Giâm cành chè in vitro

Giâm cành chè in vitro

Đại học Quốc gia Tp.Hồ Chí Minh Trường Đại học Bách Khoa Khoa Công nghệ Hóa học

BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC

CBHD Cô : Lê Thị Thuỷ Tiên

Sinh viên : Nguyễn Thị Mộng Vân 60802586 Vũ Viết Văn Thưởng 60802199 Lớp : HC08SH

Năm học: 2010 _ 2011

Mục Lục:

I Mở Đầu

II Tổng Quan Tài Liệu

1 Nguồn gốc cây chè

2 Phân loại cây chè

3 Giá trị của cây chè

4 Tình hình sản xuất chè ở thế giới và Việt Nam

5 Giới thiệu giống chè TB14

6 Các phương pháp nhân giống chè

7 Cơ sở của giâm cành chè

8 Các nghiên cứu về in vitro trên chè

I Vật Liệu Và Phương Pháp Nghiên Cứu

1 Vật liệu thí nghiệm

2 Phương pháp thí nghiệm

II Kết Quả Và Thảo Luận

1 Hình ảnh quá trình nuôi cấy hom chè

2 Xác định phương pháp, chất khử trùng mẫu, thời gian khử trùng mẫu

3 Kết luận

4 Đề nghị

III Nghiên Cứu Chiết Xuất và Xác Định tác dụng kháng oxy hóa

của Polyphenol từ lá chè xanh Việt Nam

1 Giới Thiệu

2 Hợp chất EGCG:

3 Chiết Xuất EGCG:

IV Tài Liệu Tham Khảo:

I MỞ ĐẦU

Cây chè (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) là cây công nghiệp dài ngày có giá trị xuất

khẩu và vai trò quan trọng trong việc bố trí cơ cấu cây trồng và dân cư ở nước ta Cây chè có chu kỳ khai thác kinh tế kéo dài 40 – 50 năm và có thể trên 100 năm, mang lại nguồn thu nhập chính cho nhiều nông hộ Năm 2006 tổ chức Y tế thế giới đã bình chọn: “Thức uống lựa chọn

số một có lợi cho sức khỏe là nước chè” Theo tổ chức FAO (2006), Việt Nam được xếp thứ 7

về sản lượng và thứ 6 về khối lượng xuất khẩu chè trên thế giới Cả nước có khoảng 125000

ha chè với sản lượng 570000 tấn chè thô của 630 cơ sở nhà máy ở 34 tỉnh thành trong cả nước Qua đó, cho thấy việc phát triển và mở rộng diện tích chè và năng cao chất lượng chè nguyên liệu để phục vụ xuất khẩu là rất cần thiết

Chè là cây giao phấn, cây con trồng từ hạt phân ly tính trạng mạnh, làm vườn chè không đồng đều, để phát triển những vườn chè đồng đều cho năng suất cao, phẩm chất tốt, biện pháp được khuyến cáo là nhân giống vô tính

Biện pháp giâm cành truyền thống dễ áp dụng, có hệ số nhân giống cao.Tuy nhiên, phương pháp giâm cành bằng hom truyền thống làm cho tuổi chung của cây chè con cao hơn do mang một phần tuổi chung từ cây mẹ làm giảm chu kỳ khai thác kinh tế về sau Nếu quy trình giâm cành chè không được thực hiện nghiêm ngặt, nguyên liệu giâm cành không được trẻ hóa đúng thì cây con sẽ mau bị thoái hóa Thời gian gần đây, ở các vườn chè cành mới nhất là các vườn chè trồng các giống Đài Loan cây chè sinh trưởng kém và có triệu chứng thoái hóa

Hiện nay, việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp in vitro có xu hướng ngày càng được áp dụng rộng rãi, đạt được nhiều kết quả khả quan Nhân giống in vitro có thể tạo được

cây sạch bệnh, phục tráng giống

Dựa trên những ứng dụng của công nghệ sinh học trong nhân giống cây trồng, giâm cành

chè in vitro đã được tiến hành Tuy nhiên, nhân giống bằng phương pháp giâm cành chè in vitro là phương pháp tương đối mới Hiện nay vẫn là chủ đề nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới, kết quả thu được còn hạn chế Việc nghiên cứu phương pháp nhân giống chè in vitro còn cung cấp phương tiện phục tráng giống chè cành

Một số nghiên cứu gần đây trên thế giới đã có những thành công bước đầu trong việc áp

dụng biện pháp nhân giống in vitro trên chè Nguyên nhân lớn nhất hạn chế việc áp dụng của phương pháp in vitro trên chè là giai đoạn vô mẫu Do hàm lượng tanin trong cây chè cao nên

xác định phương pháp khử tanin trong mẫu thích hợp là rất quan trọng

Tuy nhiên, tại Việt Nam, việc áp dụng phương pháp in vitro để nhân giống chè

rất ít và chưa có kết quả nào công bố

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Nguồn gốc cây chè

Việc xác định nguồn gốc cây chè cho đến hiện tại vẫn còn nhiều quan điểm khác nhau về nguồn gốc cây chè, dựa trên những cơ sở về lịch sử, khảo cổ học và thực vật học

Trong suốt thời gian dài, dựa vào những sự khác biệt về hình thái của các giống chè Ấn Độ

và Trung Quốc, các nhà thực vật học đã chấp nhận giả thuyết cây chè có hai trung tâm khởi nguyên: Trung Quốc và Ấn Độ Nhưng theo Hashimoto và Shimura, sự khác biệt giữa chè Ấn

