NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM CHUYỂN HÓA ANGIOTENSIN IN VITRO CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU TIỀM NĂNG TẠI VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ THÙY DƯƠNG MSV : 1401118 NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM CHUYỂN HÓA ANGIOTENSIN IN VITRO CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU TIỀM NĂNG TẠI VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

NGUYỄN THỊ THÙY DƯƠNG

MSV : 1401118 NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC TÁC DỤNG

ỨC CHẾ ENZYM CHUYỂN HÓA

ANGIOTENSIN IN VITRO CỦA MỘT SỐ

DƯỢC LIỆU TIỀM NĂNG

TẠI VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019

NGUYỄN THỊ THÙY DƯƠNG

MSV : 1401118 NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC TÁC DỤNG

ỨC CHẾ ENZYM CHUYỂN HÓA

ANGIOTENSIN IN VITRO CỦA MỘT

SỐ DƯỢC LIỆU TIỀM NĂNG

TẠI VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lời cám ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tới

TS Lê Thị Xoan, TS Hà Vân Oanh, ThS Phí Thị Xuyến – những người đã luôn

quan tâm, chỉ bảo, giúp đỡ, hướng dẫn tận tình tôi trong suốt quá trình làm hoàn

thành đề tài này

Tôi xin cám ơn Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền và các thầy cô, các

anh chị đã động viên, hỗ trợ tôi trong quá trình nghiên cứu

Tôi xin chân thành cám ơn TS Phạm Thị Nguyệt Hằng, CN Phạm Thanh

Huyền, TS Nguyễn Văn Tài, KTV Nguyễn Thị Huyền Phương cùng các anh chị

trong khoa Dược lí – Hóa sinh, khoa Tài nguyên, khoa Hóa Thực vật – Viện Dược

liệu đã tạo điều kiện, hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu tại Viện

Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo cùng toàn thể các thầy

cô giáo, cán bộ trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi học tập và tích

lũy kiến thức trong suốt 5 năm học vừa qua

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, thầy cô, quỹ

học bổng VietSeeds đã luôn sát cánh, động viên tôi hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019

Sinh viên Nguyễn Thị Thùy Dương

MỤC LỤC

Danh sách chữ viết tắt và kí hiệu

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 Tăng huyết áp và cơ chế sinh lí bệnh tăng huyết áp 3

1.1.1 Tăng huyết áp 3

1.1.2 Cơ chế sinh lí bệnh tăng huyết áp 3

1.2 Enzym chuyển angiotensin 5

1.2.1 Cấu trúc hóa học của ACE trong cơ thể người 5

1.2.2 Đặc tính của ACE 5

1.2.3 Vai trò của ACE trong điều hòa huyết áp 6

1.3 Một số phương pháp xác định tác dụng ức chế enzym chuyển angiotensin in vitro 7

1.3.1 Phương pháp quang phổ tử ngoại 7

1.3.2 Phương pháp quan phổ khả kiến (VSP) 8

1.3.3 Phương pháp HPLC 8

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của ACE trong thí nghiệm ức chế ACE in vitro 9

1.4 Các nghiên cứu sàng lọc dược liệu có tác dụng hạ huyết áp thông qua ức chế enzym chuyển angiotensin 10

1.4.1 Các hướng nghiên cứu trên thế giới 10

1.4.2 Tình hình tại Việt Nam 13

2.1 Nguyên vật liệu – thiết bị 18

2.1.1 Mẫu nghiên cứu: 18

2.1.2 Thuốc, hóa chất 18

2.1.3 Máy móc, thiết bị, dụng cụ 19

2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Chuẩn bị cao chiết 20

2.3.2 Đánh giá tác dụng ức chế enzym chuyển angiotensin của cao dược liệu 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28

3.1 Kết quả 28

3.1.1 Khối lượng cao dược liệu thu được 28

3.1.2 Đánh giá ảnh hưởng của DMSO lên hoạt động của ACE 30

3.1.3 Kết quả sàng lọc tác dụng ức chế ACE in vitro của các mẫu dược liệu. 30 3.1.4 Kết quả xác định IC50 của mẫu dược liệu tiềm năng 33

3.2 Bàn luận 34

3.2.1 Bàn luận kết quả thí nghiệm 34

3.2.2 Về thao tác và quy trình thí nghiệm 41

KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 42 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm 24 Bảng 3.1: Chuẩn bị mẫu cao chiết 28 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của dung môi DMSO lên tác dụng ức chế ACE 30 Bảng 3.3: Kết quả ức chế ACE của 51 mẫu cao ở nồng độ 100 µg/ml và 50 µg/ml 30 Bảng 3.4: IC50 của chất đối chiếu captopril 33 Bảng 3.5: IC50 của lược vàng cao nước 33

