Thu nhận hợp chất Alkaloid từ nuôi cấy in vitro tế bào cây dừa cạn

Thu nhận hợp chất Alkaloid từ nuôi cấy in vitro tế bào cây dừa cạn

MỤC LỤC

Mở đầu: 2

I Tổng quan về HCTC và ALKALOID: 4

A Hợp chất thứ cấp: 4

1 Định nghĩa: 4

2 Vài nét về tình hình nghiên cứu các HCTC ở Việt Nam: 4

B Alkaloid: 5

1 Lịch sử phát triển: 5

2 Khái niệm về Alkaloid: 6

II Thu nhận các hợp chất Alkaloid từ loài Catharanthus roseus (L.) G.Don bằng phương pháp nuôi cấy tế bào: 9

III Thu nhận Alkaloid từ nuôi cấy in vitro tế bào cây dừa cạn: 16

1 Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào: 18

2 Nuôi cấy mô sẹo: 19

3 Hột nhân tạo: 20

4 Nuôi cấy mô phân sinh: 21

5 Nuôi cấy rễ tơ: 22

6 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng: 22

Tài liệu tham khảo: 28

MỞ ĐẦU

Ngày nay không ai có thể phủ nhận được tầm quan trọng của công nghệ sinhhọc đối với nền kinh tế quốc dân nước ta nói riêng và thế giới nói chung Thế kỷ 21được coi là thế kỷ của ngành công nghệ sinh học.Việt Nam là nước nhiệt đới có khíhậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho sự phát triển của thực vật và đây được coi là một khotàng vô giá về nguồn hợp chất tự nhiên và nguồn nguyên liệu để phát triển ngànhcông nghệ sinh học nước nhà.

Trong những năm gần đây, công nghệ tách chiết các hợp chất từ thực vật đãkhông ngừng phát triển và và bước đầu đạt được những thành quả đáng kể Trên thếgiới từ rất lâu người ta đã ứng dụng những công nghệ này để sản xuất các chất cóhoạt tính sinh học, phục vụ cho nghiên cứu, sản xuất và phục vụ lợi ích của conngười Những nghiên cứu về hợp chất có hoạt tính sinh học ở thực vật phát triển từnhững năm 1950 Có khoảng hơn 30.000 hợp chất được chiết xuất từ thực vật cóhoạt tính và rất có giá trị đối với cuộc sống Những hợp chất này như các alkaloid,terpenoid, phenolic… được biết đến như là các hợp chất thứ cấp Các hợp chất nàythường chỉ được tạo ra ở một số loại tế bào nhất định như các tế bào rễ tơ, biểu mô,hoa, lá…

Mặc dù, hóa học tổng hợp hữu cơ đạt nhiều thành tựu quan trọng nhưng nhiềuhợp chất có hoạt tính sinh học (thường gọi là các chất thứ cấp) vẫn còn khó tổnghợp hoặc có thể tổng hợp được nhưng chi phí rất đắt Chẳng hạn, một số hỗn hợpphức tạp như tinh dầu hoa hồng là không thể tổng hợp hóa học được

Ngày nay, những hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học được phân lập từ cây

cỏ đã được ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp và chăm sócsức khoẻ con người Chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệthực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm v.v Mặc

dù công nghệ tổng hợp hoá dược ngày nay đã phát triển mạnh mẽ, tạo ra các biệtdược khác nhau sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh, nhờ đó giảm tỷ lệ tửvong rất nhiều song những đóng góp của các thảo dược cũng không vì thế mà mất

tiếp, gián tiếp hoặc cung cấp những chất đầu cho công nghệ bán tổng hợp nhằm tìmkiếm những dược phẩm mới cho việc điều trị các bệnh thông thường cũng như cácbệnh nan y.

Tuy nhiên nguồn thực vật ngoài thiên nhiên cũng đang ngày một hạn hẹp,hơn nựakhi chiết xuất hợp chất từ thiên nhiên thường hiệu suất không cao.Ứng dụng nuôicấy tế bào đơn để thu nhận hợp chất tự nhiên đang là một hướng mới cho ngànhcông nghệ sinh học hiện nay.Một trong nhữ hợp chất được thu nhận thành công từnuôi cấy tế bào đơn là các hợp chất alkaloid

I.TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT THỨ CẤP VÀ ALKALOID.