Độ và chè Trung Quốc không đủ để giữ thuyết nhị nguyên về nguồn gốc chè Bởi vì chè Ấn

Độ và chè Trung Quốc đều có cùng số nhiễm sắc thể (2n = 2x = 30) và chúng có thể thụ phấn chéo một cách tự do

Một số quan điểm được nhiều người chấp nhận nhất hiện nay là:

 Theo Daraselia (1989) luận điểm có cơ sở khoa học là dựa theo học thuyết“Trung tâm khởi nguyên cây trồng” của Vavilôp thì cây chè có nguồn gốc ở Vân Nam Trung Quốc (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Thiết, 2005)

Cây chè có nguồn gốc ở vùng Assam (Ấn Độ) Năm 1823, Bruce đã phát hiện

những cây chè dại lá to ở vùng Assam

Cây chè có nguồn gốc ở Việt Nam: Những công trình nghiên cứu của Djemukhatze (1961 – 1976) về phức chất cathesin của lá chè từ những nguồn gốc khác nhau, so sánh về thành phần các chất cathesin giữa các loại chè được trồng và chè mọc hoang dại đã nêu lên luận điểm về

sự tiến hóa sinh hóa của cây chè, trên cơ sở đó xác minh nguồn gốc của cây chè Djemukhatze kết luận rằng những cây chè mọc hoang dại ở Việt Nam tổng hợp chủ yếu là (-) – epicathesin

và (-) – epicathesin galat (chiếm 70% tổng số các loại cathesin ), cho phép đi tới một quyết định mới: “Nguồn gốc cây chè chính là ở Việt Nam”

Tuy có rất nhiều quan điểm khác nhau chứng minh về nguồn gốc ra đời của cây

chè nhưng đều có một sự thống nhất đó là: Cây chè có nguồn gốc từ Châu Á, nơi có

điều kiện khí hậu nóng ẩm

2 Phân loại cây chè

Cây chè có tên khoa học là Camellia sinensis (L.) O Kuntze hoặc Thea sinensis L., thuộc ngành thực vật hạt kín Angiospermae, lớp song tử diệp Dicotyledonae, bộ chè Theales, họ chè Theaceae, chi chè Camellia (Thea), loài sinensis

Hiện nay trong các cách phân loại, cách phân loại cây chè của Cohen Stuart (1919), chia cây chè ra làm bốn thứ (varietas):

Chè Trung Quốc lá to (Camellia sinensis var macrophylla Sieb),

chè Trung Quốc lá nhỏ (Camellia sinensis var bohea hay (Camellia sinensis var

microphylla),

chè Shan (Camellia sinensis var Shan J Wan-Fan)

chè Ấn Độ (Camellia sinensis var.assamica (Mast) Choisy)

(trích dẫn bởi Võ Thái Dân, 2004)

3 Giá trị của cây chè

Chè là loại nước uống thông dụng và phổ biến ở nhiều nước trên thế giới Hỗn

hợp tanin trong chè có tác dụng làm nguôi cơn khát Cafein và một số hợp chất ankaloide khác (theobromin, theofinlin, adenine) trong chè là những chất có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, kích thích vỏ đại não làm cho thần kinh minh mẫn, kích thích sự tiêu hóa Trong chè có chứa nhiều vitamin: A, B1, B2, B6, K, PP,… và đặc biệt chứa nhiều Vitamin C

Đây là nguồn dinh dưỡng có giá trị và rất cần thiết cho cơ thể Theo Zaprometo, cathesin chè

có tác dụng vững chắc cho mao mạch trong cơ thể con người

Qua kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật Bản đã chứng minh chè có tác dụng chống phóng xạ đó là chất stronti 90 (Sr-90) là một đồng vị phóng xạ nguy hiểm

Ngoài ra, chè được dùng làm chất tạo màu thực phẩm vừa có khả năng thay thế các chất tạp màu nhân tạo độc hại, có giá trị dinh dưỡng cao Các sản phẩm phụ của chè như dầu hạt chè có thể sử dụng trong công nghiệp hay làm dầu ăn như các loại thực phẩm khác

4 Tình hình sản xuất chè ở thế giới và Việt Nam

4.1 Tình hình sản xuất chè trên thế giới

Chè được trồng tập trung nhiều nhất ở Châu Á và Châu Phi Trên thế giới cây chè được phát triển với tốc độ rất nhanh từ thế kỷ XVIII Trên thế giới hiện nay có khoảng 52 nước trồng chè, chiếm 2,7 triệu hecta diện tích đất canh tác nông nghiệp trên thế giới, sản lượng hàng năm đạt 2,2 triệu tấn Mặc dù chỉ chiếm 16,4% tổng diện tích sản xuất chè của thế giới nhưng Ấn Độ là nước xuất khẩu chè lớn nhất thế giới với doanh thu hàng năm đạt 66 triệu đôla Mỹ một năm.Trong những năm qua diện tích chè trên thế giới không ngừng tăng trưởng bình quân 40.000 ha/năm Theo Mao (1995) diện tích chè thế giới ổn định trong vòng 15 năm qua đạt khoảng 2.430.000 ha Sản lượng chè thế giới gia tăng do được chú trọng đầu tư, nghiên cứu cải thiện Số lượng thống kê của FAO về diện tích chè trên thế giới được trình bày

