Luận văn thu nhận enzyme chitosanase từ chủng xạ khuẩn streptomyces griceus (NN2) và ứng dụng để sản xuất đường chitosanoligosaccha

Luận văn thu nhận enzyme chitosanase từ chủng xạ khuẩn streptomyces griceus (NN2) và ứng dụng để sản xuất đường chitosanoligosaccha

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
 -

NGUYỄN THỊ THẮM

THU NHẬN ENZYME CHITOSANASE TỪ CHỦNG XẠ KHUẨN

STREPTOMYCES GRICEUS (NN2) VÀ ỨNG DỤNG ðỂ SẢN XUẤT

ðƯỜNG CHITOSANOLIGOSACCHARIDE (COS) CHỨC NĂNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH

Mã số : 60.54.10

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGÔ XUÂN MẠNH

HÀ NỘI - 2010

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong khoá luận này là trung thực và chưa hề ñược sử dụng

Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện khoá luận này ñã ñược cảm ơn và các thông tin ñược trích dẫn trong khoá luận này ñã ñược ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2010

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thắm

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi ñã nhận ñược sự ñộng viên và giúp ñỡ rất lớn của nhiều cá nhân

và tập thể

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy PGS.TS Ngô Xuân Mạnh,

Trưởng khoa - Khoa công nghệ thực phẩm - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tận tình giúp ñỡ, tạo mọi ñiều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ của các thầy cô trong Khoa Công nghệ thực phẩm và Viện ñào tạo sau ñại học trường ñại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo mọi ñiều kiện cho tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này

Mặc dù ñã hết sức cố gắng, nhưng khoá luận của tôi không tránh khỏi những thiếu sót và hạn chế Vì vậy tôi kính mong nhận ñược sự góp ý, chỉ bảo của thầy cô ñể giúp tôi có thể phát huy kiến thức một cách hiệu quả sau khi ra trường

Tôi xin chân thành cảm ơn gia ñình và tất cả bạn bè ñã ñộng viên giúp

ñỡ và tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài và hoàn thành bản luận văn này

Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2010

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thắm

2.2.4 Nguồn nguyên liệu ñể thu nhận enzyme chitosanase 7

2.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình sinh tổng hợp enzyme

2.2.7 Các phương pháp thu nhận và tinh sạch enzym chitosan 17 2.3 Hiệu quả của ñường oligosaccharide chức năng 21

2.4 Chitosan oligosaccharide 23 2.4.1 Cấu trúc hoá học của chitosan oligosaccharide (COS) 23 2.4.2 Tính năng của chitosan oligosaccharide ( COS ) 24

2.7 Tình hình nghiên cứu, sản xuất enzyme chitosanase và chitosan

3.3.5 Xây dựng quy trình thu nhận enzyme chitosanase và ñường

4.1 Kết quả hoạt hóa và ñịnh tính khả năng sinh enzyme chitosanase

4.2.1 Chọn lựa các ñiều kiện môi trường nuôi cấy tối ưu xạ khuẩn Streptomyces griceus (chủng NN2) ñể sinh tổng hợp chitosanase 59

4.3 Xác ñịnh ñiều kiện tối ưu thu nhận chitosan oligosaccharide (COS) 71 4.3.1 Xác ñịnh ảnh hưởng của ñơn yếu tố ñến sự hình thành ñường

4.3.2 Xác ñịnh các ñiều kiện ảnh hưởng ñến sự hình thành ñường COS

4.4 Quy trình sản xuất chitosan oligosaccharide sử dụng enzyme

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

COS Chitosan oligosaccharide

DA Degree of deacetylation

DP Degree of polymerization DNS Acid dinitro salisilic E/S Tỷ lệ enzyme/ cơ chất

DANH MỤC BẢNG

2.1 Khối lượng phân tử của một số enzyme chitosanase 5 2.2 Phân loại chitosanase dựa vào sự phân cắt ñặc hiệu 7

2.4 ðiều kiện nhiệt ñộ, pH và thời gian nuôi cấy của một số chủng vi

2.5 Phân tích thành phần cấu tạo của chitosan oligosaccharide bằng

2.6 Sơ lược kết quả nghiên cứu về enzyme chitosanase trên thế giới 37 4.1 Ma trận qui hoạch thực nghiệm theo phương pháp qui hoạch trực

4.2 Hệ số trong phương trình hồi qui và mức ý nghĩa 60 4.3 Hoạt tính enzyme chitosanase trước và sau khi cô ñặc 66 4.4 So sánh hoạt tính chitosanase tủa bằng muối ammoni sunfate trên

4.5 Ma trận qui hoạch thực nghiệm theo phương pháp qui hoạch trực

4.6 Hệ số trong phương trình hồi qui và mức ý nghĩa 79

DANH MỤC ðỒ THỊ

2.1 Ảnh hưởng của nguồn nitơ ñến khả năng sinh tổng hợp

2.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan tới khả năng sinh tổng hợp

2.3 Hoạt tính chitosanase từ Streptomyces griseus HUT 6037 khi nuôi cấy

trong môi trường chitosan với mức ñộ deacetyl hóa khác nhau 14 4.1 (a) ðồ thị biểu diễn mối quan hệ của X1 (nhiệt ñộ, 0C), X2 (pH) và

4.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ ethanol và nồng ñộ muối amoni sunfate

4.4 Ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến sự hình thành ñường COS 74 4.5 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/cơ chất (E/S) ñến sự hình thành ñường COS 75 4.6 Ảnh hưởng thời gian ñến sự hình thành ñường COS 76 4.7 (a) ðồ thị biểu diễn mối quan hệ của X2 (nhiệt ñộ), X3 (Tỷ lệ

DANH MỤC SƠ ðỒ

4.1 Quy trình nuôi cấy Streptomyces griseus (chủng NN2) ñể sinh

4.2 Quy trình thu nhận COS từ chitosan sử dụng enzyme chitosanase 84

DANH MỤC HÌNH

2.3 Cấu trúc hoá học của chitosan oligosaccharide 23

4.2 Vòng phân giải cơ chất của chitosanase sản sinh từ mẫu NN2

4.3 Vòng phân giải cơ chất của chitosanase sản sinh từ mẫu NN2

1 MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Thế kỷ 21 là thế kỷ của công nghệ sinh học (CNSH), nó sẽ xâm nhập vào mọi lĩnh vực của ñời sống Công nghệ sinh học có ba cấp ñộ khác nhau: Công nghệ sinh học truyền thống như các hoạt ñộng chế biến thực phẩm (rượu, giấm, sữa chua, dưa muối, men bánh mì ), ủ phân, phơi ải ñất…Công nghệ sinh học cận ñại với việc sản xuất ở quy mô công nghiệp các sản phẩm công nghệ lên men, công nghệ vi sinh vật (cồn, bia, dung môi hữu cơ, chất kháng sinh, bột ngọt, thuốc trừ sâu sinh học…) Công nghệ sinh học hiện ñại chỉ mới xuất hiện trong vài thập kỷ gần ñây Công nghệ sinh học hiện ñại sử dụng các kỹ thuật trao ñổi, sửa chữa, tổ hợp hoặc cải tạo vật chất di truyền ở mức ñộ phân tử ñể tạo ra các protein hay một số sản phẩm khác mà vốn dĩ chúng ta không tạo ra ñược

