Nghiên cứu và biểu hiện gene liên quan đến tính kháng mọt phân lập từ cây Ngô

Kết quả phân tích khả năng ức chế α-amylase mọt ngô của protein ZmDEF1 tái tổ hợp từ hạt cây thuốc lá chuyển gen T1 .... Việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để tạo ra các giống ngô có khả

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

1 GS.TS Chu Hoàng Mậu

2 PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh

Thái Nguyên, 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của GS.TS Chu Hoàng Mậu và PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các Tạp chí khoa học - công nghệ, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, tháng 2 năm 2017

TÁC GIẢ

Vì Thị Xuân Thủy

i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới GS.TS Chu Hoàng Mậu, PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh đã trực tiếp hướng dẫn và thường xuyên chia sẻ, động viên khích lệ để tôi có được sự tự tin và lòng đam mê khoa học giúp tôi hoàn thành luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Chu Hoàng Hà, PGS.TS Lê Văn Sơn,

TS Phạm Bích Ngọc, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều điều kiện tốt nhất để tôi tiến hành các th nghiệm tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng công nghệ ADN ứng dụng

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của thầy cô và cán bộ Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên Được học tập và sinh hoạt chuyên môn tại tập thể khoa học nghiêm túc, ngoài việc nhận được những đóng góp quý báu, tôi còn có cơ hội trang bị cho mình

về phương pháp nghiên cứu và những hiểu biết sâu sắc hơn về nhiều vấn đề Sinh học hiện đại

Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Khoa Sinh học, các thầy cô giáo và cán bộ ộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học này Tôi xin cảm ơn Trường Đại học Tây Bắc, đồng nghiệp của tôi là thầy cô giáo, cán bộ Khoa Sinh - Hoá và các đơn vị chức năng đã tạo cho tôi mọi điều kiện thuận lợi về mặt quản lý trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng tri ân đối với những người thầy, những đồng nghiệp, gia đình và bạn bè là những điểm tựa tinh thần vững chắc, đã giúp đỡ, động viên, khích lệ, chia sẻ những khó khăn và luôn đồng hành cùng tôi trong quá trình học tập của mình

Thái Nguyên, tháng 2 năm 2017

TÁC GIẢ

ii

FAO Food and Agriculture Organization Tổ chức Nông - Lương thế giới GFP Green Fluorescene Protein Protein huỳnh quang xanh

Gus β-Glucuronidase

IPTG IsoPropylThio-β-Galactoside

nuôi cấy vi khuẩn

MS Murashige và Skoog, 1962 Môi trường dinh dưỡng cơ bản

nuôi cấy mô thực vật

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp rZmDEF1 Recombinant ZmDEF1 protein Protein tái tổ hợp ZmDEF1

RT-PCR Reverse Transcription Polymerase

Chain Reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp - phiên mã ngược

iii

T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA đƣợc chuyển vào

thực vật Ti-plasmid Tumor inducing - plasmid Plasmid gây khối u

TMB 3,3‟,5,5‟-TetraMethyl Benzidine

M C L C

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Những đóng góp mới của luận án 3

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÂY NGÔ VÀ MỌT NG 5

1.1.1 Giá trị của cây ngô và tác hại của mọt ngô 5

1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, hóa sinh của ngô liên quan đến tính kháng mọt ngô 11

1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA DEFENSIN TH C VẬT 16

1.2.1 Cấu trúc, chức năng của defensin thực vật 16

1.2.2 Cơ chế ức chế α-amylase của defensin thực vật 21

1.2.3 Nghiên cứu defensin ở cây ngô 25

1.3 NGHI N CỨU CHUYỂN GEN Ở NG 26

1.3.1 Nghiên cứu chuyển gen vào phôi non ngô thông qua A tumefaciens 26

1.3.2 Một số thành tựu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen ở ngô 29

Chương 2 VẬT LIỆU V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 38

2.1.1 Vật liệu thực vật 38

2.1.2 Các chủng vi khuẩn và các loại vector 39

2.2 HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 39

2.2.1 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 39

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 40

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHI N CỨU 40

2.3.1 Phương pháp đánh giá khả năng kháng mọt 41

iv

2.3.2 Phương pháp tách dòng và giải tự trình tự gen ZmDEF1 43

2.3.3 Phương pháp thiết kế vector chuyển vào thực vật mang gen chuyển ZmDEF1 46

2.3.4 Phương pháp tạo cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens 49

2.3.5 Phương pháp phân t ch cây chuyển gen 55

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 60

3.1 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT CỦA CÁC GIỐNG NGÔ NGHIÊN CỨU 60 3.1.1 Khối lượng hao hụt của các giống ngô nghiên cứu 60

3.1.2 Tỷ lệ tạo bột của các giống ngô nghiên cứu 61

3.1.3 Tỷ lệ nhiễm mọt của các giống ngô nghiên cứu 62

3.1.4 Hệ số gia tăng quần thể mọt của các giống ngô nghiên cứu 62

3.2 ĐẶC ĐIỂM GEN ZmDEF1 PHÂN LẬP TỪ CÁC GIỐNG NGÔ NGHIÊN CỨU 65 3.2.1 Đặc điểm của gen ZmDEF1 cDNA phân lập từ các giống ngô nghiên cứu 65

3.2.2 Đặc điểm của gen ZmDEF1 phân lập từ DNA 70

3.2.3 Sự đa dạng về trình tự vùng mã hóa gen ZmDEF1 ở ngô 72

3.3 BIỂU HIỆN GEN ZmDEF1 Ở CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN 74

3.3.1 Thiết kế cấu trúc mang gen chuyển ZmDEF1 74

3.3.2 Chuyển cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào cây thuốc lá nhờ A tumefaciens 77 3.3.3 Phân tích cây thuốc lá chuyển gen 79

3.4 BIỂU HIỆN GEN ZmDEF1 Ở CÂY NGÔ CHUYỂN GEN 87

3.4.1 Kết quả chuyển gen gus vào phôi ngô giống LVN99 87

3.4.2 Chuyển cấu trúc mang gen ZmDEF1 vào phôi ngô nhờ A tumefaciens 92

3.4.3 Xác định sự có mặt của gen chuyển ZmDEF1 ở thế hệ cây ngô chuyển gen T0 96 3.4.4 Phân tích biểu hiện protein ZmDEF1 tái tổ hợp ở thế hệ T1 100

3.4.5 Kiểm tra chức năng sinh học của protein ZmDEF1 tái tổ hợp ở thế hệ T1 101

KẾT LUẬN V ĐỀ NGHỊ 104

1 Kết luận 104

2 Đề nghị 104

TÀI LIỆU THAM KHẢO 107

DANH M C CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Mối tương quan giữa các thành phần hoá học với tính kháng mọt

của hạt ngô 14

Bảng 1.2 Các protein được mã hóa bởi các gen từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis được chuyển vào cây ngô 31

Bảng 2.1 Các giống ngô sử dụng trong nghiên cứu 38

Bảng 2.2 Thống kê các trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu 39

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR với Master Mix 44

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng gắn gen ZmDEF1 vào vector tách dòng pBT 45

Bảng 2.5 Thành phần môi trường LB lỏng và L đặc 45

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI 46 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng cắt plasmid pDON201-SLHEP-HA bằng SalI và HindIII 48

Bảng 2.8 Thành phần phản ứng trao đổi LR 48

Bảng 2.9 Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng HindIII 49

Bảng 2.10 Thành phần môi trường tái sinh cây thuốc lá 51

Bảng 2.11 Thành phần môi trường tái sinh cây ngô chuyển gen 52

Bảng 2.12 Thành phần phản ứng cắt DNA tổng số bằng SalI 56

Bảng 2.13 Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR 58

Bảng 2.14 Chu trình nhiệt độ của phản ứng Real-time RT-PCR 58

Bảng 3.1 Khối lượng hao hụt hạt của các giống ngô nghiên cứu sau các thời gian gây nhiễm mọt 60

Bảng 3.2 Tỷ lệ bột ngô tạo ra của các giống nghiên cứu sau các thời gian gây nhiễm mọt 61

Bảng 3.3 Tỷ lệ nhiễm mọt của các giống ngô nghiên cứu sau các thời gian gây nhiễm 62

Bảng 3.4 Hệ số gia tăng quần thể mọt của các giống ngô nghiên cứu sau các thời gian gây nhiễm 63

Bảng 3.5 Ch số mẫn cảm mọt tương đối (Sn) của các giống ngô nghiên cứu 64

v

Bảng 3.6 Sự sai khác về trình tự nucleotide trên vùng mã hóa gen ZmDEF1

của các giống ngô nghiên cứu 68

Bảng 3.7 Sự sai khác về trình tự nucleotide gen ZmDEF1 phân lập từ DNA

của giống ngô địa phương SLvà giống ngô lai LVN99 72

Bảng 3.8 Một số trình tự gen ZmDEF1 để phân t ch đa dạng di truyền 72

Bảng 3.9 Kết quả biến nạp cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào mảnh lá thuốc

lá C9-1 78 Bảng 3.10 Kết quả phân tích chu kỳ ngưỡng và tỷ lệ biểu hiện của gen

ZmDEF1 ở các cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 82 Bảng 3.11 Kết quả phân tích khả năng ức chế α-amylase mọt ngô của protein ZmDEF1 tái tổ hợp từ hạt cây thuốc lá chuyển gen T1 85

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của mật độ A tumefaciens, nồng độ acetosyringone (AS , thời gian nhiễm khuẩn đến hiệu quả chuyển gen gus 88 Bảng 3.13 Ảnh hưởng của tuổi phôi đến hiệu suất biểu hiện gen gus 90

Bảng 3.14 Nồng độ kanamycin mg/l cho ngưỡng chọn lọc phôi ngô LVN99

mang gen gus 91 Bảng 3.15 Kết quả tái sinh cây chuyển gen ZmDEF1 của giống ngô LC1 và LVN99 94 Bảng 3.16 Kết quả phân tích khả năng ức chế α-amylase mọt ngô của protein tái tổ hợp ZmDEF1 từ hạt cây ngô chuyển gen T1 102

DANH M C CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh Sitophilus zeamais Motsch A giai đoạn trưởng thành và

sự khác nhau giữa con đực và con cái (B) 8

Hình 1.2 Hai lớp defensin thực vật 16

Hình 1.3 Cấu trúc của chuỗi polypeptide defensin thực vật 17

Hình 1.4 Cấu trúc không gian của defensin thực vật (VrD2) 18

Hình 1.5 Mô hình mô tả sự phân bố điện tích bề mặt của α-amylase của T molitor (TMA), VrD1, VrD2 và vị trí gắn kết giữa TMA và VrD1 22

