Chương 9 PHÂN LẬP GENE TÁCH DÒNG PHÂN TỬ VÀ BIỂU HIỆN GENE Tóm tắt: Công nghệ ADN tái tổ hợp bao gồm các kĩ thuật tách dòng gene và biểu hiện gene. Bắt đầu từ sự phân lập gene và sau đó là tạo vector tái tổ hợp, biến nạp vào tế bào chủ, tách dòng và xác định trình tự gene. Protein là sản phẩm biểu hiện gene. Quá trình biểu hiện gene ngoại lai bắt đầu từ việc đưa gene vào vector biểu hiện và biến nạp vào tế bào chủ. Vector biểu hiện gene được thiết kế bao gồm promotor mạnh và điều khiển được. E. coli là vi khuẩn được sử dụng rộng rãi trong công nghệ ADN tái tổ hợp và sự biểu hiện gene thành công nhất hiện nay vẫn là ở E. coli. Phân lập, tách dòng và biểu hiện gene được minh hoạ bằng ví dụ về sự phân lập, xác định trình tự gene mã hoá cho trichobakin-RIP và quá trình biểu hiện gene này. Nội dung của chương gồm 3 vấn đề chính là: (1).Phân lập gene; (2). Tách dòng gene; (3). Biểu hiện gene. §1. PHÂN LẬP GENE Phân lập gene hay phân lập đoạn ADN theo mục đích có thể được tiến hành theo phương pháp sử dụng enzyme cắt hạn chế hoặc bằng phản ứng chuỗi PCR. Phân lập gene mang ý nghĩa trong kĩ thuật giải trình tự ADN hay tạo dòng ADN tái tổ hợp trong kĩ thuật chuyển gene. 1.1. Phân lập gene bằng kĩ thuật cắt hạn chế Enzyme giới hạn (restrition enzyme) có khả năng cắt ADN ở những điểm đặc hiệu. Với đặc tính đó người ta đã vận dụng để xác định những đoạn ADN mã hoá cho các tính trạng của sinh vật và phân lập đoạn ADN đó. Kĩ thuật phân lập gene nhờ enzyme giới hạn có thể gồm các bước sau: (1). Tách chiết và tinh sạch ADN. (2). Cắt ADN bởi enzyme giới hạn. (3). Điện di trên gel agarose. (4). Dựa vào ADN marker xác định được đoạn ADN cần phân lập. (5). Biến tính ADN thành 2 mạch đơn ngay trên gel, rồi chuyển lên màng 126 lai phân tử. Vị trí các đoạn ADN được giữ nguyên. (6). ADN cố định trên màng được lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ Rửa để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp. (7). Dùng kĩ thuật phóng xạ tự ghi để định vị các phân tử lai ADN- mẫu dò. 1.2. Phân lập gene bằng kĩ thuật PCR Phản ứng chuỗi polimerase được tiến hành với các primers có trình tự biết trước. Cặp primer gồm primer xuôi (sens primer) và ngược (antisens primer) được thiết kế theo trình tự gene từ ngân hàng gene. Cặp mồi chuyên biệt này được bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự ADN. Sử dụng cặp mồi chuyên biệt cùng với ADN mẫu, enzyme, dNTP, Mg ++ , bufpher . trong thiết bị nhân ADN (máy PCR) thì đoạn gene từ phân tử ADN mẫu sẽ được khuếch đại. Phân lập gene bằng PCR có thể được tiến hành theo các bước sau: (1) Tách chiết và tinh sạch ADN. (2). Thiết kế primers. (3). Chọn điều kiện phản ứng PCR. (4). Nhân đoạn ADN trong máy PCR để phân lập đoạn gene theo mục đích. §2. TÁCH DÒNG GENE 2.1. Mục đích - Tạo ra một lượng lớn bản sao một trình tự ADN xác định. - Chọn lọc một thư viện gene. 2.2. Các bước của kĩ thuật tách dòng - Chọn và xử lí vector. - Xử lí ADN cần tạo dòng. - Tạo vector tái tổ hợp. - Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ. - Phát hiện dòng cần tìm