Công nghệ enzyme là một trong bốn bộ phận của công nghệ sinh học Trong một vài thập kỷ gần ñây việc nghiên cứu các ứng dụng của enzyme ngày càng ñược quan tâm và chú trọng Công nghệ enzyme ñã từng bước làm thay ñổi và nâng cao chất lượng của một số quá trình công nghệ trong chế biến thực phẩm cũng như trong nông nghiệp, dược phẩm, y tế

Hàng năm lượng enzyme ñược sản xuất ra trên thế giới ñạt khoảng trên

300000 tấn với trị giá trên 500 triệu USD và ñược phân bố trên các lĩnh vực khác nhau Tuy nhiên việc nghiên cứu tìm kiếm các loại enzyme mới, và nghiên cứu các ñặc ñiểm, tính chất, ứng dụng nó luôn là mục tiêu của các nhà khoa học Một trong số các enzyme ñó là enzyme chitosanase

Chitosanase là một enzyme thủy phân liên kết nội phân tử cơ chất chitosan Enzyme chitosanase ñược ứng dụng chủ yếu ñể sản xuất ra chitosan

oligosaccharides (COS)

Chitosan có nhiều ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, nông nghiệp, thực phẩm, mỹ phẩm, xử l í nước thải và bảo vệ môi trường… Tuy nhiên, do khối lượng phân tử lớn, mạch phân tử dài, khó tan trong nước nên người ta ñã tạo ra sản phẩm thuỷ phân của chitosan là chitosanoligosaccharide (COS) nhằm khắc phục hạn chế, cũng như tăng cường khả năng ứng dụng cho chitosan Gần ñây, COS với tính năng ưu việt của mình ñã ngày càng ñược sản xuất nhiều hơn và ñược ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, ñặc biệt là trong công nghệ thực phẩm với vai trò là oligosaccharide chức năng

COS có thể ñược thu nhận bằng phương pháp hoá học Tuy nhiên, phương pháp hiệu quả nhất ñể sản xuất sản phẩm này là phương pháp sinh học sử dụng enzyme chitosanase Enzyme chitosanase có thể thu nhận ñược

từ nhiều nguồn khác nhau như vi khuẩn, nấm, hay một số thực vật… Nhưng enzyme thu nhận từ xạ khuẩn thường có hoạt tính cao hơn cả

Chính vì những ứng dụng rất thiết thực của enzyme chitosanase và COS ñến ñời sống của con người chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:

“Thu nhận enzyme chitosanase từ chủng xạ khuẩn Streptomyces griceus (NN2) và ứng dụng ñể sản xuất ñường chitosanoligosaccharide (COS) chức năng”

1.2 Mục ñích và yêu cầu

1.2.1 Mục ñích

Thu nhận enzyme chitosanase có hoạt tính cao từ xạ khuẩn

Streptomyces griceus (chủng NN2) và ứng dụng ñể thu nhận ñường

chitosanoligosaccharide chức năng

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Poly (1, 4-2-amino-2-deoxy-ß-D-glucosamine)

Hình 2.1 Cấu trúc hoá học của chitosan

Hiện nay, chitosan ñược sản xuất từ vỏ tôm bằng cả 2 phương pháp hoá học và sinh học Trong phương pháp hóa học, deacetyl hóa chitin bằng kiềm với các ñiều kiện phản ứng khác nhau như nồng ñộ kiềm, thời gian phản ứng

mà cho chitosan có các mức ñộ deacetyl khác nhau Trong phương pháp sinh học có thể dùng enzyme deacetylase ñể khử acetyl của chitin tạo thành chitosan Ngoài ra có thể kết hợp các enzyme khác trong quy trình hoá học ñể tăng hiệu quả sản xuất, giảm ô nhiễm môi trường và tận thu các sản phẩm khác Các enzyme này thường là protease như papain, bromelain, và các enzyme từ ñộng vật, thực vật, vi sinh vật có tác dụng khử protein trong nguyên liệu ban ñầu, còn deacetylase chủ yếu thu nhận từ việc nuôi cấy các vi sinh vật thường tồn tại nhiều trên vỏ tôm, ñặc biệt ở những nơi vỏ tôm ñang phân huỷ

2.2 Enzyme chitosanase

2.2.1 Khối lượng phân tử

Chitosanase cũng giống như ñại bộ phận enzyme khác ñều có bản chất là protein Chitosanase hầu hết là enzyme ngoại bào, có cấu tạo ñơn phân tử Chúng có khối lượng phân tử khoảng từ 30 – 50kDa Kích thước phân tử protein của enzyme chitosanase sản sinh từ các nguồn khác nhau thì khác nhau Người

ta ñã tiến hành thí nghiệm và tính toán khối lượng phân tử của protein

chitosanase thu ñược từ một số loài vi sinh vật khác nhau (bảng 2.1)

Bảng 2.1 Khối lượng phân tử của một số enzyme chitosanase

(ño bằng phương pháp SDS – PAGE)

Chitosanase từ Khối lượng phân tử

2.2.2 Khái niệm về enzyme chitosanase

Chitosanase có tên gọi ñầy ñủ, theo danh pháp quốc tế là: Chitosan

N-acetylglucosaminohydrolase

Chitosanase (EC 3.2.1.132) là enzyme xúc tác cho phản ứng thuỷ phân chitosan bằng cách cắt ñứt các liên kết β-1,4-glycoside trừ liên kết giữa các N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc – GlcNAc) và giải phóng ra các chitosan oligosaccharide

Chitosan + H2O

Hoạt tính chitosanase của chế phẩm enzyme ñặc trưng cho khả năng xúc tác phân giải chitosan thành các COS có phân tử thấp hơn Hoạt tính chitosanase ñược biểu thị bằng số ñơn vị hoạt tính trong 1ml (hay 1g) chế phẩm

2.2.3 Phân loại

Hiện nay có 2 cách phân loại enzyme chitosanase:

 Dựa vào sự tương ñồng của chuỗi amino acid

Theo cách phân loại này, chitosanase ñược phân loại thành 5 họ: GH-5, GH-8, GH-46, GH-75

Trong ñó, họ GH-46 nhất là các chitosanase từ Bacillus và Streptomyces

ñã ñược nghiên cứu rộng rãi nhất về ñặc tính xúc tác, cơ chế phản ứng, cấu trúc protein, chuỗi amino acid … trong khi các họ khác mới chỉ có những nghiên cứu bước ñầu về tinh sạch protein và tách enzyme GH-5 bao gồm các enzyme có khả năng thủy phân chitosan, carboxymethylcellulose và hoạt tính transglycosylation, GH-8 lại gồm có các enzyme có khả năng thủy phân nhiều loại cơ chất ngoài chitosan, nó còn có hoạt tính cellulases, licheninases và endo-xylanases ðặc biệt, họ GH-75 ñều là các enzyme từ nấm và không có tính ñồng ñẳng với enzyme thuộc GH-46 ðối với họ GH-80 thì sự khác nhau cơ bản nhất

giữa enzyme thuộc GH-80 (chitosanase từ Matsuebacter chitosanotabidus) và

GH-46 có ñầu xúc tác là Gl 141 trong khi GH- 46 là Asp 80 (chitosanase từ

Streptomyces sp N174) [58]

 Dựa vào sự phân cắt ñặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase

Chitosanase phân thành 3 loại: loại I, loại II, loại III [57]