A.HỢP CHẤT THỨ CẤP

1.Định nghĩa:

Sản phẩm trao đổi chất bậc hai hay hợp chất thứ cấp là những sản phẩm được tạo

ra trong tế bào nhờ các quá trình trao đổi chất xảy ra trong tế bào,sau đó chúng thoát

ra khỏi tế bào và đi ra môi trường ngoài

Phần lớn các sản phẩm bậc hai thường không có ý nghĩa sinh lý đối với bản thân tế bào.Quá trình tạo ra các sản phẩm bậc hai chỉ thông qua những cơ chế chuyển hóa rất tự nhiên của tế bào,cũng có thể do sự sai lệch về thông tin di truyền trong tế bào dẫn đến hiện tượng sinh tổng hợp thừa

Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ gia thựcphẩm có giá trị Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp,thường được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức năng trao đổi chấtchưa được biết đầy đủ Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hóa họccủa thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và độngvật

Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từcuối những năm 50 của thế kỷ 20 (Rao và cs 2002) Các chất trao đổi thứ cấp có thểxếp trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside

2.Vài nét về tình hình nghiên cứu hợp chất thứ cấp ở Việt Nam.

Ở Việt Nam, công nghệ tách chiết các hợp chất thứu cấp chủ yếu gắn liền vớicông nghệ nuôi cấy tế bào và chúng phát triển vào những năm 1970 Từ đó đến nay

đã đạt được nhiều thành công, đáng kể nhất chính là quy trình sản xuất sâm NgọcLinh do Học viện Quân y khai thác Phương pháp sản xuất sinh khối tế bào rễ sâmNgọc Linh được cấp bằng độc quyền sáng chế số 7523 vào ngày 11/02/2009 tại ViệtNam

Việt Nam cũng đang triển khai các dự án nuôi cấy và chiết xuấttaxol từ cây thông đỏ ở Lâm Đồng Ngoài ra còn có “Nghiên cứu sản xuấtarteminisin dùng kỹ thuật nuôi cấy tế bào từ cây thanh hao hoa vàng”

của Viện Sinh học Nhiệt đới trong nghị định thư hợp tác với Malaysia(2007-2010) hay đại học Huế “Nghiên cứu khả năng tích lũy

glycoalkaloid ở callus cây cà gai leo Solanum hainanense” Tuy nhiên,

những dự án nói trên vẫn còn ở quy mô phòng thí nghiệm

B Alkaloid.

1 Lịch sử phát hiện.

Năm 1804- 1805, pháp và Đức đã phân lập được morphin và điều chế đượcdạng muối của nó Đồng thời đã chứng minh được morphin là hoạt chất chính củacây thuốc phiện có tác dụng sinh lý rõ rệt

Năm 1980, từ vỏ cây canhkina, đã chiết và kết tinh được một chất đặt tên là

“cinchonino” sau đó hai nhà hóa học pháp đã xác định cinchonino là hỗn hợp củahai alcaloid là quinin và cinchonin

Năm 1918, phát hiện ra alcaloid của hạt mã tiền là strycnin và bruxin

Năm 1918 phát hiện ra được cafein trong chè, cà phê rồi sau đó là nicotin trongthuốc lá, atropin trong cà độc dược, theobromin trong cacao, codein trong thuốcphiện, cocain trong lá coca

Giữa năm 1973, người ta đã xác định được 4959 Alcaloid khác nhau trong đó

có 3293 chất đã xác định được công thức hóa học Hiện nay đã phát hiện ra được rấtnhiều số lượng Alcaloid và cũng đã đưa vào ứng dụng trong y học ngày một tăng

2 Khái quát về Alkaloid

2.1 Khái niệm.

Alkaloid có nguồn gốc từ chữ: alcali tiếng Ả rập là kiềm Alkaloid là:

- Những hợp chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, có tính bazơ thường gặp ởtrong nhiều loài thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài động vật

- Có phản ứng kiềm cho các muối với acid và các muối này dễ kết tinh.

