Thu nhận enzyme ficin từ trái vả( sung)

ĐẶC ĐIỂM CỦA ENZIME FICIN 1.Lịch sử nghiên cứu : Đặc điểm nguồn thu nhận ficin: Cây sung ngọt có kích thước vùa hoặc nhỏ, cây cao từ 3-9m. Cây có nhiều nhựa màu trắng đục. Lá đơn, màu xanh sáng Hoa nhỏ. Quả dài từ 2,5-10 cm, màu sắc quả thay đổi từ vàng xanh đến đỏ đồng hay màu đỏ tía sậm. Hạt có thể to, vừa hoặc nhỏ, Theo tài liệu của Phân Khoa Nông Nghiệp Mỹ ở Washington D.c,thành phần các chất trong 100g trái như sau: TÍNH CHẤT CỦA ENZIME FICIN: Cấu tạo hoá học: Ficin l m?t protease th?c v?t trong c?u tr c b?t 1 cĩ ch?a nhĩm (-SH) bảng thành phần amino acid của phân tử enzime ficin : Pro – Leu – Arg – Gln - Gly – Glu – Cys – Gly – Ser – Cys – Tryp – Tính chất vật lý: Trọng lượng phân tử: 23.000-27.000 Nhiệt độ hoạt động: 30-80oC. nhiệt độ tối hảo cho hoạt tính xúc tác: 50-65oC. Hệ số sa lắng: 2.5-2.7S. Điểm đẳng điện: 9-10. Không tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ nhưng tan một phần trong nứơc và glycerin. Tính chất vật lý của ficin ? các nguồn thu nhận khác nhau được trình bày ở bảng sau: Tính chất hoá học pH hoạt động tối thích của ficin rộng: 4-9.5 (dịch nhựa sung có pH 5), gelatin: pHopt = 5; casein: pHopt = 9.5; hemoglobin: pHopt = 7. Benzoyl-L-arginine ethyl ester, benzoyl-L-argininamide, hippurylamide và hippuryl methylester thì pHopt = 6.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hoạt động của ficin Các yếu tố hoạt hoá: Nhân tố khử như: cyanide, cysteine, 1,2- dimercaptopropandol hoặc mercaptoethanol. Cysteine hoặc 1,2- dimercaptopropandol nồng độ 0.005-0.05M HCN 0.075M làm tăng hoạt tính của ficin cao nhất . Mặt khác, hoạt tính của ficin còn tăng hơn nữa khi phối hợp giữa HCN với cystein.

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang

SINH VIÊN: Thái Quốc Hiền Em Huỳnh Văn Hiệu Lại Thị Thuỳ Dương Phạm Thị Ngọc Lan

Trần Thị Liệu

ĐẶC ĐIỂM CỦA ENZIME FICIN Ficin (ficain) là một protease được tìm thấy trong

nhựa củacây thuộc họ ficus (sung, vả), thuộc họ

Moraceae, bộ Urticales.

Cây sung có xuất sứ từ vùng Tây Á và phân bố ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới.

Ở Việt Nam, có nhiều loài sung khác nhau: sung

(Ficus racemosa L.); sung trổ (Ficus variegata); sung

ba thuỳ ( Ficus hirta); sung thằn lằn (ficus pumila L.); vả (Ficus auriculata lour)

1.Lịch sử nghiên cứu :

của cây thuộc họ sung một loại enzym cĩ khả năng tiêu diệt được giun trịn Ascaris.

thể tiêu diệt được các lồi sán dây Trichuris Trichura

được enzym này

• Đặc điểm nguồn thu nhận ficin:

Cây sung ngọt

 có kích thước vùa hoặc nhỏ, cây cao từ 3-9m

 Cây có nhiều nhựa màu trắng đục

 Lá đơn, màu xanh sáng

Theo tài liệu của Phân Khoa Nông Nghiệp Mỹ

ở Washington D.c,thành phần các chất trong 100g trái như sau:

Thành phần Quả tươi Quả khô

• TÍNH CHẤT CỦA ENZIME FICIN:

• Cấu tạo hoá học:

Stt Amino acid Tên tác giả nghiên cứu

Marini bettoolo

Metrione Gould Englund

 Tính chất vật lý:

 Trọng lượng phân tử: 23.000-27.000

 Nhiệt độ hoạt động: 30-80oC nhiệt độ tối hảo cho hoạt tính

xúc tác: 50-65oC.

 Hệ số sa lắng: 2.5-2.7S.

 Điểm đẳng điện: 9-10.

 Không tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ nhưng tan một

phần trong nứơc và glycerin.

