Nhân dòng, phân tích và biểu hiện gene mã hoá endo (bê ta) 1,4 mannanase từ bacillus subtilis g1

Hiện nay, với khả năng thủy phân bã cơm dừa, mannanase cũng được sử dụng để phân hủy nguồn thải của các nhà máy chế biến thực phẩm từ dừa, sản xuất các oligosaccharide ứng dụng trong côn

-

NGUYỄN SỸ LÊ THANH

NHÂN DÒNG, PHÂN TÍCH VÀ BIỂU HIỆN GENE MÃ HÓA

ENDO--1,4-MANNANASE TỪ BACILLUS SUBTILIS G1

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Người hướng dẫn: GS.TS ĐẶNG THỊ THU

TS QUYỀN ĐÌNH THI

HÀ NỘI 10-2005

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS TS Đặng Thị Thu, Bộ môn Hóa sinh và Sinh học Phân tử, Viện CNSH-TP, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Người đã hướng dẫn, định hướng ý tưởng nghiên cứu, sửa bài luận văn và dạy dỗ tôi trong quá trình còn là sinh viên cho đến khi học cao học

Tôi rất chân thành cảm ơn TS Quyền Đình Thi, Phòng Enzyme học, Viện CNSH, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã thiết kế và hướng dẫn thí nghiệm, sửa bài và tạo các điều kiện hóa chất và thiết bị để hoàn thành luận văn

Tôi rất cảm ơn PGS TS Đinh Duy Kháng, Trưởng phòng Vi sinh vật Phân tử, Viện CNSH, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và CN

Nguyễn Thị Hà, Phòng Vi sinh, Viện KHNN Việt Nam, đã cung cấp chủng B

subtilis G1

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ chân tình của tập thể cán bộ và các sinh viên cùng làm tốt nghiệp tại Phòng Enzyme học, Viện CNSH, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam

Cuối cùng, tôi cũng xin cảm ơn sự động viên, sự ủng hộ của gia đình tôi, các thầy cô giáo cùng bạn bè trong suốt quá trình học tập

Hà nội, ngày 15 tháng 11 năm 2005

Nguyễn Sỹ Lê Thanh

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 CHỨC NĂNG 2

1.2 CẤU TRÚC 3

1.2.1 Cấu trúc bậc nhất 3

1.2.2 Cấu trúc không gian 3

1.3 CƠ CHẾ XÚC TÁC 4

1.4 CƠ CHẤT 6

1.5 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI 7

1.6 ỨNG DỤNG 9

1.6.1 Trong công nghiệp thực phẩm 9

1.6.2 Trong công nghiệp dược 10

1.6.3 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc 10

1.6.4 Trong khai thác dầu mỏ và khí đốt 11

1.6.5 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy 11

1.7 ENDO--1,4-MANNANASE TÁI TỔ HỢP 12

1.7.1 Nhân dòng gene 13

1.7.2 Phân tích trình tự amino acid 15

1.7.3 Biểu hiện endo--1,4-mannanase 20

1.8 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN Ở VIỆT NAM 21

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 22

2.1.1 Nguyên liệu 22

2.1.2 Thiết bị thí nghiệm 23

2.1.3 Hóa chất 23

2.1.4 Dung dịch và đệm 24

2.1.5 Môi trường 25

2.2 PHƯƠNG PHÁP 25

2.2.1 Nuôi cấy vi sinh vật 25

2.2.2 Xác định hoạt tính 25

2.2.3 Tách chiết DNA tổng số 26

2.2.4 Tách chiết plasmid DNA 27

2.2.5 Khuếch đại PCR 28

2.2.6 Giải trình tự DNA 28

2.2.7 Điện di polyacrylamide 29

2.2.8 Cắt DNA bằng enzyme giới hạn 29

2.2.9 Tách phân đoạn DNA từ agarose 29

2.2.10 Gắn dính DNA 30

2.2.11 Biến nạp plasmid hóa học 30

2.2.12 Phần mềm phân tích 31

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 NUÔI CẤY CHỦNG CÓ HOẠT TÍNH ENDO--1,4-MANNANASE 32

3.1.1 Chọn chủng có hoạt tính endo--1,4-mannanase cao 32

3.1.2 Nồng độ cơ chất cảm ứng 33

3.1.3 Động thái sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme 34

3.2 NHÂN DÒNG GENE man 36

3.2.1 Tách chiết DNA nguyên liệu 36

3.2.2 Khuếch đại gene man 37

3.2.3 Gắn gene vào vector và chọn dòng 38

3.2.4 Cắt kiểm tra các plasmid 40

3.3 PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GENE man 41

3.4 BIỂU HIỆN ENDO--1,4-MANNANASE TÁI TỔ HỢP 45

3.4.1 Tinh sạch plasmid nguyên liệu 45

3.4.2 Tinh sạch các phân đoạn DNA đích 46

3.4.3 Thiết kế plasmid biểu hiện pEMAG 48

3.4.4 Cắt kiểm tra plasmid biểu hiện pEMAG 49

3.4.5 Xây dựng hệ thống biểu hiện E coli BL21/pEMAG 49

3.4.6 Mức độ biểu hiện endo--1,4-mannanase 50

3.4.7 Định tính hoạt tính endo--1,4-mannanase 51

3.4.8 Định lượng hoạt tính endo--1,4-mannanase 53

3.5 ĐẶC TÍNH CỦA ENDO--1,4-MANNANASE TÁI TỔ HỢP 54

3.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính 54

3.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền 55

3.5.3 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính 57

3.5.4 Ảnh hưởng pH đến độ bền 58

3.5.5 Ảnh hưởng của dung môi 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

PHỤ LỤC 67

LB Luria and Bertani

man Gene mã hóa mannanase

Man Endo--1,4-mannanase

PCR Polymerase chain reaction

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TBE Tris - Boric acid - EDTA

MỞ ĐẦU

Endo--1,4-mannanase (EC 3.2.1.78) là enzyme thủy phân ngẫu nhiên các liên kết -1,4-mannopyranosyl trong chuỗi mannan và rất nhiều polysaccharide khác có thành phần chủ yếu là mannose Sản phẩm thủy phân của mannanase là các mannobiose, mannotriose và các oligosaccharide khác

Mannanase phân bố rất phong phú, từ vi khuẩn, nấm mốc, nấm men, tảo biển, tảo nước ngọt, hạt nảy mầm, đến cả động vật Hoạt tính enzyme biến đổi theo nguồn gốc, do cấu trúc phân tử của chúng khác nhau

Mannanase đã được sản xuất trên qui mô công nghiệp và được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp giấy, thực phẩm, chế biến thức ăn gia súc, dược phẩm cho đến dầu khí Hiện nay, với khả năng thủy phân bã cơm dừa, mannanase cũng được sử dụng để phân hủy nguồn thải của các nhà máy chế biến thực phẩm từ dừa, sản xuất các oligosaccharide ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm, các loại thực phẩm chức năng

Tuy nhiên, năng suất sinh tổng hợp mannanase trong các chủng vi sinh vật có nguồn gốc tự nhiên thường thấp hơn trong các chủng tái tổ hợp Xuất phát từ các yêu cầu đặt ra như trên và thực tế tại Việt Nam, tôi thực hiện đề tài