Chitosanase Các chitosan oligosaccharide chứa

N-acetyl-D-glucosamine, D-glucosamine

Bảng 2.2 Phân loại chitosanase dựa vào sự phân cắt ñặc hiệu

Loại I

- Bacillus pumilus BN-262

- Penicillium islandicum Streptomyces sp N174

Phân cắt liên kết GlcNAc – GlcN

và GlcN – GlcN

Loại II

- Bacillus sp No 7-M

Phân cắt liên kết GlcN – GlcN

và GlcN – GlcN

2.2.4 Nguồn nguyên liệu ñể thu nhận enzyme chitosanase

GH-5 - Streptomyces griceus HUT 6037

- Amycolatopsis sp strain CsO-2

- Streptomyces coelicolor A3(2), SCO0677 hay SCF91.37

- Streptomyces coelicolor A3(2),SCO2024 hay SC3A3.02

- Chlorella virus PBCV-1

- Chlorella virus CVK2

GH-75 Tất cả các enzyme chitosanase thuộc họ GH-75 ñều là các

enzyme từ nấm như: Aspergillus (Aspergillus oryzae, Aspergillus fumigatus), Penicillium, Beauveria, Cordyceps, Fusarium

(Fusarium solani), Hypocrea, Magnaporthe, Metarhizium(Metarhizium anisopliae) và Neurospora

GH-80 - Matsuebacter chitosanotabidus

- Sphingobacterium multivorum

Trong các nguồn thu nhận thì chitosanase thu từ nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn cho hoạt tính enzyme tốt hơn, ñặc biệt với sự phát triển của công nghệ sinh học trong việc tái tổ hợp gen ñang hứa hẹn việc tạo ra các chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme với những ñặc tính quý báu như khả năng chịu nhiệt, khả năng phân giải cơ chất ở các mức ñộ khác nhau ñể thu các sản phẩm với ñộ chọn lọc và tinh khiết cao

Xạ khuẩn Streptomyces: Streptomyces là xạ khuẩn Gram dương, hệ sợi sinh

dưỡng phân nhánh nhiều lần, ít khi ñứt ñoạn, ñường kính 0,5 - 0,2 µm Khuẩn ty

khí sinh ở giai ñoạn trưởng thành tạo chuỗi từ ba ñến nhiều bào tử Streptomyces

là nguồn xạ khuẩn quan trọng trong sinh tổng hợp chitosanase từ vi sinh vật, hiện nay có một số chủng xạ khuẩn ñược nghiên cứu ñể thu nhận chitosanase

như: Streptomyces griceus HUT 6037, Streptomyces coelicolor A3(2), SCO0677 hay SCF91.37, Streptomyces coelicolor A3(2), SCO2024 hay SC3A3.02, Streptomyces strain N714…

2.2.5 Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase

Chitosanase có khả năng nhận dạng liên kết ñặc trưng trong chuỗi chitosan

ñể phân cắt Vị trí phân cắt ñó là liên kết β-(1-4)-glycoside giữa các phân tử Glucosamine hoặc giữa D-Glucosamine và N-Acetyl-D-Glucosamine

D-Tuy nhiên không phải bất kỳ enzyme chitosanase nào cũng tấn công vào

vị trí β-(1-4)-glycoside giữa hai D-Glucosamine, còn một số chitosanase lại có

khả năng tấn công vào liên kết này giữa hai phân tử Glucosamine và giữa

D-Glucosamine với phần N-Acetyl-D-D-Glucosamine còn lại [13] Bảng 2.3 dưới

ñây thể hiện vị trí liên kết bị tấn công bởi một số chitosanase

Bảng 2.3 Kiểu phân cắt của các loại chitosanase

Fukamizo và CS.(1999) ñã xác ñịnh ñược các sản phẩm dị vòng thu

ñược từ quá trình thuỷ phân chitosan ñều là dạng α, ñiều ñó cho thấy rằng chitosanase là một enzyme chuyển hoá

Cùng với những kết quả thu ñược khi quan sát dạng tinh thể học và các vùng biến ñổi cho phép chúng ta kết luận rằng ñầu Glu22 hoạt ñộng như là nơi cho proton, trong khi ñầu Asp4 hoạt hoá 1 phân tử nước sau ñó tấn công vào vị trí C-1 của phân tử ñường khử tại vị trí xúc tác

Cơ chế chuyển hoá này ñược duy trì liên tục trên thực tế là nhờ 2 ñầu xúc tác có khoảng cách 13,8Å; cao hơn những enzyme chuyển hoá khác gần 10Å

Cơ chế xúc tác của chitosanase ñược thể hiện trong hình 2.2

Hình 2.2 Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase

Sản phẩm phản ứng của enzyme chitosanase ñược nghiên cứu bằng cách sử dụng dung dịch chitosan và một vài COS làm cơ chất Phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC) (thin-layer chromatography) cho thấy rằng enzyme chitosanase ñã giải phóng ra COS từ chitosan, phần lớn là các COS dài hơn (GlcN)2 bằng cách phân cắt nội phân tử Enzyme này không thể thuỷ phân ñược (GlcN)2 hoặc (GlcN)3 Còn (GlcN)4 và (GlcN)5 thì bền với hoạt tính xúc tác của enzyme này Tuy nhiên, chitosan oligosaccharide (GlcN)6 và (GlcN)7ñược thuỷ phân hoàn toàn sau 15h ủ (GlcN)6 chủ yếu ñược phân cắt thành

(GlcN)3 + (GlcN)3 và (GlcN)2 + (GlcN)4 nhưng (GlcN)2 + (GlcN)4 thì ít hơn nhiều [rồi sau ñó, (GlcN)4 → (GlcN)2 + (GlcN)2] Nó cũng cho thấy rằng (GlcN)7 ñược phân cắt thành (GlcN)3 + (GlcN)4 Kết quả này chỉ ra rằng ñể phản ứng xảy ra nhanh, cơ chất chitosan nên có chiều dài chuỗi phân tử bằng hoặc dài hơn (GlcN)6, sự phân cắt liên kết glycoside xảy ra tốt nhất tại trung tâm của mối liên kết hexameric và sinh ra (GlcN)3 là sản phẩm chủ yếu Thực

tế, enzyme chitosanase thể hiện hoạt tính ñối với chitosan cao hơn so với các oligosaccharide mạch ngắn hơn [9]

2.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình sinh tổng hợp enzyme chitosanase từ vi sinh vật

2.2.6.1 Ảnh hưởng của các thành phần môi trường ñến khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase của vi sinh vật

 Nguồn nitơ

Nitơ là nguồn dinh dưỡng quan trọng ñối với sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật Các nguồn nitơ cung cấp cho vi sinh vật bao gồm nitơ vô cơ (NH4+, NO3-…) và nitơ hữu cơ (peptone, cao thịt, cao men, các acid amin…), các vi sinh vật có khả năng sử dụng nguồn nitơ khác nhau và tùy loại nitơ cung cấp mà khả năng sinh tổng hợp enzyme cũng thay ñổi

ðồ thị 2.1 Ảnh hưởng của nguồn nitơ ñến khả năng sinh tổng hợp chitosanase

của Gongronella sp JG

Khi so sánh ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau tới khả năng sinh

tổng hợp chitosanase từ Gongronella sp JG các nhà nghiên cứu cho thấy rằng:

peptone, glutamic acid và aspartic acid làm tăng khả năng sinh enzyme chitosanase, phenylalanine, amonisunfate và cao men thì không ảnh hưởng lớn tới khả năng sinh enzyme, trong khi ñó tyrosine, ure, ammonium nitrate và ammonium chloride cho khả năng sinh enzyme thấp hơn Chính vì vậy các nhà nghiên cứu ñã lựa chọn peptone, glutamic acid và aspartic acid làm nguồn nguyên liệu cho việc nuôi cấy vi sinh vật nhằm sinh hoạt tính chitosanase [52]