Hình 1.6 Biểu đồ biểu thị khả năng ức chế α-amylase từ các nguồn khác nhau của defensin VuD1 23

Hình 1.7 Mô hình mô tả cơ chế ức chế α-amylase của VuD1 24

Hình 1.8 Kết quả phản ứng RT-PCR gen ZmDEF1 ở các mô khác nhau của cây ngô 25

Hình 1.9 Mô hình phương thức hoạt động của nội độc tố Cry trong đường ruột của côn trùng 30

Hình 2.1 Hình thái hạt các giống ngô nghiên cứu 38

Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 41

Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen mang gen ZmDEF1 47

Hình 2.4 Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào phôi non của ngô 55

Hình 3.1 Đồ thị rada biểu thị khả năng kháng mọt của các giống ngô nghiên cứu sau các ngày nhiễm mọt 64

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR nhân gen ZmDEF1 66

Hình 3.3 Trình tự gen ZmDEF1 của các giống ngô nghiên cứu và JF797205 trên Ngân hàng gen Quốc tế 69

Hình 3.4 Trình tự amino acid suy diễn của protein ZmDEF1 ở các giống nghiên cứu và JF797205 trên Ngân hàng gen Quốc tế 69

Hình 3.5 Trình tự gen ZmDEF1 của giống ngô địa phương SL và giống ngô lai LVN99 phân lập từ DNA 71

Hình 3.6 Sơ đồ cấu trúc của gen ZmDEF1 của ngô 71

Hình 3.7 Sơ đồ hình cây thể hiện sự khác biệt di truyền về trình tự nucleotide đoạn mã hoá của gen ZmDEF1 73

Hình 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng HindIII 75 Hình 3.9 Sơ đồ cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 76 Hình 3.10 Kết quả tái sinh và chuyển cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào cây

thuốc lá C9-1 77 Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen

ZmDEF1 trong các cây thuốc lá chuyển gen 79 Hình 3.12 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR nhân gen ZmDEF1

của dòng cây thuốc lá chuyển gen 80 Hình 3.13 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại của các cặp mồi chuẩn bị cho phản ứng Real-time RT-PCR trên dòng cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 81

Hình 3.14 Biểu đồ biểu hiện mức độ biểu hiện của gen ZmDEF1 từ các dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 83 Hình 3.15 Kết quả lai Western các cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 84 Hình 3 16 Hình ảnh định t nh đánh giá khả năng ức chế α-amylase mọt ngô

của protein tái tổ hợp ZmDEF1 từ hạt cây thuốc lá chuyển gen T1 86

Hình 3.17 Hình ảnh tái sinh ngô chuyển gen ZmDEF1 từ phôi ngô non giống

LVN99 vụ hè - thu năm 2016 93 Hình 3.18 Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen chuyển

ZmDEF1 trong các cây ngô chuyển gen thế hệ T0 97

Hình 3.19 Kết quả lai Southern các cây ngô chuyển gen ZmDEF1 99

Hình 3.20 Kết quả lai Western các cây ngô chuyển gen ZmDEF1 thế hệ T1

100

1

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Ngô (Zea mays L.) là một trong những cây ngũ cốc ch nh có năng suất cao và

giá trị kinh tế lớn, góp phần nuôi sống hơn 30% dân số thế giới Ngày nay, trên thế giới cây ngô đứng thứ ba về diện t ch, đứng thứ hai về sản lượng và đứng đầu về năng suất Ngô được dùng để sản xuất ra khoảng 650 mặt hàng khác nhau trong các ngành công nghiệp lương thực, thực phẩm, dược phẩm và công nghiệp nhẹ Ngô góp phần vào việc ổn định sản lượng ngũ cốc trên thế giới và có vai trò quan trọng trong kinh tế và thương mại quốc tế Ở Việt Nam, việc phát triển cây ngô trong thời gian qua đã đạt được nhiều thành tựu, tăng nhanh cả về diện t ch, năng suất và sản lượng; tuy nhiên cũng gặp nhiều thách thức, trong đó có vấn đề sâu hại Đã có nhiều giống ngô lai mới có năng suất cao được đưa vào sản xuất, song xuất hiện những hạn chế về khả năng bảo quản, như dễ bị nấm, mọt… xâm hại trong khi nhiều giống ngô địa phương truyền thống tuy năng suất thấp nhưng khả năng bảo quản sau thu hoạch lại tốt hơn

Mọt ngô (Sitophilus zeamais Motsch.) là loại đa thực, chúng có thể ăn được

hầu hết các loại ngũ cốc, các loại đậu, hạt có dầu và nhiều sản phẩm thực vật khác Thức ăn thích hợp nhất với mọt ngô là hạt ngô Năng suất và chất lượng ngô bị ảnh hưởng nhiều bởi mọt ngô, chúng làm giảm sản lượng sau thu hoạch trung bình

là 20%, có những trường hợp sự phá hại của chúng lên đến 90% trong vòng sáu tháng Ngăn chặn sự tấn công của mọt với ngô hiện nay đang là vấn đề cấp bách trong bảo quản ngô góp phần bảo đảm an ninh lương thực trên toàn thế giới Một

số biện pháp bảo quản ngô sau thu hoạch hiện nay được sử dụng phổ biến là sấy ở nhiệt độ cao để tiêu diệt ấu trùng mọt, vần đảo, trộn bụi trơ, dùng thảo mộc,… Tuy vậy, các biện pháp này tốn nhiều công sức, hiệu quả thấp, giá thành cao Mặt khác, biện pháp dùng thuốc hoá học thì gây ra nhiều mối lo ngại về ô nhiễm môi trường, độc hại tới vật nuôi và con người

Defensin thực vật phân bố rộng rãi trong giới thực vật, có cấu trúc không gian nhỏ, bền, hình cầu với thành phần cơ bản khoảng 45 - 54 amino acid giàu cysteine Defensin là protein đa chức năng, chúng ức chế quá trình dịch mã, ảnh hưởng đến chức năng của kênh màng, làm suy yếu vi sinh vật, tăng cường khả

2

năng chống chịu kẽm, làm thay đổi trạng thái oxy hoá khử ascorbic acid, ức chế protease và đặc biệt ức chế hoạt động α-amylase của côn trùng Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy, defensin phân lập từ đậu xanh, đậu đũa có khả năng ức chế hoạt động α-amylase của ấu trùng mọt đậu xanh và đậu đũa Nhưng sự ức chế của các defensin này với α-amylase từ động vật có xương sống là thấp Vì vậy, đã có nhiều tác giả tập trung nghiên cứu tăng cường khả năng kháng mọt ở đậu, đỗ bằng

sử dụng protein defensin và đạt kết quả cao Tuy nhiên, cho đến nay chưa có những công trình nghiên cứu mở rộng ứng dụng protein defensin với nhiều đối tượng nông sản khác cũng bị thiệt hại lớn bởi mọt hại như ngô

Trong những năm gần đây, biến đổi di truyền đã trở thành một công cụ quan trọng trong nghiên cứu về quá trình cơ bản ở thực vật và trong cải tiến giống cây trồng Kỹ thuật tạo cây chuyển gen đang phát triển nhanh chóng kể từ thành

công đầu tiên trong việc đưa gen ngoại lai vào trong thực vật nhờ A tumefaciens

Cây chuyển gen có những đặc điểm đặc biệt, có thể cải tiến về giá trị về dinh dưỡng, tăng sản lượng, tăng khả năng chống chịu và nhiều đặc t nh ưu việt khác Việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để tạo ra các giống ngô có khả năng kháng mọt cao là vấn đề thực tiễn được đặt ra trong nghiên cứu bảo quản ngô hạt sau thu hoạch

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi xây dựng đề tài luận án là:

“Nghiên cứu đặc điểm và biểu hiện gen liên quan đến tính kháng mọt phân lập

từ cây ngô”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được đặc điểm của gen ZmDEF1 phân lập từ một số giống ngô có khả năng kháng mọt ngô khác nhau Biểu hiện được protein ZmDEF1 tái tổ hợp

(rZmDEF1) ở cây chuyển gen

3 Nội dung nghiên cứu

(i) Đánh giá khả năng kháng mọt của các giống ngô nghiên cứu trong điều kiện lây nhiễm mọt ngô nhân tạo

(ii) Phân tích đặc điểm gen ZmDEF1 của các giống ngô có khả năng kháng mọt

ngô khác nhau

3

(iii) Thiết kế vector chuyển gen chứa ZmDEF1 và đánh giá hoạt động của vector

chuyển gen trên cây thuốc lá ở thế hệ T0 và T1, phân tích khả năng ức chế amylase từ ấu trùng mọt ngô của protetin rZmDEF1

α-(iv) Nghiên cứu tạo cây ngô chuyển gen ZmDEF1 từ giống LC1 và LVN99 Phân

t ch sự biểu hiện gen ZmDEF1 trên cây ngô chuyển gen ở thế hệ T1 và đánh giá hoạt động ức chế α-amylase từ ấu trùng mọt ngô của protein rZmDEF1

4 Những đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống, từ đánh giá khả năng kháng mọt ngô của các giống ngô đến sự phân lập, tách dòng, giải trình tự gen, thiết kế

vector chuyển gen và phân tích biểu hiện gen ZmDEF1 trên cây thuốc lá và cây

ngô chuyển gen

Cụ thể là:

1 Đánh giá khả năng kháng mọt của các giống ngô nghiên cứu đã xác định được giống ngô SL có khả năng kháng mọt ngô tốt nhất và hai giống LC1 và LVN99 có khả năng kháng mọt ngô kém

2) Gen ZmDEF1 (DNA) phân lập từ các giống ngô nghiên cứu có 345 bp, cấu trúc bởi hai exon và một intron ở giữa với 102 bp; gen ZmDEF1 (cDNA) có

243 bp mã hóa cho 80 amino acid

3) Gen ZmDEF1 được biểu hiện thành công trên cây thuốc lá, cây ngô

chuyển gen Protein rZmDEF1 tách chiết từ cây thuốc lá và cây ngô chuyển gen có khối lượng phân tử gần 10 kDa đã biểu hiện chức năng ức chế hoạt động của α-amylase của ấu trùng mọt ngô

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án

Kết quả đạt được của luận án có giá trị khoa học và thực tiễn trong tiếp cận nghiên cứu tăng cường khả năng kháng mọt ngô bằng kỹ thuật chuyển gen

Về mặt khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của

gen ZmDEF1 phân lập từ các giống ngô địa phương và giống ngô lai LVN99, góp phần xác định được cấu trúc gen ZmDEF1 ở ngô thông qua so sánh trình tự

nucleotide phân lập từ cDNA và DNA

4

Phát triển thành công cấu trúc mang gen chuyển ZmDEF1 và sự biểu hiện

chức năng ức chế hoạt động α-amylase từ ấu trùng mọt ngô của protein rZmDEF1

ở cây chuyển gen là cơ sở khoa học cho ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để nâng cao khả năng kháng mọt ngô của cây ngô