trong thư viện gene. 127 Hình 9.1. Quy trinh chung của kĩ thuật tách dòng gene 2.3. Thư viện bộ gene Thư viện bộ gene là tập hợp tất cả các trình tự ADN cấu thành bộ gene đã được gắn vào vector. Về nguyên tắc, thư viện bộ gene được thiết lập từ bất cứ tế bào nào của sinh vật nghiên cứu. Các bước thiết lập thư viện bộ gene: (1) Tách chiết ADN. (2). Cắt ADN thành những đoạn có kích thước xác định bằng RF. (3). Gắn đoạn các ADN vào vector để tạo vector tái tổ hợp. (4). Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ. (5). Tế bào chủ nuôi cấy trên môi trường đặc và hình thành nên các dòng. 128 Hình 9.2. Tách dòng ADN tái tổ hợp Ứng dụng: - Giải mã thông tin di truyền chứa trong bộ gene, đặc biệt cấu trúc itron, exon của một gene xác định. - Tạo dòng các trình tự không mã hoá nằm cạnh các gene và đóng vai trò quyết định trong sự điều hoà biểu hiện gene. 2.4. Phân lập, tách dòng và xác định trình tự gene chaperonin ở đậu tương Một ví dụ về xác định trình tự gene chaperonin liên quan đến tính chịu nóng hạn ở cây đậu tương Glicine max (L.) Merrill trên thiết bị tự động theo 129 nguyên tắc của phương pháp Sanger. Glicine max (L.) Merrill là loại cây trồng có vị trí quan trọng hàng đầu trong các loại cây họ đậu. Hạt đậu tương có hàm lượng protein cao từ 28% - 45%, dễ tan và chứa hầu hết các loại axit amin, đặc biệt là các loại axit amin không thay thế. Ngoài protein, hạt đậu tương còn có lipit và nhiều chất hữu cơ khác. Rễ đậu tương có nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm Rhizobium. Các dòng đậu tương M48, M10 và M61 được tạo ra bằng phương pháp đột biến thực nghiệm (Chu Hoàng Mậu, 2001) đã được đánh giá và chọn lọc qua nhiều thế hệ. Ngoài các đặc điểm về năng suất và chất lượng, tác giả còn quan tâm nghiên cứu mối liên quan giữa khả năng chịu hạn với đặc điểm hoá sinh và sinh học phân tử của các dòng đậu tương đột biến này. Dòng đậu tương đột biến chịu hạn ML61 có nguồn gốc từ giống đậu tương Lạng Sơn và được tạo ra bằng đột biến thực nghiệm với công thức xử lí phối hợp (16 kr γ + 0,01%EI). Trần Thị Phương Liên (1999) đã nghiên cứu, phân lập và xác định trình tự gene chaperonin từ giông đậu tương chịu nóng M103, genome của các dòng đậu tương đột biến ML10, ML48 và ML61 có tồn tại gene chaperonin và cấu trúc của nó có điểm gì khác với gene chaperonin đã được nghiên cứu. Kết quả nhân và tách dòng gene chaperonin của các dòng đậu tương đột biến M48, M10 và M61 và xác định trình tự gene chaperonin của dòng đậu tương chịu hạn M61 được thực hiện nhằm mục đích trên. Phát hiện gene chaperonin theo phương pháp của Kary Mullis và cộng sự (1985) với việc sử dụng cặp mồi Chap_N/chap_C thiết kế dựa trên trình tự ADN bổ sung (cDNA) của giống đậu tương Nhật Bản. Chap_N: 5_GCC ATA TGT CGG CAA TCG CGG CCC C Chap_C: 5_CGG GAT CCC TAC CTC ACA GTT ACA GTT ACA ATA TCA TC Chu trình nhiệt phản ứng: 95 0 C : 1 phút; 55 0 C : 1 phút; 72 0 C : 1 phút 20 giây: 32 chu kì; 72 0 C : 8 phút; Kết thúc ở 4 0 C. Để tiến hành tách dòng gene chaperonin sản phẩm PCR được cắt thành các đoạn nhỏ hơn bằng SacI. Sau đó đem sản phẩm cắt gắn vào vector pBluescript KS (-) đã được mở vòng. ADN tái tổ hợp được biến nạp vào chủng E. coIi-DH5 α . Môi trường nuôi cấy, các phương pháp gắn, tạo tế bào khả biến, biến nạp, tách ADN plasmid, kiểm tra đoạn gene bằng cách xử lí với enzyme giới hạn dược tiến hành theo sách cẩm nang chọn dòng phân tử của Sambrook và cộng sự 1989. 