"Nhân dòng, phân tích và biểu hiện gene mã hóa endo--1,4-mannanase từ Bacillus subtilis G1" với nội dung: a) Tuyển chọn chủng B subtilis G1 có

hoạt tính endo--1,4-mannanase cao; b) Nhân dòng và phân tích gene mã hóa

endo--1,4-mannanase từ chủng B subtilis G1; c) Biểu hiện gene tái tổ hợp ở

Escherichia coli BL21 và xác định một số đặc tính endo--1,4-mannanase tái

tổ hợp

1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CHỨC NĂNG

Endo--mannanase (EC 3.2.1.78) là enzyme xúc tác cắt đặc hiệu liên kết -1,4 mannose trong mạch mannan (Hình 1.1) cũng như liên kết -1,4 giữa mannose và glucose trong mạch glucomannan Endo--mannanase thủy phân glycoside và polymannan tạo ra các mannooligosaccharide Mức độ cắt mạch mannan phụ thuộc vào tỉ lệ glucose và mannose trong mạch Ví dụ: Bột glucomannan salep (glucose:mannose = 2:8) bị cắt nhiều hơn so với glucomannan konjac (glucose:mannose = 66:100) Mức độ thay thế và phân

bố các nhóm bên làm ảnh hưởng đến hoạt tính của mannanase Nhóm bên galactosyl của galactomannan và nhóm acetyl hạn chế sự thủy phân mạch

thay thế nước Đây là nhóm enzyme glycosidase, thủy phân các liên kết

glucoside mà vẫn giữ nguyên cấu hình (Sunna et al 2000)

1.2 CẤU TRÚC

Mannanase nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc tinh

thể khác nhau Mannanase từ nấm Sclerotium rolfsii là một glycoprotein có khối lượng phân tử 46,5 kDa (Sachslehler et al 2000), từ A niger có khối lượng 45 kDa (Christgau et al 1994) Mannanase từ vi khuẩn có kích thước phân tử xấp xỉ Ví dụ mannanase từ vi khuẩn ưa nhiệt Thermotoga

neapolitana là một protein có khối lượng phân tử 65 kDa, từ Vibrio sp MA

138 có khối lượng 49 kDa

Hogg et al (2001) đã có những nghiên cứu chi tiết về cấu trúc mannanase 26A (Pc Man26A) thuộc nhóm GH26 từ vi khuẩn Pseudomonas

cellulosa Polypeptide của Man26A gồm 423 aa, trong đó chỉ có 337 aa cấu

tạo nên ba chuỗi protein Trong phân tử enzyme có bốn ion Zn và 446 phân tử nước Một trong số các ion, Zn đóng vai trò liên kết trong tinh thể enzyme

1.2.1 Cấu trúc bậc nhất

Trình tự aa của mannanase Pc Man26A gồm 423 aa Ba chuỗi protein được hình thành từ 337 aa tương ứng là Pa (Pro44-Ile323), Pb (Leu332-Trp360), Pc (Thr392-Thr419) Các gốc aa còn lại hình thành 4 cấu trúc nối không sắp xếp theo trật tự nhất định: Arg324-Gly331; Arg361-Thr391; Arg39-Lys43; và Leu420-Lys423

1.2.2 Cấu trúc không gian

Phân tử Man26A cấu tạo bởi 8 chuỗi xoắn  và 8 dải  (Hình 1.2) Chuỗi Pa và Pb có cùng kích thước 93,2 Å Chuỗi Pc có kích thước 5,8 Å Chuỗi Pa hình thành vùng xúc tác của enzyme Tâm hoạt tính cấu tạo bởi các

gốc aa nằm trên các chuỗi 4, 5, 7, và 8. Các phân tử ZnSO4 xuất hiện ngẫu nhiên gần với trung tâm hoạt tính của Pc nhưng chúng không có ảnh hưởng tới hoạt tính xúc tác cũng như độ bền của enzyme

Hình 1.2 Cấu trúc không gian của Pc Man26A

A: Cấu trúc chuỗi  và chuỗi 

(Đỏ: chuỗi ; Xanh lục: chuỗi ; Ghi: đoạn nối; Chấm: ZnSO 4 )

B: Phân bố các vùng Pa (A), Pb (B) và Pc(C) trong phân tử Pc Man26A

1.3 CƠ CHẾ XÚC TÁC

Hogg et al (2001) thấy rằng trung tâm xúc tác của các mannanase

nhóm GH5 cũng như GH26 có sự tương đồng lớn về sự phân bố các gốc acid,

base, gốc ái nhân và nền kỵ nước Chính vì vậy mà trung tâm xúc tác của các mannanase có cấu tạo và cơ chế hoạt tính tương tự nhau

Hình 1.3 Cấu tạo tung tâm xúc tác của Pc Man26A

Trung tâm xúc tác thủy phân mannan của Pc Man26A (Hình 1.3) cấu tạo bởi các gốc aa như sau: His211, Glu212, Tyr285, Glu320, Trp360, và Arg208 và cấu trúc liên kết cơ chất tạo thành bởi Asn127, Glu128, Tyr198, Glu225, Trp254, và Arg50 Vị trí xúc tác tạo bởi phân tử Glu320 ở cuối dải 7

và Glu212 ở cuối dải 4 Các gốc aa phụ trợ gồm His211, Arg208 trên 4, Asp283, Tyr285 trên 5 cũng như Trp360 trên 8 liên kết với nhau bởi liên kết hydro Glu320 liên kết với vòng imidazol của His211, nhóm hydroxyl của Tyr285 và nhóm amine của Arg208 bằng các nhóm carboxyl Glu320 cũng liên kết với Trp360 bởi liên kết hydro Trong khi đó Glu212 chỉ liên kết với Asp283 bằng nhóm carboxyl

Vai trò liên kết cơ chất khi tham gia xúc tác thủy phân mannan được thực hiện bởi các aa không nằm tại trung tâm xúc tác và thay đổi tùy thuộc độ lớn của khối lượng phân tử cơ chất Nếu cơ chất là manno-oligosaccharide thì Trp162 sẽ tương tác kỵ nước với cơ chất Tuy nhiên Trp162 không liên kết với polysaccharide Khác Trp162, His143 liên kết với cả hai loại cơ chất trên nhờ liên kết hydro giữa vòng imidazol với nhóm hydroxyl của mannose Nếu

cơ chất là mannopyranose thì Trp217 sẽ hình thành tương tác kỵ nước với cơ chất Ngoài các aa trên còn có Trp156 Trong trung tâm xúc tác, Trp360 ngoài vai trò xúc tác cũng đóng vai trò liên kết cơ chất để ổn định trạng thái cho enzyme Còn His211 có vai trò duy trì trung tâm xúc tác

1.4 CƠ CHẤT

Cơ chất của -mannanase là các polysaccharide có chứa mannose (mannan và glucomannan) Đây là những thành phần quan trọng của sinh khối thực vật Mỗi năm có khoảng 100 tỉ tấn sinh khối thực vật được phân hủy nhờ các enzyme vi sinh vật Các đường được giải phóng ra đóng vai trò là nguồn năng lượng và nguồn carbon trong sinh quyển

Mannan là một bộ khung gồm các gốc mannose kết nối bởi liên kết 1,4, còn glucomannan là một polymer dị thể của glucose và mannose và cũng được nối bởi liên kết -1,4 Trong khung mannan hay glucomannan còn có liên kết -1,6 của các gốc galactosyl Chính vì vậy mà các polysaccharide này còn được gọi là galactomannan và galactoglucomannan Glucomannan đóng vai trò thiết yếu trong thành tế bào của các loài hạt trần Còn galactomannan thường có trong thành tế bào của hạt carob (một loại hạt giống như hạt cacao)

-và đóng vai trò dự trữ polysaccharide (Sunna et al 2000)

Mannan tinh khiết

Đây là polysaccharide có thành phần mannose trên 90%, các gốc đường khác dưới 10% Các mannan tinh khiết thường có trong nhân các hạt họ cọ

như hạt chà là (Phoenix doctylifera), hạt hạnh nhân (Phytelephas

macrocarpa), hạt các loài hoa tán và hạt cà phê xanh

Glucomannan

Trong mạch chính của glucomannan, một phần lớn D-mannose được thay thế bởi D-glucose với tỉ lệ glucose:mannose là 1:2, ở một số loài tỉ lệ này

lên tới 1:1 Glucomannan trong rễ loài Amorphophallus konjac có khối lượng

phân tử khoảng 300 kDa với tỉ lệ glucose:mannose là 66:100 và cứ 10 phân tử đường thì có một nhóm acetyl liên kết với phân tử thứ 10 Trong hạt các cây

thuộc họ huệ tây, hoa diên vĩ, mạch chính chứa D-mannose và D-glucose phân bố ngẫu nhiên cùng một lượng nhỏ D-galactose (3-6%) liên kết với mạch chính bởi liên kết -1,6