ở bảng 2.1 và bảng 2.2

Bảng 2.1 Diện tích chè kinh doanh (ha) ở một số khu vực trên thế giới 2000 – 2007

Năm Thế giới Châu á Châuphi Châumỹ Châu âu Châu đại dương

Về lâu dài, các nước sản xuất chè lớn đều tăng sản lượng kể từ thập niên 80 nhưng với tốc

độ chậm Hơn nữa, sản lượng thu hoạch rất khác nhau giữa các năm do phụ thuộc nhiều vào thời tiết và nhiều nhân tố khác

Nhìn chung, sản lượng chè dự kiến sẽ tăng khoảng 1,9%/năm giai đoạn từ 1999- 2010, cao hơn mức bình quân 1,3%/năm của thập kỷ 90 Phần lớn sự tăng trưởng này là nhờ gia tăng sản lượng chè xanh

Theo ước tính của FAO, sản lượng chè đen thế giới sẽ tăng trung bình 1,2 triệu tấn/năm lên 2,4 triệu tấn vào năm 2010, chủ yếu là nhờ tăng năng suất Trong giai đoạn này, dự đoán phần lớn các nhà sản xuất chè châu Phi sẽ tăng sản lượng do các đồn điền chè đã đến tuổi trưởng thành và kỹ thuật sản xuất cũng được cải thiện Ví dụ như sản lượng chè của Uganda, Kenya

và Tanzania được dự đoán sẽ tăng tương ứng thêm 2,7%, 2,3% và 1,7%

Bảng 2.2 Một số quốc gia có diện tích sản xuất chè (ha) lớn trên thế giới

năm Ấn độ Trung quốc Sri lanka Kenya Indonesia

Tại châu Á, sản lượng chè Ấn Độ ước tăng bình quân 2,5%/năm cho đến năm 2010 Trong thập kỷ này, tỉ trọng của Ấn Độ trong tổng sản lượng chè thế giới sẽ tăng từ 38% lên 44% Sản lượng chè của Inđônêxia và Sri Lanka ước tăng lần lượt 1,1% và 1,7% Tuy nhiên, sản lượng chè đen của Trung Quốc có thể sẽ tiếp tục giảm (khoảng 1,7%/năm) do nước này đang tập trung sản xuất các loại chè khác Đến 2010, dự đoán ba nước sản xuất chè đen lớn nhất thế giới là Ấn Độ, Kyena và Sri Lanka sẽ chiếm 70% sản lượng chè toàn cầu, tăng so với 63% năm 2000

Chè xanh chủ yếu được sản xuất ở Trung Quốc (chiếm 73% sản lượng thế giới năm 2000), Nhật Bản (13%), Việt Nam (6%) và Inđônêxia (6%) Phần lớn chè xanh được tiêu thụ ngay tại nước sản xuất (như Trung Quốc và Nhật Bản) Khối lượng xuất khẩu rất thấp, chỉ khoảng 27% Trong năm 2001, nhập khẩu chè xanh thế giới chỉ đạt tổng cộng 187.000 tấn, bằng 17% lượng chè đen nhập khẩu

Theo ước tính của FAO, sản lượng chè xanh thế giới sẽ tăng bình quân 2,6%/năm cho đến năm 2010, cao hơn gấp 3 lần tỉ lệ tăng trưởng của chè đen và đạt 900.000 tấn Trong đó, sản lượng chè xanh của Trung Quốc tăng nhiều nhất (2,7%/năm), tiếp đến là Việt Nam (2,5%), Inđônêxia (2,3%) và cuối cùng là Nhật Bản (0,1%/năm) Đến năm 2010, Trung Quốc sẽ chiếm tới 75% sản lượng chè thế giới

4.1 Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam

Việt Nam được xác định là một trong tám địa điểm cội nguồn của cây chè, có điều kiện địa hình, đất đai, khí hậu phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cây chè và đứng thứ năm trên thế giới về sản lượng và xuất khẩu chè Sản phẩm chè của Việt Nam có mặt trên 110 quốc gia và vùng lãnh thổ, trong đó “CheViet” đã được đăng ký bảo hộ tại 70 thị trường (Hiệp hội Chè Việt Nam, 2009)

Năm 2004, toàn quốc có 108.000 ha chè, đạt năng suất 513,8 nghìn tấn (chè tươi) trong đó

có 85% diện tích đang được trồng bằng các giống chè địa phương có năng suất và chất lượng thấp nên chất lượng chè của Việt Nam chỉ đạt mức trung bình yếu của thế giới (Báo cáo ngành chè năm 2004)

Bảng 2.3 Biến động diện tích, năng suất và sản lượng chè ở Việt Nam từ 2000- 2007

Năm Diện tích(ha) Năng suất

(kg chè khô/năm/ha)

Sản lượng (tấn/năm)

Hiện nay, nước ta có năm vùng sản suất chè chính bao gồm:

Vùng chè miền núi Tây Bắc: gồm Sơn La, Lai Châu là hai tỉnh trồng chè lớn, giống chè trồng chủ yếu là Shan và Trung Du

Vùng chè Việt Bắc – Hoàng Liên Sơn: gồm các tỉnh Hà Giang, Tuyên Quang, Yên Bái, Hòa Bình, Lào Cai, giống chè chủ yếu là Shan, Trung du, Assam