130 2.4.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch ADN tổng số Mầm 2-3 ngày tuổi của các dòng dậu tương ML10, ML48 và ML61 được chia nhỏ từ 0,5-1g và giữ ở -70 0 C. Khi tách chiết, mầm được nghiền trong nitơ lỏng và ADN tổng số được chiết ra bằng dung dịch đệm có chứa 10 mM Tris- HCl pH 8.0,1 mM EDTA, 100 mM NaCl, SDS 2,1%. Sử dụng enzyme proteinaza, hỗn hợp phenol : chlorofoc : isoamylalcohol (25 : 24 : 1) để loại protein và các hợp chất không mong muốn, EDTA có tácdụng cố định các ion Mg ++ - là yếu tố cần thiết cho sự hoạt động của các nucleaza, do đó ADN trong dung dịch không bị phân giải bởi các enzyme này. Thực hiện quy trình tách chiết ADN như đã mô tả [1], thu được dung dịch có chứa ADN. Dung dịch ADN thu được vẫn tồn tại cả ARN, loại bỏ ARN bằng cách xử lí với ARNaza, ủ ở 37 0 C trong 2-3 giờ. Sau đó tiến hành kiểm tra sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Bản gel sau khi điện di được nhuộm bằng EtBr (ethidium bromide) trong 10-15 phút. Do cấu trúc của ADN có các liên kết hydro giữa hai mạch đơn nên khi nhuộm, các phân tử EtBr sẽ bám vào các liên kết này. Phân tử EtBr có khả năng phát quang dưới ánh sáng của tia tử ngoại (UV) nên có thể phát hiện băng vạch khi chiếu bản gaeldưới đèn UV. Hình 9.3. Kết quả điện di ADN tổng số trên gel agaroza 0,8% 2.4.2. Nhân gene chaperonin từ 3 dòng đậu tương bằng kĩ thuật PCR Chaperonin tế bào chất là một dạng protein tồn tại trong tất cả các tế bào đóng vai trò quan trọng trong việc tạo cấu trúc không gian đúng cho protein tạo khung tế bào là actin và tubulin. Chúng cùng đồng thời thực hiện nhiều chức năng khác như tham gia tái tạo cấu trúc không gian đúng cho protein bị biến tính khi gặp điều kiện bất lợi. Các tác giả đã sử dụng đoạn mồi được tổng hợp dựa vào trình tự cDNA của chaperonin tế bào chất giống đậu tương chịu lạnh Nhật Bản để tiến hành nhân gene chaperonin của các dòng đậu tương đột biến ML10, ML48 và ML61 bằngkĩ thuật pPC. 131 Hình 9.4. Điện di đồ sản phẩm PCR gene chaperonin của 3 dòng đậu tương Sau 32 chu kì phản ứng, sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% và kết quả cho thấy ở cả ba dòng đậu tương đều thu được sản phẩm PCR đặc hiệu. Kích thước phân tử (KTPT) của sản phẩm PCR vào khoảng 1,6 kb. Đồng thời sản phẩm PCR nhận được có KTPT giống với đoạn tương ứng ở đoạn cDNA của gene chaperonin trong giống đậu tương Nhật Bản. Điều đó chứng tỏ rằng các dòng đậu tương nghiên cứu đều có gene chaperonin. Như vậy, trong trình tự của nó chỉ có những vùng được dịch mã sang protein (exon), mà không có những vùng không dịch mã (intron). 