký lổng hiệu năng cao.Chủng tôi sơ hộ klĩẳiìg định mau nghiên sưu ]a Găhôẩẽrmd ăppỉãnõHim

Pat

Dí) vậy chúne tôi chọn mẫu nấm này để nghiên cứu các thanh phẩn

3.2 Nghiên cứu vc thành phun

hoa học

3.3 Xứ

lý

mau

Từ màu Linh chi đả xác định lỏn la Gunoderma applanalum Pat.

chúng tôi liến hành xứ lv mẫu theo sơ đổ sau:

3.2.1 Xác định các nhóm hoạt cliât chính tù dược liệu.

thinh thoảng lác 20 phút, lác (3-4 lần) và dể qua đêm Lục dịch chiết qua

giấy lọc vào hình gạn, sau đó thêm lOml dung dịch acid sulluric 5% lắc

nhẹ 5 phiu, đê yên cho dung dịch tách thành hai lóp rồi gạn lấy lớp nướcacid để làm các phản ứng sau:

Alkaloid là các hợp chất hữu cư, có dính nitơ do vậy có nhiều phánứng dương tính với các thuốc thử chung cua alkaloiđ Trong đổ tài nàychúng tôi thăm dò sự có mật cúa alkaloid bàng một sỏ thuốc thử được ghitrong các lài liệu [17,7]

- Phản ứng với thuốc thứ Mayer: Lấy 1 ml dịch chiết cho vào ống

nghiệm nhỏ, gió 1-2 giọt thuốc thử Mayer, quan sát thấy có lúa dụctrắng

- Phán ứng với thuốc thử Bưochardat: Lấy Inrtl dịch chiết cho vào

- Phan ứng với thuốc thử Dragenđorff:

Lấy liTil dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, giỏ vài ỉỉiọt thuốc thứDmgendoriT quan sat thấy có tủa mầu đỏ gạch,

Lấy khoang 50ml dịch chiết, cô đặc cách thuv cho đến lượng tôithiểu cĩủ để chẩm trẽn bản mỏng Silicagcti dã hoạt hoá sau đỏ phun lênbán mỏng bằng thuốc thứ Dragendorỉí quan sát thấv vết chấm chuyểnsang mẩu đỏ hồng

Chúng lỏi sơ bộ kết luận trong mẫn Linh chi nghiên cứu cóalkaloid

3-2.2.2 Định lính glycusid tim

Cho 20g nguyên liệu dã tán nhỏ vào bình có dung tích 250ml,thêm vào bình dó HXhĩìl cổn ctylic 30°, lắc nhc đcu trong 13 phút, dể quađêm Lọc vào cốc cỏ mỏ dung lích 200ml, dung dịch thu dược khoảngỗOml

Loại tạp bàng cách thêm vào dó dung dịch chì acetate 10% đến khihết tủa gạn lọc loại chì acelale dư bằng dung dịch Na>S04 bao hoà, gạn,

lọc dung dịch chu vào bình gạn, thêm cùng 1 thể tích chloroíorni lắc, dể

lắng, gạn lấy phần chloroíorm, loại nước thừa bàng Na2S04 khan Sau đó,

cô cách Ihuỷ đến cán và hoà tan cắn với cồn etylic 90° Dung dịch này dểlàm cấc phan ứng;

- Phán úng Liberman: Lấy 2ml dịch chiết ether cho vào ống

- Phán ứng Legal: Cho lml dung dịch trên vào ông nghiệm, thêmvào đó 1 giọt thuốc thu Natrinitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịchNaOll 10% lắc đều, quan sát không thấy xuất hiẹn máu đò.

- Phán ứng Kedde: Lấylml dung dịch trẽn cho vào I ống nghiệm

và cho vào đó vài giọt thuốc thử mới pha (gồm cổ Iml dung dịch acid3,5-dinilro henzoic acid 3% trong ethanol, 3ml dung dịch KOH 40% và7ml nước cất), quan sát không thấy xuất hiện Iĩiầu đỏ tía

- Phan ứng Balịct: Lấy Iml dung dịch trên cho vào ống nghiộm vàthêm vào dó Iml dung dịch thuốc thử mới pha (gỏm có 0.5ml đung dịchNaOĨI bão hoà và 9,5ml dung dịch acid picric bão hoa trong nước), quansát chỉ thấy máu của thuốc thử không thấy xuất hiện mầu đỏ cam