Galactomannan

Mạch chính của galactomannan gồm toàn các phân tử mannose Polysaccharide này có nhiều nhánh -1,6-D-galactopyranosyl Galactomannan có trong nhân hạt đậu, cọ non và hạt một số loài cây không phải họ đậu Ở các cây họ đậu, mức độ thay thế galactose biến đổi trong

khoảng 20 đến gần 100% Ví dụ locust bean gum từ hạt Ceratonia siliqua,

một cây họ đậu vùng Địa Trung Hải, có khối lượng phân tử 350 kDa gồm một chuỗi mannose thẳng và cứ 4 gốc mannose thì có một gốc galactose Guar

gum từ hạt cây Cyamopsis tetragonoloba có khối lượng phân tử 800-100 kDa

với tỉ lệ mannose:glucose là 1,6:1

Galactoglucomannan

Galactoglucomannan là một mannan dị thể, cấu tạo chính gốm các đường D-glucopyranose và -D-galactose phân bố ngẫu nhiên liên kết với nhau bởi liên kết -1,4 Ngoài ra có một số hexose mang -D-galactopyranose gắn vào vị trí C-6 Galactoseglucomannan chiếm khoảng 15-20% trọng lượng khô của gỗ mềm và là thành phần dự trữ polysaccharide

trong nhân hạt một số cây thuộc họ Cercis siliquaestrum và Bauhinia (Gubitz

et al 2000)

1.5 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI

Nguồn thu endo--1,4-mannanase rất phong phú, từ vi sinh vật, tảo cho đến thực vật Trong vi sinh vật, rất nhiều chủng vi khuẩn, nấm mốc nhưng rất

ít nấm men sinh tổng hợp -mannanase Các chủng vi khuẩn có thể kể đến là

Aeromonas, Bacillus, Cellulomonas fimi, Entercoccus casseliflavus, Pseudomonas và Streptomyces Nấm mốc tổng hợp mannanase gồm Aspergillus niger, A awamori, Fomes annosus, Penicillium, Sclerotium rolfsii, Trichoderma và Thielavia Hầu hết -mannanase thu từ vi khuẩn có

hoạt tính thấp hơn nấm mốc Tuy nhiên -mannanase hoạt tính cao nhất lại

thu từ B subtilis (4250 IU/ml.h sau 1 ngày nuôi cấy), đứng thứ hai là enzyme thu từ nấm Sclerotium rolfsii (3740 IU/ml.h sau 8 ngày nuôi cấy) Đại diện

duy nhất của nấm men có khả năng sinh tổng hợp -mannanase là

Aureobasidum pullutans -mannanase cũng được thu từ hạt nảy mầm của các

cây thân cứng như cọ, chà là và đặc biệt là hạt cà chua nảy mầm Trong suốt quá trình quả cà chua chín, mannanase ở trạng thái bất hoạt nhưng đến giai đoạn hạt nảy mầm, mannanase chuyển sang trạng thái hoạt tính để phân giải

mạch glucomannan (Hogg et al 2003, Politz et al 2000, Stalbrand et al

1995)

Mannanase được chia thành hai nhóm là GH5 và GH26 Nhóm GH26

có nguồn gốc chủ yếu từ sinh vật tiền nhân và có tính đặc hiệu cơ chất cao, chỉ phân giải mannan và glucomannan, không phân giải các -glycan khác hay các dẫn xuất hòa tan của cellulose Trong khi đó GH5 chủ yếu thu từ nấm, vi khuẩn và có hoạt tính với cả các cơ chất cellulose Một đặc điểm khác biệt của các glycoside hydrolase thủy phân thành tế bào là chúng thường chứa các module không xúc tác liên kết với polysaccharide Việc phân loại mannanase dựa vào các module liên kết carbohydrate (Carbohydrate-binding module, CBM) Các CBM có thể liên kết với mannan, cellulose, xylan, tinh bột và laminarin (Ethier et al 1998) Trong nhóm GH5, các mannanase từ nấm Trichoderma reesei và Agaricus bisporus cũng như từ vi khuẩn

Caldocellum saccharolyticum, ngoài tâm xúc tác còn có một domain liên kết

cellulose (CBD) nối với tâm xúc tác bởi các nhóm liên kết giàu proline-threonine

và serine

1.6 ỨNG DỤNG

Enzyme thủy phân mannanase được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc, công nghiệp dược, công nghiệp giấy và bột giấycũng như trong công nghiệp khai thác dầu mỏ và khí đốt

1.6.1 Trong công nghiệp thực phẩm

Mannanase được ứng dụng để sản xuất cà phê tan và nước quả các loại trong công nghiệp thực phẩm

Trong sản xuất cà phê tan, dịch cà phê được chiết từ hạt cà phê sau đó được cô đặc và sấy phun Polysaccharide trong hạt cà phê bao gồm mannan, arabinogalactan và cellulose, chiếm đến một nửa trọng lượng khô của hạt cà phê trong đó mannan chiếm đến 20-30% Phần lớn mannan này có trong dịch chiết cà phê Do khối lượng phân tử lớn, mannan làm dịch chiết cà phê rất nhớt, gây khó khăn và tốn năng lượng cho quá trình lọc và sấy phun Việc sử dụng mannanase trong sản xuất cà phê làm giảm độ nhớt của dịch chiết cà phê

từ đó làm giảm năng lượng tiêu tốn và hạ giá thành sản phẩm Mặt khác, sản phẩm thủy phân mannan là các loại đường và oligosaccharide làm tăng vị tự

nhiên của sản phẩm cà phê tan Trên thực tế, mannanase từ S rolfsii đã được dùng để thủy phân dịch chiết cà phê Arabica và Robusta, hai giống cà phê

được trồng phổ biến ở nước ta hiện nay Độ nhớt của dịch chiết giảm đi một nửa sau hai giờ xử lý bằng chế phẩm enzyme thô Cùng với sự giảm độ nhớt, hàm lượng đường khử tăng lên

Trong công nghiệp chế biến các loại rau quả, mannanase có tiềm năng

ứng dụng lớn như pectinase (Gubitz et al 2000) Mannan là thành phần chủ

yếu của thành tế bào quả do vậy nó thường làm giảm năng suất lọc và tăng

hàm lượng cặn lơ lửng trong sản phẩm nước quả trong Việc xử lý quả trong quá trình sản xuất một mặt làm tăng năng suất lọc, đảm bảo độ trong của dịch quả, mặt khác làm tăng hiệu suất thu hồi quả

1.6.2 Trong công nghiệp dược

Bã cơm dừa là phẩn còn lại của dừa sau khi ép hết chất béo chứa một lượng lớn mannan Sự phân giải bã cơm dừa nhờ mannanase làm tăng giá trị

sử dụng của dừa và làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường do phế phụ phẩm của việc ép dầu dừa Dưới tác dụng của mannanase, mannan được phân cắt thành các oligosaccharide ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm với vai trò là giá thể cho vi sinh vật đường ruột giúp hệ vi sinh vật có lợi cho tiêu hóa

(Bifidobacterium sp và Lactobacillus sp.) phát triển ổn định

Trong những năm gần đây oligosaccharide là mối quan tâm rất lớn

trong công nghiệp dược và công nghiệp thực phẩm (Gubitz et al 2000)

Oligosaccharide, đặc biệt là oligosaccharide dị thể đóng vai trò trong glycoprotein và glycolipid Chúng là thành phần của màng tế bào tại đó chúng đóng vai trò là các thụ thể nhận biết hormon, chất độc, kháng thể, virus và vi khuẩn Các kỹ thuật mới bao gồm cả công nghệ enzyme đang được nghiên cứu theo hướng tổng hợp các chất có cơ sở là oligosaccharide dùng trong điều trị và chẩn đoán (tác nhân gây sưng viêm, phát hiện bệnh, kít thử kháng thể)

