NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME PHYTASE TỪ Bacillus sp. VÀ THỬ NGHIỆM ẢNH HƯỞNG CỦA VIỆC BỔ SUNG PHYTASE TRONG KHẨU PHẦN THỨC ĂN ĐẾN KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG VÀ HIỆU QUẢ SỬ DỤNG THỨC ĂN CHO CÁ RÔ PHI VẰN (Oreochromis niloticus)

Việc thực hiện nồng độ phytase từ các vi sinh vật 1000 UI/kg thức ăn mang lại kết quả trong việc tăng trưởng và sử dụng các chất khoáng tương tự với việc sử dụng các khẩu phần thức ăn từ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN C ỨU THU NHẬN ENZYME PHYTASE TỪ Bacillus sp

VÀ TH Ử NGHIỆM ẢNH HƯỞNG CỦA VIỆC BỔ SUNG PHYTASE TRONG KHẨU PHẦN THỨC ĂN ĐẾN KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG VÀ HIỆU QUẢ SỬ DỤNG THỨC ĂN CHO

CÁ RÔ PHI VẰN (Oreochromis niloticus)

Sinh viên th ực hiện : VÕ ĐỨC TUẤN Niên khóa : 2008 – 2012

Tháng 7/2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

B Ộ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN C ỨU THU NHẬN ENZYME PHYTASE TỪ Bacillus sp

VÀ TH Ử NGHIỆM ẢNH HƯỞNG CỦA VIỆC BỔ SUNG

TĂNG TRƯỞNG VÀ HIỆU QUẢ SỬ DỤNG THỨC ĂN CHO

CÁ RÔ PHI V ẰN (Oreochromis niloticus)

Tháng 7/2012

i

LỜI CẢM ƠN

Trước hết con xin chân thành cảm ơn Ba và Mẹ đã sinh ra và dưỡng dục con nên người Những người thân yêu trong gia đình là nguồn động viên cho tôi vượt qua mọi khó khăn

Ban giám hiệu Trường đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng tất cả các quý Thầy Cô trong và ngoài trường đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong quá trình học tập tại trường

ThS Trương Phước Thiên Hoàng và ThS Nguyễn Thị Thanh Trúc đã tận tình giúp đỡ, dìu dắt, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

KS Nguyễn Minh Quang và ThS Võ Thị Thúy Huệ đã tạo điều kiện và trau dồi kinh nghiệm cho tôi trong suốt thời gian học tại trường

KS Trần Thị Quỳnh Diệp, KS Trương Thị Ngọc Hân, KS Nguyễn Trường

Ngọc Tú, các anh chị và các bạn Bộ môn Công nghệ Sinh học luôn động viên giúp đỡ tôi những lúc khó khăn

Các bạn Trại thực nghiệm Khoa Thủy Sản cùng toàn thể lớp DH08SH đã tận tình giúp đở tôi trong suốt thời gian làm thí nghiệm

Xin chân thành cám ơn

Tp Hồ Chí Minh, tháng 7/2012

Võ Đức Tuấn

ii

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu nhằm thu nhận được enzyme phytase từ các chủng vi khuẩn

Bacillus sp và thử nghiệm ảnh hưởng việc bổ sung enzyme phytase trong khẩu phần

thức ăn lên khả năng tăng trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn và sử dụng phosphor của

cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus)

Thí nghiệm được tiến hành từ 14 chủng vi khuẩn Bacillus sp và 10 chủng

Bacillus subtilis Dựa vào đường kính vòng phân giải acid phytic và định lượng hoạt

độ enzyme phytase trên môi trường bán rắn đã chọn được chủng Ba58 cho hoạt độ enzyme phytase cao nhất Chủng Ba58 sinh tổng hợp phytase tối ưu ở các điều kiện:

và đối chứng (không bổ sung phytase) Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Sau 12 tuần thí nghiệm, kết quả cho thấy cá cho ăn với thức ăn có bổ sung enzyme phytase giúp cải thiện trọng lượng, tăng trọng, tốc độ tăng trưởng đặc biệt, hệ số biến đổi thức

ăn và phosphor cá cao hơn so với đối chứng (P < 0,05) Thêm vào đó, việc bổ sung enzyme phytase làm giảm lượng phosphor thải ra môi trường từ việc nuôi cá rô phi

vằn Trong đó, bổ sung phytase 1500 U/kg thức ăn mang lại kết quả cao nhất

iii

ABSTRACT

The study were conducted to acquire phytase from Bacillus sp strains and the

effects of phytase supplementation in diets on growth, feed efficiency and phosphorus

content of fish (O.niloticus)

Experiment were conducted from 14 strains of Bacillus sp and 10 strains

Bacillus sbtilis Based on periphery zone from acid phytic and through quantitative

method activity of phytase enzyme were choise strain Bacillus subtilis Ba58 is highest

capable of synthesizing phytase Phytase from Ba58 strain biosynthesis optimal with conditions: the seed density 106, culture time was 48 hours, Ca2+ concentration is 0.35%, and relative humidity around 60%

Unrefined preparation of phytase were supplemented in diets on growth, feed

utilization and phosphorus content of zebra tilapia (O.niloticus) Experiment includes

five isonitrogenous (27.4% crude protein) and isolipidic (4.2% crude lipid) were prepared with graded levels of supplemental phytase (750 U/kg, 1000 U/kg, 1250 U/kg and 1500 U/kg) and controls (no added phytase) in diets Each treatment was repeated

3 times for 6 weeks At the end of the experiment, the results show that fish fed with feed supplemented phytase improved final body weight, weight gain and specific growth rate and higher phosphor fish compared to controls (P < 0.05) Furthermore, the addition of phytase reduce the amount of phosphorus discharged from catfish In particular, additional 1500 U phytase/kg feed helps the best results

Keywords: Phytase, Bacillus, phosphor

iv

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

ABSTRACT iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH xi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.2 Mục đích đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Enzyme phytase 3

2.1.1 Định nghĩa 3

2.1.2.1 Dựa trên vị trí của nhóm phosphor đầu tiên bị enzyme tác động 4

2.1.2.2 Dựa trên sự khác biệt về cấu trúc và đặc trưng thủy phân của phytase 5

2.1.3 Các nguồn thu nhận enzyme phytase 5

2.1.3.1 Nguồn thực vật 5

2.1.3.2 Nguồn động vật 5

2.1.3.3 Nguồn vi sinh vật 5

2.1.3 Cơ chất đặc hiệu của enzym phytase 6

2.1.3.1 Acid phytic và muối phytate 6

2.1.3.2 Các cơ chất khác 7

2.1.4 Các đặc tính lý hóa của enzym phytase 8

2.1.4.1 Cấu tạo và trọng lượng phân tử 8

2.1.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ phytase 9

v

2.1.4.3 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ phytase 9

2.1.4.4 Ảnh hưởng của ion kim loại và một số hóa chất lên hoạt độ phytase 10

2.1.4.5 Các điều kiện khác ảnh hưởng đến hoạt độ phytase 10

2.1.5 Vị trí phản ứng, sản phẩm cuối phản ứng thủy giải acid phytic 11

2.1.6 Động học của enzyme phytase 11

2.1.7 Ứng dụng của enzyme phytase 11

2.1.7.1 Trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản 11

2.1.7.2 Trong dinh dưỡng thực phẩm 12

2.1.7.3 Trong sản suất bột giấy và công nghiệp giấy 13

2.2 Bacillus và enzyme phytase c ủa Bacillus 13

2.2.1 Tổng quan về Bacillus 13

2.2.3 Cơ chất đặc hiệu của enzyme phytase từ Bacillus 15

2.2.4 Các đặc tính lý hóa của enzyme phytase từ Bacillus 15

2.2.4.1 Trọng lượng phân tử 15

2.2.4.2 Thành phần acid amin 15

2.2.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH 16

2.2.4.4 Các tác nhân khác ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme phytase 16

2.2.5 Vai trò của Ca2+ đối với cấu trúc và chức năng của enzyme phytase 16

2.2.6 Sản phẩm cuối và động học của sự thuỷ giải acid phytic 17

2.3.1 Phân loại 19

2.3.2 Nguồn gốc 19

2.3.3 Đặc điểm hình thái cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus) 19