2.4.3. Phân tích gene chaperonin bằng enzim giới hạn Theo các nghiên cứu đã công bố, trình tự gene chaperonin có điểm nhận biết cho một số enzyme giới hạn như: SacI, AluI, SauI. Trong đó SacI cắt trình tự cDNA thành 5 đoạn có kích thước phân tử tương ứng là 260, 189, 198, 630 và 325 bp. Như vậy, để so sánh gene chaperonin này với các trình tự công bố. Sản phẩm cắt được điện di trên gel agaroza 1,2%. Hình 9.5. Phổ điện di ADN plasmid Kết quả trên diện di đồ cho thấy không có sự khác biệt về vị trí điểm cắt SacI ở các dòng đậu tương đột biến so với các gene chaperonin đã được công bố trước đây. Điều này chứng tỏ sản phẩm PCR nhận được có thể chính là đoạn gene chaperonin. Đây là một trong những bằng chứng khẳng định sản phẩm 132 PCR thu được chính là gene chaperonin đã được công bố. Tuy nhiên để có thể khẳng định chắc chắn về gene này cần tiếp tục nghiên cứu tách dòng sản phẩm PCR của một đại diện là dòng đột biến ML61 - dòng được đánh giá là có năng suất cao, chín sớm và khả năng chống chịu hạn tốt để tiến hành đọc trình tự ADN của đoạn gene này làm cơ sở cho việc so sánh với trình tự của gene chaperonin đã được công bố trên ngân hàng gene thế giới. 2.4.4. Tách dòng một số đoạn ADN của gene chaperonin ở dòng ML61 Nhằm mục đích nghiên cứu đọc trình tự gene, cần phải gắn một số đoạn ADN của gene chaperonin ở dòng ML61 đã được cắt bằng enzyme SacI vào vector pBluescript KS (-). Dựa vào các đặc điểm của vector pBluescript KS (-) có chứa gene lacZ và vị trí cắt của SacI . Đồng thời trên gene chaperonin cũng chứa vị trí các điểm cắt đặc hiệu của SacI. Vì vậy, sử dụng SacI để xử lí sản phẩm PCR của dòng đậu tương ML61 và mở vòng vector pBluescirpt KS (-). Phản ứng gắn của vector với các đoạn cắt của sản phẩm PCR được tiến hành ở 16 0 C trong vòng 24 giờ, sử dụng enzyme T 4 ligaza. Sau đó, dịch phản ứng được biến nạp vào chủng E. coli - DH5 α và cấy trải trên môi trường chọn lọc có ampixillin, X-gal và IPTG. Kết quả đã nhận được một số khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh trên môi trường chọn lọc. Những khuẩn lạc trắng có thể đã mang đoạn ADN ngoại lai, còn khuẩn lạc xanh mang plasmid không chứa đoạn gắn vào. Để kiểm tra kết quả của quá trình chọn dòng 9 khuẩn lạc màu trắng (kí hiệu các khuẩn lạc từ 1 đến 9) và một khuẩn lạc màu xanh (làm đối chứng) được sử dụng để tách chiết ADN plasmid. Sau khi tách chiết và làm sạch, sản phẩm ADN plasmit được kiểm tra trên gel agaroza 0,8%. Trên ảnh điện di đồ cho thấy cả 9 khuẩn lạc đều có ADN plasmid với độ di động điện di cao hơn đối chứng. Để xác định được những khuẩn lạc cần tìm có gắn đoạn sản phẩm PCR cắt bằng SacI, chọn ADN plasmid từ bơn khuẩn lạc 1, 4, 7 và 8 để tiến hành phản ứng cắt kiểm tra bằng enzyme SacI. Sản phẩm sau khi cắt được kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza 0,8 %. Kết quả trên ảnh điện di dòng số 8 đã gắn được một đoạn ADN khoảng 0,6 kb; dòng số 7 đã gắn được đoạn ADN khoảng 0,4 kb; dòng số 4 đã gắn dược đoạn ADN khoảng 0,2 kb. Riêng sản phẩm cắt của dòng số 1 cho thấy có cả 2 đoạn ADN khoảng 0,6 kb và 0,2 kb được gắn vào vector. Trong quá trình tách dòng, sử dụng enzyme SacI cắt gene chaperonin thành 5 