- Có hoạt tính sinh học rất quan trọng

- Có một số phản ứng chung là tạo “tủa“ cần thiết cho sự xác định chúng.Chúng là một nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng về nhiều mặt Đặc biệt tronglĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao và độc đáo

2.2 Cấu tạo hóa học.

Về mặt hóa học, sự phong phú và đa dạng của alkaloid đã trở thành mộtchuyên nghành, chiếm một vị trí quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu và trong tạpchí thông tin về hóa học Đối với việc nghiên cứu alkaloid còn quan trọng hơn bởi

vì chúng có hệ thực vật nhiệt đới phong phú là nguồn cung cấp alkaloid chủ yếu

Về mặt cấu trúc hóa học, chúng có ít nhất 1 nguyên tử N trong phân tử, chủyếu nằm trong vòng Có ý kiến xếp các hợp chất có N ngoài vòng như Colchicin,Hordenin, là các protoalkaloid Sự có mặt của nguyên tử của N trong cấu trúc quyếtđịnh tính bazơ của alkaloid và là chỗ dựa rất quan trọng cho các nhà hóa học trongnghiên cứu alkaloid

2.3 Phân loại.

Đã biết có đến trên 250 dạng cấu trúc khác nhau với hơn 5.500 hợp chất alkaloidtrong tự nhiên Vì vậy cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản trước đây(khoảng 20 nhóm cấu trúc) xét ra chưa đáp ứng nên ngày càng có xu hướng chiachúng thành những nhóm nhỏ: nhóm alkaloid Ecgotamia, Harmin, Yohimbin,Strychnin, Echitamin Nhóm alkaloid có nhân isoquinolin được chia thành cácnhóm: Benzyliaoquinolin, Apocphin, Protobecberin, Benzophenanthridin

Tên cấu trúc Công thức Hợp chất thí dụ

Steroit Solasodin, Tomatidin

II.THU NHẬN CÁC HỢP CHẤT ALKALOID TỪ LOÀI Catharanthus roseus (L.) G Don BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO.

1 Catharanthus roseus

2 Tên khác: Bông dừa, Hải đăng, Hải đằng

3 Tên khoa học: Catharanthus roseus (L.) G Don

4 Tên đồng nghĩa: Vinca rosea L.

5 Họ: Trúc đào (Apocynaceae)

6 Tên nước ngoài: Madagasca Periwinkle, Pervenche mangache

Thân cỏ nhỏ, mọc đứng, phân nhiều cành, cao 40-60 cm Thân hình trụ có 4 khía dọc, có lông ngắn, thân non màu xanh lục nhạt sau chuyển sang màu hồng tím

Lá đơn nguyên, mọc đối chéo chữ thập, hình trứng, dầu hơi nhọn, dài 4-7 cm, rộng2-3 cm, mặt trên sẫm, mặt dưới nhạt, có lông Cuống lá ngắn, dài 3-5 mm Gân lá hình lông chim lồi mặt dưới, 12-14 cặp gân phụ hơi lồi mặt dưới, cong hướng lên trên.

Cụm hoa : Hai hoa ở kẽ lá Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5; cuống hoa dài 4-5 mm Láđài 5, hơi dính nhau ở dưới, trên chia thành 5 thùy hình tam giác hẹp, có lông ởmặt ngoài, dài 3-4 mm Cánh hoa 5, dính

Ống tràng màu xanh, cao 2-4 cm, hơi phình ở gần họng, mặt ngoài có 5 chấmlồi; 5 thùy có màu đỏ hay hồng tím , trắng , …ở mặt trên, mặt dưới màu trắng, dài1,5-1,7 cm, miệng ống tràng có nhiều lông và có màu khác phiến (màu vàng hay đỏnếu hoa trắng, màu đỏ sẫm hay vàng nếu hoa màu hồng tím)Tiền khaihoa vặn cùngchiều kim đồng hồ

Nhị : rời, đính ở phần phình của ống tràng, xen kẽ cánh hoa,chỉ nhị ngắn

Bao phấn hình mũi tên, hướng trong, khai dọc, đính đáy Các bao phấn chụm trênđầu nhụy Hạt phấn rời, hình chữ nhật, có rãnh dọc

Lá noãn : rời ở bầu nhưng dính ở vòi và đầu nhụy, mặt ngoài có nhiều lông, mỗi lánoãn mang nhiều noãn, đính noãn mép, bầu trên