Vùng chè Trung du – Bắc Bộ: Bao gồm Thái Nguyên, Bắc Cạn, Phú Thọ, Yên Bái, Hà Tây, giống chủ yếu được trồng chủ yếu là Trung Du, Assam và chè lai

Vùng chè Bắc Trung Bộ: gồm các tỉnh Nghệ An, Thanh Hóa, Hà Tĩnh, giống trồng chu yếu

là chè Gay địa phương và chè Assam

Vùng chè Miền Nam: chủ yếu trồng ở vùng Tây Nguyên như Lâm Đồng, Gia Lai, Kontum

và Đắc Lắc, giống được trồng chủ yếu là chè Shan

Việt Nam trở thành thành viên chính thức của Tổ chức thương mại thế giới (WTO) từ tháng 1/2007 Nền nông nghiệp nói chung, ngành chè nói riêng bước vào quá trình hội nhập đối mặt với thách thức lớn về cải thiện chất lượng sản phẩm, tiếp cận thị trường mới, nhất là bối cảnh buộc phải thực hiện những biện pháp ngặt nghèo hơn các nước khác về kiểm dịch động thực vật, an toàn thực phẩm, sở hữu trí tuệ và các rào cản kỹ thuật trong thương mại Năm 2006, chè Việt Nam đứng ở vị trí thứ 6 về diện tích, thứ 7 về sản lượng và thứ 5 về lượng xuất khẩu trong số gần 40 nước sản xuất và hơn 30 nước xuất khẩu chính, được xem là kỷ lục về sản lượng và giá trị xuất khẩu mà trước đó chưa từng có Theo số liệu của của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn năm 2009, diện tích trồng chè của Việt Nam sẽ đạt 131,5 nghìn ha tăng 1.900 ha so với diện tích năm 2007 Năng suất trồng chè năm 2009 dự kiến đạt 6,5 tấn búp tươi/ha, tăng so với mức 5,9 tấn/ha của năm 2007 (Vinanet, 2009) Song, chè Việt Nam là một trong số ít nước được cảnh báo về dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong thực phẩm Chính vì vậy, vấn đề sản xuất chè an toàn, chất lượng, bền vững, an toàn cho sức khỏe của con người, bảo vệ môi trường và phát triển nông nghiệp bền vững đã và đang được nghành chè quyết tâm thực hiện

5 Giới thiệu giống chè TB14

Là giống chè Shan Trấn Ninh được người Pháp bình tuyển tại Blao từ tập đoàn so sánh giống của Trung tâm thực nghiệm nông nghiệp Bảo Lộc từ năm 1952 Hiện nay là giống chủ lực của nghành chè Lâm Đồng chiếm 80% diện tích (Trung tâm nghiên cứu và chuyển giao kĩ thuật cây công nghiệp và cây ăn quả Lâm Đồng, 2008)

Giống chè TB14 có lá màu xanh nhạt, hình thon dài, lá dài từ 10 – 15 cm, rộng 4 – 4,5 cm,

có 12 đôi gân lá Mép lá có răng cưa đều và kéo dài đến chóp lá Góc lá lớn, trên tôm có nhiều lông tơ trắng mịn, khả năng phân cành mạnh, năng suất đạt từ 18 – 20 tấn/ha/năm Chất lượng chè phù hợp với chế biến hương nội tiêu và chè đen Hiện nay là giống chè cành chủ lực ở Lâm Đồng

6 Các phương pháp nhân giống chè

6.1 Nhân giống bằng hạt

Đây là phương pháp nhân giống chè đầu tiên được áp dụng từ khi ngành chè Việt Nam phát triển Hiện nay trong phát triển ngành chè khuyến cáo là không nên sử dụng vì chè là cây giao phấn nên vườn chè trồng bằng hạt có sự phân ly rất lớn về hình thái, về đặc tính sinh trưởng,

về năng suất, phẩm chất giảm và không ổn, chỉ được áp dụng trong công tác chọn tạo giống mới ở các trung tâm nghiên cứu

 Ưu điểm

– Đơn giản, dễ làm giá thành thấp

– Chi phí lao động thấp

– Tuổi thọ của cây chè cao

– Cây có khả năng thích ứng rộng trên nhiều địa hình

 Nhược điểm

– Cây chè không giữ được đặc tính của cây mẹ, quần thể cây chè không đồng

đều, năng suất chè không cao, chất lượng phẩm chất không ổn định

– Hạt chè dễ mất sức nảy mầm và khó bảo quản được lâu Thời vụ gieo hạt chủ yếu phụ thuộc vào mùa quả chín thường gieo vào đầu tháng 10 đến hết tháng 11 Số lượng hạt gieo cho một hecta 200 – 250 kg tương đương 400 – 500 kg quả Do đó hệ số nhân giống thấp Theo Đỗ Ngọc Quý và ctv (1978) một hecta chè để giống quả chỉ trồng được bốn hecta

6.2 Nhân giống bằng phương pháp chiết cành

Chiết cành chè được tiến hành trên cây mẹ, hàng năm các cành chiết không thu hái, sau đó tiến hành chiết bằng hai cách:

Cách 1: Uốn cành sát đất, lấy đất vùi một phần cành, phần bị lấp đất sẽ mọc ra rễ mới