2.3.4 Môi trường sống của cá rô phi vằn 20

2.3.4.1 Nhiệt độ 20

2.3.4.2 Độ mặn 20

2.3.4.3 Khoảng pH 20

vi

2.3.4.4 Hàm lượng Oxy hòa tan 20

2.3.4.5 Hàm lượng NH3 21

2.3.5 Dinh dưỡng cho cá rô phi vằn 21

2.3.6 Sinh trưởng của cá rô phi vằn 21

2.3.7 Sự sinh sản của cá rô phi vằn 21

2.3.7.1 Thành thục sinh dục 21

2.3.7.2 Chu kỳ sinh sản của cá rô phi vằn 22

2.3.7.3 Tập tính sinh sản 22

2.3.8 Nhu cầu và sự biến dưỡng phosphor ở loài cá 22

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24

3.2 Vật liệu 24

3.2.1 Giống vi sinh vật 24

3.2.2 Các môi trường dùng trong thí nghiệm 24

3.2.3 Dụng cụ , thiết bị, hoá chất dung trong thí nghiệm 24

3.2.3.1 Dụng cụ thí nghiệm 24

3.2.3.2 Thiết bị dùng trong thí nghiệm 24

3.2.3.3 Hoá chất dùng trong thí nghiệm 25

3.3 Phương pháp nghiên cứu 25

3.3.1 Sơ đồ quy trình thí nghiệm 25

3.1 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp phytase của các chủng Bacillus sp 25

3.1.1 Định tính 25

3.1.2 Phương pháp khảo sát hoạt độ enzym phytase 26

3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp phytase 26

3.3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian và mật độ giống 26

3.3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của ion Ca2+ 26

vii

3.3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm 27

3.3.6 Thu nhận enzyme phytase từ Bacillus sp ở quy mô pilot 27

3.3.7 Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm phytase thô 27

3.3.9 Khảo ảnh hưởng của enzyme phytase lên hiệu quả tiêu hóa và tăng trọng của cá rô phi vằn 28

3.3.9.1 Thức ăn dung trong thí nghiệm 28

3.3.9.2 Bố trí thí nghiệm 28

3.3.9.3 Phương pháp đánh giá các thông số của môi trường thí nghiệm 29

3.3.9.4 Phương pháp thu thập số liệu 29

3.3.9.5 Đánh giá ảnh hưởng của phytase đến tỷ lệ sống và tăng trưởng của cá rô phi 30 3.3.9.6 Đánh giá ảnh hưởng của phytase đến hiệu quả sử dụng thức ăn của cá rô phi 30 4.1 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme phytase của các chủng Bacillus sp 31

4.1.1 Kết quả định tính 31

4.1.2 Kết quả định lượng 32

4.2 Các yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh enzyme phytase của Ba58 33

4.2.1 Ảnh hưởng của mật độ giống đầu vào và thời gian nuôi cấy 33

4.2.2 Ảnh hưởng của độ ẩm trong môi trường bán rắn 35

4.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ Ca2+trong môi trường bán rắn 35

4.3 Kết quả nuôi cấy thu nhận chế phẩm enzyme phytase thô ở quy mô pilot 36

4.4 Kết quả khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm phytase thô 37

4.5 Kết quả thử nghiệm 38

4.5.1 Các thông số môi trường của thí nghiệm 38

4.5.1.1 Nhiệt độ nước trong quá trình thí nghiệm 38

4.5.1.2 Hàm lượng oxy hòa tan trong quá trình thí nghiệm 39

4.5.1.3 Thông số pH trong quá trình thí nghiệm 39

4.5.1.4 Hàm lượng NH3 40

viii

4.5.2 Thành phần sinh hóa của 5 công thức thức ăn 40

4.5.3 Tăng trưởng và tỷ lệ sống của cá thí nghiệm 41

4.5.4 Hiệu quả sử dụng thức ăn của cá rô thí nghiệm 43

4.5.5 Lượng phosphor đào thải ra môi trường khí sản xuất 1 kg cá 44

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45

5.1 Kết luận 45

5.2 Đề nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

ix

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

IUBMB International Union of Biochemistry and Molecular Biology

x

DANH SÁCH CÁC B ẢNG

Bảng 2.1 Trọng lượng phân tử phytase từ các nguồn khác nhau 9

Bảng 2.2 Bảng phân biệt cá đực, cái Error! Bookmark not defined Bảng 3.1 Thành phần các nguyên liệu dùng trong phối trộn thức ăn cho cá rô phi 29

Bảng 4.1 Kết quả địn tính phytase 33

Bảng 4.2 Biến thiên hoạt độ phytase theo nồng độ Ca2+ 38

Bảng 4.3 Kết quả thu nhận phytase trên quy mô pilot 39

Bảng 4.4 Kết quả phân tích thành phần sinh hóa thức ăn 44

Bảng 4.5 Tăng trọng (WG), tốc độ tăng trưởng ngày (SGR) và tỉ lệ sống (SR) 44

Bảng 4.6 Hiệu quả sử dụng thức ăn của cá rô thí nghiệm 45

xi

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Phản ứng thủy giải phytate bởi enzym phytase 3

Hình 2.2 Cấu tạo hóa học của cơ chất bị thủy giải bởi 3- phytase và sản phẩm của quá trình thủy giải 4

Hình 2.3 Cấu tạo hóa học của acid phytic 7

Hình 2.4 Vi khuẩn Bacillus 15

Hình 2.5 Sự gắn acid phytic vào trung tâm hoạt động của phyC 16

Hình 2.6 Cấu trúc không gian của phyC 18

Hình 2.7 Các con đường thủy giải acid phytic của phytase Bacillus 19

Hình 2.8 Cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus) 20

Hình 3.1Sơ đồ quá trình thí nghiệm 26

Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 30

Hình 4.1 Vòng phân giải acid phytic 34

Hình 4.2 Biến thiên họat độ phytase của 5 chủng khảo sát 35

Hình 4.3 Biến thiên hoạt độ phytase theo mật độ giống và thời gian nuôi cấy 36

Hình 4.4 Biến thiên hoạt độ phytase theo độ ẩm môi trường bán rắn 38

Hình 4.5 Biến thiên hoạt độ phytase theo thời gian bảo quản 40

Hình 4.6 Biến động nhiệt độ nước trong thời gian thí nghiệm 41

Hình 4.7 Biến động DO trong thời gian thí nghiệm 42

Hình 4.8 Biến động pH trong thời gian thí nghiệm 43

Hình 4.9 Cá rô sau khí nghiệm 45

Hình 4.10 Lượng phospho thải ra môi trường khi sản xuất một kg cá 47

vật nuôi vào môi trường Enzym phytase có thể làm tăng hấp thụ phosphor trong cơ

thể vật nuôi thêm 60% và được dùng như là chất bổ sung bắt buộc cho thức ăn chăn nuôi ở châu Âu, Đông Nam Á, Hàn Quốc, Nhật, Đài Loan để giảm tác hại đến môi trường do phosphor từ phân vật nuôi thải ra