Tír đổ chúng tồi sơ bộ kết luận trong mẫu Linh chi nghĩcn cứukhông cỏ glvcoside tim

3.2.23 Định tính Saponỉn: Lấy 20g dược liệu đã tán nhỏ cho vào bình

có dung tích 250ml, thêm vào đó lOOml cồn ctylic 75°, lắc mạnh trong

15 phút, đổ qua đôm, lọc lấy dịch cliiếl làm các phán ứng sau:

- Phán ứng San kovvski; Lấy Iml dịch chiết cho vào ống nghiêm, cỏcách tliuy đến khô, hoà tan cắn trong cồn ctylic 90°, nhỏ từ từ theo thànhống nghiệm dung dịch acid H>SOj đặc xuất hiện vòng dỏ nâu, mầu đỏchuyến dần lên dịch chiết ỏ phía trên có mầu xanh

- Phán ứng Rozentaler: Lấy lml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm

- Quan sát hiện tạng tạo họt: Lấy Iml dịch chiết cho vào ốngnghiêm và thêm 5ml nước cất, lác mạnh trong 5 phui, để yên tháy bọtbồn vững.

- Tạo bọt ở pH khác nhau: Lấy 2 ống nghiệm, 1 ống đựng 5ml HC10,1 N còn ống kia đựng 5ml dung dịch NaOH 0JN Cho vào mỗi ống0,5ml dịch chiết, lắc cả 2 ống trí ì ne 5 phứt thấy cột bọt 2 ống cao hằngnhau và có độ bền vững như nhau

Chúng tồi sơ bộ kết luận trong mầu Linh chi nghiên cứu có

Saponin trilerpcnoiđ

X2.2A Định tính Sterol

Lấy lOg dược liệu đã tán nhỏ cho vào bình 250ml thêm vào đólOOml ether dầu hoa, lác dểu, ngâm lạnh trong 3 giờ Lọc lấy dịch lọc,kiềm hoá, gạn lấy phần cthcr rửa bằng nước, sau đó rứa băng acid 13,50,2% gạn lấy lóp cthcr dể tiến hành các phản ứng sau:

- Phán ứng Libcmtan: Lấy 2ml dịch chiết cthcr cho vào ống

nghiệm, hốc hơi đến cân, hoằ tan cấn trong lml anhỵdritc acetio, gỉỏ

thêm ùr lừ ihc.0 thành ống nghiôm 0,5mi H -S()4 dậm đạc, quan sát thấyxuất hiện vòna xanh lục bển vững giữa hai lớp chát lóng

xanh lơ

- Phán ứng Toriđlkhilĩe: Lấy 2ml ether cho vào ống nghiệm, bốchơi cách thuý đến cán, hơà tan cắn trong 0,2ml acid íicetic và 0,5mlCHCly Giỏ từ từ theo thành ống 3giọt Br2 trong CHC1, quan sát thấyxuất hiện vòng lục giữa 2 lớp chất lỏng.

Chúng tói sơ bộ kết luận tron” mẫu Linh ch nghiên cứu có Sterol

3.12.5 Bịnh lính Flavưnuỉd

Lấy 20g nguyên liệu cho vào bình duna tích 250ml có nút mài,thêm vào đó cồn etylic 90° cho ngập dược liệu, lốc và để ycn qua đềm.Lọc lấy địch lọc, cô dạc cách thuỷ cho còn khoáng 15ml dể tiến hành cácphản ứng:

- Phán ứng vói Nỉ],: Giỏ 1-2 giọt dịch chiết trên vào giây lọc, đé’khỏ, hư lên hơi NH ( quan sát thấy mẩu vàng trốn giấy lọc láng lên rõ rệt

- Phấn ứng với FeCl3 5%: Lấy lml dịch chiết cho vào ổng nghiêm,

thêm vài giọt dung dịch FcC], 5% xuất hiện mầu xanh đen.