Cách 2: Đắp đất vào toàn bộ gốc cao đến tận các cành, để cho phần cành bị lấp mọc ra rễ

mới Khi cành chè có bộ rễ phát triển tốt tiến hành chặt đứt phần tiếp giáp với cây mẹ rồi bứng cành đưa đi trồng

 Ưu điểm

– Cây con mau cho thu hoạch búp, rút ngắn thời gian kiến thiết cơ bản

– Cành chiết đem trồng có tỷ lệ sống cao

 Nhược điểm

– Phương pháp chiết cành có hệ số nhân giống thấp một cây chè mẹ chỉ được

10 – 15 cây con

– Tốn nhiều nhân công nên không được phổ biến rộng rãi trong sản xuất

6.3 Nhân giống bằng ghép cây con trong giai đoạn vườn ươm

Chè là cây giao phấn vì vậy khi trồng chè bằng hạt làm cây chè dễ bị thoái hóa và lẫn tạp, năng suất không ổn định, nhưng chè trồng bằng hạt có bộ rễ phát triển tốt ăn sâu, chịu hạn tốt Mặt khác, cây chè trồng bằng cành cho năng suất cao hơn chè trồng bằng hạt từ 33 – 45 % tùy giống (kết quả nghiên cứu của Trường Đại Học Nông Nghiêp I Hà Nội), nhưng bộ rễ của chè cành phát triển nông và chịu hạn kém Tháng 5 – 1999 Trung tâm Nghiên cứu và chuyển giao

kỹ thuật cây Công nghiệp và cây Ăn Quả Lâm Đồng đã tiến hành nghiên cứu thành công kỹ thuật tạo cây chè ghép Cây chè ghép được tạo thành bằng cách kết hợp giữa hai cá thể, chè trồng bằng hạt làm gốc ghép và chè cành làm cành ghép Cành ghép lấy từ cây chè giống nội địa hoặc nhập nội có năng suất và phẩm chất cao, dễ canh tác và chăm sóc

 Ưu điểm:

– Sản lượng và chất lượng chè cao hơn cây chè hạt

– Cây con đồng đều

– Cây chè ghép có khả năng chống chịu tốt và tuổi thọ cao, dễ chăm sóc

 Nhược điểm:

– Chi phí cao, đòi hỏi kỹ thuật trong thao tác ghép, thời vụ ghép

6.4 Nhân giống bằng phương pháp giâm cành

Hiện nay, giâm cành chè là một phương pháp nhân giống phổ biến trên thế giới

Giâm cành chè được nghiên cứu ở Trung Quốc từ năm 1900, Ấn Độ 1911, Gruzia năm 1928, Srilanka năm 1938 Ở nước ta, miền Bắc bắt đầu nghiên cứu và ứng dụng năm 1962, miền Nam năm 1952 (Đỗ Ngọc Quỹ và ctv, 1997)

 Ưu điểm:

– Có hệ số nhân giống rất cao, có thể cung cấp đồng thời một số lượng giống lớn, tránh được khó khăn thiếu giống khi trồng mới Một hecta chè để giống đem giâm cành có thể trồng được

30 – 70 hecta (Lê Tất Khương và ctv 1999) Số liệu từ Viện nghiên cứu chè Phú Hộ cho thấy

từ một hecta vườn chè giống bốn tuổi có thể cung cấp được khoảng ba triệu hom, đủ cây cho trồng mới 50 hecta nếu trồng hai cây/hố, hoặc 80 hecta nếu trồng một cây/hố

– Tạo được vườn chè đồng đều với những đặc tính tốt của cây mẹ, rất thuận lợi cho đầu tư và thâm canh, cơ giới hóa, cho năng suất cao, nguyên liệu đồng đều giúp chế biến được chè có chất lượng tốt và ổn định

– Rút ngắn được thời gian kiến thiết cơ bản Thời gian cho thu hái nhanh khoảng hai đến ba năm (Viện nghiên cứu chè, 2000)

 Nhược điểm:

– Phải qua giai đoạn vườn ươm

– Đòi hỏi phải có kỹ thuật trong các khâu giâm cành, chăm sóc, quản lý vườn ươm tỉ mỉ, tốn nhiều công lao động

– Khối lượng vận chuyển cây con ra trồng ngoài đồng lớn

– Giá thành cây con cao, làm tăng đáng kể chi phí trồng mới, chi phí cao hơn

trồng hạt từ sáu đến tám lần (Viện nghiên cứu chè, 2000)

– Trong thời gian kiến thiết cơ bản, khả năng chịu hạn của cây con kém

6.5 Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô

Hiện nay, nhân giống chè bằng phương pháp nuôi cây mô là một hướng nghiên cứu rất mới Theo Willson và Clifford (1992), những tiến bộ gần đây trong nghiên cứu tế bào và nuôi cấy mô mở ra cơ hội cho không chỉ việc nhân nhanh chóng vật liệu nhân giống, và cả cho việc

sử dụng các quy luật di truyền, sinh lý học và sinh hóa học vào việc phát triển các dòng chè đặc trưng Đối với các nước trồng chè nổi tiếng trên thế giới hiện nay như: Ấn Độ, Trung

Quốc, Nhật Bản, Kenya, Đài Loan…đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trên chè thu được một số thành tựu bước đầu trong việc chuẩn hóa quy trình nuôi cấy, môi trường nuôi cấy mô chè

 Ưu điểm:

– Tạo ra cây con đồng nhất và giống như cây mẹ Phần này giống như nhân giống vô tính Đối với các cây trồng thuộc nhóm thụ phấn chéo như phần lớn các loài cây ăn trái, các cây con sinh ra từ hạt không hoàn toàn đồng nhất, và có thể không giống như cây mẹ, trong trường hợp này nhân giống vô tính có lợi điểm hơn nhân giống qua hạt

– So với kiểu nhân giống vô tính thông thường (chiết cành, hom), nhân giống bằng nuôi cấy

mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong thời gian ngắn

– Có thể tạo ra cây con sạch bệnh nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban đầu một cách chặt chẽ hoặc làm cho vật liệu ban đầu trở nên sạch bệnh Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh Một giống cây quý có thể được nhân ra nhanh chóng để đưa vào sản xuất Việc trao đổi giống được dễ dàng

– Phục tráng giống

 Nhược điểm:

– Đòi hỏi kỹ thuật cao

– Chi phí cao

6.6 Nhân giống bằng phương pháp giâm cành in vitro

Đây là phương pháp nhân giống dựa trên sự kế thừa của phương pháp giâm cành truyền thống và nuôi cấy mô Bằng cách sử dụng một hom chè mang một mầm nách qua khử trùng được giâm trong môi trường dinh dưỡng có chứa chất kích thích sinh trưởng Hom chè sẽ được kích thích cho tăng trưởng tạo rễ và tạo chồi trực tiếp từ hom chè, không qua giai đoạn tạo cụm chồi và cấy chuyền Từ một hom chè ban đầu qua giâm cành tạo thành một cây con phát triển hoàn chỉnh rễ thân lá, rồi tiến hành trồng ra đất

 Ưu điểm

– Làm cho cây con thuần nhất và sinh trưởng tốt, cây được làm trẻ lại và ít nhiễm bệnh – Giữ nguyên đặc tính của cây mẹ, có ý nghĩa trong công tác phục tráng giống và nhân giống chè

– Hệ số nhân giống cao

– Có thể tiến hành nhân giống quanh năm, rút ngắn thời gian nhân giống

– Tuổi chung của cây chè tạo ra từ giâm cành in vitro nhỏ hơn tuổi chung của cây chè được

tạo ra từ giâm cành truyền thống

2.7 Cơ sở của giâm cành chè

7.1 Cơ sở hình thành callus và rễ

Khi cắt đoạn thân chè giâm vào trong môi trường dinh dưỡng thích hợp sau một thời gian

sẽ xuất hiện những mô lồi màu trắng nhạt hay vàng nhạt đó la callus Nhờ sự biến đổi của tế bào tượng tầng chu luân và các tế bào nhu mô ở cạnh mô sẹo xảy ra hiện tượng phản phân hóa

và tại những chỗ riêng biệt của callus dưới tác động của chất kích thích sẽ tạo ra các tế bào mới là nhóm tế bào phân sinh, chúng phát triển thành các mấu lồi là nguồn gốc của rễ non Chúng chọc thủng vỏ hóa bần của mô sẹo và chui ra ngoài (trích dẫn bởi Lê Tuyết Hoa, 1990) Callus được coi là nguồn cung cấp dinh dưỡng vì không bào chứa nhiều chất dự trữ cần thiết để tạo rễ Theo Mitshuhashi (1969), Mai Trần Ngọc Tiếng (1983) và Nguyễn Bá (1987) quá trình hình thành rễ gồm hai giai đoạn:

Giai đoạn 1: giai đoạn chuẩn bị, khởi sự bằng sự hoạt động của một vài tế bào tầng phát sinh libe gỗ hoặc chu luân để tạo một nhóm tế bào sơ khởi

Giai đoạn 2: là giai đoạn kéo dài của tế bào sơ khởi Mỗi giai đoạn do một nhóm kích tố điều khiển Các kích tố của giai đoạn hai phối hợp với nhau tạo sự cân bằng thích hợp thì rễ bất định mới tạo đủ số lượng và chiều dài thích hợp cho cây (trích dẫn bởi Lê Tuyết Hoa, 1990) Chất điều hòa sinh trưởng auxin có tác động kích thích ra rễ Theo Hartmann và Kester’s (2002), sự hình thành rễ bất định chịu ảnh hưởng của chồi và lá có trên cành giâm Đối với một số loài, nếu ta cắt bỏ lá hoặc chồi thì cành giâm sẽ không ra rễ hoặc ra rễ rất ít mặc dù có xử lý với chất kích thích ra rễ Vì lá và chồi là nơi sản sinh ra auxin và vận chuyển xuống gốc để kích thích sự hình thành rễ, lá còn cung cấp carbonhydrat cho sự phát triển của

rễ

7.2 Cơ sở hình thành chồi

Chồi là mầm mống của cành cây, nó bắt đầu khởi động rất sớm dưới dạng mấu lồi trong nách phôi thai, lá còn nằm trong chồi, về sau mấu chồi phát triển thành chồi nách Khi còn ở cành bình thường các chồi không phát triển được nằm trong trạng thái ngủ nghỉ Khi cành chè được cắt thành từng hom làm mất ảnh hưởng của ưu thế ngọn Các mầm nách thoát khỏi giai đoạn ngủ nghỉ phát triển thành chồi mới Các hom chè được cắt đem giâm trong môi trường chứa cytokinin ở nồng độ thích hợp ,các mầm nách sẽ phát triển thành chồi