1.6.3 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc

Mannanase được sử dụng để phân cắt galactomannan có trong thành phần thức ăn gia súc đặc biệt nhiều trong các cây họ đậu như đậu tương, cỏ linh lăng, thịt guar Thịt guar là phế phụ phẩm của công nghiệp sản xuất guar gum, chứa nhiều aa cần thiết cho sự phát triển của động vật Tuy nhiên, galactomannan có trong thịt quả lại là thức ăn phản dinh dưỡng: guar gum có trong thức ăn trương nở lên trong hệ tiêu hóa của động vật làm tăng độ nhớt

khối thức ăn trong hệ tiêu hóa, do đó làm giảm khả năng tiêu hóa và hấp thụ

thức ăn (Pettey et al 2002) Theo nghiên cứu của các nhà chăn nuôi chỉ cần

có 2-4% galactomannan có trong thức ăn làm giảm hiệu quả của việc sử dụng thức ăn Việc xử lý mannanase thịt guar gum loại bỏ tác dụng phản dinh dưỡng của galatomannan, giúp tận dụng nguồn phế phẩm này trong sản xuất guar gum thành thức ăn cho gia súc có giá trị

Mannanase được sản xuất thành chế phẩm thương mại nhằm bổ sung vào phế thải công nghiệp như vỏ đậu tương, bột đậu tương, bã cơm dừa, thịt quả

cọ, thịt quả vừng, thịt quả cải dầu làm thức ăn gia súc (Jackson et al 1999) Ví

dụ, chế phẩm có tên là Hemicell của Chemgene Corporation (Mỹ) được thêm vào thức ăn gia súc làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, tăng lượng sữa đối với

bò, giảm lượng mỡ trong lợn, tăng trọng lượng gà, số lượng và chất lượng trứng

gà

1.6.4 Trong khai thác dầu mỏ và khí đốt

Một loại dịch có độ nhớt cao thường được cấp vào đầu mũi khoan Dịch này chứa các hạt nhỏ có nhiệm vụ lấp đầy các kẽ nứt xuất hiện do áp suất thủy tĩnh, giữ cho mũi khoan không bị gãy dưới tác dụng của áp suất lớn Các chất có độ nhớt cao thường được sử dụng là galactomannan Để dầu và khí đốt có thể ra khỏi giếng, độ nhớt này cần được loại bỏ hoặc làm giảm bằng cách oxy hóa hoặc thủy phân bằng enzyme Dịch có độ nhớt thấp này sau đó được bơm ra trước khi quá trình dẫn dầu và khí đốt bắt đầu

Mannanase được sử dụng để làm giảm độ nhớt dịch này (Politz et al 2000)

1.6.5 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy

Mannanase có thể sử dụng cùng với xylanase nhằm tẩy trắng lớp vỏ gỗ

mềm (Gibbs et al 1996) Mục tiêu chính của quá trình tẩy trắng bằng enzyme

này là làm giảm lượng chlor sử dụng trong phương pháp hóa học Thêm vào

đó, việc sử dụng enzyme trong làm trắng giấy và bột giấy lại cho chất lượng giấy tốt, điều này là chìa khóa cho sự phát triển công nghiệp làm trắng giấy hoàn toàn mà không dùng chlor Việc sử dụng hemicellulase là cách làm trắng giấy gián tiếp, cho cấu trúc sợi gỗ chặt chẽ hơn so với sử dụng chlor, chất hóa học Tuy nhiên hiệu quả làm trắng giấy còn phụ thuộc nhiều vào phương pháp nấu và quy trình làm trắng được sử dụng

Cùng với xylanase, mannanase được sử dụng để loại hemicellulose ở bột giấy không tan Bột giấy không tan được sử dụng để làm sợi visco, ether

và ester cellulose Trong quá trình tạo sợi visco, một lượng lớn hemicellulose

có thể ảnh hưởng đến độ trơn bóng và độ bền của sợi Trong công đoạn acetate hóa, hàm lượng có thể ảnh hưởng đến chế độ hòa tan của celluloacetate đặc biệt một lượng nhỏ galactomannan ảnh hưởng xấu đến độ trương nở của sợi acetate Mannanase và xylanase hoạt tính kết hợp trên bột giấy loại thêm 50% mannan và 11% xylan ra khỏi bột giấy so với sử dụng riêng rẽ hai enzyme này Việc loại mannan và xylan sẽ tốt hơn nếu sử dụng thêm endoglucanase.Như vậy, mannanase có tiềm năng ứng dụng rất to lớn và rộng rãi trong công nghiệp, y dược, và làm giảm thiểu chất thải môi trường

1.7 ENDO--1,4-MANNANASE TÁI TỔ HỢP

Các nghiên cứu về gene mã hóa mannanase từ vi khuẩn chủ yếu tập trung vào các vi khuẩn chịu nhiệt Các vi khuẩn này sinh tổng hợp mannanase chịu nhiệt, sau khi biểu hiện ở tế bào chủ thích hợp, enzyme tái tổ hợp có hoạt tính cao, chịu được nhiệt độ cao, thích hợp cho xử lý làm trắng trong sản xuất giấy, ngành công nghiệp chủ yếu ứng dụng mannanase hiện nay

1.7.1 Nhân dòng gene

Các trình tự gene mã hóa mannanase vi khuẩn đã được công bố có kích thước giao động từ 1 kb đến khoảng 4,5 kb (Bảng 1.1) Quá trình tách dòng chủ yếu được thực hiện bằng kỹ thuật PCR với mồi thiết kế đặc hiệu cho từng vi khuẩn hoặc cắt ngẫu nhiên DNA geneome vi khuẩn rồi sàng lọc đoạn DNA chứa

gene mã hóa mannanase (Yoshida et al 1998, Luthi et al 1999, Mendoza et al

1995)

Các trình tự gene mã hóa mannanase vi khuẩn có sự tương đồng giữa các mannanase thuộc nhóm GH5 hay GH26 Ngay các mannanase thuộc hai nhóm cũng có sự tương đồng Gene mã hóa mannanase vi khuẩn thường chứa trình tự

Shine-Dalgarno GAGGAGG hoặc trình tự tương tự như AGGAGG (B subtilis NM39), GGAGGAG (B stearothermophilus) hay AGGCGG (Thermoanaero-

bacterium polysaccharolyticum) Đây là trình tự để ribosome liên kết vào gene

và phiên mã Ngoài ra ở đầu hoặc cuối gene mannanase còn mang vùng trình tự giàu AT Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng các gene mã hóa mannanase thường có vị

trí cắt giới hạn với EcoRI Vị trí này thường phân chia phân tử enzyme thành hai

domain, một có hoạt tính xúc tác thủy phân mannanase (có thể là domain đầu

nitơ hoặc đầu carboxy) và một domain không xúc tác (Cann et al 1999)