Danh mục các hình

Hình 1.1: Phản ứng thủy phân Angiotensinogen thành AngI, AngII [21] 4

Hình 1.2: Vai trò của ACE trong điều hòa huyết áp [39] 7

Hình 2.1: Hệ thống đo ELISA 96 giếng - EL x808 Biotek 20

Hình 2.2: Sơ đồ chiết cao tổng dược liệu 21

Hình 2.3: Sơ đồ chiết cao phân đoạn 22

Hình 2.4: Cơ chế phản ứng thủy phân HHL của ACE [16] 23

Hình 2.5: Sơ đồ thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế ACE 26

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tăng huyết áp (THA) là một trong những yếu tố nguy cơ chính dẫn tới các bệnh tim mạch Hầu hết bệnh nhân THA cần điều trị thuốc hạ áp cùng với thay đổi lối sống để đạt hiệu quả kiểm soát tối ưu [1], [7] Enzym chuyển hóa Angiotensin (ACE) chiếm một vai trò sinh lí quan trọng trong điều hòa huyết áp Đã có một số chất ức chế ACE tổng hợp như captopril, lisinopril, enalapril và fosinpril được sử dụng là thuốc điều trị THA Tuy nhiên, các thuốc này có thể gây ra một số tác dụng phụ đáng kể như ho, rối loạn vị giác, phát ban Vì vậy, việc tìm kiếm các nguồn thuốc mới với tác dụng điều trị tương đương, thậm chí vượt trội hơn, đồng thời giảm hoặc

ít tác dụng phụ đang là hướng được quan tâm

Việc tìm kiếm các dược chất làm thuốc từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên luôn

là chính sách ưu tiên trong chiến lược phát triển ngành Dược ở nhiều quốc gia, trong

đó có Việt Nam Việt Nam có nguồn tài nguyên thực vật phong phú, nền y học cổ truyền lâu đời Do đó, khai thác nguồn tài nguyên sinh học từ nguồn dược liệu được

sử dụng theo kinh nghiệm trong nhân dân và sàng lọc tác dụng dược lí của các cao chiết từ các dược liệu này là hướng tiếp cận phát hiện và phát triển các thuốc mới phục vụ cho điều trị [38]

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu đánh giá, sàng lọc tác dụng ức chế ACE

in vitro trên cao chiết dược liệu và các chất/nhóm chất phân lập từ dược liệu [13], [15], [19], [44] Tại Việt Nam, nghiên cứu theo hướng này còn hạn chế Các nghiên cứu bước đầu đánh giá tác dụng ức chế ACE từ các chất phân lập được từ dược liệu [6] Dựa trên các nghiên cứu trước đó trên thế giới về tác dụng ức chế enzym chuyển angiotensin, việc đánh giá lại các đối tượng dược liệu được trồng tại Việt Nam có ý nghĩa trong việc mở rộng mục đích sử dụng các dược liệu Tổng quan tài liệu giúp lựa chọn các dược liệu dựa trên hai tiêu chí: một là, kinh nghiệm dân gian sử dụng các dược liệu trong điều trị tăng huyết áp và lợi tiểu; hai là dựa trên các nghiên cứu

về tác dụng ức chế ACE và hạ áp của dược liệu Qua đó, lựa chọn được 8 mẫu dược liệu đưa vào nghiên cứu bao gồm: lá sa kê, lá lược vàng, vỏ thân đỗ trọng, toàn cây cần tây, bộ phận trên mặt đất của dừa cạn, lá hồng, thân rễ gối hạc và lá cành gối hạc

Từ đó, đề tài “Nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym chuyển hóa angiotensin

in vitro của một số dược liệu tiềm năng tại Việt Nam” được thực hiện với mục tiêu

cụ thể là:

Đánh giá, sàng lọc tác dụng ức chế ACE in vitro của các mẫu cao chiết tổng

và phân đoạn của các dược liệu thu hái tại Việt Nam

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tăng huyết áp và cơ chế sinh lí bệnh tăng huyết áp

1.1.1 Tăng huyết áp

Tăng huyết áp là một bệnh mạn tính phổ biến nhất trên thế giới và đang trở thành một vấn đề thu hút sự quan tâm của toàn xã hội Nó là yếu tố nguy cơ chính dẫn đến suy tim, rung nhĩ, bệnh thận mạn, bệnh mạch máu ngoại vi, suy giảm chức năng nhận thức [1], [28], để lại di chứng nặng nề, suy giảm chất lượng cuộc sống, đòi hỏi sự chăm sóc dài ngày và tốn kém, là gánh nặng to lớn cho gia đình và xã hội Theo các chuyên gia trong lĩnh vực tim mạch, tăng huyết áp là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu với 10 triệu người tử vong mỗi năm trên toàn thế giới trong năm 2015 [1]