Một số nghiên cứu về hiệu quả của phytase trên thủy sản đã đư ợc công bố ở một

số quốc gia trên thế giới Theo Furuya và ctv (2001), việc sử dụng phytase trong khẩu phần thức ăn nhằm tăng calcium và phospho r hữu dụng, cải thiện tốc độ tăng trưởng

và tăng hiệu quả sử dụng thức ăn Việc thực hiện nồng độ phytase từ các vi sinh vật

1000 UI/kg thức ăn mang lại kết quả trong việc tăng trưởng và sử dụng các chất khoáng tương tự với việc sử dụng các khẩu phần thức ăn từ thực vật bổ sung với

phosphor vô cơ ( Portz và ctv, 2003; Portz và Liebert, 2004; Liebert và Portz, 2005) Đối tượng cá rô phi là loài cá đem lại kim ngạch xuất khẩu quan trọng trong ngành nông nghiệp Việt Nam Năm 2003, Việt Nam sản xuất được khoảng 30.000 tấn cá rô phi và một nửa trong số đó xuất khẩu mang về 24 triệu USD Phấn đấu đến năm 2015 cá rô phi sẽ

trở thành sản phẩm xuất khẩu chủ lực với giá trị đạt từ 200-300 triệu USD Chi phí sử dụng

thức ăn cho cá rô phi khá cao với FCR (hệ số chuyển đổi thức ăn) khoảng 1,7 – 1,8 Nếu nguồn thức ăn được bổ sung enzyme phytase vào khẩu phần nhằm cải thiện hiệu quả sử

dụng thức ăn, tăng cường khả năng tiêu hóa cho cá là điều rất cần thiết

Tuy nhiên, hiệu quả của các nguồn enzyme phytase được sử dụng cho cá rô phi ở Việt Nam vẫn chưa được nghiên cứu Nhận thức được tầm quan trọng của enzyme phytase đối

với ngành nông nghiệp nói chung và ngành nuôi trồng thủy sản nói riêng Vì vậy đề tài:

“Nghiên cứu quy trình sản xuất enzyme phytase từ các chủng vi khuẩn Bacillus sp và thử nghiệm ảnh hưởng của việc bổ sung phytase trong khẩu phần thức ăn đến sự tăng trưởng và

hiệu quả sử dụng thức ăn của cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus)” đã được tiến hành

2

1.2 Mục đích đề tài

Nghiên cứu quy trình thu nhận enzyme phytase từ vi khuẩn Bacillus sp Khảo sát hàm lượng enzyme phytase thích hợp vào trong khẩu phần thức ăn cho cá rô phi nhằm nâng cao hiệu quả kinh tế

1.3 Nội dung thực hiện

Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme phytase từ Bacillus sp và các yếu tố

ảnh hưởng (mật độ giống, thời gian nuôi cấy, nồng độ Ca2+, độ ẩm) đến khả năng sinh

tổng hợp phytase của Bacillus sp.

Khảo sát hàm lượng enzyme phytase thích hợp đến khả năng tăng trưởng

và hiệu quả sử dụng thức ăn cho cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus)

Phản ứng có thể khái quát như sau: Myo-inositol hexakisphosphate + H2O

= D-myo-inositol 1,2,4,5,6pentakisphosphate + phosphate

Hình 2.1 Phản ứng thủy giải phytate bởi enzyme phytase

(www faculty.evansville.edu)

4

2.1.2 Phân loại

2.1.2.1 Dựa trên vị trí của nhóm phosphor đầu tiên bị enzyme tác động

Các tổ chức nghiên cứu về sinh hóa như IUBMB (International Union of Biochemistry and Molecular Biology), JCBN (Joint Commission on Biochemistry Nomanclatue) đã chia phytase thành 2 loại

E.C.3.1.3.8: tên thông thường là 3-phytase, tên hệ thống là: inositolhexakisphosphate-3-phosphorhydrolase Enzyme loại này thủy giải lien

myo-kết ester tại vị trí thứ 3 của myo-inositolhexakisphosphate thành D-myo-Ins 1,2,4,5,6-pentakisphosphate và orthophosphat Có công thức phân tử C6H17O21P

Đây là dạng thường gặp đối với các enzyme phytase có nguồn gốc vi sinh vật

Hình 2.2 Cấu tạo hóa học của cơ chất bị thủy giải bởi 3-phytase (A)

và sản phẩm của quá trình thủy giải (B)

(www en.wikipedia.org)

E.C.3.1.3.26: t ên thông thường là 6-phytase, tên hệ thống là

myo-inositolhexakisphosphate-6-phosphorhydrolase Enzyme loại này thủy giải liên

kết ester tại vị trí thứ 6 của myo-inositolhexakisphosphate, cho sản phẩm là myo-Ins-1,2,3,4,5-pentakisphosphate và orthophosphat 6-phytase là dạng thường gặp đối enzyme phytase có nguồn gốc thực vật

D-5

2.1.2.2 Dựa trên sự khác biệt về cấu trúc và đặc trưng thủy phân của phytase

Một số tổ chức nghiên cứu và các nhà khoa học khác như Trung tâm thông tin sinh học quốc gia Hoa Kỳ (NCBI) và các tác giả Mullaney, Ullah, đã phân chia enzyme phytase thành 3 nhóm

Nhóm thứ 1 (EC 3.1.3.2) bao gồm các acid phosphatase hoặc histidin acid phosphatase (HAPs) Đặc điểm chung có trung tâm hoạt động là RHGXRXP và quá trình thủy giải phosphomonoester gồm các bước giống nhau

Nhóm thứ 2 (EC 3.1.3.8) là các β-propeller phytase (BPP), chủ yếu là các enzyme của Bacillus Cho đến nay, việc phân lập, xác định các gen điều khiển hoạt động của phyase thuộc nhóm này chưa đầy đủ Các nghiên cứu cho thấy, hiện có 2 loại phytase của Bacillus

đã được xác định, đó là phyC do Kerovuo và các cộng sự phát hiện vào năm 1998 và phy do Kim và các cộng sự phát hiện năm 1998

TS-Nhóm thứ 3 (EC 3.1.3.2) bao gồm các purple acid phosphatase (PAP) PAP được chiết tách từ lá mầm của đậu nành nảy mầm thuộc nhóm enzym này Người ta đã xác định được cấu trúc không gian 3 chiều và cơ chế xúc tác của PAP

2.1.3 Các nguồn thu nhận enzyme phytase

2.1.3.1 Nguồn thực vật

Enzyme phytase được tìm thấy nhiều ở thực vật Ví dụ như phytase từ ngũ

cốc: lúa mì, bắp vàng, lúa mạch, lúa gạo và từ các loại đậu: đậu nành, đậu xanh

và đậu trắng califoria loại nhỏ Hoạt độ enzyme phytase cũng đã được xác định

ở cải trắng, khoai tây, rau diếp, rau bina, cỏ và phấn hoa lily

2.1.3.3 Nguồn vi sinh vật

Shieh và Ware (1968) đã tiến hành phân lập từ đất hơn 2000 chủng vi sinh vật có khả năng tạo enzyme phytase Hầu hết các chủng được phân lập cho sản