Vòi nhụy: dài bằng ống tràng, dạng sợi màu trắng Đầu nhụy hình trụ, màu xanh,đỉnh có 2 thùy nhọn, phía dưới có màng mỏng màu vàng 2 đĩa mật màu vàng, hìnhtam giác hẹp nằm xen kẽ 2 lá noãn 2 quả đại dài 3-5 cm, mỗi quả chứa 12-20 hạt,xếp thành 2 hàng Hạt nhỏ, hình trứng

Đặc điểm giải phẫu:

Vi phẫu rễ:

Lớp bần gồm 4-5 lớp tế bào hình chữ nhật Mô mềm vỏ khoảng 5-6 lớp tế bào có vách bằng cellulose, hình dạng thay đổi, xếp không đều đặn Trụ bì vách bằng cellulose Libe 1 bị libe 2 đẩy ra sát trụ bì, các tế bào bị ép dẹp lại Libe 2 là những

tế bào hình chữ nhật, xếp thành dãy xuyên tâm Gỗ 2 chiếm tâm Mạch gỗ 2 xếp thành dãy, kích thước không đều Tia tủy hẹp 1-2 dãy tế bào Gỗ 1 phân bố đều Libe trong tạo thành đám phân bố đều bên trong gỗ 1

Vi phẫu thân : Gần vuông, 2 cạnh phẳng và 2 cạnh hơi lồi; 4 cánh ngắn Vùng vỏ:

biểu bì gồm một lớp tế bào xếp đều đặn mang lông che chở, cutin dày Dưới biểu bì

là mô dày góc Tế bào mô mềm vỏ hình bầu dục, xếp không thứ tự theo hướng tiếp tuyến Ống nhựa mủ rải rác Nội bì có nhiều hạt tinh bột

Vùng trung trụ : Trụ bì hóa sợi thành đám, vách tế bào sợi vẫn bằng cellulose Libe

2 và gỗ 2 liên tục thành một vòng Mạch gỗ 2 tương đối đều đặn Libe trong thành đám Tia tủy hẹp 1 hoặc 2 dãy tế bào Mô mềm tủy hình tròn, kích thước không đều,

có tinh thể calci oxalate hình khối

Vi phẫu lá :

Gân giữa: Biểu bì trên và biểu bì dưới gồm một lớp tế bào khá đều, lông che chở và

lỗ khí rải rác Dưới biểu bì trên là mô dày góc, mô mềm gồm những tế bào vách mỏng, kích thước không đều Bó libe-gỗ chồng kép hình cung gồm những đám libe xếp thành 2 cung bao bọc lấy cung gỗ Mạch gỗ xếp đều đặn

Phiến: Biểu bì trên và dưới gồm một lớp tế bào, có lông

Lỗ khí nhiều ở biểu bì dưới Mô mềm giậu gồm một lớp tế bào hẹp, dài, khá đều nhau; mô mềm khuyết tế bào vách mỏng, xếp chừa các khuyết nhỏ

Phân bố, sinh học và sinh thái:

Xuất xứ từ miền Đông Châu Phi được truyền vào nước ta Nay phát tán hoang dại

và cũng được trồng Cây sinh trưởng tốt trên đất cát vùng biển, phát triển tốt về cả mùa hè Ra hoa quanh năm, chủ yếu là từ tháng 5-9

Bộ phận dùng:

Toàn cây (Herba Catharanthi rosei) Ở Trung Quốc gọi là Trường xuân hoa.

Thành phần hóa học:

Hoạt chất của Dừa cạn là alkaloid có nhân indol trong tất cả các bộ phận của cây, nhiều nhất trong lá và rễ

Dừa cạn Việt Nam có tỷ lệ alkaloid toàn phần là 0,1-0,2%

Rễ chứa hoạt chất (0,7-2,4%) nhiều hơn trong thân (0,46%) và lá (0,37-1,15%) Các chất chủ yếu là: vinblastin, vincristin tetrahydroalstonin, prinin, vindolin, catharanthin, vindolinin, ajmalicin, vincosid (1 glucoalkaloid tiền thân để sinh tổng hợp các alkaloid) Từ Dừa cạn, người ta còn chiết được các chất sau: acid

pyrocatechic, sắc tố flavonoid (glucozid của quercetol và campferol) và anthocyanic

từ thân và lá dừa cạn hoa đỏ Ngoài ra từ lá chiết được acid ursoloc, từ rễ chiết đượccholin