8 Chất điều hòa sinh trưởng

Chất điều hoà sinh trưởng thực vật là những chất liệu với liều lượng thấp hiệu lực sinh học cao Các hợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo) có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển, làm biến đổi một quá trình sinh lý thực vật nào đó, ở những nồng độ rất thấp

Các chất điều hoà sinh trưởng được chia làm hai nhóm: các chất kích thích sinh trưởng và

các chất ức chế sinh trưởng Trong nuôi cấy in vitro thì sự cân bằng giữa các chất điều hoà

sinh trưởng với nhau là điều cần thiết

Hiện nay có năm nhóm chất điều hoà sinh trưởng thường sử dụng: auxin, gibberellin, cytokinin, acid abscisic, ethylen, các hợp chất phenol và các chất làm chậm sinh trưởng

8.1 Auxin

Auxin là một nhóm các chất được tổng hợp chủ yếu ở đầu thân, đầu rễ, được vận chuyển đến các bộ phận khác nhau của cơ thể để kích thích sự tăng trưởng của tế bào Auxin bị phân huỷ bởi ánh sáng, có tính phân cực

 Chức năng của auxin

Kích thích sự giãn nở của tế bào, làm tế bào phình to ra, làm tăng kích thước của các cơ quan, ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào, kích thích sự tổng hợp các cấu tử cấu trúc nên thành

tế bào như cenlulose, pectin Điều chỉnh tính hướng động của cây: quang hướng động và địa hướng động Gây ra hiện tượng ưu thế ngọn được giải thích bằng việc ức chế sinh trưởng của

chồi bên khi auxin được vận chuyển từ ngọn xuống dưới Kích thích sự hình thành rễ Kích thích sự hình thành quả, sự lớn của quả, tạo nên quả đơn tính không hạt và kìm hãm sự rụng

lá, hoa, quả Tạo phôi trong nuôi cấy huyền phù

Các phản ứng auxin và sự tăng trưởng có liên quan với vô số quá trình sinh lý, trao đổi chất khác Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với việc xử lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào, điều này xảy ra chỉ một vài phút sau khi xử lý Một đặc trưng quan trọng là vách tế bào, một vị trí quan trọng chịu sự tác động của các chất điều hoà sinh trưởng thực vật (Torry

và ctv.,1981) Auxin làm giảm pH do kích thích sự bài xuất proton H+, pH hoạt hoá các enzyme tác động nới lỏng vách tế bào và enzyme tổng hợp vách tế bào, nhờ đó khởi động quá trình giãn nở tế bào (Prat, 1993)

Auxin hoạt hoá sự sinh tổng hợp các hợp chất cao phân tử (protein, cenllulose, pectin,…)

và ngăn cản sự phân giải chúng (Vũ Văn Vụ, 2003; Nguyễn Đức Lượng, 2002)

8.2 Cytokinin

Cytokinin hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ thực vật Ngoài ra, một số cơ quan còn non đang sinh trưởng mạnh cũng có khả năng tổng hợp cytokinin như chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh Đây là chất hoạt hoá sự phân chia tế bào, đồng thời làm tăng quá trình chuyển hoá acid nucleic và protein (Vũ Văn Vụ, 2003) Cytokinin được sử dụng khá nhiều trong kỹ thuật nuôi cấy mô

 Đặc điểm của cytokinin

Cytokinin được vận chuyển trong cây không phân cực như auxin, có thể hướng ngọn và hướng gốc Cytokinin trong cây có thể ở dạng liên kết và dạng tự do cũng như các phytohormone khác Ở trong cây chúng bị phân giải bằng các enzyme, tạo nên sản phẩm cuối cùng là ure

Các cytokinin thường dùng trong nuôi cấy mô: kinetin, BA và TDZ

 Chức năng của cytokinin

Vai trò sinh lý đặc trưng của cytokinin đối với thực vật là kích thích sự phân chia mạnh mẽ của tế bào Ảnh hưởng lên sự hình thành và phân hoá cơ quan đặc biệt là phân hoá chồi Kìm hãm quá trình hoá già của các cơ quan và của toàn cây, kìm hãm sự phân huỷ của diệp lục, protein và acid nucleic Phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nảy mầm, làm tăng sự nở hoa Điều chỉnh hiện tượng ưu thế ngọn Ảnh hưởng đến sự hoạt động sinh lý của cây do nó

có ảnh hưởng đến các quá trình trao đổi chất Cytokinin gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô gồm mô sẹo sinh trưởng trong mô nuôi cấy, hay việc tạo thành các mô bướu ở các cây gỗ lâu năm (Nester và ctv., 1985; Taiz và ctv., 1991)

 Vai trò của cytokinin trong kích thích sự tạo chồi

Cytokinin rất có hiệu quả trong vai trò kích thích sự tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp trên

thực vật nguyên vẹn cũng như trên mô thực vật nuôi cấy in vitro Một tỷ lệ thích hợp giữa

auxin và cytokinin sẽ có hiệu quả trên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy Để tăng sinh chồi bên, nếu nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này không thể kéo dài, hoặc làm cho lá bị biến dạng hoặc làm cho chồi có nhiều nước Để kích thích sự tạo chồi bất định trực tiếp từ mẫu cấy hoặc gián tiếp qua sự tạo mô sẹo thì người ta thường phối hợp cytokinin với auxin Nồng độ cytokinin cao (0,5 – 10,0 mg/l) thường cản hoặc làm chậm sự tạo rễ (Schraudolf và Reinert, 1959; Harris và Hart, 1964; Ben Jaacov và ctv., 1991; Humphries, 1960; trích bởi Vũ Văn Vụ, 2003)