Năm 1998, Ethier et al đã xây dựng một ngân hàng gene của B

stearothermophilus với khoảng 10.000 khuẩn lạc E coli để sàng lọc khuẩn lạc

có hoạt tính mannanase dựa trên vòng thủy phân cơ chất đặc hiệu Tám khuẩn lạc tái tổ hợp có hoạt tính được nghiên cứu sâu hơn và phân đoạn chèn DNA

có kích thước 7,6 kb (3 khuẩn lạc), 10,7 kb (4 khuẩn lạc) và 16,9 kb (1 khuẩn

lạc) Cắt EcoRI, tất cả các đoạn chèn đều cho các đoạn kích thước 1,2 và 6,4

kb Tiếp tục cắt với BamHI, HindIII và EcoRI riêng lẻ hặc phối hợp Trình tự

vùng 1,7 kb mang đoạn DNA 1,2 kb có một ORF của đoạn chèn 7,6 kb Trình

tự aa tương ứng của vùng này phù hợp với protein có hoạt tính mannanase tuy nhiên trình tự gene mã hóa protein lại chưa có codon kết thúc và tiếp giáp với

vị trí cắt EcoRI trên pUC18 Tiếp tục giải trình tự nt của đoạn 16,9 kb (đoạn kéo dài của đoạn 7,6 kb có vị trí cắt với EcoRI) để xác định trình tự còn lại

của đoạn gene ORF tương ứng có codon khởi đầu ATG và codon kết thúc

TAA lần lượt ở vị trí 351 và 2433 Trình tự nt của gene manF mã hóa protein endo--1,4-mannanase gồm 694 aa Đầu nitơ của mannanase B

stearothermophilus gồm các gốc aa ở vị trí 33 đến 47 (KTKREPATPTKDNEF) Trình tự 29 aa đầu nitơ mang đặc điểm của trình tự peptide đặc trưng cho vi khuẩn có chứa vùng cơ bản, tiếp theo là vùng kỵ

nước và vùng cực Q tại các gốc aa 4-8 trước vị trí cắt EcoRI Các aa 30-32

(V-H-A) giống dấu hiệu nhận biết peptidase Trình tự 5'-GGAGGAG-3' (trình

tự liên kết ribosome) nằm ở trước codon khởi đầu ATG Trình tự nt 175-201 (TTGACA-15 nt-TATAAA) tương ứng với trình tự -35 và -10 của promoter Trình tự kết thúc phiên mã là 10 nt sau codon kết thúc của ORF Sau đó là

một trình tự kích thước 20 nt thymine (Ether et al 1998)

Năm 1999, Cann et al khi nghiên cứu glucanase đã phát hiện ra gene

mã hóa mannanase chủng T polysaccharolyticum Sáu nghìn khuẩn lạc được

sàng lọc trên cơ chất chứa chrome OBR-HEC Trong số đó, 8 phage tái tổ hợp

có hoạt tính enzyme được tinh sạch và kiểm tra hoạt tính của enzyme ở 37C

và 65C Cắt kiểm tra phân đoạn chèn trên phagemid bằng EcoRI và PstI, 7 phagemid tái tổ hợp mang phân đoạn chèn DNA của T polysaccharolyticum

có cùng kích 3,4 kb Trình tự nt phân đoạn DNA thiếu mất codon kết thúc, nghĩa là gene chưa hoàn chỉnh Sử dụng phương pháp geneome-walking PCR

để nhân tiếp một đoạn DNA kích thước 1,5 kb của T polysaccharolyticum và

clone vào plasmid pGEM-T và giải trình tự để thu gene hoàn chỉnh Gene

nhân dòng được đặt tên manA do tính đặc hiệu cao bất thường đối với

galactomannan (locust bean gum) Phần trước của gene là đầu carboxy, mã hóa một protein ngắn có tỉ lệ tương đồng với đoạn 51 aa của -

fructofuranosidase từ Beta vulgaris và Vicia faba tương ứng là 54% và 53%

Codon khởi đầu ATG nằm ở vị trí 586, và codon kết thúc nằm ở vị trí 3877 Toàn bộ đoạn gene gồm 3291 nt và mã hóa một tiền protein gồm 1097 aa với khối lượng phân tử khoảng 120 kDa Trước codon khởi đầu là một vị trí liên kết ribosome gồm 9 nt và vùng promoter -10 (TAAAAT) và -35 (TTCGC) xuất hiện ở giữa protein bị cắt Vị trí liên kết ribosome bổ sung hoàn hảo với

trình tự đầu 3' của 16S RNA của E coli (3'-AUUCCUCCAC-5') 16S rRNA

có vai trò đưa 30S ribosome tới codon khởi đầu Hơn nữa còn tồn tại một vùng trống giàu AT giữa trình tự Shine-Dalgarno và codon bắt đầu (ATG),

tiếp sau đó là trình tự AAAA Quá trình dịch mã tối ưu ở E coli được điều khiển bởi promoter của gene manA (Cann et al 1999)

1.7.2 Phân tích trình tự amino acid

Trình tự aa của endo--1,4-mannanase từ vi khuẩn được phân tích theo mức độ tương đồng trình tự aa và phân tích dải kỵ nước (hydrophobic cluster analysis) Nhiều endo--1,4-mannanase vi khuẩn có một trình tự peptide đầu

N đặc trưng MKKVLSKLMV FVMVLTVALG NGVFIGDKQA KA

Bảng 1.1 Nhân dòng gene mã hóa endo--1,4-mannanase vi khuẩn

KT: kích thước, HT: hoạt tính; TTH: tái tổ hợp

Chủng gốc Trình tự mồi xuôi/ mồi ngược Vector

tách dòng

KT gene (nt)

Hệ thống biểu

hiện E

coli/vector

HT enzyme TTH (U/mg protein)

Tài liệu tham khảo

GTAtGGTAATTTCATTCTAAT TTCTTAAGTCATCTTTG-5'

CTTGCTGATGAGCATACTAG GCTGC-5'

pJLA602 4567 E coli

JM101/

pSUN22

4 (85C, pH 6)

CCGTATTTCCAAAGTCCGCC-3291 E coli

JM109/

pGEM-T

1412 (65C, pH 5,7)

Mendoza

et al 1995

pUC119 5,5)

Trình tự aa của các mannanase vi khuẩn tương đồng từ 36 đến 71%

(Henrissat et al 1991) Quan hệ loài càng gần thì sự tương đồng về trình tự aa

của mannanase càng lớn Trong toàn bộ phân tử mannanase có thể chỉ có một domain có hoạt tính mannanase, domain còn lại không có hoạt tính mà có nhiệm vụ liên kết cellulose Phân tử mannanase cũng có thể gồm nhiều domain mã hóa các enzyme khác nhau, trong đó có mannanase Trong trường hợp có nhiều domain, enzyme vẫn thể hiện hoạt tính thủy phân hemicellulose, nhưng phổ cơ chất rộng hơn so với enzyme chỉ có một domain xúc tác Như

trường hợp mannanase từ T polysaccharolyticum, phân tử enzyme có 4

domain xúc tác, thể hiện hoạt tính của mannanase, endoglucanase,

endo-1,4-mannosidase, và xylanase (Cann et al 1999) Dưới đây là một số nghiên cứu

sâu hơn về trình tự aa hình thành nên cấu trúc phân tử mannanase từ hai vi

khuẩn là T polysaccharolyticum và B stearotherphilus

Khi phân tích trình tự enzyme ManA từ T polysaccharolyticum, Cann

thấy rằng trình tự aa đầu nitơ của ManA có đặc điểm của một peptide đánh dấu đặc trưng cho các enzyme ngoại bào Khi so sánh vùng đầu nitơ của ManA với các vị trí nối của các peptide đánh dấu khác thấy xuất hiện trình tự Ala-X-Ala tại vị trí gốc aa thứ 32 đặc trưng cho peptidase I Trình tự aa đầu

nitơ của ManA tinh sạch từ E coli là AGTSGDGRFHV (vị trí 33 đến 43) cho thấy rằng protein này được tổng hợp bởi cả E coli và T polysaccharolyticum

Các dữ liệu phân tích cho thấy ManA là một protein cấu tạo bởi 4 domain Domain xúc tác gồm 174 aa (vị trí 39 đến 212) có một vài tương đồng với endoglucanase thuộc cellulase lớp GH5 Đặc điểm dễ nhận thấy nhất là trình

tự trung tâm hoạt tính đặc trưng cho lớp enzyme này Sự thay thế glutamic acid (E) bởi alanine (A) làm mất hoạt tính enzyme Vùng này của ManA

tương đồng với CelA của Butyrivibrio fibrisolvens 22,8% và với EglA của

Clostridium acetobutylicum 20,2% Trình tự của 424 aa tiếp theo (213 đến

636) rất ít tương đồng với các trình tự đã công bố trên GenBank, EMBL, DDBJ và Swissprot ngoại trừ một đoạn 53 aa (vị trí 240 đến 292) có sự tương đồng với endo--1,4- mannosidase của C saccharolyticum (56%) và