Các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học - công nghệ quốc tế và trong nước cùng với các trình tự gen công bố trên Ngân hàng Gen là những tư liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và giảng dạy

Về mặt thực tiễn

Dịch chiết protein của hạt các dòng cây thuốc lá, cây ngô chuyển gen

ZmDEF1 có khả năng ức chế hoạt động của α-amylase từ ấu trùng mọt ngô đã góp

phần giải quyết cơ sở lý luận của vấn đề nâng cao khả năng kháng mọt theo cách

tiếp cận tăng cường biểu hiện gen ZmDEF1 bằng phương pháp chuyển gen Kết

quả này là cơ sở khoa học vững chắc cho hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong nâng cao khả năng kháng mọt của ngô, mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực tiễn tạo giống ngô kháng mọt cao

5

Chương 1 TỔNG QUAN T I LIỆU1.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÂY NGÔ V MỌT NGÔ

1.1.1 Giá trị của cây ngô và tác hại của mọt ngô

1.1.1.1 Giá trị của cây ngô

Cây ngô tên khoa học là Zea mays L., thuộc chi Maydeae, họ hoà thảo (Gramineae), bộ hoà thảo (Graminales) Từ loài Zea mays L., dựa vào cấu trúc nội

nhũ của hạt và hình thái bên ngoài, ngô được phân thành các loài phụ: ngô đá rắn, ngô răng ngựa, ngô nửa răng ngựa, ngô nếp, ngô đường,… Hạt ngô thuộc loại quả dĩnh gồm 4 bộ phận chính: vỏ hạt, lớp aleurone, phôi và nội nhũ Ph a dưới hạt có gốc hạt gắn liền với lõi ngô Vỏ hạt bao bọc xung quanh, màu sắc vỏ hạt tuỳ thuộc vào giống Nằm trong lớp vỏ hạt là lớp aleurone bao bọc lấy nội nhũ và phôi Nội nhũ là bộ phận chính chiếm 70 - 78% khối lượng hạt, thành phần chủ yếu là tinh bột, ngoài ra có chứa protein, lipid, vitamin, khoáng và enzyme để nuôi phôi phát triển [51] Phôi ngô chiếm 8 - 15%, đây là bộ phận cần chú trọng trong quá trình bảo quản [9]

Hạt ngô có giá trị dinh dưỡng cao, chứa tương đối đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho người và gia súc Hàm lượng protein và lipid trong hạt ngô nhiều hơn trong hạt gạo Thành phần chính trong hạt ngô ở Việt Nam là tinh bột (60 - 70%), tập trung chủ yếu ở nội nhũ Hàm lượng tinh bột ở ngô tẻ nhiều hơn ngô nếp và được chia thành tinh bột mềm và tinh bột cứng Ngô nếp được cấu tạo hoàn toàn từ amylopectin nên có độ dẻo hơn ngô tẻ Thành phần dinh dưỡng của các bộ phận khác nhau của hạt ngô cũng khác nhau Thành phần sinh hóa của hạt ngô chịu ảnh hưởng nhiều của đặc điểm về giống, điều kiện khí hậu, đất đai và kỹ thuật canh tác [5]

Tỷ lệ lipid trong hạt ngô là 3,5 - 7%, phần lớn tập trung ở mầm phôi Trong chất béo của ngô có chứa đến 50% linoleic acid liên kết với các glyceride, oleic acid, panmitic acid, rixinic Hàm lượng lipid là một ch tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng hạt Protein của ngô được chia thành ba loại chính: protein hoạt tính (chủ yếu là enzyme), protein cấu tạo và protein dự trữ, trong đó protein dự trữ chiếm tỷ lệ cao nhất Hàm lượng protein dao động từ 8 - 12% tùy thuộc vào giống

6

Tuy nhiên trong hạt ngô thiếu hai loại amino acid quan trọng là lysine và tryptophan Vitamin của ngô tập trung ở lớp ngoài hạt ngô và ở mầm phôi Ngô cũng có nhiều vitamin C, vitamin B (B1, B2, B6, ) Vitamin PP hơi thấp và thiếu tryptophan một amino acid có thể tạo vitamin PP Trong ngô vàng chứa nhiều carotene (tiền vitamin A) [5]

Ngô còn là cây làm thức ăn quan trọng cho gia cầm, gia súc trong phát triển chăn nuôi Trên 70% chất tinh trong thức ăn tổng hợp của gia súc là ngô Thân, lá cây ngô được dùng làm thức ăn xanh hoặc thức ăn ủ chua giàu dinh dưỡng cho gia súc, đặc biệt là bò sữa Từ ngô hạt có thể xay vỡ nuôi gia cầm, nghiền thành bột và chế biến thức ăn cho trâu bò, tôm cá [59], [107]

Ngô được sử dụng nhiều trong công nghiệp như chế biến thực phẩm, công nghiệp nhẹ, Các loại ngô nếp, ngô đường được đóng hộp làm thực phẩm xuất khẩu Bột ngô được dùng để sản xuất cồn, sản xuất đường glucose, làm môi trường nuôi cấy nấm penicillin, sản xuất acetic acid Lõi ngô được chế biến làm chất cách điện, nhựa hóa học, làm giá thể cho trồng nấm, rau, Phôi ngô dùng để

ép dầu, phục vụ trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm Ví dụ, nước Mỹ hàng năm sử dụng 18% tổng sản lượng ngô để sản xuất tinh bột, 37% sản xuất cồn và 5,8% sản xuất bánh kẹo [20], [107]

Toàn thế giới sử dụng khoảng 21% sản lượng ngô làm lương thực Các nước trồng ngô đều sử dụng ngô với mức độ khác nhau Các nước ở Đông Nam Phi sử dụng tới 85% sản lượng ngô làm lương thực cho người, các nước Tây Á khoảng 27%, các nước Đông Nam Á dùng 30%, các nước Trung Mỹ và Caribe dùng 61%, các nước châu Âu sử dụng 14% [13] Mức tiêu thụ ngô bình quân trên đầu người hàng năm thay đổi đáng kể, nhiều nước có mức tiêu thụ cao hơn so với mức tiêu thụ bình quân đầu người trung bình của thế giới, như Kenya 103 kg, Zimbabwe

153 kg, Zambia 168 kg và Malawi 181 kg [53]

Ở Việt Nam, ngô đã được trồng từ lâu đời và trở thành cây lương thực quan trọng thứ hai sau cây lúa và là cây màu số một về năng suất Năm 1990, năng suất ngô nước ta mới ch bằng 34% so với trung bình thế giới, năm 2000 bằng 59,8% thì đến năm 2014 đạt hơn 80% với năng suất 44,1 tạ/ha Thành tựu nhảy vọt này

có được là do việc tạo được các giống ngô lai và mở rộng diện tích trồng ngô lai

7

trong sản xuất, kết hợp áp dụng các biện pháp kỹ thuật canh tác hiện đại Tuy nhiên, ngành ngô Việt Nam còn gặp nhiều thách thức Dù diện t ch, năng suất, sản lượng đều tăng nhanh so với mức bình quân chung của thế giới nhưng năng suất ngô vẫn còn thấp Trong khi đó nhu cầu sử dụng ngô của Việt Nam ngày càng lớn Sản lượng ngô trong nước không đủ phục vụ cho con người và phát triển ngành chăn nuôi Hàng năm, Việt Nam vẫn phải nhập khẩu lượng lớn ngô để chế biến thức ăn gia súc trị giá trên 500 triệu USD) Vì vậy, việc nghiên cứu để tạo các giống ngô có năng suất cao, khả năng chống chịu tốt, đồng thời đáp ứng yêu cầu chất lượng là nhiệm vụ rất quan trọng và cấp thiết đối với các cơ quan nghiên cứu, chọn tạo giống

1.1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh thái, chu kỳ sống và lây nhiễm của mọt ngô

Mọt ngô phân bố phổ biến ở hầu khắp các nước trên thế giới, gây hại đáng

kể ở những vùng ấm áp, nhất là ở Châu Á, vùng Địa Trung Hải (Châu Âu) và Bắc

Mỹ Ở nước ta, có thể gặp mọt hại ngô ở tất cả các địa phương, chúng có mặt trong 100% kho bảo quản ngô [1], [64]

Về hình thái, ở giai đoạn trưởng thành mọt ngô rất giống mọt gạo (Sitophilus

oryzae), vì thế trong phân loại trước đây đã có ý kiến cho rằng mọt ngô và mọt gạo

là cùng loài nhưng khác tên [36] Cho đến nay, mọt ngô được xem như một loài riêng biệt, rất gần với mọt gạo Giai đoạn trưởng thành, mọt ngô có k ch thước

cơ thể 3,5 - 5 mm (Hình 1.1 A) Cánh trước trơn bóng và các điểm màu đỏ tròn cánh khá rõ Các lỗ chấm trên tấm lưng ngực trước thô và dày ở ph a trước Mọt ngô có cánh màu nâu, đen bóng Các điểm vá màu vàng đỏ hình bán nguyệt rất rõ [50], đây là hình ảnh dễ quan sát nhất để phân biệt biệt mọt ngô và mọt gạo [106] Mọt ngô đực và cái ở giai đoạn trưởng thành có hình dạng rất giống nhau, chúng phân biệt nhau bởi hình dạng của bụng (Hình 1.1.B Con đực có bụng thuôn dài, hơi cong xuống trên mặt phẳng ngang, cánh chùm gần hết bụng Con cái, bụng hình bầu hơn, nằm ngang trên mặt phẳng và cánh dài hơn, chùm hết phần bụng [82]

Thức ăn có ảnh hưởng rất lớn đến đời sống của mọt ngô, trong cùng một điều kiện độ nhiệt và độ ẩm như nhau, nuôi mọt ngô bằng thức ăn khác nhau đã thu

8

được kết quả như sau: khi nuôi bằng ngô hạt, thời gian vòng đời của mọt là 34 ngày; khi thay bằng loại thức ăn khác là gạo, thời gian vòng đời sẽ là 47 ngày; thóc là 53 ngày [85]

Hình 1.1 Hình ảnh Sitophilus zeamais Motsch (A) giai đoạn trưởng thành và

sự khác nhau giữa con đực và con cái (B)

(Nguồn: Hình A Proctor, (1971) [106], hình B Maceljski và cs (1973) [82])