6

phẩm enzyme nội bào Chỉ có khoảng 30 chủng đã phân lập cho sản phẩm phytase ngoại bào Tất cả các enzyme phytase ngoại bào đều là sản phẩm của vi

nấm, 28 chủng thuộc giống Aspergillus, một thuộc giống Penicillium và một

thuộc giống Mucor Các nghiên cứu đã chứng minh rằng A.niger tổng hợp phytase ngoại bào tốt nhất (Vohra và Satyanayarana, 2003)

Các nghiên cứu của Powar và Jaganathan (1982), Shimizu (1992) cho thấy

Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp phytase ngoại bào Kim và ctv,

(1998) đã nghiên cứu và chứng minh Bacillus amylolique faciens cũng có khả năng sinh tổng hợp enzyme phyase Bên cạnh đó, các chủng như Aerobacter

aerogenes, Pseudomonas sp., Escherichia coli Enterobacter sp cũng có khả năng sinh tổng hợp enzyme phytase nội bào (Trần Thị Thúy, 2010)

2.1.3 Cơ chất đặc hiệu của enzym phytase

2.1.3.1 Acid phytic và muối phytate

Acid phytic (myo-inositol hexakisphosphat) là ester của rượu inositol và acid phosphoric Công thức tổng quát là C6H18O24P6 Cấu trúc hóa học của acid phytic rất ổn định, hàm lượng phosphate cao, do đó nó tích điện âm và có khả năng tồn tại trong phổ pH rộng

Hình 2.3 Cấu tạo hóa học của acid phytic

(www.en.wikipedia.org)

Acid phytic chiếm từ 1-5% trọng lượng trong ngủ cốc, cây họ đậu, hạt cho

dầu và các loại quả hạch (Ravindran và ctv, 1994) Trong các hạt làm thức ăn cho động vật, 1/3 là các ion phosphor cá thể tiêu hóa được, trong khi đó 2/3 còn

lại là các phosphor vô cơ tồn tại dưới dạng phytin, một dạng hỗn hợp của muối

7

canxi, magie với acid ionositol hexaphosphoric, được biết như là một dạng muối của phytate Ngoài ra trong tự nhiên, acid phytic tồn tại chủ yếu dưới dạng muối phytate với các ion kim loại như kẽm, sắt… Muối phytate là loại hợp chất phức tạp khó tan, con người và động vật không thể phân giải, do đó không thể hấp thu được phosphor và các nguyên tố cần thiết cho cơ thể Trong trường hợp này acid phytic là nguyên nhân gây nên hiện tượng kháng dưỡng, hầu như không có enzyme nào có khả năng phân cắt các liên kết phosphodiester trong phân tử acid phytic, ngoại trừ enzyme phytase (Lynch và ctv, 1998)

Acid phytic và các chất trung gian inositol có liên quan đến sự đáp ứng glucose trong máu, làm giảm lượng cholesterol và triglyceride (Ogawa và ctv 1979) Acid phytic cũng là nguồn cung cấp thông tin liên quan đến khối u, đến

việc điều trị bệnh Parkinson, bệnh Alzhermer và bệnh đa xơ cứng

2.1.3.2 Các cơ chất khác

Enzyme phytase có nhiều cơ chất đặc trưng như ADP, ATP, p-nitrophenyl phosphate, phenyl phosphate, fructose 1,6-bisphosphat, glucose 6-phosphat, α-, β-glycerophosphat và 3-phosphoglycerat Các chất này không có cấu trúc tương

tự acid phytic nhưng tất cả đều được thủy giải bởi phytase Chỉ có một số ít phytase được nghiên cứu cho thấy tính đặc hiệu cao với acid phytic, đó là phytase của Bacillus và alkaline phytase được phân lập từ hạt phấn hoa lily

(Qian và ctv, 2011; Barrientos và ctv, 1994)

Dựa trên cơ chất đặc trưng, enzyme phytase có thể được phân chia thành 2

loại là phytase có lượng cơ chất đặc trưng khá rộng và phytase đặc hiệu cao với acid phytic Enzyme phytase phù hợp với nhiều cơ chất đặc hiệu thì lại có tính đặc hiệu thấp với acid phytic Ngược lại, phytase có lượng cơ chất đặc hiệu thấp thì cho hoạt độ cao hơn

8

2.1.4 Các đặc tính lý hóa của enzym phytase

2.1.4.1 Cấu tạo và trọng lượng phân tử

B ảng 2.1 Trọng lượng phân tử của enzyme phytase từ các nguồn khác nhau

Nguồn enzyme

phytase

Trọng lượng lý thuyết (kDa)

Trọng lượng thực nghiệm (kDa)

Số lượng tiểu đơn

vị

Ghi chú

Aspergillus niger 48,423 64,89 1 Xác định bằng siêu ly tâm

A terreus 48,189 70,38 1 Xác định bằng siêu ly tâm

A fumigatus 48,273 70,74 1 Xác định bằng siêu ly tâm

Bacillus subtilis

Xác định bằng điện di trên gel SDS

Bacillus subtilis - 36,5 1 Xác định bằng điện di

trên gel SDS

Bacillus

amyloliquefaciens 39,23 44 1

Xác định bằng điện di trên gel SDS

Klebsiella

aerogenes - 700 1

Xác định bằng điện di trên gel SDS

9

Hầu hết các enzyme phytase trong tự nhiên đều là các enzyme đơn phân tử, một vài enzym phytase từ thực vật và động vật là những enzyme đa phân Phytase được hình thành trong quá trình nảy mầm của hạt bắp được xác định là một enzym gồm 2 tiểu đơn vị có trọng lượng 38 kDa Enzyme phytase được tinh sạch từ ruột của chuột, qua kết quả điện di cho thấy có 2 loại protein có kích thước 70 và 90 kDa

Phytase của vi khuẩn hầu hết có trọng lượng phân tử nhỏ hơn phytase của

nấm, phytase của nấm có trọng lượng phân tử khoảng 50 kDa Trọng lượng và kích thước phân tử tính toán theo lý thuyết của các protein hoàn chỉnh và số lượng các

tiểu đơn vị của phytase từ nhiều nguồn khác nhau được trình bày trong Bảng 2.1

2.1.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ phytase

Các nghiên cứu cho thấy enzyme phytase có hoạt tính cao ở nhiệt độ

50-700C Khi nghiên cứu khả năng chịu nhiệt của Aspergillus fumigatus, A.niger, kết

quả cho thấy phytase từ nguồn này không có khả năng chịu nhiệt ngay cả khi có sự

biến đổi cấu trúc sau khi bị biến tính bởi nhiệt độ Ở nhiệt độ 50-550

C, phytase

A.niger trải qua quá trình biến đổi hình dáng cấu tạo không thuận nghịch và kết

quả là làm giảm 70-80% hoạt độ enzyme Phytase của A.fumigatus cũng không có

khả năng chịu nhiệt, nhưng có khả năng hồi tính, đảm bảo đầy đủ hoạt độ sau khi bị

biến tính ở 900C (Tomschy và ctv, 2000) Phytase của Bacillus sp.có nhiệt độ tối ưu

tại 700C, cao hơn nhiệt độ tối ưu của phytase nói chung Enzyme này có tính ổn nhiệt, hoạt tính giữ 100% khi ủ ở 700