 Nguồn Cacbon

Hợp chất cacbon là nguồn năng lượng quan trọng trong hoạt ñộng sống của vi sinh vật ðối với vi sinh vật dị dưỡng, ñường và tinh bột tan thường ñược dùng làm nguồn cacbon trong môi trường nuôi cấy và trong công nghiệp thì rỉ ñường là nguồn cacbon thích hợp với rất nhiều loại vi sinh vật

Chitosan cũng là nguồn cacbon cho vi sinh vật và cũng chính là cơ chất của chitosanase, vì vậy khi cho một lượng cơ chất – chitosan vào môi trường nuôi cấy sẽ làm cho sự sinh tổng hợp của chitosanase tăng lên một cách ñáng

kể, ñây chính là hiện tượng cảm ứng sinh tổng hợp enzyme

Cũng vì vậy mà hàm lượng chitosan trong môi trường nuôi cấy cũng rất quan trọng, thông thường là từ 0,2 - 0,5%, tuy nhiên với các vi sinh vật khác nhau là khác nhau

ðồ thị 2.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan tới khả năng sinh

tổng hợp chitosanase của Aspergillus sp CJ 22-326

Nhìn vào ñồ thị trên ta thấy khi lựa chọn nồng ñộ chitosan là cơ chất của chitosanase thì theo các nhà nghiên cứu thấy rằng: nồng ñộ chitosan tăng thì làm tăng khả năng sinh enzyme chitosanase và khoảng nồng ñộ sinh hoạt tính enzyme chitosanase cao nhất từ 1,5 - 2% sau ñó giảm dần khi nồng ñộ tăng quá cao [11]

Mặt khác, chitosan còn có một giá trị ñặc trưng là mức ñộ deacetyl hóa, chính yếu tố này cũng ảnh hưởng không nhỏ tới việc sinh tổng hợp chitosanase Mức ñộ deacetyl hóa là một ñặc tính quan trọng của quá trình sản xuất chitosan bởi vì nó ảnh hưởng ñến tính chất hóa lý và khả năng ứng dụng của chitosan sau này Mức ñộ deacetyl hóa của chitosan thường vào khoảng 56 -99% (nhìn chung là 90%) phụ thuộc vào loài giáp xác, phương pháp sử dụng

và thời gian của quá trình deacetyl

ðồ thị 2.3 Hoạt tính chitosanase từ Streptomyces griseus HUT 6037 khi nuôi cấy trong môi trường chitosan với mức ñộ deacetyl hóa khác nhau

Qua ñồ thị 2.3 các nhà nghiên cứu chỉ ra rằng: Nhìn chung mức ñộ

deacetyl hóa của chitosan bổ sung trong môi trường nuôi cấy càng cao thì hoạt tính của enzyme chitosanase ñược sinh ra càng lớn và mức ñộ deacetyl hóa của chitosan ở 99% và trong 4 ngày cho hoạt tính enzyme chitosanase cao nhất [19]

 Nguồn khoáng

Ngoài nước, chất hữu cơ… trong tế bào vi sinh vật còn chứa rất nhiều khoáng chất, lượng khoáng chất này thay ñổi tùy theo loài, tùy từng giai ñoạn phát triển và ñiều kiện sinh trưởng phát triển của vi sinh vật Các nguyên tố cần thiết với lượng có thể rất nhỏ nhưng không thể thay thế do chúng tham gia vào rất nhiều các quá trình chuyển hóa và sinh tổng hợp enzyme Các nguyên tố quan trọng là: P, S, Na, K, Fe, Mg…

Tuy nhiên, nồng ñộ của các khoáng chất này cũng cần ñược lưu ý, ví dụ

Ag+, Cu2+ và Fe3+ 0,5mM/l làm mất hoàn toàn khả năng phát triển của

Gongronella sp JG Còn Mg2+ ở nồng ñộ ñó thì không ảnh hưởng tới sự phát triển của tế bào, song không có enzyme chitosanase ñược tổng hợp [52]

2.2.6.2 Ảnh hưởng của ñiều kiện nuôi cấy ñến khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase của vi sinh vật

Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn tới sản lượng và hoạt tính enzyme thu ñược Enzyme có thể là enzyme nội bào hoặc ngoại bào, nó là sản phẩm của quá trình trao ñổi chất của vi sinh vật ðối với việc thu nhận chitosanase ngoại bào, ñây là sản phẩm ñược sinh tổng hợp bằng con ñường dị hóa và ñược cảm ứng bằng cơ chất do vậy sự sinh tổng hợp enzyme sẽ ñồng biến với sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật

2.2.6.3 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy và pH môi trường nuôi cấy ñến khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase của vi sinh vật

Mỗi chủng vi sinh vật thường sinh trưởng, phát triển trong một khoảng nhiệt ñộ nhất ñịnh và thường có một giá trị nhiệt ñộ tối ưu cho sự phát triển của mình Nhìn chung các vi sinh vật sinh tổng hợp chitosanase bao gồm vi khuẩn,

xạ khuẩn và nấm thường là những vi sinh vật ưa ấm, nhiệt ñộ nuôi cấy tối ưu thường từ 20 – 400C, một số ít là vi sinh vật ưa nhiệt như Bacillus sp Strain CK4

nhiệt ñộ nuôi cấy ở 600C [50]

ðộ pH rất cần cho sự phát triển của vi sinh vật, nó ảnh hưởng trực tiếp ñến quá trình trao ñổi chất của tế bào, hoạt ñộng của nhiều enzyme, sự thẩm thấu, vận chuyển các chất trao ñổi qua màng tế bào Giới hạn chung của pH ñối với các vi sinh vật là từ 3 - 11 nhưng tùy theo loại hình vi sinh vật mà chúng có giới hạn pH khác nhau và trong giới hạn ñó có giá trị pH tối thích Tuy nhiên giá trị này cũng thay ñổi khi thay ñổi về môi trường, pH và áp suất thẩm thấu trong khi nuôi cấy Các loại vi sinh vật sinh tổng hợp chitosanase ñược nghiên cứu chủ yếu là các vi sinh vật ưa pH trung tính, có

ñộ pH từ 5.5 - 7

Bảng 2.4 ðiều kiện nhiệt ñộ, pH và thời gian nuôi cấy của một số

chủng vi sinh vật sản sinh chitosanase

( 0 C) pH

Thời gian (ngày)

Chitosanase thu nhận từ Bacillus sp Srain KCTC 0377BP thì hoạt tính khá

ổn ñịnh trong khoảng pH từ 4 - 8 ðiều kiện tối ưu của enzyme này là từ 4 - 6, ñiều kiện nhiệt ñộ cho phản ứng thủy phân tốt nhất là từ 50 – 600C, hoạt tính của chitosanase cao nhất ở 600C Chủng vi khuẩn này có ñiều kiện nuôi cấy tối ưu là nhiệt ñộ 300C, pH = 7, nuôi trong 5 ngày sẽ thu ñược enzyme có hoạt tính cao [9]