Nhiệt độ môi trường ảnh hưởng lớn đến chu kỳ sinh trưởng của mọt ngô Mỗi con cái trưởng thành có khả năng đẻ 300 - 400 trứng và sống 5 - 8 tháng Chu kỳ sống khoảng 5 tuần ở 300C và độ ẩm 70%, điều kiện tối ưu cho sự phát triển của mọt ngô ở nhiệt độ từ 27 - 310C với độ ẩm hơn 60%; ở nhiệt độ dưới 170C thì mọt ngừng phát triển [67] Ở nhiệt độ 0ºC, mọt có thể sống được 37 ngày, ở -5ºC mọt chết sau 23 ngày, còn ở -10ºC thì mọt sẽ chết sau 13 ngày Ở 55ºC, mọt chết sau 6 giờ, ở 60ºC chết sau 2 giờ Trong điều kiện độ nhiệt 25ºC mọt có thể sống không có thức ăn 18 - 26 ngày [129] Như vậy có thể thấy, Việt Nam là vùng có nhiệt độ thích hợp với sinh trưởng của mọt ngô, do đó số lứa trong năm của mọt là cao

Thời gian phát triển hoàn ch nh cho chu kỳ sống của mọt ngô trung bình 36 ngày Giai đoạn trứng có đặc điểm: dài 0,5 - 0,7 mm, rộng 0,25 - 0,3 mm, hình bầu dục hơi dài màu trắng sữa Giai đoạn sâu non (ấu trùng): khi đã lớn dài 3-3,2 mm, rất mập, lưng cong lại như hình bán nguyệt, mặt bụng tương đối bằng, chân không phát triển Toàn thân màu sữa đến màu nâu nhạt Chúng bắt đầu ăn ngay ở trong hạt Giai đoạn nhộng: có chiều dài khoảng 3 - 4 mm, hình bầu dục, cân đối 2 đầu,

9

lúc đầu màu vàng sữa sau chuyển sang màu vàng nâu Chúng cắn một lỗ nhỏ và vũ hoá bay ra ngoài thành mọt trưởng thành [106] Mọt trưởng thành có thể sống từ 5 đến 8 tháng Khi mọt trưởng thành chui ra khỏi bề mặt ngô hạt, những con cái di chuyển đến một bề mặt cao và tiết ra pheromone để dẫn dụ con đực Con đực sau

đó được thu hút bởi pheromone này sẽ di chuyển đến chỗ con cái để giao phối [105]

Khi đẻ trứng, mọt ngô cái dùng vòi khoét một lỗ sâu vào hạt, rồi đẻ một quả trứng vào những lỗ này, sau đó tiết ra một thứ dịch nhày để bít kín lỗ đó lại Sâu non nở ra ăn ngay trong hạt và lớn lên, làm hạt ch còn lại một lớp mỏng, nhưng nhìn bề ngoài tưởng như vẫn còn nguyên vẹn [106] Mỗi con cái đẻ một quả trứng vào một hạt ngô, nhưng trong một hạt ngô có thể có nhiều quả trứng khác nhau Trong trường hợp này, do lượng thức ăn trong một hạt ngô có hạn nên ấu trùng mọt ngô có tập tính cạnh tranh nhau Thường là ch có một ấu trùng được phát triển thành nhộng và trưởng thành [93]

Mọt ngô là loài gây hại phổ biến và là dịch hại nguyên phát Mọt gây hại trên bắp và hạt ngô ngay giai đoạn ngô ch n sáp ngoài đồng, chúng theo ngô vào kho và gây hại liên tục trong suốt quá trình bảo quản T nh ăn của loài mọt này khá phức tạp vì mọt ngô thuộc loại đa thực, nó có thể ăn hầu hết các loại ngũ cốc thô hoặc chế biến như lúa mì, yến mạch, lúa mạch, lúa miến, lúa mạch đen, các loại đậu, hạt có dầu, hạt bông và nhiều sản phẩm thực phẩm khác Nhưng thức ăn ưa thích của mọt ngô là ngô hạt Trong kho, mọt hoạt động nhanh nhẹn, hay bay, bò và có tính giả chết, chúng thích bò lên các vị tr cao trong đống hạt Khi gặp điều kiện độ nhiệt cao, mọt thường tập trung vào kẽ kho, mép bao,… để ẩn nấp [89], [116]

Lây nhiễm và gây hại ngoài đồng của mọt ngô do mọt trưởng thành sẽ đẻ trứng trong hạt ngô từ trước khi thu hoạch nên nhiều ngô bắp đã bị ăn rỗng trước khi đưa vào bảo quản, đặc biệt là những giống ngô cho năng suất cao và lá bi không che phủ được hết bắp ngô [93] Theo Nguyễn Kim Hoa và cs (2008), mọt ngô là loài gây hại nguyên phát, xuất hiện và gây hại rất sớm Ngay từ giai đoạn ngô chín sáp ở ngoài đồng, mật độ của loài này trên giống ngô địa phương và giống ngô lai tương ứng là 0,07 và 0,21 con/bắp Sau 12 tháng bảo quản, mật độ của mọt ngô trên các giống nêu trên đạt tương ứng là 34,13 và 44,2 con/bắp Trong

10

suốt thời gian bảo quản, mọt ngô luôn chiếm ưu thế trong mật độ chung của các loài mọt, đặc biệt là trong 6 tháng đầu [4]

Cũng giống như ngoài tự nhiên, các loài thiên địch cũng có vai trò điều hoà

số lượng các loài sâu hại Vì thế có nhiều tác giả quan tâm điều tra thành phần loài thiên địch của côn trùng gây hại trong kho bảo quản ở Việt Nam Hiện nay đã phát hiện 7 loài thiên địch trên côn trùng gây hại đậu đỗ bảo quản sau thu hoạch, trong

đó có 3 loài ong ký sinh và 4 loài bắt mồi thuộc 2 lớp côn trùng và lớp nhện Các loài thiên địch đều là các loài đa thực, phổ biến trong các kho bảo quản, song với

số lượng không lớn vì vậy khó có thể sử dụng chúng như một tác nhân phòng chống sinh học Do đó, hiện nay rất ít công trình nghiên cứu về nhân nuôi và sử dụng thiên địch trong phòng chống côn trùng gây hại trong kho Thực tế, rất ít kỳ vọng vào việc nhân nuôi, sử dụng các loài thiên địch này mà ch cố gắng bảo vệ và khích lệ vai trò có ích của chúng như một tác nhân tự nhiên trong các kho bảo quản nông sản [1]

1.1.1.3 Tổn thất do mọt ngô

Mọt ngô là dịch hại chính của ngô hạt trong kho lưu trữ và ngoài đồng ruộng Chúng có mặt trong 100% kho bảo quản ngô Mọt ngô xâm nhập vào trong hạt ngô và tấn công phôi ngô trước rồi đến các bộ phận khác, hạt ngô sau đó thành trống rỗng và giá trị dinh dưỡng giảm, tỷ lệ nảy mầm thấp và ảnh hưởng lớn đến giá thành các sản phẩm trên thị trường [11]

Ở Châu Phi, đã cảnh báo biện pháp để đảm bảo an ninh lương thực là giảm thiểu thiệt hại của các loại ngũ cốc do côn trùng gây ra, theo ước tính ở Châu Phi mỗi năm thiệt hại 4 tỷ USD tổn thất ngũ cốc do côn trùng Tác hại của mọt ngô là một vấn nạn ngày càng nghiêm trọng ở châu Phi Sản lượng ngô bị giảm trầm trọng bởi mọt ngô trong các kho lưu trữ với các mức độ khác nhau, gây ra những

cú sốc về thực phẩm Thiệt hại trên toàn thế giới do mọt ngô mọt ngô dao động từ

20 - 90%, tuỳ thuộc vào giống ngô khác nhau, vùng khác nhau và phương thức bảo quản khác nhau [97]

Bergvinson và cs (2004) nhận thấy tỷ lệ hao hụt ngô trong kho bảo quản là 20%, trong đó do mọt ngô gây thiệt hại lên đến 15% của một vụ thu hoạch trong

11

vài tháng và làm giảm chất lượng ngô hạt [20] Một số tác giả đã nghiên cứu tỷ lệ thiệt hại do mọt ngô gây ra cũng cho biết mọt làm 20% giảm khối lượng ngô lai được lưu trữ trong các kho bảo quản tốt, giảm 40% trong các kho dự trữ thường và 80% thiệt hại ở các nông trại ở vùng nhiệt đới [36]

Những thiệt hại do mọt hại ngô gây ra bao gồm giảm khối lượng, giảm dinh dưỡng và tổn thất kinh tế do phải bán giá thấp,… Tổn thất do mọt hại gây ra liên quan chặt chẽ đến thời gian bảo quản ngô trong kho và mật độ của mọt Tadele và

cs (2011) đã sàng sạch, sấy khô 12% độ ẩm và đã được hun với phostoxin trong

7 ngày để tiêu diệt hết trứng, ấu trùng các loại sâu hại trong hạt Sau đó các mẫu ngô này dùng để nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ mọt và thời gian bảo quản đến

sự giảm khối lượng ngô hạt do mọt gây ra Với mật độ 50 con/200g ngô hạt sau

30, 60 và 90 ngày lưu trữ khối lượng ngô hạt giảm tương ứng là 1,4%, 1,5% và 6,9% Mật độ côn trùng có xu hướng gia tăng sau các ngày bảo quản và có sự khác biệt về số lượng côn trùng đáng kể khi mật độ đầu tiên là 5 con/200g ngô hạt và 45-50 con/200g ngô hạt sau 90 ngày bảo quản [123]

Khảo sát của Ostrem và cs (2016) cho thấy có sự gia tăng tỷ lệ hao hụt do mọt hại gây ra ở ngô lưu trữ trong kho bảo quản từ 7 đến hơn 30% trong thời gian

6 - 9 tháng bảo quản [102] Tadele và cs 2013 đã xác định khả năng gây hại của mọt đối với 22 giống ngô lai Kết quả cho thấy các giống ngô khác nhau thì mức

độ thiệt hại khác nhau, sau 56 ngày thí nghiệm, mức độ thiệt hại dao động từ 3,2 đến 22,3% [125]

Ở Việt Nam, mọt ngô là một đối tượng nguy hiểm, có khả năng sinh sản mạnh, một con mọt cái đẻ trung bình 376,82 trứng Mọt ngô có độ thường gặp cao, 100% trong các kho bảo quản ngô và 26,67 % trong các kho bảo quản đậu đỗ [96] Theo nghiên cứu của Chuong và cs (2003) cho thấy tổn thất sau thu hoạch của ngô 15%, cá biệt có nơi đến 20% và do mọt ngô từ 5,7 - 6,5% và giá bán giảm 20% [32]

1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, hóa sinh của ngô liên quan đến tính kháng mọt ngô