đoạn. Vì SacI là enzyme cắt tạo đầu dính nên sản phẩm cắt chỉ cho được 3 đoạn có đầu dính tương ứng với kích thước là 189, 198 và 630 bp. Như vậy, rõ ràng là dòng số 8 đã gắn được đoạn tương ứng có kích thước là 630 bp. Dòng số 4 thì gắn dược hoặc là đoạn 189 bp hoặc 198 bp (vì hai đoạn 133 này rất khó phân biệt trên diện di đồ). Còn dòng số 1 gắn được cả hai đoạn 630 bp và một trong hai đoạn ngắn nói trên. Đối với dòng số 7 đoạn gắn có kích thước khoảng 400 bp có thể là tổng của hai đoạn ngắn 189 và 198 bp và cũng có thể là đoạn lẫn tạp trong sản phẩm cắt ngẫu nhiên. Để có những kết luận chính xác về các dòng thu được, cần tiến hành đọc trình tự ADN. 2.4.5. Xác định trình tự gene Chaperonin ở cây đậu tương Vector tách dòng TA cloning và các hoá chất cần thiết của hãng Invitrogen, vi khuẩn E. coli chủng DH5 α . Tạo dòng phân tử được tiến hành theo phương pháp của Sambrook và Russell. Xác định trình tự gene chaporonin được thực hiện trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analizer. Nhân đoạn gene chaperonin từ ADN tổng số, tiểu phần CTT δ của dòng đậu tương đột biến ML61. Sau đó, sản phẩm PCR được đưa vào vector TA cloning, được biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5 α . Kiểm tra vector tái tổ hợp bằng xử lí với enzyme EcoRI đã thu được dòng mang đoạn gene mong muốn để tiến hành đọc trình tự. Để kiểm tra kết quả đọc trình tự gene chaperonin, sử dụng phần mềm Sinh học Clustalx để so sánh trình tự gene này với các gene chaperonin của giống Cúc Vàng (còn gọi là Cúc Lục Ngạn), một giống địa phương có khả năng chịu hạn, giống M103 đột biến có khả năng chịu nóng và giống đậu tương chịu rét Nhật Bản - Bonminori. 134 135 [...]... Đưa gene vào vector biểu hiện và biến nạp vào tế bào E coli Bước 9: Biến nạp vector biểu hiện có mang gene vào tế bào chủ (E coli hoặc nấm men) Bắt đầu từ bước này, các thao tác để biểu hiện gene ở các chủng khác nhau là khác nhau Bước 10: Kiểm tra sự biểu hiện của gene 3.2.1 Lựa chọn hệ biểu hiện E coli và Nấm men là hai hệ được sử dụng nhiều trong kĩ thuật biểu hiện gene E coli được dùng để biểu hiện. .. nhưng tốt nhất là nhân gene trực tiếp từ chính plasmid mang gene đã từng dùng để đọc trình tự gene đó Bước 5: Đưa gene vào vector tách dòng và biến nạp vào tế bào E coli để khuếch đại dòng gene Bước 6: Tách plasmid từ các thể biến nạp E coli Kiểm tra gene trong vector tách dòng bằng enzym hạn chế Kiểm tra gene và đặc biệt là chiều của gene trong vector biểu hiện Gene cần biểu hiện phải nằm đúng chiều... lac-operon đã được sử dụng rộng rãi trong việc biểu hiện gene tách dòng Ngoài ra nhiều promotor đã được phân lập từ nhiều cá thể khác nhau để sử dụng trong biểu gene Phương pháp tối ưu hoá sự biểu hiện của gene tách dòng là gắn gene đó vào plasmid dưới sự kiểm soát của promotor phiên mã liên tục và mạnh Tuy nhiên, sự biểu hiện liên tục và ở mức độ cao của một gene ngoại lai thường gây hại cho tế bào chủ... một số hay toàn bộ các plasmid chứa gene tách dòng sẽ bị mất đi sau một số lần phân chia tế bào Những tế bào không chứa các plasmid mang