Chitosanase thu nhận từ Matsuebacter chitosanmotabidus 3001, một vi

khuẩn G(-) thì pH tối ưu cho enzyme hoạt ñộng là 4, nhiệt ñộ tối ưu cho enzyme hoạt ñộng là 30 – 400C ðiều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng vi khuẩn này sản sinh enzyme có hoạt tính cao là nhiệt ñộ 300C, pH = 7, nuôi trong 4 ngày [31]

Chitosanase thu nhận từ Streptomyces griseus HUT 6037 thì hoạt tính

khá ổn ñịnh tại pH từ 6 – 9, hoạt tính cao nhất tại pH = 5,7 Nhiệt ñộ tối ưu cho enzyme này hoạt ñộng là 600C Hoạt tính của enzyme khá ổn ñịnh ở

400C ðiều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng xạ khuẩn này sản sinh enzyme có hoạt tính cao là nhiệt ñộ 300C, pH = 7, nuôi trong 3 ngày [19]

2.2.7 Các phương pháp thu nhận và tinh sạch enzym chitosan

ðể tách và tinh chế enzyme thường trải qua các công ñoạn:

- Chiết rút chế phẩm enzyme thô: Ở ñây ta xét việc nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường lỏng và sau quá trình nuôi cấy ta có dịch nuôi cấy gồm 2 pha riêng biệt: pha rắn - sinh khối tế bào và các tạp chất rắn; pha lỏng – các chất tan của môi trường, sản phẩm của quá trình trao ñổi chất của vi sinh vật ðối với ñề tài này, chúng ta ñang tiến hành thu hồi chitosanase ngoại bào, vì vậy công ñoạn ñầu tiên là loại sinh khối tế bào Các phương pháp sử dụng phổ biến là lọc và ly tâm, dịch lỏng ñược thu lại và ñem ñi tinh sạch

- Tinh sạch enzyme: Quá trình tinh sạch enzyme chính là quá trình loại

bỏ ñi các thành phần không phải enzyme mục tiêu có trong dịch lỏng, nó thường bao gồm các chất hòa tan và các protein tạp chất, việc loại bỏ chúng dựa trên sự khác nhau giữa enzyme mục tiêu và các thành phần khác về kích thước, hình dạng phân tử, khả năng hòa tan trong các dung môi, ñiện tích… Các phương pháp thường dùng như: tủa muối, tủa cồn, phương pháp sắc kí trao ñổi ion, phương pháp sắc kí lọc gel, phương pháp sắc kí ái lực… thường thì một phương pháp duy nhất không thể thu ñược enzyme tinh khiết mà phải

áp dụng kết hợp nhiều phương pháp theo một trật tự nào ñó ñể cho kết quả tốt nhất [2]

ðối tượng nghiên cứu là enzyme, ñây là những chất xúc tác sinh học có bản chất protein và rất không ổn ñịnh, chúng rất không bền và dễ dàng biến tính Do ñó khi làm việc với enzyme ta cần chú ý tránh những ñiều kiện làm

mất hoạt ñộ của nó như: các yếu tố acid mạnh, kiềm mạnh, nhiệt ñộ cao, các kim loại nặng như: chì, ñồng, thủy ngân… ðặc biệt khi thực hiện tinh sạch enzyme phải tiến hành ở nhiệt ñộ thấp, thực hiện thí nghiệm nhanh, liên tục, không ngắt quãng

2.2.7.1 Phương pháp ly tâm

Ly tâm là phương pháp tách nhanh chóng các phần tử có khối lượng riêng khác nhau dưới tác dụng của lực ly tâm ðây là cách ñể loại sinh khối tế bào một cách hiệu quả Tốc ñộ ly tâm và thời gian ly tâm phụ thuộc vào tính chất của dịch ly tâm Sự sai khác về tỷ trọng của các phần tử lơ lửng so với chất lỏng càng lớn thì tốc ñộ kết tủa sẽ càng cao, thời gian ly tâm dài và tốc

ñộ ly tâm lớn thì hiệu quả phân tách càng cao Các chế ñộ ly tâm thường dùng

là từ 6000 ñến 10000 vòng/phút trong thời gian 20 phút và ly tâm lạnh

Ly tâm cũng là phương pháp cơ bản ñể tách kết tủa, huyền phù sau các quá trình tủa muối, tủa cồn Ngoài ra cũng có thể thực hiện ly tâm siêu tốc trong một thời gian ñủ dài ñể thu ñược từng phân lớp các phần tử có tỷ trọng khác nhau Phương pháp ly tâm là phương pháp ñược dùng trong suốt quá trình thu nhận chitosanase và thu nhận ñường COS vì phương pháp cũng ñơn giản mà mang lại hiệu quả phân tách cao

2.2.7.2 Phương pháp sắc ký

Sắc ký là phương pháp quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể sử dụng ngay cho việc ñịnh lượng và ñịnh danh Nhưng chi phí cho phương pháp này cũng khá ñắt nên trên phạm vi quy mô phòng thí nghiệm thì thường chưa ñược sử dụng phổ biến

Trong tinh sạch enzyme có 4 phương pháp ñược sử dụng nhiều nhất như sau:

 Sắc ký lọc gel

Phương pháp này dựa vào mức ñộ dịch chuyển khác nhau của các phân tử

có kích thước khác nhau trong hệ thống mạng lưới phân tử của gel sắc ký Gel thường sử dụng là sephadex, sepharose (sephadex G-10, G-15, G-25, G-50 hay sepharose 4B, 6B…) Các phân tử mẫu ñi qua hệ thống các hạt gel, nếu có kích thước nhỏ hơn kích thước của lỗ gel sẽ chui vào trong các hạt gel và do ñó thời gian ñi qua cột gel sẽ lâu hơn các phân thử có kích thước lớn chỉ chui qua khoảng trống giữa các hạt gel Vì vậy, nếu ta chọn các gel có kích thước lỗ gel khác nhau có thể tách hỗn hợp của protein với các chất hòa tan như muối, và hỗn hợp của các protein có kích thước phân tử khác nhau

ðối với tinh sạch chitosanase do kích thước phân tử thường nằm khoảng 30 – 90 kD nên gel thường dùng là Sephadex G-75 và Sephadex G-100 [17], [19]

 Sắc ký trao ñổi ion

Phương pháp này dựa vào ñiện tích thực của protein tại một ñiểm pH nhất ñịnh ñể phân tách hỗn hợp protein Pha tĩnh là những hạt mang sẵn một ñiện tích nhất ñịnh, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử protein mang ñiện tích trái dấu với chúng, do vậy những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại ðể phóng thích những protein này, ta tăng nồng ñộ ion của pha ñộng, những ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang ñiện tích, dung dịch thường sử dụng là natri hoặc kali clorua Pha tĩnh thường ñược dùng khi tinh sạch chitosanse là: CM- Sephadex C-25, CM- Sepharose CL-6B, CM – Sepharose FF, Q- Sepharose FF… [17], [19], [29], [38], [52]

gắn với gel Khi cho hỗn hợp protein chứa enzyme quan tâm ñi qua cột sắc kí ái lực, enzyme và những chất có ái lực ñặc biệt trên gel sẽ ñược giữ lại, còn chất khác sẽ ñi qua Enzyme sau ñó ñược tách ra bằng cách thay ñổi nồng ñộ muối, pH môi trường hay dùng một chất cạnh tranh ñặc hiệu enzyme