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý liên quan đến khả năng kháng mọt của ngô

Việc sử dụng rộng rãi các loại thuốc trừ sâu hoá học cho việc bảo quản nông

12

sản, đã gợi lên mối lo lắng toàn cầu do mối nguy hiểm đến môi trường, phát triển của côn trùng gây hại kháng với hoá chất, dư lượng hoá chất trong nông sản tác động đến côn trùng thiên địch, gây ngộ độc đến gia súc, gia cầm và con người [98] Hướng nghiên cứu chọn, tạo giống cây có khả năng kháng sâu hại đang là vấn đề cấp thiết để bảo vệ cộng đồng và đảm bảo an ninh lương thực cho toàn cầu hiện nay [81]

Nhiều tác giả đã quan tâm đến nghiên cứu khả năng kháng mọt hại của ngô

để tìm mối quan hệ về đặc điểm của hạt ngô với tính kháng và mẫm cảm với mọt ngô [12], [94] Một số tác giả khẳng định khả năng kháng mọt ngô của ngô liên quan đến đặc điểm sinh lý, hoá sinh của giống ngô [10] Theo Osipitan và cs (2007) thì màu sắc của hạt, hình dạng, k ch thước, độ cứng, hàm lượng protein, độ

ẩm, đường và phenol của hạt ngô là những đặc điểm liên quan đến tính kháng mọt [101] Garcia và cs (2004) ch ra rằng hàm lượng phenolic acid, protein, cấu trúc

và kết cấu của vỏ hạt liên quan đến khả năng kháng mọt [45]

Màu sắc của hạt ngô khá đa dạng từ màu trắng, màu vàng, màu đỏ, màu tím sang màu đen Nhiều tác giả đã nghiên cứu mối quan hệ giữa màu sắc của hạt ngô với khả năng kháng mọt và ch ra rằng màu sắc của hạt ngô khác nhau là do kiểu gen khác nhau, chúng có khả năng kháng mọt khác nhau [11] Luke và cs (2015)

đã nghiên cứu 20 giống ngô có màu sắc khác nhau gồm: màu trắng, màu đỏ, màu vàng và màu đỏ vàng Kết quả cho thấy đến 83,33% các kiểu gen quy định hạt màu trắng có khả năng kháng cao với mọt ngô Có thể, độ sáng của màu trắng đã đẩy lùi mọt hại tiếp xúc với hạt ngô [81]

Kết quả nghiên cứu về độ nhám của bề mặt hạt ngô cho thấy, hạt ngô có bề mặt trơn nhẵn hay xù xì thì khả năng kháng mọt của chúng không khác nhau đáng

kể Có thể bề mặt của hạt ngô không ảnh hưởng đến khả năng tiếp xúc và xâm nhiễm của mọt [57], [81]

Nhiều tác giả đã nghiên cứu mối liên hệ giữa chiều dài hạt, chiều rộng hạt, khối lượng và độ cứng của hạt với khả năng kháng mọt Kết quả các nghiên cứu này cho thấy hạt có k ch thước lớn hơn thì các ch số kháng sự xâm nhiễm của mọt tốt hơn và tỷ lệ thiệt hại do mọt gây ra thấp hơn [83] Nhưng kết quả nghiên cứu của Tongjura và cs (2010), thì cho rằng hạt nhỏ, độ cứng cao, hình dáng nhỏ gọn,

Silverio và cs 2014 đã lựa chọn từ các giống ngô có khả năng kháng mọt cao và tạo ra được giống P84 mới có khả năng kháng tốt với mọt ngô Sau đó ông

đã phân t ch các ch số sinh lý, hoá sinh, kết quả cho thấy giống P84 có độ cứng tăng 10% và tỷ lệ của vỏ hạt tăng 68% so với giống gốc [116]

Như vậy đã có nhiều công trình nghiên cứu khả năng kháng mọt ngô liên quan đến đặc điểm hình thái và sinh lý của hạt ngô Tuy nhiên chưa có tác giả nào nghiên cứu ngô có kiểu gen quy định hạt màu tím hoặc màu đen, màu sắc rất có thể có lợi cho đặc tính kháng mọt ở ngô

1.1.2.2 Đặc điểm h a sinh liên quan đến khả năng kháng mọt của hạt ngô

Ngoài các đặc điểm hình thái, sinh lý liên quan đến khả năng kháng mọt, các ch tiêu sinh hoá cũng được nhiều nhà khoa học quan tâm từ rất sớm Kumar (1984) đã đưa ra mối tương quan giữa thành phần hoá học của ngô với tính kháng mọt ngô (Bảng 1.1) Hàm lượng protein, tinh bột trong hạt ngô càng cao thì khả năng kháng mọt của ngô càng thấp và ngược lại giống ngô nào có hàm lượng chất

xơ, pheonlic acid và chất ức chế tripsin càng cao thì khả năng kháng mọt của giống ngô đó càng cao [66]

Theo Demissie và cs (2008) cho rằng các giống ngô lai hiện nay đến 95% khả năng kháng mọt thấp bởi hàm lượng tinh bột cao và vỏ bao bọc lại mỏng [33] Thành phần hoá học của vỏ hạt, độ dày vỏ hạt ngô là thông số quan trọng liên quan đến khả năng kháng mọt hại ngô Giống ngô có độ dày vỏ hạt ngô cao thì có khả năng ngăn cản sự xâm nhiễm của mọt hại cao Kết quả này làm cơ sở cho

14

nghiên cứu khả năng kháng mọt của các giống ngô khác nhau [12]

Bảng 1.1 Mối tương quan giữa các thành phần hoá học với tính kháng mọt

Phenolic acid - 0,764 Cơ sở cho tính kháng

Ức chế trypsin - 0,814 Cơ sở cho tính kháng

(Nguồn: Kumar (1984) [66])

Luke và cs 2015 đã nghiên cứu hàm lượng protein, tinh bột, hàm lượng sợi, chất khoáng, pholic acid, ức chế trypsin của vỏ hạt của 10 giống ngô khác nhau để xác định mối liên hệ giữa các thành phần hoá học của vỏ hạt với khả năng kháng mọt của 10 giống ngô nghiên cứu [81] Kết quả cho thấy, thành phần hoá học của vỏ hạt của các giống ngô nghiên cứu có sự khác biệt đáng kể Thành phần hoá học của vỏ hạt của giống ngô kháng mọt tốt nhất (giống TZBRELD3C5) và kém nhất (giống PVASYN-3F2) cho thấy, hàm lượng protein, tinh bột, chất khoáng trong vỏ hạt của giống PVASYN-3F2 cao hơn giống TZBRELD3C5 Hàm lượng chất xơ, phenolic acid, chất ức chế trypsin của giống TZBRELD3C5 cao hơn giống PVASYN-3F2 Như vậy, hàm lượng protein, tinh bột trong hạt hay vỏ hạt là thành phần làm giảm khả năng kháng mọt của ngô Còn hàm lượng chất xơ, phenolic acid, chất ức chế trypsin là các chất làm tăng khả năng kháng mọt Ichiro

và cs 2009 đã giải thích, do mọt sử dụng tinh bột và protein trong hạt làm thức

ăn để sinh trưởng và phát triển, nên khi không tiêu hóa thức ăn được quá trình sinh trưởng, phát triển của mọt bị ngừng trệ [60] Garcia và cs (2004) cũng đã khẳng định phenolic acid của vỏ ngũ cốc làm cơ sở cho khả năng kháng với sâu hại ngô [45]

Thực vật đã tự sản xuất ra các chất ức chế protease để bảo vệ mình và

15

chống lại sự tấn công của côn trùng Những chất cản trở sự trao đổi chất, dinh dưỡng của côn trùng bằng ức chế các enzyme tiêu hóa của chúng có ý nghĩa lớn trong kháng mọt hại [60] Các cơ chế kháng này cũng tương đồng với nghiên cứu Munyiri và cs (2013) về cơ chế kháng mọt trong kho lưu trữ ngô và gạo [92] Các chất ức chế proteinase có khả năng can thiệp vào quá trình tiêu hoá protein côn trùng bằng cách gắn vào trung tâm hoạt động của protease tiêu hoá, dẫn đến sự thiếu hụt amino acid ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và phát triển, khả năng sinh sản và sự sống sót của mọt [43]

Các chất ức chế α-amylase được sử dụng như một công cụ trong việc nâng cao khả năng kháng mọt của cây trồng bởi khả năng ức chế sự tiêu hoá tinh bột của chúng Rất nhiều protein có khả năng ức chế hoạt động của α-amylase của côn trùng phân lập từ thực vật đã được một số tác giả chứng minh là một hệ thống sinh học quan trọng việc kiểm soát côn trùng gây hại Biểu hiện của các chất ức chế α-amylase đã có hiệu quả kháng mọt trong cây chuyển gen Như chuyển gen quy định tổng hợp protein αAl-I có khả năng kháng bọ cánh cứng (Coleoptera:

Bruchidae) vào đậu hà lan (Pisum sativum L và đậu azuki (Vigna anguralis L.)

[117] Cây đậu hà lan và đậu azuki chuyển gen có khả năng ức chế α-amylase do biểu hiện protein tái tổ hợp α-AI, các cây chuyển gen có khả năng kháng mọt đậu

hà lan (Bruchus pisorum) và mọt đậu xanh (Callosobruchus chinensis) [91]

Protein ức chế α-amylase từ lúa mạch biểu hiện trong hạt thuốc lá chuyển gen

(Nicotiana tabacum) gây chết đến 74% đối với mọt hại bông (Anthonomus

grandis) [35]

Nhiều protein ức chế α-amylase của côn trùng cũng đã được thử nghiệm

chức năng kháng mọt in vitro như protein defensin VuD1 của cây đậu đũa Vigna

unguiculata) có khả năng ức chế tiêu hóa tinh bột của mọt đậu cô ve

(Acanthoscelides obtectus) mọt đậu Mexico (Zabrotes subfasciatus) Defensin VrD1 từ cây đậu xanh (Vigna radiata) có khả năng kháng mọt bột vàng (Tenebrio

molitor) [67]

Như vậy, nghiên cứu, sử dụng, tạo cây trồng chuyển gen chứa các protein

có khả năng ức chế sự tiêu hóa của côn trùng đặc biệt là ức chế hoạt động của amylase là một hướng tạo cây trồng kháng mọt bền vững Đã có nhiều cây chuyển

α-16

gen được nghiên cứu để tăng cường khả năng kháng mọt hại ở cây họ Đậu, tuy

nhiên nghiên cứu tạo cây ngô chuyển gen có khả năng kháng mọt ngô (Sitophilus

zeamais Motsch.) còn chưa được quan tâm nhiều

1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA DEFENSIN TH C VẬT

1.2.1 Cấu trúc, chức năng của defensin thực vật

ch nh có điểm đẳng điện (pI) bằng 3,1 Lớp này không có nhân tố tín hiệu rõ ràng

17

cho quá trình biến đổi sau dịch mã [70]