Tính chất vật lý của ficin ở các nguồn thu nhận khác nhau được

trình bày ở bảng sau:

Nguồn thu

nhận

Phương pháp tinh sạch

Hệ số

sa lắng (S o )

Trọng lượng phân tử

Điểm đẳng điện

Hệ số tinh sạch

A 280 A 260

Hệ số tắt

Bước sóng hấp thu

CM-pH 7

25.500

± 750 23.800

>9.6 1.88 20.2 Krame

r và Whita ker

Tính chất hoá học

• pH hoạt động tối thích của ficin rộng: 4-9.5 (dịch nhựa

sung có pH 5),

• gelatin: pHopt = 5;

• casein: pHopt = 9.5;

• hemoglobin: pHopt = 7

• Benzoyl-L-arginine ethyl ester, benzoyl-L-argininamide,

hippurylamide và hippuryl methylester thì pHopt = 6.5

 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hoạt động

của ficin

Các yếu tố hoạt hoá:

o Nhân tố khử như: cyanide, cysteine, 1,2-

dimercaptopropandol hoặc mercaptoethanol

o Cysteine hoặc 1,2- dimercaptopropandol nồng độ

0.005-0.05M HCN 0.075M làm tăng hoạt tính của ficin cao

nhất

o Mặt khác, hoạt tính của ficin còn tăng hơn nữa khi phối

hợp giữa HCN với cystein

• Các yếu tố kìm hãm:

o Các chất ức chế như HgCl2, N- ethylmalenide, iodo acetic acid, chloroacetamide hay iodoacetamide kết hôp với trung tâm hoạt động của ficin thì enzime sẽ

bị bất hoạt

o Các chất kìm hãm hoạt động của các protease động vật khi liên kết với gốc cystein của enzime ficin

cũng có thể làm bất hoạt ficin

o Trong lòng trắng trứng có một loại protein có một loại protein có khả năng kìm hãm hoạt động của

ficin

Tính bền vững:

• Bền vững với nhiệt độ: Cohen nhận thấy chúng có thể giữ

nguyên hoạt tính trong 2h ở 50oC

• Bền vững với pH: trong một vùng pH khá rộng (4.5-9.5) độ

bền vững của enzime ficin đạt đến mức cực đại

-pH hẹp dao động quanh pH 8 thì nó lại có tính bền vững

ở mức tối thiểu

-Cơ chế xúc tác của enzyme:

Cơ chế thuỷ giải này gồm có hai giai đoạn:

Giai đoạn 1: giai đoạn “acyl hoá”

Giai đoạn 2: giai đoạn “deacyl hoá” có sự tham gia của phân tử nước

Một số yếu tố khác ảnh hưởng lên khả năng

thuỷ phân protein của ficin:

• Nhiệt độ:

Hoạt động thuỷ giải protein của enzime ficin chịu ảnh

hưởng rất nhiều bởi nhiệt độ

– Tác động vào trạng thái ion hoá của phân tử enzime.– Tác động vào trạng thái ion hoá của cơ chất

– Tác động vào độ bền của phân tử enzime

– Tác động vào sự kết hợp giữa phần protein và phi

protein của phân tử enzime…

Dịch nhựa sung Pha nước cất Khuấy tr n ộ

Ly tâm Thu dịch bên trên

Thu lấy các phân đoạn

Loại bỏ tủa

Tủa bằng ethanol

Từ nhựa thân Từ lá và quả xanh

Dịch nhựa sung Pha nước cất Khuấy tr n ộ

Ly tâm Thu dịch bên trên

Thu lấy các phân đoạn

Loại bỏ tủa

Tủa bằng ethanol

lọc gel

Thu phân đoạn enzyme

Chế phẩm enzyme

Sấy khô

Enzym

e th ơ

Xấc nh ho t tính đị ạ cac phan o n đ ạ

Độn với tinh bột

(tỉ lệ 1:1)

Máy vontex

Dùng khuấy trộn

Máy ly tâm

Tủ sấy ở 40˚C

PHƯƠNG PHÁP LỌC GEL (GEL FILTRATION)

phương pháp

 Phương pháp lọc gel hay sắc kí rây phân tử là một loại sắc ký được sử dụng để tách, phân tích, xác định kích thước,

trọng lượng phân tử của các chất cao phân tử, nó cũng được sử dụng để điều chế và tinh sạch protein

bằng cách cho chúng đi qua cột gel

CTCT sephalex

 Các loại sephalex:sephalex-G75,G100,G200

Phương pháp này có thể xác định được trọng lượng phân tử của các protein cũng như có thể xác định được độ tinh sạch của chế phẩm enzyme khi k t h p v i ph ng phap s c kíế ợ ớ ươ ắ Nguyên tắc :

Trong hệ thống này, khi cho hỗn hợp protein vào thì các

protein sẽ kết hợp với các chất bề mặt mang điện tích âm là SDS ( Sodium Dodecyl Sulfate) để trở thành các phức hợp mang điện tích âm

Trong thực phẩm:

Đông tụ sữa

Thủy phân protein

Kìm hãm sự hóa nâu của củ quả trong quá trình sơ chế