Streptomyces lividans (56%) Sự tương đồng về trình tự aa của domain xúc

tác với trình tự của các cellulase khác trong lớp A5 chỉ ra rằng domain xúc tác được tạo thành bởi 2 domain riêng biệt, một cho cellulase và một cho hoạt tính mannanase Trong các polysaccharide depolymerase, khi hai domain xúc tác khác nhau tồn tại trong cùng một protein thì giữa chúng thường tồn tại một cấu trúc nối Không giống như trình tự cổ điển giàu Pro-Ser-Thr (hộp PT)

trong mannanase của C saccharolyticum, trình tự liên kết các domain xúc tác của ManA trong T polysaccharolyticum là PVTSPELTVS KTDFTVKAVI

DSSST (vị trí 441 đến 465) Đầu carboxy của ManA mang 3 đoạn lặp SLH ở

vị trí 59 (SLH1), 67 (SLH2) và 56 (SLH3) Các đoạn lặp này có sự tương đồng với các đoạn lặp của xylanase như endoxylanase của

Thermoanaerobacterium sp., pullulanase của T thermosulfurigenes), endoxylanase của T saccharolyticum B6A-RI và exoglucanase của

C thermocellum

Khác với ManA, ManF từ B stearothermophilus có trình tự đầu nitơ tại

aa thứ 33 đến 417 tương đồng 33, 32, 36 và 26% với -mannanase của

Aspergillus aculeatus, Trichoderma reesei, Agaricus bisporus, và từ hạt cà

chua nảy mầm (Lycopersicon esculentum) Sự sắp xếp của 7 gốc aa (Arg96,

His182, Asn227, Glu228, His306, Tyr308, và Glu345) trong ManF mang đặc trưng cho nhóm GH5 Domain đầu nitơ của ManF có sự tương đồng cao với mannanase của sinh vật nhân chuẩn Việc không có tương đồng trình tự với mannanase từ các vi khuẩn khác của ManF cho thấy rằng chúng được tổng hợp bởi các tổ tiên khác nhau Trình tự sắp xếp của ManF tạo thành hai chuỗi polypeptide khác biệt là tâm xúc tác đầu nitơ và domain đầu carboxy Chức

năng của domain đầu nitơ được quy định bởi 7 gốc aa cố định Ngược lại 277

aa cuối của ManF không có một sự tương đồng nào với các mannanase khác trong nhóm GH5 Trình tự ManF bị cắt (thiếu 136 aa từ đầu carboxy) do có vị

trí cắt bởi EcoRI cũng mã hóa cho -mannanase cho thấy rằng domain đầu carboxy không cần thiết cho hoạt tính xúc tác của -mannanase từ B

stearothermophilus 122 aa đầu carboxy của ManF tương đồng đến 49% với

đầu nitơ của ManA mã hóa -mannanase chịu nhiệt từ C saccharolyticum

Rt8B.4 thuộc nhóm GH26 Domain xúc tác của ManA nằm ở đầu carboxy

trong khi đầu nitơ lại không có hoạt tính thủy phân mannan (Ethier et al 1998)

Nhìn chung việc so sánh sự tương đồng về trình tự aa giữa các mannanase cho phép xác định chính xác enzyme thuộc lớp nào trong số các enzyme thủy phân glycoside Từ sự tương đồng về trình tự aa, chính xác là sự tương đồng về các gốc kỵ nước, gốc ái nhân cho phép xác định vùng tâm xúc tác cũng như vùng liên kết cơ chất

1.7.3 Biểu hiện endo--1,4-mannanase

Khác với mannanase tái tổ hợp nguồn gốc từ nấm mốc được biểu hiện

ở nấm men Saccharomyces cerevisae (Jackson et al 1999), các mannanase tái

tổ hợp từ vi khuẩn được biểu hiện chủ yếu ở E coli Độ phức tạp trong việc

thiết kế vector biểu hiện phụ thuộc vào sự phức tạp của bản thân enzyme Enzyme có kích thước phân tử càng lớn, cấu tạo gồm càng nhiều domain và

có điểm cắt với enzyme giới hạn thì vector biểu hiện càng phức tạp Thông thường gene mannanase được thu từ phản ứng PCR với mồi đặc hiệu Mồi được thiết kế có điểm cắt với enzyme giới hạn Điểm cắt tương ứng với vị trí cắt trên plasmid vector biểu hiện nhằm có được gene hoàn chỉnh

Trong số các mannase tái tổ hợp nguồn gốc vi khuẩn, mannanase tái tổ

hợp từ T polysaccharolyticum có hoạt tính thủy phân mannan cao nhất (1412

U/mg protein) trên cơ chất locust bean gum Để thu được mannanase tái tổ

hợp hoạt tính cao, môi trường nuôi E coli tái tổ hợp có thể được bổ xung cơ chất cảm ứng isopropyl--D-thiogalactopyranoside (IPTG) (Cann et al

1999) Ngoài ra để thu được hoạt tính mannanase tái tổ hợp cao, enzyme sau khi tinh sạch có thể được cảm ứng bằng nhiệt độ như trường hợp từ

Caldicellulosiruptor Rt8B.4 Trong trường hợp này, mannanase tái tổ hợp

được ủ ở 42C trong 2 giờ trước khi cho thực hiện phản ứng thủy phân locust

bean gum ở 60C (Gibbs et al 1996)

1.8 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN Ở VIỆT NAM

Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về mannanase từ các chủng vi sinh vật Tuy nhiên những công trình này mới bắt đầu trong vài năm lại đây, và chỉ dừng lại ở chỗ sinh tổng hợp và đánh giá

endo--1,4-hoạt tính Năm 2003, Đặng Thị Thu et al đã nghiên cứu sinh tổng hợp mannanase từ nấm mốc Aspergillus niger 92 trong môi trường có nguồn

carbon là guar gum và bã cà phê kết hợp Hoạt tính thu được sau khi tối ưu môi trường nuôi cấy đạt 94 IU/ml Bước đầu nghiên cứu khả năng thủy phân

bã cơm dừa tạo thành các oligosaccharide

Năm 2003, Lê Thị Thu Giang et al và Cao Thị Vân Hậu đã nghiên cứu thu nhận và xác định một số đặc tính mannanase ở B thuringensis DDH2

Hoạt tính endo--1,4-mannanase chủng B thuringensis nuôi cấy trong môi

trường LB có bổ sung 12 g/l cơ chất cảm ứng LBG là 7,02 IU/ml Các tác giả bước đầu đã nghiên cứu nhân dòng gene mã hóa endo--1,4-mannanase bằng phương pháp nhân dòng ngẫu nhiên Tuy nhiên phân đoạn chèn chưa được đọc trình tự và chưa có kết quả cuối cùng

2 CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT

2.1.1 Nguyên liệu

Các chủng tế bào B subtilis sinh tổng hợp endo--1,4-mannanase do

các phòng thí nghiệm cung cấp: G1 (Phòng Vi sinh vật Phân tử, Viện CNSH

và Phòng Vi sinh vật, Viện KHKTNN), 92 (Lê Thị Thu Giang et al 2003,

Cao Thị Vân Hậu 2003), STH (Viện Sau thu hoạch), và BK1 (Viện CNSH và Thực Phẩm, Đại học Bách Khoa), dùng để khảo sát hoạt tính endo--1,4-

mannanase và phân lập gene Tế bào E coli DH5 và BL21 được dùng để nhân dòng và biểu hiện gene man Vector pTZ57R/T (Fermentas, Litva) và

pET22b(+) (Hình 2.1) được dùng để nhân dòng và biểu hiện Man

Hình 2.1 Vector tách dòng pTZ57R/T và biểu hiện pET22b(+)

Các enzyme: Proteinase K (Mersck, Đức); BamHI, EcoRI, HindIII

(Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển); T4-ligase (Biolabs, Mỹ); calf intestinal alkaline phosphatase, CIAP (Biolabs, Mỹ)