 Sắc ký lỏng cao áp

Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột Cột ñược làm từ vật liệu mịn hơn nên có nhiều vị trí tương tác, tuy vậy cần một áp lực tác ñộng lên cột ñể ñạt ñược tốc ñộ chảy thích hợp Kết quả sắc ký cho ñộ phân giải cao và phân tách nhanh

2.2.7.3 Phương pháp tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (ethanol) và bằng muối

Dung môi hữu cơ thường dung là ethanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu Khi sử dụng các dung môi hữu cơ, cần tiến hành ở nhiệt ñộ thấp (từ 50C trở xuống) Dùng dung môi hữu cơ có thể tiến hành tách phân ñoạn dưới 00C, như vậy có tác dụng tốt ñến ñộ ổn ñịnh của protein enzyme

Khi ñã có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng cách dùng máy ly tâm lạnh Phương pháp tủa enzyme bằng ethanol cho hiệu quả nhanh, dễ làm và khả năng phân tách enzyme tốt phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm

Có thể dùng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ ñể tách chiết các protein - enzyme Cơ sở của phương pháp này là ñộ hòa tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích ñiện trong phân tử protein với các phân tử nước Sự tương tác ñó (còn gọi là sự hydrate hóa) bị giảm xuống khi thêm vào dung dịch protein các dung môi hữu cơ hoặc các muối trung tính

Các muối trung tính có thể dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4 Tuy nhiên, người ta ñã nhận thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại

mà làm ổn ñịnh (làm bền) hầu hết các loại protein enzyme ðối với chitosanase thì phương pháp tủa muối là phương pháp thường ñược áp dụng phố biến trong quá trình làm sạch enzyme và phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm [19], [29], [31], [38]

2.3 Hiệu quả của ñường oligosaccharide chức năng

Oligosaccharide là một nhóm quan trọng của carbohydrate polymeric ñược tìm thấy hoặc bằng hình thức tổng hợp trong tất cả các sinh vật sống Oligosaccharide chức năng thường ñược ñịnh nghĩa như là các glycoside có chứa từ 3 ñến 10 phân tử ñường ñơn

Thuật ngữ chung chung "oligosaccharide" hay còn gọi là ñường chức năng ñược cấu tạo bởi sự liên kết của một số ít monosaccharide, khối lượng phân tử không lớn, có chứa từ 2 ñến 10 phân tử ñường ñơn và hòa tan ñược 80% ethanol [31] Các olygosaccharide có tính chất chung là dễ tan trong nước và dễ kết tinh Các liên kết glycoside dễ dàng bị thủy phân bởi acid hoặc các enzyme cụ thể ñể giải phóng ra các mono saccharide, chúng rất có ích làm tăng hương vị sản phẩm

Có nhiều loại oligosaccharide ñã ñược tìm thấy như là các thành phần

tự nhiên trong nhiều loại thực phẩm phổ biến bao gồm cả trái cây, rau quả, sữa, mật ong ðặc biệt trong sữa mẹ chứa một lượng lớn oligosaccharide: chứa hơn 130 oligosaccharide với hàm lượng khoảng 12 -15g/l

Oligosaccharide có những ñặc tính rất thú vị bởi sự tác dụng lên hệ vi sinh vật ñường ruột kích thích có lợi với sức khỏe của con người.Cũng chính

vì vậy mà oligosaccharide ñược gọi là " Prebiotics " " Prebiotics " là nhóm các cấu tử chức năng sử dụng trong sản phẩm thực phẩm với mục ñích chính

ñể cung cấp thức ăn cho hệ vi sinh vật có lợi cho ñường tiêu hóa, ñặc biệt là

hệ vi sinh vật có lợi cư trú trong ñại tràng ( vi khuẩn lactic, vi khuẩn

Bifidobacterium…) Các cấu tử prebiotics này không bị phân giả ở dạ giày,

không bị hấp thụ ở ruột non mà tồn tại ở cuối ựường tiêu hóa và trở thành nguồn dinh dưỡng cho hệ vi sinh vật ựường ruột phát triển cân bằng Việc duy trì cân bằng sinh thái ổn ựịnh này ựã ngăn chặn hữu hiệu sự phát triển của các loài vi sinh vật có hại khác Qua ựó, góp phần tăng sức ựề kháng cho cơ thể, tránh táo bón, hạn chế béo phì, chậm quá trình lão hóa, giảm nguy cơ xơ vữa ựộng mạchẦ

Những oligosaccharide thực phẩm hiện nay ựược sử dụng như các chất

có năng lượng thấp trong các thực phẩm ăn kiêng cho người béo phì hay người bị bệnh tiểu ựường Oligosaccharide còn ựược sử dụng như là tác nhân nối các chất ngọt nhân tạo mạnh như aspartame hay sucralose và tạo ra vị dễ chịu khi sử dụng Khả năng khó tiêu hóa của oligosaccharide khiến chúng có vai trò như chất xơ trong việc ngăn ngừa táo bón

Nhờ vai trò tác ựộng như một prebiotecs nên ựã mang lại hiệu quả rất

có lợi cho sức khỏe đó là sự bảo vệ chống lại quá trình phát triển của bệnh ung thư chủ yếu do các sản phẩm có tắnh năng bảo vệ từ quá trình trao ựổi chất (như là butyric acid) mà kắch thắch sự xung huyết trong các tế bào ung thư ) và bằng việc kắch thắch sự phát triển của vi khuẩn ( vi khuẩn lactic ) mà người ta tin rằng có hiệu quả ngăn chặn một vài vi khuẩn sản xuất ra enzyme gây ung thư

Ngoài ra, oligosaccharide là thành phần thực phẩm chức năng có một tiềm năng lớn ựể cải thiện chất lượng của nhiều loại thực phẩm Ngoài việc cung cấp hữu ắch ựể sửa ựổi các thuộc tắnh hóa lý của thức ăn, nó ựã ựược báo cáo rằng các oligosaccharide có nhiều chức năng sinh lý như cải thiện hệ vi

sinh ựường ruột dựa trên sự gia tăng chọn lọc của vi khuẩn Bifidobacterium,

kắch thắch sự hấp thu chất khoáng, dẩy mạnh quá trình tiêu hóa, và cải thiện các cholesterol huyết tương và mức ựộ ựường trong máu

2.4 Chitosan oligosaccharide

2.4.1 Cấu trúc hoá học của chitosan oligosaccharide (COS)

Chitosan oligosaccharide, ñược hình thành với 2 - 10 glucosamine bởi mối liên kết ß-(1- 4) glycoside, có thể ñược sản xuất bởi thủy phân chitosan bằng enzyme chitosanase

Công thức phân tử: (C6H11O4N) n

Hình 2.3 Cấu trúc hoá học của chitosan oligosaccharide

Thành phần của chitosan oligosaccharide gồm N-acetyl glucosamine (GlcNAc, n = 1; G1), chitobiose (n = 2; G2), chitotriose (n = 3; G3), chitotetraose (n = 4; G4), chitopentaose (n = 5; G5), chitohexaose (n = 6; G6), chitoheptaose (n = 7; G7) và chitooctaose (n = 8; G8) [18]

Có nhiều phương pháp ñể xác ñịnh thành phần của chitosan oligosaccharide trong ñó nhiều nhà nghiên cứu ñã sử dụng phương pháp HPLC cho hiệu quả tốt nhất Phương pháp này có thể phân tích ñược thành

phần cấu tạo của chúng (bảng 2.5)