C khi có sự hiện diện của CaCl2, hoạt tính

giảm nhanh khi nhiệt độ vượt quá 500C và vắng mặt Ca2+ (Edward và ctv, 2003) Các nghiên cứu cho thấy có thể dùng kỹ thuật protein để tăng tính ổn định nhiệt độ của phytase như thay thế Proline và tạo cầu disulfit hay dùng kỹ thuật sinh

học phân tử để tạo dòng phytase từ những nấm chịu nhiệt như M.thermophlia,

T.thermophilus (Kim và ctv, 1998; Đỗ Thị Ngọc Huyền và ctv, 2007)

2.1.4.3 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ phytase

pH tối ưu của các loại enzyme phytase dao động từ 2,2 - 8 Hầu hết phytase

từ vi sinh vật, đặc biệt là nấm mốc, có pH từ 4,5 - 5,6 (Hassouni và ctv, 2001) Tuy nhiên phytase của A.fumigatus có phổ pH khá rộng, khoảng 80% hoạt độ

của enzyme được biểu hiện ở pH 4,0 - 7,3 Phytase từ thực vật có pH tối ưu từ 4,0 - 7,5 Hai enzyme phytase thực vật có tính kiềm (hạt đậu và hạt phấn hoa

10

lily) có pHop là 8,0 Phytase từ động vật đa số hoạt động ở pH kiềm, từ 7,4 đến 8,7 Để tạo phytase có pH phù hợp với hệ thống tiêu hóa của động vật Các nghiên cứu gần đây tiến hành đột biến điểm định hướng một số acid amin làm thay đổi pH tối ưu của enzyme phytase cho phù hợp với hệ tiêu hóa của các đối

tượng vật nuôi (Tomschy và ctv, 2002; Sheng, 2007)

2.1.4.4 Ảnh hưởng của ion kim loại và một số hóa chất lên hoạt độ phytase

Các ion kim loại được xem như là các tác nhân ảnh hưởng trược tiếp lên

hoạt độ phytase Tuy nhiên, rất khó để xác định ảnh hưởng của các kim loại khác nhau vì sự liên kết trực tiếp với enzyme hoặc các ion kim loại ở dạng phức hợp chất hòa tan với acid phytic và do đó làm giảm mức độ hoạt động của cơ chất Các ion kim loại thường ức chế hoạt tính của enzyme phytase: Ba2+

, Cd2+, Co2+,

Cr3+, Cu2+, Hg2+, and Mn2+ Theo nghiên cứu của Wyss và ctv (1999), ion Cu2+

được xác định có khả năng làm giảm hoạt độ của enzyme phytase có nguồn gốc

từ E.nidulans và A.terrus Phytase của A.fumigatus bị ức chế bởi một số ion kim

loại thông thường Theo nghiên cứu của Yang và ctv (2001), khi thêm các thành

phần EDTA, BaCl,2 CaCl2, CdCl2 CoCl2 CrCl3 CuCl2 và HgCl2 thì hoạt độ phytase từ chủng Bacillus sp KHU-10 so với ban đầu giảm lần lượt là: 94%,

65%, 100%, 40%, 55%, 61% và 57% Tuy nhiên khi thêm CaCl2 với nồng độ 1mM thì hoạt độ phytase có thể hồi tính gần như ban đầu Những chất hóa học khác có khả năng kìm hãm hoạt độ phytase là flor, molypdat, vanadat…

Vai trò của ion kim loại đối với hoạt độ enzyme phytase phải được xem xét trên từng loại đối tượng cụ thể Các nghiên cứu đều cho thấy, ion Ca2+ đóng vai trò quan trọng đối với hoạt độ và sự ổn định của enzyme phytase Khi thêm tác nhân Ca vào phytase của Bacillus, phytase có nguồn gốc từ phấn hoa Typha

latifolia và phytase của một số loài thực vật khác với một lượng thích hợp thì hoạt độ có thể đạt đến hoạt độ tối ưu Ngoài Ca2+, một số ion kim loại khác cũng

có khả năng làm tăng hoạt độ của enzyme như Zn2+

, Fe2+, Mg2+

2.1.4.5 Các điều kiện khác ảnh hưởng đến hoạt độ phytase

Nồng độ cơ chất khoảng 300µM có khả năng ức chế phytase và các enzyme

có chức năng gần giống phytase ở Paramecium Phytase của Klebsiella sp.,

11

Rhizopus oligosporus bị ức chế ở nồng độ cơ chất cao Hoạt độ phytase của nấm

bị ức chế ở nồng độ trên 1mM

Một cơ chất có cấu trúc tương tự cơ chất, myo-inositol hexasulfat, cho thấy

nó có khả năng cạnh tranh hiệu quả, trở thành tác nhân ức chế của phyA và phyB của A.ficuum

2.1.5 Vị trí phản ứng, sản phẩm cuối phản ứng thủy giải acid phytic

Acid phytic có 6 nhóm phosphate có thể được giải phóng bằng phytase với

tỷ lệ và trình tự khác nhau Theo Wyss và ctv (1999), tất cả các enzyme phytase

của nấm đã nghiên cứu đều giải phóng 5 hoặc 6 nhóm phosphate, sản phẩm cuối

là myo-inositol 2-monophosphat và sử dụng một lượng enzyme dư Trong một số trường hợp hiếm đã phát hiện sự tồn tại của các myo-inositol hoặc các myo-

inositol 1-monophosphat ở dạng tự do

Có một thực tế là các sản phẩm cuối của sự thủy giải acid phytic của hầu

hết các con đường làm giảm acid phytic về cơ bản đều giống nhau 3-phytase bắt đầu thủy giải các liên kết ester của phosphate ở vị trí D-3, cho ra D-Ino (1,2,4,5,6)p5 như là sản phẩm thứ cấp 6-phytase bắt đầu thủy giải các liên kết ester ở vị trí L-6 hoặc (D-4) tạo thành L-Ins(1,2,3)P3 như là sản phẩm cuối cùng

2.1.6 Động học của enzyme phytase

Cho đến nay, hầu hết các enzyme phytase được nghiên cứu tuân theo động

học Michalelis – Menten, ngoại lệ có phytase của M thermophila và E nidulans

hoạt động không theo động học trên Ở điều kiện tiêu chuẩn, chỉ có một tỷ lệ của

phản ứng từ myo-inositol hexakisphosphat thành pentankisphosphat được xác

định Ullah và Phylippy (1994) đã xác định các thông số động học của enzyme

phytase A ficuum và hai acid phosphatase với cơ chất acid phytic hầu hết nằm

trong khoảng từ 23 - 198 UI/mg Hoạt độ đặc hiệu của enzyme phytase vi khuẩn

có trị số biến thiên trong khoảng 100 lần

2.1.7 Ứng dụng của enzyme phytase

2.1.7.1 Trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản

Thức ăn chiếm đến 70% giá thành sản phẩm từ vật nuôi (Rumsey, 1993)

thế nhưng trong thành phần thức ăn cho thủy sản, heo, gia cầm lại thiếu enzyme thích hợp cho việc phân giải phytin nên vật nuôi khó hấp thu phosphor và lượng

chứng minh kết luận này (Robinson và ctv, 1999)

Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã và đang nỗ lực tìm cách làm giảm ô nhiễm từ các chất thải trong chăn nuôi Trong quá trình nghiên cứu, các nhà khoa học đã xác định được rằng cần cải thiện khả năng sử dụng các dưỡng chất trong khẩu phần của vật nuôi để hạn chế tối đa lượng phân thải ra Trước đây, do ít quan tâm đến lượng chất dinh dưỡng bị thải ra ngoài nên hậu

quả của việc cho ăn quá nhiều chất dinh dưỡng nhằm tối đa hóa năng suất đã dẫn đến hậu quả là lượng chất dinh dưỡng thải ra quá nhiều qua phân và nước tiểu (chủ yếu là hàm lượng protein, phosphor và canxi) Qua những phần trình bày ở trên, enzyme phytase được bổ sung vào thành phần thức ăn cho vật nuôi để cải thiện lượng dinh dưỡng hấp thu như phosphor, acid amin, khoáng chất và năng lượng nhưng nó cũng góp phần bảo vệ môi trường Tuy nhiên, phytase từ vi sinh

vật nhất là từ vi khuẩn rất khó kiểm soát vì chúng ta chưa giải thích được rõ về

cơ chế tổng hợp phytase đặc biệt là các gene điều khiển sinh tổng hợp phytase luôn biến đổi (Liu và ctv, 1998) Tùy theo nhóm vi sinh vật, như vi khuẩn cũng tùy vào mỗi giống và loài, điều kiện môi trường nuôi cấy, cơ chất… sẽ ảnh hưởng đến năng suất và hoạt tính của phytase (Pandey và ctv, 2001) Như vậy, nghiên cứu và sản xuất phytase từ vi sinh vật, tối ưu hóa môi trường và điều kiện sinh tổng hợp phytase tốt nhất cũng như bảo quản hoạt tính enzyme phytase

để thành một sản phẩm thương mại phải còn nhiều bước nghiên cứu nữa

2.1.7.2 Trong dinh dưỡng thực phẩm

Sự hiện diện enzyme phytase trong thành phần thực vật đã được ứng

dụng nhiều trong đó nấm mốc lên men đậu nành cho sản phẩm đậu nành lên men, có tên là tempe (Fardiaz và Markakis, 1981) vì phytate liên kết với protein

và protein phân lập từ đậu nành lại giàu phytate Tuy nhiên, lượng phytase có

sẵn trong thực vật không đủ để đáp ứng cho quá trình lên men Mặt khác phytase

13

dễ bị hư trong quá trình nấu nướng nên phytate khó được tiêu hóa và dĩ nhiên ảnh hưởng đến khả năng hấp thu khoáng chất Vì vậy, phytase được bổ sung trong sản phẩm protein đậu nành trước khi xuất xưởng (Simell và ctv, 1989)

Bổ sung enzyme phytase từ Aspergillus niger vào trong bột mì gia tăng hấp thu Fe2+ ở người (Sandberg và ctv, 1996), làm bánh mì giàu sắt, phosphor, protein dễ tiêu vì bánh mì bán ngoài thị trường chứa từ 0,29 đến 1,05% (w/w) acid phytic bằng cách bổ sung nấm mốc này trong quá trình nhồi bột trước khi nướng sẽ làm phytate phân giải hoàn toàn (Knorr và ctv, 1981)

2.1.7.3 Trong sản suất bột giấy và công nghiệp giấy

Trong sản xuất giấy và bột giấy, các nguyên liệu dùng có nguồn gốc từ

thực vật có hàm lượng acid phytic cao, để giảm thiểu ô nhiễm phosphor cho môi trường các phytase chịu nhiệt được sử dụng để thuỷ giải acid phytic trong nguyên liệu Vì vậy, việc khai thác enzyme phytase trong quá trình chế biến giấy

và bột giấy sẽ mang lại nhiều lợi ích cho môi trường và hỗ trợ sự phất triển của các công nghệ sản xuất sạch trong tương lai

2.2. Bacillus và enzyme phytase của Bacillus

2.2.1 Tổng quan về Bacillus

Trong các giống vi khuẩn, Bacillus có mức độ phổ biến cao và có nhiều công trình nghiên cứu về đặc điểm, sinh lý cũng như khả năng cảm ứng, sinh

tổng hợp các loại enzyme Bacillus là vi khuẩn gram dương, hình que, sống hiếu

khí, có khả năng sinh bào tử và khi sinh bào tử thì không biến dạng hình thái tế bào Các chủng khảo sát có đặc điểm chung là thể mang bào tử (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2006)

Hầu hết các chủng Bacillus đều có khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ như đường, amino acid, các acid hữu cơ Trong một số trường hợp, chúng có thể

sử dụng các hợp chất carbonhydrat trong một hổn hợp phản ứng có sản phẩm là glycin và các dẫn xuất butanol Một số chủng như Bacillus megaterium, không

cần thiết có sự tham gia của các nhân tố hữu cơ trong quá trình phát triển; một

số chủng khác thì cần các amino acid, vitamin B hoặc cả hai Phần lớn các chủng trông giống Bacillus có nhiệt độ sinh trưởng ở mức trung bình, với nhiệt độ tối

ưu từ 30oC đến 45o

C, tuy nhiên, cũng có một số chủng có mang các gen chịu

14

nhiệt với nhiệt độ tối ưu khá cao, khoảng 65oC Trong điều kiện phòng thí nghiệm, với các điều kiện tối ưu cho quá trình phát triển, các chủng Bacillus có

thời gian sinh trưởng khá ngắn, khoảng 24 giờ

Các chủng Bacillus được nghiên cứu khá nhiều, đặc biệt là trong việc sử

phytase,…Một vài nghiên cứu gần đây cho thấy một số chủng Bacillus như

Bacillus subtilis, Bacillus amiloliquefaciens đóng vai trò tích cực trong quá trình phát triển của của thực vật trong điều kiện môi trường đất có nhiều phytate Sự

hiện diện của các vi khuẩn này trên bề mặt rễ của thực vật đã giúp ích cho sự phát triển của thực vật thông qua việc tạo nên các điều kiện thuận lợi cho quá trình dinh dưỡng của thực vật

Hình 2.4 Vi khuẩn Bacillus

( www.scientificamerican.com)

2.2.2 Phân loại enzyme phytase Bacillus

Enzyme phytase tổng hợp từ Bacillus có hai loại là phyC (Kerovuo, 1998)

và TS-phy (Kim, 1998) Cả hai loại này đều thuộc nhóm β-propeller phytase (BPP) Sự phụ thuộc vào liên kết với ion Ca2+

cho tính ổn định nhiệt và hoạt độ xúc tác của enzyme để phân biệt phyC với các nhóm phụ khác của phytase

BPP có hai vị trí gắn với phosphate, vị trí “bẻ gãy” và vị trí “ái lực” Sự

thủy giải cơ chất xảy ra tại vị trí bẻ gãy, còn vị trí ái lực thì có thể làm tăng ái lực liên kết với cơ chất Ion Ca2+ tạo liên kết dễ dàng với cơ chất bởi tạo ra một môi trương tĩnh điện thích hợp

15

2.2.3 Cơ chất đặc hiệu của enzyme phytase từ Bacillus

PhyC đặc hiệu cao với cơ chất là acid phytic, hoạt độ đạt 100%, ngoài ra nó còn đặc hiệu với ATP (hoạt độ đạt 50%) và ADP (hoạt độ đạt 75%) Tính đặc hiệu enzyme phytase ở Bacillus rất cao, tuy nhiên hiệu quả đặc hiệu thấp so với phytase sinh tổng hợp từ các nguồn khác Hoạt độ đặc hiệu thấp làm cản trở việc

sử dụng phytase của Bacillus trong công nghiệp

Hình 2.5 Sự gắn acid phytic vào trung tâm hoạt động của phyC

trọng lượng đạt 44 kDa

2.2.4.2 Thành phần acid amin

Năm 1982, các nhà khoa học tại phòng thí nghiệm Sinh hóa Quốc gia của

Ấn Độ đã nghiên cứu và công bố thành phần acid amin trong enzyme phytase

của Bacillus subtilis Trong phytase của Bacillus subtilic có hầu hết các loại acid

amin Trong 1 mol enzyme phytase có chứa 3 mol tryptophan và 12 mol tyrosin, còn lại là các loại khác, trong đó, cao nhất là acid aspartic, tiếp đó là acid glutamic (trích dẫn Lê Quốc Phong, 2009)