Am p

O

ri

la cZ

Am p

O

ri

la cZ

Am p

O

ri

la cZ

Am p

O

ri

la cZ

Am p

O

ri

la cZ

Am p

O

ri

la cZ

Am p

O

ri

la cZ

Am p

O

ri

la cZ

Am p

O

ri

la cZ

Am p

O

ri

la cZ

Am p

O

ri

la cZ

Am p

O

ri

la cZ

Am p

O

ri

la cZ

Am p

O

ri

la cZ

Am p

O

ri

la cZ

Am p

O

ri

la cZ

Am p

O

ri

la cZ

cZ

EcoRI 615 SacI 621 XbaI 644 BamHI 654 ApI 661 HindIII 690

dT dT

2.1.2 Thiết bị thí nghiệm

Bảng 2.1 Danh sách thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm

Thiết bị Hãng sản xuất (nước)

Bể ổn nhiệt Trung Quốc Máy ly tâm lạnh Biofuge (Mỹ) Máy quang phổ Hewlett Package (Mỹ)

Hệ thống điện di ngang Biometra (Đức)

Hệ thống chụp ảnh doc

gel-Pharmacia (Thụy Điển)

Máy phá tế bào Microson (Mỹ)

Máy ly tâm Beckmann Beckmann (Mỹ)

2.1.3 Hóa chất

Bảng 2.2 Danh sách hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm

Hóa chất Hãng sản xuất (nước)

D(+)-mannose Sigma (Mỹ)

Locust bean galactomannan Sigma (Mỹ)

3,5 Dinitrosalisilic Sigma (Mỹ)

Sodium dodecylsulfate Merck (Đức)

EcoRI, HindIII, BamHI, SacI Amersham Pharmacia Biotech

(Mỹ)

DNA cloning kit, CIAP Fermentas

DNA extraction kit Fermentas

Dung dịch phá tế bào 10 mM Tris, 100 mM EDTA, 2% SDS, pH 8,0

Dung dịch tủa protein 7,5 M ammonium sulfate

Dung dịch I 50 mM glucose; 25 mM Tris-Cl; 10 mM EDTA; pH

8,0 Dung dịch II 0,2 N NaOH; 1% SDS

Dung dịch III 60% (w/v) 5 M potassium acetate; 11,5% (w/v) glacial

acetate acid; 28,5% (w/v) nước cất Dung dịch proteinase K 20 mg/ml proteinase K

Dung dịch RNase 10 mg/ml Rnase

Dung dịch nhuộm 0,1% (w/v) coomassie brilliant blue; 30% (v/v)

methanol; 10% (v/v) acid acetic Dung dịch rửa PAGE 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) acid acetic

Dung dịch ampicillin gốc 100 mg/ml ampicillin

Dung dịch nhuộm gene 0,1 g/ml ethidium bromide

đệm 1 M Tris-HCl; pH 6,8 Dung dịch A Đệm 1,5 M Tris-HCl; pH 8,8

Dung dịch B Đệm 0,5 M Tris-HCl; pH 6,8

Dung dịch C 30% acrylamide; 0,8% bis-acrylamide

100 g/ml ampicillin

SOC: 0,5% (w/v) cao nấm men; 2% (w/v) tryptone; 10 mM NaCl; 2,5

mM KCl; 10 mM MgCl2; 20 mM MgSO4; 20 mM glucose Khử trùng

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Nuôi cấy vi sinh vật

Vi sinh vật sinh tổng hợp endo--mannanase được nuôi cấy chìm trong bình tam giác 250 ml chứa 100 ml môi trường LB lỏng với 1,2% cơ chất guar gum, ở nhiệt độ 30C, lắc 200 vòng/phút trong 2 ngày

2.2.2 Xác định hoạt tính

Hoạt tính endo--1,4-mannanase được xác định tương đối theo phương pháp khuếch tán enzyme trên đĩa thạch Đĩa thạch chứa cơ chất 0,5% LBG trong đệm KP, dày khoảng 0,5 cm được đục lỗ đường kính 0,5 cm 50 l dịch enzyme được rỏ vào lỗ rồi ủ 24 giờ trong tủ lạnh cho enzyme khuếch tán Sau

đó, đĩa thạch được ủ 6 giờ ở 50C, rồi nhuộm với 1% lugol, rửa lại bằng 1 M NaCl Bán kính vòng thủy phân Rhalo = R-r, với R là bán kính vòng ngoài tính

từ tâm lỗ đến mép ngoài cùng vòng thủy phân và r là bán kính lỗ, biểu thị hoạt tính tương đối của enzyme

Hoạt tính endo--1,4-mannanase được xác định chính xác theo phương pháp quang phổ (Miller 1959), với cơ chất 0,5% LBG trong đệm phosphate Hàm lượng đường khử giải phóng ra trong dung dịch phản ứng ở 30C trong

5 phút được đo bằng quang phổ bước sóng 540 nm Độ hấp phụ được đối chiếu với đường chuẩn nồng độ đường mannose (Hình 2.2) để tính hàm lượng đường giải phóng tương đương Một đơn vị hoạt tính mannanase được định nghĩa là lượng enzyme xúc tác thủy phân giải phóng 1 mol manose trong 1 phút ở điều kiện thích hợp

Hình 2.2 Đường chuẩn nồng độ đường mannose - OD 540nm

Các phương pháp sinh học phân tử chính được tham khảo theo Sambrook và Ruessel (2001)

bào được bổ sung 900 l dung dịch phá tế bào, 5 l proteinase K và đảo trộn Hỗn hợp được ủ ở 55C đến khi tế bào bị phá hoàn toàn, để nguội xuống nhiệt

độ phòng Sau đó 4 l RNase được thêm vào, đảo trộn và ủ 15-60 phút ở 37C rồi để nguội xuống nhiệt độ phòng Dịch phá tế bào đã xử lý RNase được bổ sung 300 l 7,5 M ammonium acetate, đảo trộn nhiều lần và ủ trong

đá 15-30 phút Dịch nổi chứa DNA sau ly tâm 3 phút với 13.000 vòng/phút được hút sang ống eppendorf mới chứa 900 l isopropanol Hỗn hợp được đảo trộn và kết tủa DNA ở -20C trong nhiều giờ Tủa sau khi ly tâm được làm khô ống bằng giấy thấm và bổ sung 500 l 70% ethanol, đảo trộn rửa DNA để loại muối và isopropanol Sau ly tâm 1 phút với 13.000 vòng/phút, tủa được làm khô và hòa trong 100 l đệm TE và bảo quản DNA ở 4C

2.2.4 Tách chiết plasmid DNA

Một khuẩn lạc biến nạp phát triển trên đĩa thạch được cấy vào ống nghiệm 3 ml LB chứa ampicillin, nuôi lắc qua đêm ở 37C, 200 vòng/phút Tủa tế bào từ 1,5 ml dịch nuôi cấy (ly tâm 5 phút với 6.000 vòng/phút) được vortex khoảng 30 giây trong 150 l dung dịch I thành dịch đồng nhất Sau đó,

150 l dung dịch II được bổ sung, lắc nhiều lần, rồi ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng Thêm 150 l dung dịch III, tiếp tục lắc mạnh nhiều lần, ủ 15 phút ở 4C Hỗn hợp được bổ sung 450 l dung dịch chloroform/isoamyl alcohol 24:1, lắc rung và ly tâm 10 phút với 13.000 vòng/phút 450 l pha trên được hút sang một ống mới, bổ sung 320 l isopropanol (theo tỷ lệ 10:7) và lắc để tủa plasmid Tủa plasmid (ly tâm 15 phút với 13.000 vòng/phút) được rửa với

500 l 70% ethanol ở 4C để loại muối và isopropanol, và làm khô trong không khí ở nhiệt độ phòng Cuối cùng, tủa plasmid được hòa trong đệm TE

pH 8,0 hoặc nước khử ion vô trùng, phân tích điện di, cắt hạn chế hoặc bảo quản ở -20C