Bảng 2.5 Phân tích thành phần cấu tạo của chitosan oligosaccharide bằng phương pháp HPLC

tỷ lệ cao nhất là 25,78%, D-Glucosamine GlcN chiếm tỷ lệ thấp nhất

2.4.2 Tính năng của chitosan oligosaccharide ( COS )

Chitosan oligosaccharide dạng thương phẩm kết tinh thành dạng hạt hay bột, có màu trắng ñến vàng nhạt Do COS có mức ñộ polymer thấp hơn nhiều

so với chitosan nên nó có khả năng hòa tan cao trong nước, dung môi hữu cơ tạo ñiều kiện cho hoạt ñộng của chúng trong các môi trường khác nhau và các tính năng công nghệ, tính năng sinh học cũng thể hiện hiệu quả hơn

công tác bảo vệ chống nhiễm trùng…

Hiệu quả kháng khuẩn của chitosan oligosaccharide phụ thuộc rất lớn vào mức ñộ của polyme (DP) (degree of polymerization) và mức ñộ deacetyl (DA) (degree of deacetylation) Do ñó, trọng lượng phân tử ñược coi như là một ñặc tính chính của chitosan oligosaccharide rằng rất tương quan ñến hoạt ñộng sinh học của chúng

 Hoạt ñộng kháng khuẩn

Hoạt ñộng kháng khuẩn của chitosan và dẫn xuất của nó ñối với một số loài vi khuẩn ñã ñược công nhận và nó ñược coi là một trong những khả năng quan trọng nhất liên quan trực tiếp vào ứng dụng sinh học Chitosan oligosaccharide có khả năng ức chế hầu hết các vi khuẩn [20], [21], [32] COS với trọng lượng phân tử MW (Molecular Weight) cao hơn có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn Chitosan oligosaccharide hỗn hợp (MW 2000 ~ 30000DA); mức

ñộ deacetylation (DD) 91,5% cho hoạt ñộng kháng khuẩn tốt ñối với hai ñại diện

tác nhân gây bệnh răng miệng là Astinobacillus actinomycetemcomitans và Streptococcus mutans [10] Chitosan oligosaccharide mà chủ yếu là chứa

tetramer-hexamer hiệu quả cao hơn COS mà chủ yếu là chứa trimer-tetramer

trong việc ức chế Escherichia coli [44]

 Hoạt ñộng kháng siêu virus

Chitosan và COS có khả năng ngăn chặn nhiễm virus trong hệ thống ña dạng sinh học Nghiên cứu cho nhiễm virus ở thực vật cho thấy rằng việc ñiều trị của chitosan trên bề mặt lá có thể làm giảm số lượng các necroses khác nhau gây ra bởi virus khảm [35] Chitosan oligosaccharide có thể kích thích miễn dịch và hệ thống phòng thủ trong các tế bào ñộng vật Tác ñộng ñiều trị của COS với kháng nguyên trên ñối tượng chuột có thể tăng mạnh mẽ các phản ứng trong hệ thống miễn dịch ñể phòng cúm A và B virus [24] Carboxymethyl sulfated và dẫn xuất của chitosan có thể ức chế sự sao chép

của HIV trong cơ thể con người [15] Chitosan oligosaccharide cũng có hiệu quả trong việc ngăn ngừa một số bệnh nhiễm phage [22]

 Kìm hãm hoạt ñộng tế bào ung thư

Chitosan oligosaccharide có thể ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư bằng cách tạo ra hiệu ứng ngược Một lượng N-acetyl-hexamer hòa tan trong nước ñã có thể tăng tác dụng bảo vệ của tế bào trên ñối tượng chuột chống

nhiễm Listeria monocytogenes [43] Ngoài ra N-acetyl-hexamer và hexamer có

khả năng kìm hãm, chống lại có hiệu quả Meth - Một khối u rắn trong cơ thể con người [42]

 Chống oxi hóa và các hoạt ñộng cấp tiến

Gần ñây, các hoạt ñộng chống oxi hóa của chitosan và dẫn xuất của nó thu hút ñược sự chú ý nhiều hơn Dựa trên kết quả thu ñược từ các nghiên cứu ñang ñược thực hiện bằng cách sử dụng các kỹ thuật ñiện tử spin bẫy, chitosan oligosaccharide trọng lượng phân tử của 1 - 3 KDA ñã ñược xác ñịnh

là có thể liên kết gốc tự do khác nhau chống oxi hóa và giảm các hoạt ñộng cấp tiến [33]

 Kích thích sự vận chuyển các chất trong máu

Một số nghiên cứu ñã chứng minh rằng cả hai oligomers của chitin và chitosan có hiệu quả trong việc tăng cường các hoạt ñộng di cư của các ñại thực bào [30] Khi chitosan oligosaccharide với DP 2 - 8 ñược ñưa vào thức ăn cho thỏ thì các lysozyme hoạt ñộng trong huyết thanh máu của thỏ tăng lên hai lần Chitosan oligosaccharide ñược ñưa vào thức ăn trong thời gian 11 ngày với liều lượng 4,5 mg/kg Theo dõi tình trạng sinh lý thỏ thì không thấy bất kỳ phản ứng nào xảy ra bất lợi Chitosan oligosaccharide an toàn cho ñộng vật

 Khả năng tạo màng bảo vệ

Chitosan và COS có khả năng tạo vỏ bọc có tính chất của màng bán thấm Khi dùng trong thực phẩm, chúng sẽ kéo dài thời gian bảo quản sản

phẩm nhờ có tác dụng như màng ngăn cản không khí, hơi ẩm và sự chuyển màu của trái cây, rau củ

Ngoài ra, chitosan còn có các ñặc tính khác là khả năng tạo nhũ, khả năng chống oxy hoá, như một chất ñiều chỉnh ñộ chắc, là chất ñông tụ polycation ñược dùng trong tinh lọc nước, trong nước ép trái cây, trong sữa, trong việc bất ñộng enzyme… [1]

2.4.2.2 Tính chất hóa học của COS

- Chitosan oligosaccharide là một ñường chức năng không ñộc trọng lượng phân tử thấp Trong khi chitosan chỉ hoạt ñộng của dạ dày và ruột, vì

nó không ñược hấp thu vào hệ thống thì chitosan oligosaccharide có thể ñến ñược ñại tràng, nơi nó ñược chia nhỏ theo các enzym và phân phối trong cả cơ thể ñể làm sạch các tế bào chất thải Những lợi ích của chitosan oligosaccharide mang lại là rất to lớn

- Gắn chất béo dư thừa và ức chế sự hấp thụ chất béo: COS ñang ñược nghiên cứu trong những năm gần ñây thấy rằng hiệu quả hấp thu lipid và cholesterol của COS lớn hơn rất nhiều so với chitosan Không chỉ giống chitosan khi hấp thụ chất béo ñể chúng không bị tiêu hóa tức có tác dụng loại chất béo trong dạ dày và ñường ruột, COS có thể loại bỏ ngay cả cholesterol

và lipoprotein tỉ trọng thấp từ các mạch máu và ngăn chặn sự tích lũy mỡ ở các nội quan ñặc biệt là thận [30]