16

2.2.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH

Enzyme phytase của Bacillus sp DS11 có nhiệt độ tối ưu khoảng 70oC, đây

là nhiệt độ cao hơn hầu hết nhiệt độ tối ưu của các phytase khác Đó cũng là nhiệt độ tối ưu chung của các phytase chịu nhiệt Hoạt độ của phytase chiết xuất

từ Bacillus sp DS11 giảm một cách đáng kể ở khoảng 50oC, trong điều kiện thiếu CaCl2, ngược lại hoạt độ của nó sẽ tăng lên đáng kể ở 90o

C với sự có mặt của CaCl2 Sau khi ủ ở 90oC trong 10 phút, hoạt độ enzyme phần còn lại đạt khoảng 50% hoạt độ lúc ban đầu Điều đó cho thấy ion Ca2+ ảnh hưởng mạnh mẽ trong việc bảo vệ sự ổn định của enzyme trước sự biến tính bởi nhiệt độ

pH tối ưu của phytase Bacillus đa số trong khoảng 6,5 - 7,0 Phytase của

B.subtilis có pH tối ưu hơi acid, từ 6,0 – 6,5 Tuy nhiên, cũng có trường hợp ngoại lệ như B.subtilis VTE68013 có pH ở 7,0, nhiệt độ tối ưu là 55o

C

2.2.4.4 Các tác nhân khác ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme phytase

Enzyme phytase của B.subtilis (natto) N-77 bị ức chế bởi các ion kim loại

như Zn2+

, Cd2+, Ba2+, Cu2+, Fe2+ và Al3+ Các tác nhân ức chế β-mercaptethanol, dithipreitol…không ảnh hưởng nghiêm trọng đến hoạt độ enzyme phyC, do phyC không chứa bất kỳ phân tử cysteine nào

Sự ức chế bởi cơ chất ở nồng độ tương thấp thì phổ biến ở các phytase, điều này có thể do sự kìm hãm cạnh tranh bởi sản phẩm, thể hiện rõ ở phytase

của vi khuẩn, nấm…với nồng độ cơ chất là 16 mM, hoạt độ phyC chỉ bị giảm khoảng 30% Điều này do enzym phytase tách 3 nhóm phosphate từ acid phytic,

nồng độ phospho vô cơ ở phản ứng cuối tại nồng độ cơ chất 16 mM so với 48mM Vì thế phyC không thể bị kìm hãm cạnh tranh bởi sản phẩm

2.2.5 Vai trò của Ca 2+ đối với cấu trúc và chức năng của enzyme phytase

Ca2+ có vai tò quan trọng đối với enzyme phytase của Bacillus Nó hoàn

toàn bị ức chế bởi các tác nhân ức chế (như EDTA) ở nồng độ phân tử vượt trội

nồng độ Ca2+

Sự ức chế có thể xảy ra do việc loại ion Ca2+

từ enzyme Phần apoenzyme có thể phục hồi hoạt động chỉ với Ca2+

(42% hoạt độ ban đầu được phục hồi) Điều này chứng tỏ các ion kim loại khác không thể hoặc chỉ có thể thay thế ion Ca2+

một phần nhỏ để enzyme hoạt động

17

Tính bền nhiệt của enzyme phytase cũng phụ thuộc rất lớn vào Ca2+

phytase phục hồi hơn 90% hoạt độ của nó sau 10 phút nuôi cấy ở 60oC khi có sự

hiện diện của 5 mM Ca2+

Trong khi không có mặt của ion Ca2+

thì hoạt độ enzyme bị mất sau nuôi cấy Sau 10 phút nuôi cấy ở 1000

C khi có 5 mM Ca2+ thì enzyme phytase vẫn còn lại 20% hoạt độ

Ca2+ cũng góp phần hình thành cấu trúc phyC Có tất cả 6 ion Ca2+

gắn vào phyC, ba ion trong só đó có ái lực cao và cần độ bền vững của enzyme, ba ion còn lại có ái lực thấp giúp điều hòa hoạt độ xúc tác của enzyme Những enzyme này phần lớn tập trung xung quanh một cái “khe cạn” mang điện âm tạo một trường tĩnh điện thuận lợi cho việc gắn acid phytic (Edward và ctv, 2003)

Hình 2.6 Cấu trúc không gian của phyC

(www.sciencedirect.com)

2.2.6 Sản phẩm cuối và động học của sự thuỷ giải acid phytic

PhyC thủy giải acid phytic ở những thời điểm khác nhau tạo sản phẩm rất phong phú gồm có inositol hexaphosphate, tetraphosphate và triphosphate (lần lượt là InsP6, InsP5, InsP4, InsP3 ) Acid phytic (InsP6 ) được phân cách nhánh thành InsP5 , rồi sau đó thành InsP4 Sự chuyển chậm từ InsP5 thành InsP4 và InsP4 thành InsP3 cho thấy những myo-inositol chứa ít phosphat hơn thì ít thích

hợp với enzyme hơn so với acid phytic Sau 30 phút, hơn 50% sản phẩm phản ứng được hình thành là InsP4, trong khi đó chỉ 10% là InsP3 Phản ứng không tiếp tục tạo những inositol chứa ít phosphat hơn khi nuôi cấy trong thời gian dài, điều này cho thấy InsP3 là sản phẩm cuối cùng của sự thủy giải acid phytic bởi phyC

18

Con đường thủy giải acid phytic thành InsP3 bởi enzyme phyC được đề nghị, thể hiện trong hình 2.7

Hình 2.7 Các con đường thủy giải acid phytic của enzyme phytase Bacillus

(Lê Quốc Phong và ctv, 2009)

Loài: Oreochromis niloticus

Hình 2.8 Cá rô phi vằn (O.niloticus)

Cá rô phi vằn ( rô phi Đài Loan O.niloticus) được nhập vào Việt Nam từ

năm 1973 từ Đài Loan

2.3.3 Đặc điểm hình thái cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus)

Cá rô phi vằn có thân hình màu hơi tím, vẩy sáng bóng, có 9 – 12 sọc đậm song song nhau từ lưng xuống bụng Vây đuôi có màu sọc đen sậm song song từ phía trên xuống dưới và phân bố khắp vây đuôi, vây lưng có những sọc trắng

20

chạy song song trên nền xám đen Viền vây lưng và đuôi có màu hồng nhạt (Trần Văn Mỹ, 2002)

B ảng 2.2 Bảng phân biệt cá đực, cá cái (Trần Văn Mỹ, 2002)

trứng và con

Lỗ niệu sinh dục 2 lỗ: Lỗ niệu sinh dục và lỗ hậu môn 3 lỗ: lỗ niệu, lỗ sinh dục và lỗ hậu môn