III.THU NHẬN ALKALOID TỪ NUÔI CẤY INVITRO TẾ BÀO CÂY DỪA

CẠN

Mô sẹo màu xanh được nuôi trong điều kiện chiếu sáng từ lá dừa cạn in vitro 4

tháng tuổi được chuyển vào 100 ml môi trường cảm ứng trong erlen 250 ml.Môi trường cảm ứng gồm môi trường MS + Vitamin Morel + Hormon tăngtrưởng thực vật (NAA hoặc 2,4-D và Kinhoặc BAP) + 30g/l đường sucrose.Sau đó đặt vào máy lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ 25± 2oC

trong điều kiện chiếu sáng liên tục 16 giờ/ngày.

Cũng làm theo cách tương tự như trên nhưng thay thế nồng độ đường 30g/l bằngcác nồng độ đường 40 g/l, 50 g/l, 60 g/l, 70 g/l, 80 g/l và nồng độ hormon tăngtrưởng là tối ưu nhất trong thí nghiệm trên

Xác định sinh khối bằng phương pháp cân

Chiết tách alkaloid toàn phần từ sinh khối tế bào Dừa cạn theo phương pháp củaKutney và cộng sự (1983)

Cây dừa cạn ngoài tự

nhiên

Khử trùng mẫu và nuôi cấy

trongđiều kiện thích hợp

Cây dừa cạn invitro

Mô sẹo

Nuôi cấy mô sẹo trong điều kiện chiếu sáng 1000 lux

Dịch huyền phù tế bào

Định lượng alkaloid

Chuyển mô sẹo sang môitrường lỏng để nuôi cấydịch huyền phù

Nuôi cấy trong 28

ngày

1.Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào

Nhiều nghiên cứu đã được thử nghiệm trong việc thu nhận huyền phù tế bàonuôi cấy cho năng suất thu indole alkaloid cao, đặc biệt là vinblastine vàvincristine

Phương pháp sản xuất catharanthine và ajmalicine trong dịch huyền phù

được nuôi cấy trong bioreactor đã thành công Moreno và cộng sự (1996) đãnghiên cứu ảnh hưởng của các chất cảm ứng lên những con đường chuyển hóa khácnhau liên quan đến quá trình chuyển hóa hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy huyền phù

tế bào C.roseus Dịch trích tế bào nấm Phytium aphanidermatum đã được tiệt trùng được dùng trong nghiên cứu này Những tế bào C.roseus ngay lập tức biến đổi quá

trình chuyển hóa của chúng để phản ứng lại tác động của nấm

Zhao và cộng sự (2001) đã thử nghiệm nhiều chất cảm ứng của nấm nhậnđược từ 12 loại nấm và ảnh hưởng của chúng lên việc cải thiện sản xuất indole

alkaloid ở huyền phù tế bào C.roseus Những kết quả này cho thấy rằng những chất

chiết từ nấm khác nhau kích thích tích lũy những indole alkaloid khác nhau, có thểgấp 2 đến 5 lần ở nuôi cấy thường

Zhao và cộng sự (2001) đã tăng sản phẩm catharanthine trong tế bào nuôi cấy

C.roseus bằng cách kết hợp chất cảm ứng nuôi trong bình lắc và bioreactor Tác

động tổng hợp lên sự tích lũy alkaloid trong tế bào nuôi cấy đã được theo dõi khichúng được xử lý với một vài sự kết hợp giữa chất cảm ứng của nấm và hóa chất

Sự kết hợp giữa tetramethyl ammonium bromide và nấm sợi Aspergillum niger đã

cho hiệu suất thu ajmalicine cao nhất và cải thiện sự tích lũy catharanthine.Trong khi sự kết hợp giữa chất cảm ứng malate và sodium alginate cho kết quả hiệusuất catharanthine cao nhất và cũng tích lũy ajmalicine cao trong tế bào nuôi cấy Cáctác giả sau đó đã phát triển quy trình này để nâng cao việc sản xuất catharanthine ở tế

bào C.roseus nuôi trong bình lắc và bioreactor Sau 10 ngày nuôi cấy đã thu được

catharanthine với hiệu suất theo thứ tự là 25 mg/l, 32mg/l và 22 mg/l trong bình lắc

500 ml, 1,000 ml và bioreactor dạng sục khí 20 lít