gene tách dòng sẽ phân chia mạnh hơn các tế bào chứa plasmid mang gene tách dòng và các tế bào không chứa các plasmid mang gene tách dòng sẽ chiếm ưu thế Điều này đã cản trở quá trình biểu hiện và sản xuất các sản phẩm từ gene tách dòng Để khắc phục khó khăn này người... HIỆN GENE 3.1 Khái niệm 3.1.1 Các hệ biểu hiện gene Trong tế bào sống, biểu hiện gene được hiểu là quá trình sinh tổng hợp protein trong mối liên hệ: ADN → ARN → Protein và protein là sản phẩm biểu hiện gene Trong kĩ thuật di truyền, biểu hiện gene là hiện tượng protein của gene ngoại lai được tổng hợp trong tế bào chủ Hiện nay có 4 hệ sau hay sử dụng biểu hiện gene như Escherichia coli, Bacillus subtilis,... vững của phân tử protein được mã hoá bởi gene tách dòng trong tế bào chủ Mức độ biểu hiện gene ngoại lai (foreign gene) còn phụ thuộc vào sự nhận biết của cơ thể vật chủ Hiện nay đã có phổ rất rộng các cơ thể biểu hiện gene ngoại lai (cả Prokaryot và Eukaryot) nhưng đa số các sản phẩm được sản xuất bởi công nghệ ADN tái tổ hợp được tổng hợp ở E coli 3.1.2 Biểu hiện gene từ những promotor mạnh và điều... bằng PCR sau xử lí với EcoRI và HindIII được gắn vào vùng cắt gắn đa vị (MCS) của vector pMAL - C2 ở đúng các vị trí cắt của các enzyme kể trên THẢO LUẬN 1 Thế nào là sự phân lập gen? Nêu nguyên tắc và quy trình của các phương pháp phân lập gen 2 Phân biệt khái niệm thư viện bộ gene và thư viện cADN 3 Biểu hiện gene là gì? 4 Giải thích kĩ thuật biểu hiện gene 5 Biểu hiện gene ngoại lai ở vi khuẩn E... pastoris) và tế bào động vật Tuy nhiên E coli và nấm men là hai hệ biểu hiện chính hiện đang được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và ứng dụng Cho đến nay có thể nói rằng vấn đề biểu hiện gene ngoại lai vẫn còn mang tính thực nghiệm đối với từng gene, chưa có một mô hình chung cho phép biểu hiện tối ưu đối với các loại protein khác nhau trong một biểu hiện Vì vậy, để đạt được mức độ biểu hiện cao đối... đoạn gene cần nhân để đưa vào biểu hiện và kiểm tra các điểm cắt của enzyme hạn chế trong đoạn gene Để tiện cho việc đưa gene vào vector biểu hiện, các đoạn mồi nhân gene thường được thiết kế có chứa thêm trình tự của enzyme hạn chế ở 2 đầu tận cùng của gene Khi đó gene có thể được cắt trực tiếp bằng các enzyme này để dưa vào vector biểu hiện Trình tự enzyme hạn chế được đưa thêm vào mồi cũng được lựa... gel agarose 3.2.7 Đưa gene vào vector biểu hiện Các plasmid tách dòng mang đoạn gene mong muốn được cắt hoàn toàn bằng hai enzyme hạn chế đã được thiết kế ở hai mồi Vector biểu hiện cũng được cắt bằng enzyme tương tự Sau đó vector và đoạn gene có kích thước như mong muốn được tinh sạch từ gel agarose và được nối lại với nhau bằng DNAligase Nếu đoạn gene được đưa vào vector biểu hiện bằng một enzyme . Chương 9 PHÂN LẬP GENE TÁCH DÒNG PHÂN TỬ VÀ BIỂU HIỆN GENE Tóm tắt: Công nghệ ADN tái tổ hợp bao gồm các kĩ thuật tách dòng gene và biểu hiện gene. Bắt. gene này. Nội dung của chương gồm 3 vấn đề chính là: (1) .Phân lập gene; (2). Tách dòng gene; (3). Biểu hiện gene. §1. PHÂN LẬP GENE Phân lập gene hay phân