2.3.4 Môi trường sống của cá rô phi vằn

2.3.4.2 Độ mặn

Cá rô phi là loài rộng muối, có khả năng sống được trong môi trường nước sông, suối, đập tràn, ao hồ nước ngọt, nước lợ nước mặn có độ muối từ dưới 18‰ - 40‰ Cá sống trong môi trường nước lợ (độ mặn 10‰ - 25‰) tăng trưởng nhanh, mình dày, thịt thơm ngon

2.3.4.3 Khoảng pH

pH thích hợp cho cá từ 6,5 – 8,5 Ngoài ra cá có thể chịu đựng được khoảng

pH từ 4 – 11, khi vượt quá giới hạn cá sẽ chết trong vòng 2 – 6 giờ (Baraline và Halton, 1979; Trích bởi Nguyễn Thị Mỹ Hạnh, 2009)

2.3.4.4 Hàm lượng Oxy hòa tan

So với các loài cá khác, cá rô phi có thể chịu đựng được hàm lượng oxy hòa tan thấp, khoảng 1 mg/l Ngưỡng oxy gây chết của cá rô phi là từ dưới 0,3 mg/l Nếu hàm lượng oxy hòa tan thấp trong nước kéo dài sẽ ảnh hưởng đến quá

21

trình hô hấp và trao đổi chất của cá, làm cá chậm lớn, giảm khả năng kháng bệnh (Thomas Popma và Michael Masser, 1999)

2.3.4.5 Hàm lượng NH3

Cá rô phi chết trong vòng vài ngày khi amonia trong nước lớn hơn 2 mg/l

Nồng độ amoni từ khoảng 0,08 mg/l trở lên làm giảm khả năng tiêu thụ thức ăn

của cá (Thomas Popma và Michael Masser, 1999)

2.3.5 Dinh dưỡng cho cá rô phi vằn

Tính ăn của cá rô phi thay đổi theo giai đoạn phát triển và môi trường nuôi Khi còn nhỏ (20 ngày tuổi , kích thước khoảng 18 mm), cá rô phi ăn sinh vật phù du ( tảo và động vật nhỏ ) là chủ yếu Khi cá trưởng thành ăn mùn bã hữu cơ lẫn các tảo

lắng ở đáy ao, ăn ấu trùng, côn trùng và thực vật thuỷ sinh Tuy nhiên trong nuôi công nghiệp cá cũng ăn các loại thức ăn chế biến từ cá tạp, cua, ghẹ, ốc, bột cá khô, bột bắp, bột khoai mì, khoai lang, bột lúa, cám mịn, bã đậu nành, bã đậu phộng Trong thiên nhiên cá thường ăn từ tầng đáy có mức sâu từ 1 - 2 m

Cá rô phi có nhu cầu dinh dưỡng ở mức như sau: protein khoảng 25% - 35%,

chất béo khoảng 5% - 6%, canxi 1,5% - 2%, phospho khoảng 0,45%

2.3.6 Sinh trưởng của cá rô phi vằn

Tốc độ lớn của cá rô phi phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường, thức ăn, mật độ thả

và kỹ thuật chăm sóc Khi nuôi thâm canh cá lớn nhanh hơn khi nuôi bán thâm canh hay là nuôi ghép

Giai đoạn cá hương, cá rô phi vằn có tốc độ sinh trưởng khá nhanh từ 15- 20 gam/tháng Từ tháng nuôi thứ 2 đến tháng nuôi thứ 6 tăng trưởng bình quân ngày có thể đạt 2,8-3,2 g/con/ngày Cá rô phi vằn có thể đạt trọng lượng bình quân trên 500g/con sau 5-6 tháng nuôi

2.3.7 Sự sinh sản của cá rô phi vằn

2.3.7.1 Thành thục sinh dục

Trong điều kiện ao nuôi cá rô phi thành thục sinh dục vào tháng thứ 3, 4 khi cá

có trọng lượng thông thường là 100-150 g/con (cá cái) Tuy vậy kích thước thành thục sinh dục của cá rô phi phụ thuộc vào điều kiện chăm sóc, điều kiện nhiệt độ và độ tuổi

Cá nuôi trong mô hình thâm canh năng suất cao, cá cái tham gia sinh sản lần đầu sinh

22

sản khi trọng lượng đạt trên 200 g trong khi đó ở điều kiện nuôi kém, cá cái bắt đầu đẻ khi trọng lượng cơ thể mới khoảng 100 g

2.3.7.2 Chu kỳ sinh sản của cá rô phi vằn

Hầu hết các loài cá rô phi trong giống Oreochromis đều tham gia sinh sản nhiều

lần trong 1 năm Trong điều kiện khí hậu ấm áp, cá rô phi đẻ quanh năm Quan sát buồng trứng cá rô phi cho thấy trong buồng trứng lúc nào cũng có tất cả các loại trứng,

từ loại non nhất đến loại chín sẵn sàng rụng để đẻ Vì vậy trong tự nhiên ở các ao nuôi

cá rô phi chúng ta gặp rất nhiều cá con ở các cỡ khác nhau (trừ ao nuôi cá rô phi đơn tính) Số lượng trứng mỗi lần đẻ từ vài trăm trứng đến khoảng 2000 trứng Chu kỳ sinh sản của cá rô phi thường kéo dài từ 3 - 4 tuần (tính từ lần đẻ này đến lần đẻ tiếp theo)

2.3.7.3 Tập tính sinh sản

Ðến thời kỳ thành thục, vào mùa sinh sản các đặc điểm sinh sản thứ cấp của cá rô phi rất rõ Cá đực có màu hồng hoặc hơi đỏ ở dưới cằm, viền vây ngực, vây lưng và vây đuôi, khi đó ở con cái có màu hơi vàng Ngoài ra, con cái xoang miệng hơi trễ xuống Trước khi đẻ, cá đực đào tổ xung quang bờ ao nơi có nền đáy cứng, độ sâu mực nước 50 - 60 cm Hố hình lòng chảo, đường kính tổ đẻ từ 30 - 40 cm, sâu 7 - 10 cm

Cá cái đẻ trứng vào tổ, cá đực tiến hành thụ tinh, sau khi thụ tinh cá cái nhặt hết trứng vào miệng để ấp Cá sau khi nở lượng noãn hoàng lớn, cá rất yếu, cá mẹ tiếp tục ấp trong miệng từ 4 - 6 ngày, cá mẹ nhả con và vần tiếp tục bảo vệ ở phía dưới trong 1 - 2 ngày đầu Cá bột khi còn nhỏ thường bơi thành đàn xung quanh ao, có thể quan sát được vào lúc sáng sớm

2.3.8 Nhu cầu và sự biến dưỡng phosphor ở loài cá

Phosphor là thành phần quan trọng của acid nucleic và màng tế bào Chất khoáng này tham gia vào các phản ứng sinh hóa tạo năng lượng ở các tế bào Ngoài ra, phosphor còn tham gia vào quá trình biến dưỡng của các dưỡng chất như chất bột đường, chất béo và acid amin cũng như các quá trình biến dưỡng liên quan đến khả năng đệm của dịch cơ thể Không giống như canxi, khả năng hấp thu phosphor của cá trong môi trường nước rất hạn chế do hàm lượng phosphor trong nước rất thấp Vì vậy, thức ăn là nguồn cung cấp phosphor chủ yếu cho các loài cá, kể cả cá nước ngọt và cá

biển Ở hầu hết các loài cá, những dấu hiệu của sự thiếu phosphor là tăng trưởng chậm,

giảm hiệu quả sử dụng thức ăn, giảm khoáng hóa xương, giảm hoạt tính của một số