Lớp defensin thứ 2 gồm các protein có tiền protein lớn hơn do có thêm trình

tự amino acid ở vùng đuôi C với 33 amino acid (C-terminal prodomain - Hình 1.2B) Một giả thuyết về chức năng của trình tự đuôi C C-terminal liên quan đến tín hiệu điều ch nh sau dịch mã và bị phân hủy sau dịch mã [70]

Vùng chức năng hay vùng cơ bản của defensin có điểm đẳng điện (pI) bằng

9 Vùng này bao gồm 45 - 55 amino acid, chứa 8 gốc cystein tạo nên 4 cầu nối

disunfide, giúp cho cấu trúc không gian ba chiều ổn định với dạng CSαβ (dạng chứa cầu nối disunfide giữa các cystein của xoắn α và nếp gấp β) đặc trưng cho

defensin thực vật [26] Các defensin thực vật khá đa dạng tương ứng với vị trí khác nhau của các amino acid cũng như nhóm 8 gốc cystein [37] Sự khác biệt trong cấu trúc bậc nhất dẫn tới các hoạt tính sinh học khác nhau đối với các loại defensin này

Protein defensin thực vật gồm ba phiến gấp β và một chuỗi xoắn α, chúng được giữ vững bởi 4 cầu nối disunfide Cầu nối disulfide thứ tư có chức năng nối đầu N và C tạo ra một cấu trúc protein ổn định [71] Nicole và cs 2013 đã phân tích 139 trình tự amino acid của defensin thực vật và xác định được vị trí cystein

và tạo 4 cầu nối disulfide giữa các cystein như sau: Cys1 – Cys8, Cys2 – Cys5, Cys3 – Cys6, Cys4 – Cys7 Giữa các cystein nối với nhau tạo ra 7 loop (vòng lặp) trong cấu trúc (Hình 1.3) [95]

Hình 1.3 Cấu trúc của chuỗi polypeptide defensin thực vật

18

3 nó liên quan đến hoạt tính sinh học của defensin [67], [95]

Hình 1.4 Cấu trúc không gian của defensin thực vật (VrD2)

(A: mặt trước, B: mặt sau, màu xanh: phiến gấp β, màu đỏ xoắn α, màu vàng hình

ở hình B: cầu nối disunfide, VrD2: defensin của đậu xanh)

(Nguồn: Hình A Feng Lin và cs (2007) [67], hình B Nicole và cs (2013) [95])

1.2.1.2 Chức năng của defensin thực vật

Defensin thực vật là protein đa chức năng, chúng có tác dụng ức chế sự sinh trưởng của nấm, kháng vi khuẩn; ức chế trypsin, α-amylase, ức chế tổng hợp protein; tăng khả năng chịu kim loại nặng; ảnh hưởng đến chức năng kênh ion, ức chế quá trình dịch mã, thay đổi trạng thái oxy hóa khử ascorbic acid

Ức chế dịch mã in vitro

Hoạt tính sinh học đầu tiên của defensin thực vật là ức chế quá trình dịch mã

in vitro được mô tả bởi Mendez và cs 1990 , đó là một peptide được phân lập từ

nội nhũ lúa mạch γ-hordothionin, đã được chứng minh có tác dụng ức chế quá trình dịch mã ở gan chuột Một peptide khác sau đó được chiết xuất từ nội nhũ lúa mạch và đặt tên ω- hordothionin, cũng có khả năng ức chế quá trình dịch mã trong

gan chuột, gan thỏ và trong hệ thống prokaryote (Escherichia coli) [88]

Cơ chế ức chế quá trình dịch mã in vitro của defensin đang được bàn luận

Một số nghiên cứu cho thấy ở nồng độ cao, defensin lúa mạch gây phosphoryl hoá một tiểu đơn vị trong chuỗi polypeptide của 2 nhân tố khởi đầu eIF-2α ở eukaryote, có lẽ là do sự hoạt hoá eIF-2α kinase Nên đây có thể là lý do giải thích cho việc suy yếu các giai đoạn khác nhau của tổng hợp protein [26]

Ức chế protease

19

Hai defensin tương đồng được phân lập từ hạt của Cassia fistula (muồng

hoàng yến , được biết đến với đặc tính chống côn trùng Đó là defensin 5459, có tác dụng ức chế trypsin Còn peptide thứ 2 là defensin 5144, không có khả năng ức chế trypsin Defensin 5459 khác với 5144 ch bởi vài amino acid, trong đó sự thay đổi ở amino acid thứ 25 trong chuỗi peptide, ở defensin 5144 là Thrcòn defensin 5459 là Lys Khi Lys trong defensin đã được xác định là có liên quan đến các hoạt động ức chế proteinase Với chức năng sinh lý này, 5459 có thể góp phần giúp cây trồng có khả năng chống lại côn trùng bởi khả năng ức chế tiêu hoá côn trùng Cơ chế của khả năng ức chế trypsin được giải thích với defensin Cp-thionin là nó có thể liên kết với trypsin của côn trùng, do đó ức chế tiêu hóa protein của côn trùng [87]

Kháng vi sinh vật

Chức năng sinh học kháng vi sinh vật của defensin thực vật đã được quan tâm ngay từ những năm đầu thập niên 1990 bởi Terras và cs [126]

Khả năng kháng vi sinh vật được quan tâm nhiều là khả năng kháng nấm

[79] Defensin phân lập từ lá của Spinacia oleracea (cải bó xôi) có khả năng ức chế vi khuẩn C michiganensis (vi khuẩn gây thối cà chua), vi khuẩn P

solanacearum (vi khuẩn gây bệnh héo rũ ở cà chua, khoai tây, ) ở nồng độ dưới

20 mM [139]

Rất nhiều loài nấm gây bệnh ở cây trồng bị ức chế sinh trưởng bởi defensin

thực vật như: Alternaria brassicola (gây bệnh đốm vòng), A solani gây héo rũ ở

cà chua), Botrytis cinerea (gây bệnh thối xám), Cladosporium colocasiae (gây bệnh đốm mốc), Verticilium dahliae (gây bệnh thối rễ), và một số loài nấm gây bệnh ở người như Candida albicans Nồng độ ức chế tuỳ thuộc và loài nấm và loại defensin khác nhau Ví dụ, F culmorumwas bị ức chế bởi Ah-AMP1 (defensin phân lập từ loài Aesculus hippocastanum) ở nồng độ 12 mg/ml và bởi Rs-AFP2I (defensin phân lập từ hạt loài R sativus) ở nồng độ 1,5 mg/ml, loài R solani bị ức

chế bởi TvD1 (defensin phân lập từ cây cốt khí) ở nồng độ 100 mg/ml [119], [128] Defensin ức chế sự tăng trưởng của nấm bằng cách tương tác với lipid trên màng sinh chất ngăn cản sự phân chia của tế bào nấm hoặc defensin cạnh tranh để liên kết với sphingolipid trên màng của nấm, gây ức chế sinh trưởng của nấm [95]

20

Khả năng chịu kẽm

Hiện nay, tình trạng ô nhiễm kim loại nặng đang trở nên phổ biến ở nhiều khu vực do hoạt động sản xuất của con người Trong đó, đáng chú ý là hiện tượng

bị nhiễm kẽm, chì, đồng,… Các tác giả đã biểu hiện cDNA của cây Arabidopsis

halleri trong nấm men S.cerevisiae và lựa chọn các chủng chịu kẽm bằng cách ủ

chúng vào một môi trường có chứa nồng độ độc hại của các kim loại Chín trình tự cDNA đã được lựa chọn và kết quả dịch mã cho thấy các trình tự này mã hoá cho

bốn peptide tương đồng với defensin thực vật Biểu hiện của defensin trong nấm men và A halleri được thúc đẩy khi cây t ch lũy lượng kẽm lớn [95] Tuy nhiên,

cơ chế liên quan đến khả năng chịu kẽm của defensin thực vật vẫn còn là vấn đề đang được bàn luận

Liên quan đến trạng thái oxi hoá khử ascorbic acid

Defensin SPD1 được nhân dòng từ củ khoai lang (Ipomoea batatas được

xem như một enzyme SPD1 có khả năng khử dehydroascorbate (DHA) tới ascorbic acid (AsA) với sự có mặt của glutathione Tuy nhiên, khi thiếu glutathione SPD1 có hoạt tính DHA-reductase rất thấp và AsA bị oxi hóa bởi AsA-oxidase tạo monodehydroascorbate MDA MDA cũng được khử bởi SPD1 tới AsA với sự có mặt của NADPH bởi MDA-reductase Những dữ liệu này cho thấy, SPD1 có cả hai hoạt tính là DHA-reductase và MDA-reductase Vì vậy, chức năng của SPD1 là quy định trạng thái oxi hoá khử của AsA Điều này có ý nghĩa đối với

tế bào thực vật, giúp cho cây loại bỏ được các gốc oxy hoạt hóa, tránh được tình trạng bị stress oxy hóa [58]

Khoá kênh ion

Kushmerick và cs (1998) là những tác giả đầu tiên mô tả sự ức chế kênh natri của tế bào động vật có vú GH3 bởi hai defensin phân lập từ hạt ngô, γ1- zeathionin ở nồng độ 33 mM, và γ2-zeathionin ở nồng độ 62 mM Defensin có thể tác động làm thay đổi điện thế hoạt động của kênh ion bằng cách giảm số lượng kênh ion mở hoặc giảm số lượng các kênh mở trong bước nhảy thế [68] Các tác giả này cũng đã chứng minh, các kênh ion kali không bị thay đổi dưới tác động của defensin [16]

21

Spelbrink và cs 2004 , đã nghiên cứu ảnh hưởng của MsDEF1 (defensin

của loài M truncatula) đến hoạt động của kênh ion canxi Kết quả cho thấy có tới

90% kênh ion này bị đóng bởi MsDEF1 Các tác giả cũng giải thích nguyên nhân MsDEF1có thể ngăn chặn kênh ion canxi có thể là do MsDEF1 có cấu trúc giống protein KP4, một chất có khả năng ngăn chặn kênh ion canxi [122]

1.2.2 Cơ chế ức chế α-amylase của defensin thực vật

Trong tự nhiên, thực vật có thể sản sinh ra vô số các chất để chống lại sâu, bệnh gây hại Chúng bao gồm các phân tử carbohydrate, polyanions và một số protein bảo vệ như chitinases, β-1,3-glucanases, lectin, α và β-thionins, defensin

và một số chất ức chế tiêu hóa enzyme [102], [113]