- Phán ứng với kiềm: Lấy Iml dịch chiết cho vào ổng nghiệm vàthêm vào đó vài giọt dung dịch NaOH 10% quan sát thấy xuất hiện vẩnđục mầu vàng

- Phản ứng Cyanidin: Lấy lml dịch chiết cho vào ống nghiệm,thêm một ít bột Mg giò vào đó vài giọt HCỈ đậm dặc Đun cách thuý vàiFlavonoid,

2.Glycosid tim

Phản ứng LibermanPhán ứng LegalPhán ứng KederPhản ứng Baljet

có

Phán ứng Sankovv.skiPhản ứng Rozcn(alơ

3.2.2 Ó Định tính Coumarin

Lấy 20g nguyên liệu cho vào bình dung tích 250ml có nút mài,thêm vào đó cồn ctylic 90" cho ngập dược liệu, lác và để yên qua đêm(Chiết 3 lán) Lọc lấy dịch chiết, cô dạc cách ihuy cho còn khoáng 20ml

để tiến hành các phán ứng:

- Phản ứng mở, dóng vồng LaetoR: Lấy 2 ống nghiệm, mỗi ống

dựng Iml dịch chiết Ông 1 thêm NaOÍI 10% đun nhẹ, đe nguôi Rồithêm vào mỗi ống 5ml nước cất quan sát thấy độ đục 2 ống bằng nhau,sau dó đem acid hoá thì độ đục cá hai ống vẫn bằng nhau

- Phán ứng ghép dôi vói muối Diazoni: Cho vào ống nghiêm 2 mldịch chiết trên, thêm 2rnl dung dịch Na2CO, 3% Đun cách thuy rồi đổnguội, thêm vào dung dịch vài giọt thuốc thử Diazo Máu của dung dịchthay đổi sang máu dỏ cam nhạt không rõ ràng

- Vi thăng hoa: Từ dịch chiết trên, cổ hay hơi hết dung mỏi, sau đócho cấn vào náp kim loại, dậy nắp kín bang mội phiến kính phía trên cóbông ướt, hơ nắp kim loại trên ngọn lửa đèn cồn 20-30 phíit, lấy phiếnkính IM để nguội, gió một giọt đung dịch KI và soi trên kính hiển vi.Thấy tinh thể hình kim

3.2.227 Định tính Poỉysaccharid

Láy Imỉ dịch chĩẽí cồn Irên vào ống nghiệm, giỏ vào dỏ l giọt

dung dịch Iođ xuất hiện mầu xanh đen Chúng tỏi sơ bộ kcì luận trongmẫu Linh chi nghiên cứu có Polysaccharid

3.2.2.8 Định tính Acid amin: Lấy Ig bợt dược liệu mịn vào bình nón

dung tích lOOml co nút mài, thêm vào đó 30ml cồn ctylic 70°, đế lạnhqua đèm lọc lấy dịch lọc cho vào ống nghiệm Criỏ từ từ vào dó thuốcthừ Ninhydrin pha trong aceton quan sát thấy xuất hiện mầu nâu đen.Chúng tôi sơ bộ kết luận có acid amin

Kết quả định tính các nhóm chất thấy trong thành phần cua nấmlãnh chi cỏ 6 nhóm chất chính: Saponin, Flavonoiđ, Sterol Alcaloid,Bảng 3.2: KẾL quá định tính các nhỏm chất trong nấm Linh chi

* Tiến hành:

Bộl dược liệu khô được chiết bằng Ether dầu hoả trong Soxhlet(thời

gian 16 giờ) thu được dịch chiết Ether dầu hoả (Dịch chỉết A)

Dược liệu sau khi đả chiết bằng Ether dẩu được làm khô, thấm ẩmbằng ammoniac 10% tiếp tục chiết trong Soxhlet bằng Qoroíbrm, thuđược dịch chiết Cloroíbrm (DÉch chiết B)

Dược liệu sau khi dã chiết bằng Cloroíorm được làm khô, tiếp tụcngâm chiết trong Bình ngâm chiết bằng Ethanol 90°, thu được dịchchiết

Etiianol (Dịch chiết C)

Chụp ở bước sổng 254 nm Chụp ở hước sóng 366 nmHình 3.21: Ảnh sác ký lớp mỏng các dịch chiết A, B, c

Từ dịch chiết A, kiểm tra trên sác ký lớp mỏng với hệ dung môiCloroíorm : Methanol (19: 1) chúng tôi quan sát thấy có rất 5 vết khác