- Chống ung thư và kích thích khả năng miễn dịch: Tràng ung thư là một trong những bệnh ung thư phổ biến nhất trong thế giới công nghiệp phát triển

và là một nguyên nhân chính gây mắc và tử vong [15] Nguy cơ ung thư ñược kết hợp với cả hai yếu tố cố hữu và các yếu tố môi trường, trong ñó có chế ñộ ăn uống Dịch tễ học và phòng thí nghiệm nghiên cứu chỉ ra rằng mức tiêu thụ cao của hoa quả và rau dẫn ñến giảm tỷ lệ mắc bệnh ung thư ruột Chitosan oligosaccharide (COS, 3 KDA < MW) ñược thử nghiệm cho việc

phòng ngừa ung thư ruột kết bằng cách ño các hoạt ñộng của reductase quinin (QR) và glutathione-S-transferase (GST), glutathione (GSH) các cấp, hoạt ñộng Ornithine decacboxylaza (ODC) và biểu hiện cyclooxygenase (COX) Các kết quả này cho thấy rằng COS có hoạt ñộng hóa liệu phòng ngừa ung thư ruột kết bằng cách tăng hoạt ñộng GST, QR và mức ñộ GSH ODC hoạt ñộng rất hữu ích trong việc kìm hãm sự tăng trưởng khối u kéo dài thời gian trong việc ñiều trị bệnh ở người

- Chitosan oligosaccharide ngăn chặn tác ñộng tiêu cực của rượu trên gan Oligosaccharide ñóng một vai trò vượt trội trong kiểm soát chức năng gan, ngăn ngừa sự phát triển của những tác ñộng có hại do cồn gây ra [27]

- Chitosan, COS có hoạt tính như một chất kích thích sự phát triển có lựa

chọn vi khuẩn Lactobacilli và Bifidobacteria tốt hơn các oligosaccharide có

nguồn gốc thực vật [20]

- Ngoài ra chitosan oligosaccharide làm giảm lượng ñường trong máu, tăng cường hấp thụ canxi, giảm mức ñộ acid uric trong máu, ñiều khiển huyết

áp cơ thể, ngăn ngừa bệnh tim…

2.4.3 Ứng dụng chitosan và COS trong ñời sống

Chitosan và COS có ứng dụng rất thiết thực trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, y học… và ñem lại hiệu quả kinh tế cao

2.4.3.1 Ứng dụng trong nông nghiệp

- Chúng ñược sử dụng ñể bảo vệ hạt giống trước sự tấn công của nấm trong ñất, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt, ñồng thời nó còn có tác dụng

cố ñịnh phân bón, cải tạo ñất khô cằn, bạc màu, giữ ẩm cho cây trồng

- Chitosan còn là một loại thuốc trừ bệnh cây tác ñộng theo cơ chế kích kháng Ngoài tác dụng kích thích hoạt ñộng của hệ thống kháng bệnh trong cây, chitosan còn có tác dụng như một chất kích thích sinh trưởng của cây và

trực tiếp tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh Chitosan phòng trừ ñược các bệnh cây

do nấm, vi khuẩn, tuyến trùng và cả virus Chitosan ñược coi như một loại vắc-xin thực vật [56]

- Chitosan oligosaccharide có chứa giàu C và N ñược vi khuẩn sử dụng tạo ra với vai trò là dinh dưỡng cho cây trồng

- Chitosan oligosaccharide có thể kích thích tăng trưởng cây trồng như trái cây và rau củ

- Chitosan oligosaccharide có thể cải thiện sức ñề kháng bệnh của thực vật, ngăn ngừa nhiều loại nấm, vi khuẩn và virus, ngăn ngừa và chữa bệnh khảm lúa mì, trứng xanh vỏ bông và cà chua vào cuối vụ thu hoạch …

- Một nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan ñến sinh trưởng và năng suất của lúa giống trong ñiều kiện bón ñạm thấp mới ñây cho thấy khi phun chitosan nông ñộ 10, 20 và 30 ppm ñã làm tăng diện tích lá, tăng chỉ số hàm lượng diệp lục, tăng cường ñộ quang hợp của lúa giống ở giai ñoạn làm ñòng, trỗ và sau trỗ 20 ngày [7]

2.4.3.2 Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

 Chất làm trong - ứng dụng trong công nghiệp sản xuất nước quả

- Trong sản xuất nước quả, việc làm trong là yêu cầu bắt buộc Thực tế hiện nay ñang sử dụng các chất làm trong như: genatin, bentonite, kali caseinat, tannin, polyvinyl pirovinyl… Chitosan là tác nhân tốt loại bỏ ñi ñục, giúp ñiều chỉnh acid trong nước quả ðối với dịch quả táo, nho, chanh, cam không cần qua xử lý pectin, sử dụng chitosan ñể làm trong ðặc biệt nước táo, ñộ ñục có thể giảm tối thiểu chỉ ở mức xử lý với 0.8 kg/m3 mà không hề gây ảnh hưởng xấu tới chỉ tiêu chất lượng của nó Nghiên cứu ñã chỉ ra rằng chitosan có ái lực lớn ñối với hợp chất pholyphenol chẳng hạn: catechin, proanthocianydin, acid cinamic, dẫn xuất của chúng, những chất mà có thể biến màu nước quả bằng phản ứng oxy hóa

 Phụ gia thực phẩm

- Do hoạt ñộng kháng sinh của nó cao, dự kiến rằng sử dụng ñể tăng cường bảo quản thực phẩm Chitosan tạo ra bột chitofood thay thế hàn the ñộc hại nhưng ñảm bảo sản phẩm vẫn dai, ngon Phụ gia này ñược dùng trong chế biến, bảo quản các sản phẩm từ nhóm thịt (giò, chả, thịt hộp, nem), bột (bún, bánh phở, bánh kem), bánh (bánh ít, phu thê), thực phẩm tươi sống, thịt nguội, ñồ uống, nước giải khát, sản phẩm sữa

 Thực phẩm vật liệu

- Do tính hòa tan cao của nó, nó rất dễ dàng ứng dụng trong chế biến

thực phẩm như thực phẩm viện trợ y tế, thực phẩm dinh dưỡng ñặc biệt và các loại khác nhau của sản phẩm uống chức năng

 Ứng dụng làm màng bao trong bảo quản thực phẩm

- Chitosan, COS có tính năng ñặc biệt, có thể làm bao bì bọc các loài

thực phẩm tươi sống giàu ñạm, dễ hư hỏng như cá, thịt, làm vỏ nhồi xúc xích

có bảo quản sản phẩm, không làm mất màu, mùi vị, trạng thái của sản phẩm

mà an toàn cho người

- Sử dụng chitosan, COS ñể bảo quản một số loại quả tươi (cam, bưởi, dưa chuột, dâu tây, hồ tiêu, cà chua ) Màng mỏng chitosan trên bề mặt quả có tác dụng ức chế hô hấp, giữ lại khí cacbonic, giảm thiểu lượng ethylene, diệt ñược một số loại nấm và kìm hãm quá trình biến màu của quả trong khi bảo quản, vận chuyển ñi tiêu thụ

2.3.3.3 Ứng dụng trong y dược

 Phòng bệnh ung thư

- Chitosan có chức năng tăng cường miễn dịch tế bào, kích hoạt tế bào hạch tấn công tế bào ung thư tương ñối tốt Ngoài ra chúng có tác dụng ức chế tính khuyếch tán của ung thư do chúng bám chặt vào các phân tử ở bề mặt tế bào biểu bì trong huyết quản ngăn chặn bộ phận bị ung thư khuyếch