Ba loại defensin đó là SIα1, SIα2 và SIα3 (defensin của hạt cao lương có khả năng ức chế sự tiêu hoá của côn trùng bởi sự ức chế hoạt động α-amylase Ba defensin này cũng thể hiện hoạt động chống lại nấm và ức chế yếu α-amylase trong tuyến nước bọt của người Nhưng α-amylase từ tuyến tuỵ lợn, lúa mạch và vi khuẩn không bị ức chế bởi các defensin này Defensin γ-Hordothionin của nội nhũ lúa mạch cũng đã được chứng minh là có khả năng ức chế α-amylase γ-Hordothionin ức chế α-amylase từ nước bọt của người nhưng không có hiệu quả

ức chế α-amylase của tuỵ lợn Trên cơ sở khả năng ức chế α-amylase từ ruột của côn trùng của một số defensin thực vật, có thể sử dụng defensin thực vật trong việc bảo vệ cây trồng chống lại côn trùng Defensin ngăn cản côn trùng tiêu hoá, vì thế côn trùng mất đi năng lượng từ sự tiêu hóa tinh bột [100]

Defensin VrD1 được phân lập ở cây đậu xanh đã được xác định là có khả

năng kháng mọt đậu xanh (Callosobruchus chinensis) [75] Trong hạt có chứa

0,2% defensin VrD1 tái tổ hợp gây chết đối với ấu trùng mọt đậu xanh [27], [28] Những kết quả tương tự cũng thu được khi defensin VrD1 tái tổ hợp gây chết đối

với P pastoris VaD1 được phân lập từ đậu azuki đậu đỏ) đã cho thấy khả năng

ức chế mọt đậu xanh (C chinensis) với nồng độ 0,8% [29] Defensin thực vật có

khả năng ức chế α-amylase, hoạt động theo cơ chế cạnh tranh, ức chế sự hoạt động của enzyme tiêu hóa dẫn đến cái chết của côn trùng [86] Nghiên cứu Liu và cs

(2006) về cơ chế ức chế α-amylase mọt bột vàng (T molitor) của defensin từ đậu

xanh (VrD1), cho rằng loop 3 tạo giữa gấp nếp β2 và β3 của cấu trúc không gian

22

của VrD1 gắn kết với trung tâm hoạt động của α-amylase của mọt bột vàng Trong trường hợp này, tương tác không xảy ra tại vị tr xúc tác, nhưng xảy ra ở một vị trí trên bề mặt, mà vị tr đó có tính ổn định ngăn cản sự tiêu hóa cơ chất của enzyme

Sự gắn kết giữa VrD1 và α-amylase mọt bột vàng là do lực hút tĩnh điện Bề mặt gắn kết của loop 3 chủ yếu t ch điện dương, trong khi trung tâm hoạt động của α-amylase thì t ch điện âm (Hình 1.5) [78] Điều này càng được chứng minh khi Feng Lin và Cs (2007) so sánh VrD1 với defensin khác của đậu xanh là VrD2 là protein có khả năng kháng nấm, không có khả năng ức chế α-amylase mọt bột vàng mặc dù chúng có cấu trúc không gian tương tự nhau Kết quả so sánh cho thấy ở loop 3 của VrD2 ngắn hơn VrD1 Hơn nữa, có sự khác nhau về vị trí amino acid t ch điện dương là Arg Ở VrD2 thì Arg ở vị trí 40 trong chuỗi polypeptide trong khi VrD1 ở vị tr 38 Ngoài ra, VrD2 được tăng t ch điện âm bởi Asp ở vị trí

37 và Asp ở vị tr 38 do đó ngăn cản VrD2 chèn loop 3 của mình vào trung tâm hoạt động của enzyme [67]

Pelegrini và cs 2008 đã nghiên cứu khả năng ức chế hoạt động α-amylase

của ấu trùng mọt đậu xanh (A obtectus), mọt đậu Mexico (Z subfasciatus , α-

amylase trong nước bọt của người, trong tụy của lợn, của defensin VuD1 được

phân lập từ cây đậu đũa V unguiculata) Kết quả cho thấy, khả năng ức chế α-

amylase từ các nguồn khác nhau của VuD1 là khác nhau (Hình 1.6) Hình 1.6 cho

thấy, VuD1 không tác động đến hoạt động của Callosobruchus maculatus - một loại nấm gây bệnh Aspergillus fumigatus VuD1 ức chế thấp với α-amylase của

lợn và người, ức chế mạnh hoạt động của α-amylase của mọt đậu Mexico và mọt đậu xanh [104] Như vậy, VuD1 có thể được sử dụng trong bảo vệ sự phá hại của mọt với đậu đỗ

Hình 1.5 Mô hình mô tả sự phân bố điện tích bề mặt của α-amylase của

T molitor (TMA), VrD1, VrD2 và vị trí gắn kết giữa TMA và VrD1

23

(TMA: α-amylase của mọt bộ vàng, VrD1: Defensin của đậu xanh có khả năng ức chế α-amylase mọt bột vàng; VrD2: Defensin của đậu xanh không có khả năng ức chế α-amylase mọt bột vàng; Màu đỏ: điện tích âm; màu trắng: điện tích trung tính; màu xanh: tích điện dương; D: Aspartic, E: Glutamic, M: Methionine, Q: Glutamine, R: Arginine)

(Nguồn: Feng Lin và Cs (2007)[67])

Hình 1.6 Biểu đồ biểu thị khả năng ức chế α-amylase từ các nguồn

khác nhau của defensin VuD1

(CMA: α- amylase mọt đậu đỏ (Callosobruchus maculatus), PPA: α-amylase tụy

lợn, Aasp: α-amylase Aspergillus fumigatus, HA: α-amylase tuyến nước bọt của người, AA: α-amylase A obtectus, ZSA: α-amylase Z subfasciatus)

(Nguồn: Pelegrini và cs (2008) [104])

Rất nhiều nhà khoa học đã đi tìm câu trả lời cho câu hỏi cơ chế nào giúp cho defensin (VuD1) có khả năng ức chế α-amylase khác nhau là khác nhau Cấu trúc phân tử của VuD1 gồm một chuỗi α từ Thr17 đến Lys27 và 3 nếp gấp β ở các

vị trí cụ thể: β1 từ Cys3 đến Ala7, β2 từ Gly33 đến Asp37 và β3 Arg40 đến Arg45 Các amino acid từ vị tr 1 đến 25 t ch điện dương, xen kẽ giữa arginine và lysine.Trên mô hình 3D cho thấy khu vực t ch điện dương trong VuD1 tương tác với vùng t ch điện âm của enzyme, vì vậy giả thiết sự gắn kết giữa defensin thực vật với enzyme là do liên kết ion và liên kết hydro [104]

Cấu trúc không gian của VuD1 tạo nên 3 loop như cấu trúc chung của defensin thực vật Trong chuỗi α và nếp gấp β, bên cạnh đầu C có đặc điểm là giàu amino acid cation như lysine và arginine Một số amino acid kỵ nước nằm trên vị trí tiếp xúc trên

24

bề mặt, các amino acid này như Leu6, Phe15, Leu30, Leu31 và Val39 [104] Sử dụng hai chương trình Hex và Autodock, Pelegrini và cs 2008 đã xác định được cơ chế

ức chế α-amylase của mọt đậu Mexico (Z subfasciatus) của VuD1 (Hình 1.7A)

Đó là, Lys1 của VuD1 liên kết với Asp 204 của α-amylase của mọt đậu Mexico ZSA , đây là vị trí hoạt động của α-amylase của ZSA, vì thế ngăn cản sự đi vào của cơ chất tinh bột Để chứng minh vai trò của Lys1, tác giả đã gây đột biến điểm biến đổi Lys thành Gly, kết quả là ZSA và VuD1 không gắn kết với nhau [104]

Hình 1.7 Mô hình mô tả cơ chế ức chế α-amylase của VuD1

(A: Tương tác cấu trúc không ba chiều giữa VuD1(màu đen) và ZSA (màu xám) B: Tương tác cấu trúc không ba chiều giữa VuD1(màu đen) và ZSA (màu xám trắng) và PPA α-amylase tụy lợn (màu xám đen))

(Nguồn: Pelegrini và cs (2008) [104])

Khả năng ức chế hoạt động của α-amylase tụy lợn (PPA) của VuD1 là thấp, nguyên nhân do đặc điểm 3 loop của α-amylase tụy lợn dài hơn ZSA, gây ra sự giảm tiếp xúc giữa VuD1 và trung tâm hoạt động của α-amylase tụy lợn (Hình 1.7 B) Cụ thể, loop 1 của ZSA được tạo thành bởi 4 amino acid còn PPA được tạo bởi

6 amino acid Loop này là yếu tố quan trọng trong giảm ức chế hoạt động PPA của VuD1 bởi nó như một trở ngại về không gian cho lối vào của VuD1 đến trung tâm hoạt động của PPA Loop 2 của ZSA gồm 3 amino acid còn PPA gồm 5 amino acid dài hơn ZSA 0,87 Å Loop 3 của PPA gồm 10 amino acid còn ZSA ch có 3 amino acid, ở loop này PPA dài hơn ZSA đến 8,4 Å Như vậy, sự khác biệt trong cấu trúc ở lối vào trung tâm hoạt động của PPA và ZSA đã gây cản trở sự đi vào gắn kết giữa VuD1 và PPA [104]

Như vậy, với khả năng ức chế enzyme tiêu hóa của côn trùng cụ thể là α- amylase mở ra hướng ứng dụng sử dụng defensin thực vật trong bảo vệ nông sản khỏi tác hại của sâu hại an toàn, bền vững Defensin có thể sử dụng như công cụ

25

công nghệ sinh học để ứng dụng trong bảo vệ nông nghiệp cho sự kiểm soát của sâu, bệnh

1.2.3 Nghiên cứu defensin ở cây ngô

Đã có nhiều tác giả nghiên cứu đặc điểm, chức năng của defensin ở ngô Các nghiên cứu này đều cho thấy trong cấu trúc của defensin ở ngô chứa 8

cystenin, tạo nên 4 cầu nối disunfide như dạng CSαβ chung của defensin thực vật

Hầu hết defensin ở ngô ch biểu hiện ở hạt (hạt non và trưởng thành), ở các bộ phận khác ch biểu hiện khi có mặt của salicylate hay jasmonate hay A A nên để tách RNA của defensin từ các mô khác hạt cần phải xử lý hạt qua các chất này (Hình 1.8) [18], [83]

Maite và cs 2005 đã nghiên cứu defensin kháng vi khuẩn và nấm biểu hiện ở xung quanh nội nhũ của hạt ngô gọi là ZmESR-6 cDNA quy định tổng hợp