Tùy vào từng loại cây trồng và mục đích sử dụng để kết hợp hợp lý nồng độ axin và cytokinin

9 Các nghiên cứu về in vitro trên chè

9.1 Chất khử trùng mẫu

 Theo Debergh và Vanderschaeghe (1988), mẫu chè lấy trực tiếp từ đồng ruộng đã bị nhiễm bẩn bởi nhiều nguồn khác nhau tùy theo từng cơ quan và bộ phận, đó là nguyên nhân chủ yếu gây tổn thất trong nhân giống chè bằng phương pháp nuôi cấy mô Thông thường mẫu cấy được lấy từ những cây phát triển được sàng lọc, bảo vệ từ ruộng thí nghiệm

Theo Sandal và ctv (2001), đã tiến hành rửa sạch hom chè bằng Tween 20 trong 15 phút, sau đó khử trùng bề mặt hom chè bằng thủy ngân clorua 0,04% trong 5 phút rồi rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng

Mondal và ctv (1998) tiến hành khử trùng bề mặt hạt chè bằng Natri clorua 4% trong 10 phút, sau đó rửa sạch hạt bằng nước cất vô trùng

 Sharma và ctv (1999) tiến hành khử trùng mẫu hom chè có mang hai đốt bằng Streptomycin sulphate 0,001% trong 10 – 15 phút, sau đó khử trùng bằng thủy ngân clorua 0,04% trong 7 – 8 phút rồi rửa sạch bằng nước cất từ 3 – 4 lần

Ogutaga và Northcote (1970) đã dùng đoạn thân chè dài 5 -15 mm được trồng trong nhà kính khử trùng bề mặt với cồn 70o sau đó khử trùng mẫu bằng dung dịch natri hypoclorit 7%  Kato (1985, 1989) dùng những đoạn thân chè có từ 3 – 4 lá từ những cây chè được trồng trong nhà kính (giống Yabukira) khử trùng mẫu bằng Canxi hypoclorit 7% trong 20 phút Arulpragasam và Latiff (1986) đã tách bỏ những lá có cuống lá nằm sát thân một cách cẩn thận tránh gây hại cho mầm nách Sau đó khử trùng bề mặt bằng dung dịch clo 10 – 15% trong 15 phút lắc mẫu liên tục sau đó rửa sạch bằng nước cất và cấy vào môi trường

Karanuki và Shibata (1993) làm giảm vi khuẩn nội sinh có trong mẫu bằng cách lấy những mẫu cấy ở mô phân sinh ngọn và những lá mầm non với kích thước 0,5 mm

Theo Nakamura (1989) tỉ lệ nhiễm của mẫu phụ thuộc theo mùa Để làm giảm nấm ta thu thập, lấy mẫu vào đầu mùa khi nhiệt độ không khí tương đối thấp và chọn những cây trưởng thành khỏe mạnh

Haldeman và ctv (1987) đã chỉ ra một biện pháp quan trọng để làm giảm vi khuẩn và nấm, nhưng không gây độc cho mẫu bằng benomyl (1, 2, 4 g/l) và rifampicin (10, 25, 50 mg/l)

Das và Barman (1988) xử lý mẫu bằng Streptomycin sulfate 1% ngăn chặn sự tái nhiễm của mẫu thí nghiệm

Rajacumar và Ayyappan (1992); Rajashekaran và Mohankumar (1992); Jha và Sen (1992); Agarwal và ctv (1992) đã dùng dung dịch thủy ngân clorua 0,05 – 1,0% khử trùng bề mặt mẫu đối với mẫu thí nghiệm

9.2 Môi trường và vật liệu vô trùng mẫu

Murashige và Skoog (1962) đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiến trong

kỹ thuật nuôi cấy mô Môi trường MS của họ đã được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây trong đó có áp dụng phổ biến trên chè

 Theo Sandal và ctv (2001) thực hiện vô trùng mẫu hom chè, Camellia sinensis (L) O Kuntze, 30 năm tuổi tạo nguồn vật liệu sạch cho thí nghiệm được tiến hành trong bình tam giác 250ml có bổ sung 100ml môi trường MS với 0,8% agar bổ sung thêm BA (8,88µM), IBA (0,98µM) và 3% đường

Mondal và ctv (1998), tiến hành vô trùng mẫu hạt chè Camellia sinensis (L) O Kuntze

bằng cách cho hạt nảy mầm trong môi trường 1/2 MS bổ sung sucrose 30g/l và agar 8g/l (Qualigens, Bombay) tạo cây trong ống nghiệm sau 60 ngày làm vật liệu cho vi nhân giống chè

Sharma và ctv (1999) vô trùng mẫu hom chè Camellia sinensis (L.) var China hybrid

trong môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l và agar 8 g/l (Qualigens, Bombay)

Theo Nguyễn Thanh Mai và Nguyễn Sĩ Tuấn (2005), quá trình vô trùng mẫu hom chè

Camellia sinensis (L.) var Oo-Long được tiến hành trong erlen 100ml có bổ sung 20 ml môi

trường MS, agar 8g/l, TDZ 1mg/l, sucrose 30g/l