2.2.5 Khuếch đại PCR

Để khuếch đại gene mã hóa mannanase từ chủng B subtilis G1, các

mồi xuôi MAF (5'-GGC CAT GGG GGA GTT GCA TTT-3') và ngược MAR (5'-GGGA ATT CTC AAC GAT TGG CGT-3') được thiết kế dựa vào trình tự

nucleotide của gene mã hóa endo--1,4-mannanase chủng B subtilis mã số AF324506, được bổ sung điểm cắt hạn chế HindIII và EcoRI để chèn vào

vector biểu hiện pET22b(+)

Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm: 2,5 l đệm PCR; 0,5 l Taq

polymerase; 2 l MgCl2; 2 l 2,5 mM dNTP; 1 l khuôn DNA; 1 l mồi mỗi loại, bổ sung nước cất lên tổng thể tích 25 l Phản ứng được thực hiện theo điều kiện: 94C/3 phút; 35 chu kỳ: 94C/1 phút, 54C/1 phút, 72C/1 phút; 72C/10 phút

2.2.6 Giải trình tự DNA

Sau khi tinh sạch plasmid tái tổ hợp, phân đoạn chèn được giải trình tự theo nguyên lý của phương pháp Sanger cải tiến dựa trên các dideoxy DNA polymerase xúc tác gắn các deoxynucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp vào đầu 3'-OH, khi gặp dideoxynucleotide đánh dấu huỳnh quang không

có nhóm 3'-OH phản ứng tổng hợp sẽ bị dừng lại Kết quả là hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide có kích thước hơn kém nhau một nucleotide, được phát hiện bằng đầu dò huỳnh quang trên máy đọc trình

tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer Vector pTZ57R/T được gắn hai trình tự mồi xuôi M13 và mồi ngược M13 (-20) để đọc trình tự phân đoạn chèn DNA ngoại lai

2.2.7 Điện di polyacrylamide

Điện di protein được thực hiện trên gel polyacrylamide 12,5% theo Laemmli (1970) Sự phân tách các protein bằng điện di gel polyacrylamide SDS (SDS-PAGE) không phải dựa vào sự tích điện bên trong của các polypeptide mà dựa vào khối lượng phân tử SDS là một chất hoạt tính bề mặt

có điện tích âm (anion), làm biến tính protein bằng cách bao phủ xung quanh mạch polypeptide chính của phân tử protein Trong điện di protein, SDS sẽ cung cấp một mạng lưới điện tích âm dọc suốt theo chiều dài chuỗi polypeptide Như vậy với sự có mặt của SDS và một yếu tố khử, các polypeptide trở nên duỗi thẳng và tích điện âm Khi điện di, dưới tác dụng của dòng điện một chiều các phân tử protein tích điện âm sẽ di chuyển đến cực dương và được phân tách thành các băng khác nhau theo khối lượng của mỗi phân tử Gel sau khi điện di được nhuộm với dung dịch Coomassie Brilliant Blue trong 1 giờ Sau đó gel được tẩy màu bằng dung dịch tẩy cho đến khi nền gel trở nên trong còn các băng protein xuất hiện màu xanh

2.2.8 Cắt DNA bằng enzyme giới hạn

DNA tổng số hoặc plasmid được cắt với các enzyme hạn chế BamHI,

EcoRI, SacI và HindIII trong 1 giờ ở 37C Tổng thể tích phản ứng 50 l gồm

5 đơn vị enzyme hạn chế; 40 l dung dịch DNA; 5 l đệm cắt 10x Sau phản ứng, sản phẩm cắt được kiểm tra trên gel agarose điện di

2.2.9 Tách phân đoạn DNA từ agarose

Phân đoạn DNA trên gel agarose được tách chiết theo QIAquick Gel Extraction Kit và kiểm tra lại kết quả bằng điện di trên gel agarose

2.2.10 Gắn dính DNA

Phản ứng gắn dính bao gồm 1 l đệm gắn dính 10x; 2 l DNA plasmid; 6,5 l phân đoạn chèn DNA hoặc nước cất vô trùng (đối chứng âm tính); 0,5

l T4 ligase; tổng thể tích 10 l Phản ứng được thực hiện qua đêm ở 16C

2.2.11 Biến nạp plasmid hóa học

Plasmid được biến nạp vào tế bào khả biến E coli theo phương pháp sốc nhiệt và hóa học Một khuẩn lạc E coli được cấy chuyển vào 3 ml môi

trường LB có kháng sinh thích hợp, lắc 200 vòng/phút ở 37C qua đêm 100

ml môi trường LB được tiếp giống với 1 ml dịch tế bào qua đêm, nuôi lắc ở 37C với 200 vòng/phút Khi OD600nm đạt 0,4-0,6 (khoảng 2-3 giờ nuôi cấy), dịch nuôi cấy được đặt vào đá lạnh 1 giờ, rồi ly tâm 10 phút ở 4C với 6000 vòng/phút Tủa tế bào được hòa đều trong 100 ml CaCl2 100 mM lạnh, vô trùng, ủ đá lạnh 15 phút và ly tâm như trên Tủa tế bào lại được hòa đều trong

40 ml CaCl2 100 mM lạnh, vô trùng, ủ đá khoảng 1 giờ và ly tâm 10 phút với 4.000 vòng/phút Tủa tế bào được hòa vào 500 l 100 mM CaCl2 lạnh, vô trùng, chứa 15% glycerol Dịch hỗn hợp tế bào và glycerol được chia nhỏ ra các ống 40 l/ống Eppendorf, dùng biến nạp ngay hoặc bảo quản ở -80C để biến nạp sau

1 l dung dịch plasmid hoặc hỗn hợp phản ứng nối được trộn với 40 l dịch tế bào khả biến vừa chuẩn bị xong (hoặc tế bào khả biến ở -80C được giải đông), ủ 20-30 phút ở 4C Hỗn hợp được gây sốc nhiệt 45 giây ở 42C Sau đó được đặt ngay vào đá lạnh khoảng 2 phút rồi bổ sung 250 l môi trường SOC đã khử trùng [0,5% (w/v) cao nấm men; 2% (w/v) tryptone; 10

mM NaCl; 2,5 mM KCl; 10 mM MgCl2; 20 mM MgSO4; 20 mM glucose hoặc LB Sau khi ủ lắc hỗn hợp khoảng 60 phút ở 37C với 200 vòng/phút,

50-200 l dịch tế bào đã biến nạp plasmid được cấy trải trên đĩa thạch có chứa chất chỉ thị (theo hệ thống chọn lọc xanh/trắng) hoặc cơ chất và kháng sinh thích hợp, ủ qua đêm ở 37C để sàng lọc tiếp

2.2.12 Phần mềm phân tích

Để phân tích trình tự nucleotide và amino acid của DNA và protein, một chương trình phần mềm chuyên dụng DNAStar được sử dụng để tìm OFR, so sánh nucleotide và amino acid, xây dựng cây di truyền và tính khoảng cách di truyền

3 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 NUÔI CẤY CHỦNG CÓ HOẠT TÍNH ENDO--1,4-MANNANASE 3.1.1 Chọn chủng có hoạt tính endo--1,4-mannanase cao

Bốn chủng vi khuẩn BK1 (Phòng Hóa sinh, Trường Đại học Bách khoa

Hà Nội), 92 (Phòng Enzyme học, Viện CNSH, Viện KHCN Việt Nam), STH (Viện Sau thu hoạch) và G1 (Phòng Vi sinh vật, Viện KHKTNN Việt Nam)

có hoạt tính endo--1,4-mannanase được nuôi cấy và xác định hoạt tính tương đối trên đĩa thạch có chứa 0,5% cơ chất LBG Sau khi ủ ở 37C và nhuộm

bằng 1% lugol, vòng thủy phân cơ chất xuất hiện (Hình 3.1) Chủng B

subtilis G1 có vòng thủy phân cơ chất rộng nhất tương ứng với hoạt tính cao

nhất được chọn để nhân dòng

Hình 3.1 Hoạt tính endo--1,4-mannanase trên đĩa thạch

của các chủng B subtilis STH (1); 92 (2); BK1 (3); G1 (4)