ZmESR-6 có chiều dài 550 bp Trong đó, trình tự dẫn đầu ở đầu 5' có 147 bp và 79

bp ở đầu 3' là không quy định amino acid, còn 324 bp mã hóa cho 108 amino acid Protein ZmESR-6 có khối lượng phân tử 11,1 kDa, gồm ba vùng Vùng dẫn đầu hay vùng tín hiệu gồm 27 amino acid tín hiệu, chúng có đặc điểm kỵ nước, có vai trò trong dẫn tiết của ZmESR-6 Vùng đuôi, bao gồm 29 amino acid, tạo nên phần đuôi đầu C Cuối cùng là vùng trung tâm, nằm giữa vùng tín hiệu và đuôi C, nó là thành phần cơ bản của ZmESR-6, gồm 52 amino acid có khối lượng khoảng 5,5

kDa, điểm đẳng điện pI bằng 8,73 và pH thay đổi từ 7 đến 3,68 Sự hiện diện của

một peptide tín hiệu ở đầu N cho thấy rằng ZmESR-6 được tổng hợp ở xung quanh nội nhũ như một pre-protein và sau đó được bài tiết như các peptide kháng khuẩn khác thể hiện trong việc phát triển hạt ngô [84]

Hình 1.8 Kết quả phản ứng RT-PCR gen ZmDEF1 ở các mô khác nhau của

cây ngô

(R: rễ cây, S: thân cây, L: lá cây, F: hoa, IS: hạt non, MS: hạt trưởng thành, tublin: gen biểu hiện đối chứng dương)

26

Kant và cs 2009 cũng nghiên cứu defensin 1 của ngô có tên Pdc1 biểu

hiện trong Escherichia coli và Pichia pastoris có tác dụng ức chế sinh trưởng của nấm Fusarium graminearum Phân lập DNA của gen Pdc1 có chiều dài 351 bp,

với 2 exon và 1 intron Chiều dài chuỗi tổng hợp cDNA dài 249 bp, quy định tổng hợp 82 amino acid Chuỗi polypeptide Pdc1 bao gồm một chuỗi tín hiệu với 35 amino acid và vùng defensin với 47 amino acid, chứa tám cysteine tạo thành bốn liên kết disulfide [65] Baosheng và cs (2011) cũng đã nghiên cứu đặc điểm của

gen defensin1 (ZmDEF1) của giống ngô NongDa108 cDNA của ZmDEF1 có

chiều dài 243 bp, mã hóa chuỗi polypeptide gồm 80 amino acid Chuỗi polypeptide này gồm đầu tín hiệu với 31 amino acid ở đầu N và 49 amino acid ở

vùng chức năng (vùng chính) Vùng chức năng của ZmDEF1 có khối lượng phân

tử là 5,4 kDa với điểm đẳng điện (pI) là 8,61 Protein ZmDEF1 cũng chứa 8 cystein với 4 cầu nối disulfide như các defensin thực vật khác ZmDEF1 được

chuyển vào cây thuốc lá, cây thuốc lá chuyển gen biểu hiện khả năng kháng nấm

P palmivora tốt [18]

Các protein ZmESR-6, Pdc1 và ZmDEF1 đều ưu tiên biểu hiện, tích tụ ở hạt Nên có thể các protein này có tác dụng bảo vệ hạt ngô trong quá trình bảo quản và nảy mầm Các nghiên cứu defensin ở ngô tập trung chủ yếu đến chức năng kháng nấm và kháng khuẩn Ít tác giả nghiên cứu về khả năng ức chế hoạt động α-amylase từ côn trùng của defensin ở ngô để ứng dụng trong việc chọn, tạo giống ngô có khả năng kháng côn trùng cao cụ thể là kháng mọt ngô

1.3 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Ở NGÔ

1.3.1 Nghiên cứu chuyển gen vào phôi non ngô thông qua A tumefaciens

iến đổi di truyền đã trở thành một công cụ quan trọng trong nghiên cứu về quá trình cơ bản ở thực vật và trong cải tiến cây trồng Kỹ thuật tạo cây chuyển gen đang phát triển nhanh chóng kể từ thành công đầu tiên trong việc đưa gen

ngoại lai vào thực vật nhờ A tumefaciens Từ đó số lượng cây chuyển gen được

tạo ra đã tăng lên nhanh chóng Cây chuyển gen có những đặc điểm đặc biệt, có thể cải tiến về giá trị về dinh dưỡng, tăng sản lượng, tăng khả năng chịu đựng với các yếu tố sinh học và phi sinh học Nhờ kĩ thuật chuyển gen có thể giảm thời gian cần thiết cho việc th ch nghi của một đặc điểm mới lạ được đưa vào thực vật so

27

với giống cây truyền thống Với các ưu điểm mà cây chuyển gen mang lại, nghiên cứu chuyển gen ở cây ngô cũng đã được quan tâm Hiện nay, chuyển gen ở cây ngô có 2 phương pháp, chuyển gen trực tiếp và gián tiếp Chuyển gen gián tiếp

nhờ vi khuẩn Agrobacterium được sử dụng rộng rãi hơn cả bởi vì phương pháp

này dễ sử dụng, ít tốn kém nhưng mang lại hiệu quả cao lượng bản sao gen biến nạp ít, tạo thuận lợi cho việc phân tích cây chuyển gen và không gây tổn thương tế bào) [39], [99]

Phương pháp chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn A tumefaciens

ban đầu không được xem là có hiệu quả với cây một lá mầm Tuy nhiên, đã có nhiều cố gắng trong việc cải tiến khả năng tái sinh đối với các cây một lá mầm

và khả năng tiếp nhận gen ngoại lai Chuyển gen vào cây một lá mầm thông qua

vi khuẩn A tumefaciens thành công là bước đột phá của công nghệ gen Đến nay,

các quy trình chuyển gen hiệu quả đã được xây dựng cho các cây một lá mầm như lúa, lúa mì, lúa miến [57], [143]

Khả năng chuyển gen ngoại lai vào tế bào ngô nhờ A tumefaciens lần đầu

tiên được chứng minh vào giữa những năm 80 của thể k XX [46] Sau đó,

phương pháp chuyển gen gián tiếp qua Agrobacterium được phát triển mạnh khi Ishida và cs (1996), đã chuyển gen vào phôi non ngô với một dòng A

tumefaciens mang vector nhị thể với gen vir từ pTiBo542 [61] Từ đó, phương

pháp này đã được áp dụng rộng rãi ở nhiều phòng th nghiệm trên thế giới để sản xuất ngô biến đổi gen, đây vẫn là phương pháp được lựa chọn cho nghiên cứu gen quy mô lớn và cho phát triển thương mại [60] Các yếu tố quan trọng

quyết định đến thành công của chuyển gen bằng A tumefaciens đã được nghiên

cứu tối ưu hóa, thiết lập nên một hệ thống chuyển gen

Trong quá trình chuyển gen vào cây ngô thì phôi ngô là vật liệu chuyển gen

ưu thế nhất mà các tác giả sử dụng [23] Vì vậy, để tạo cây ngô chuyển gen thành công thì việc nuôi cấy phôi ngô là một trong các yếu tố quan trọng nhằm thiết lập

hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen Đã có nhiều tác giả nghiên cứu môi trường

và các chất ảnh hưởng đến sinh tái sinh phôi ngô non Các công trình nghiên cứu đều cho rằng phôi non nuôi cấy trên môi trường N6 cho tỷ lệ mô sẹo cao hơn môi trường MS [41], [115]

28

Các chất điều hòa sinh trưởng và các chất ảnh hưởng đến khả năng tạo mô sẹo đã được các tác giả quan tâm Nhìn chung, chất điều hòa sinh trưởng nhóm auxin, điển hình là 2,4-D với nồng độ khoảng 1 - 3 mg/l là cần thiết cho sự hình thành mô sẹo phôi hóa từ phôi hợp tử 2,4-D là yếu tố quan trọng trong sự khởi đầu và phát triển của mô sẹo và mô sẹo có khả năng tạo phôi từ phôi ngô non Bổ sung BAP 0,1 mg/l kết hợp với 2,4-D 2 mg/l vào môi trường nuôi cấy là rất cần thiết đối với sự hình thành và duy trì mô sẹo phôi hóa [16], [23]

Đã có nhiều nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ AgNO3 đến khả năng tạo

mô sẹo dạng II Các tác giả nhận thấy tỷ lệ tạo mô sẹo dạng II được tăng lên khi phôi non được nuôi cấy trong môi trường bổ sung AgNO3 (5 - 20 mg/l) và AgNO3không ảnh hưởng đến sự phát triển của mô sẹo AgNO3 được sử dụng như một chất ức chế hoạt tính của ethylen nội sinh Ethylen được hình thành trong quá trình

nuôi cấy in vitro và ảnh hưởng tới sự phân chia và biệt hóa của tế bào Do vậy,

việc bổ sung AgNO3 vào môi trường nuôi cấy đã có tác dụng kích thích sự tạo thành mô sẹo và tái sinh cây [99], [131]

Vai trò của L-proline trong việc duy trì mô sẹo xốp và mô sẹo có khả năng tạo phôi ở ngô đã được nghiên cứu Các tác giả đã tạo mô sẹo và duy trì hơn một năm mà mô sẹo vẫn xốp và không mất khả năng phôi hóa Tỷ lệ tạo mô xốp và mô sẹo phôi hóa tăng tỷ lệ với bổ sung L-proline với nồng độ 20 - 25 mM vào môi trường N6 [22], [47], [115]

Ở Việt Nam, cây ngô cũng được nghiên cứu nuôi cấy nhằm phục vụ cho việc chuyển gen Phạm Thị Lý Thu 2005 , đã nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non ngô Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ tạo mô sẹo của 2 dòng ngô HR8 và HR9 đạt 75,2% và 74,1%, tỷ lệ tái sinh cây đạt 24,9% và 21,4% [7] Nguyễn Văn Đồng và cs 2009 , đã tiến hành nghiên cứu khả năng tái sinh từ phôi non của 45 dòng ngô Việt Nam thuộc 3 nhóm ngô tẻ, ngô nếp và ngô ngọt, sử dụng dòng đối chứng là dòng ngô mô hình HR8 có khả năng tái sinh cao Kết quả nghiên cứu thu được 4 dòng ngô tẻ VH1, VH11, VH19, VH29; 3 dòng ngô nếp VHN9, VHN10, VHN16 và 2 dòng ngô ngọt VHD2, VHD5 có khả năng tái sinh cao đồng thời mang một số đặc tính nông học tốt được sử dụng làm nguồn vật liệu cho nghiên cứu chuyển gen [2]