1.1.2 Cơ chế sinh lí bệnh tăng huyết áp

Hai thành phần quan trọng trong điều hòa huyết áp, đó là hệ thần kinh giao cảm và hệ thống renin-angiotensin [7]

 Hệ thần kinh giao cảm [7]

Tăng hoạt tính thần kinh giao cảm làm tăng huyết áp và góp phần cho sự phát triển và duy trì huyết áp qua tác động lên tim, mạch máu ngoại biên, thận, từ đó làm tăng cung lượng tim, co mạch ngoại biên và ứ nước Ngoài ra, mất cân bằng hệ thần kinh tự chủ, bao gồm tăng trương lực giao cảm và giảm đồng thời trương lực phó giao cảm, kết hợp với nhiều bất thường về chuyển hóa huyết động, dinh dưỡng, … từ

đó làm gia tăng tử suất và tử vong tim mạch Tăng hoạt tính thần kinh giao cảm rõ rệt nhất ở những bệnh nhân trẻ tuổi, những người này có thể có nhịp tim nhanh và cung lượng tim cao, là một trong những nguyên nhân dẫn tới tăng huyết áp

 Hệ thống renin-angiotensin

Hình 1.1: Phản ứng thủy phân Angiotensinogen thành AngI, AngII [21]

Lịch sử về việc tìm ra hệ thống renin-angiotensin bắt đầu từ năm 1898 với nghiên cứu thực hiện bởi Tigerstedt và Bergman [17] Theo quan điểm trước đây, sự điều hòa huyết áp được thực hiện với hệ renin-angiotensin-aldosteron hoàn chỉnh, tức

là có sự tham gia của cả ba chất: renin, angiotensin, aldosteron Tuy nhiên, những phát hiện trong những năm gần đây đã chỉ rõ, riêng hai chất renin-angiotensin đã hợp thành một hệ hoàn chỉnh – gọi tắt là hệ R.A trong việc tự điều hòa huyết áp [9]

Renin được sản xuất và tích trữ ở tế bào cạnh cầu thận nằm bao quanh các tiểu

động mạch đến, được phóng thích vào tuần hoàn khi có các kích thích như: giảm áp lực tưới máu thận, giảm thể tích tuần hoàn, giảm các catecholamin lưu hành trong

Angiotensin I NH2-Asp-Arg-Val-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-COOH

Angiotensinogen NH2-Asp-Arg-Val-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile-His-Ser-R

Angiotensin II NH2-Asp-Arg-Val-Ile-His-Pro-Phe-COOH

Val-Ile-His-Ser-R

Renin

tuần hoàn, tăng hoạt tính hệ thần kinh giao cảm, giãn các tiểu động mạch đến và giảm kali máu, có tác dụng chuyển angiotensinogen thành Angiotensin I Angiotensin I nhanh chóng chuyển thành angiotensin II có hoạt tính dưới tác dụng của enzym chuyển angiotensin [7]

Angiotensin I (AngI) là một decapeptit nội sinh, được mô tả bởi cấu trúc cơ

bản sau: H2N-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-COOH [41], có nguồn gốc

từ angiotensinogen, một globulin huyết thanh dài 452 axit amin, được sản xuất trong gan và có vai trò quan trọng trong hệ renin-angiotensin Angiotensin I có vai trò như tiền chất của chất vận mạch Angiotensin II, được hình thành bằng phản ứng thủy phân bởi ACE tại đầu C của nó (-His9-Leu10-) [41]

Angiotensin II (AngII), lần đầu tiên được phân lập bởi hai nhóm nghiên cứu

độc lập dẫn dắt bới Braun-Mendez và cộng sự (Argentina) và Page và Helmer (Indianapolis, USA), được mô tả và tổng hợp bởi nhóm nghiên cứu ở phòng thí nghiệm lâm sàng Cleveland và Ciba ở Basel, Thụy Sĩ [41] AngII là chất có tác dụng

co thắt tiểu động mạch, làm tăng sức cản ngoại vi, co tĩnh mạch làm tăng cung lượng tim, tác động lên thận làm giảm bài xuất muối và nước [9]

Sự điều hòa bất thường dẫn tới một loạt các vấn đề nghiêm trọng bao gồm tăng huyết áp, xơ vữa động mạch, phì đại cơ tim, nhồi máu cơ tim, rối loạn nội môi… Do

đó tác động vào quá trình hình thành ANG II có cơ sở rõ ràng và trở thành mục tiêu hấp dẫn cho các can thiệp dược lí

1.2 Enzym chuyển angiotensin

1.2.1 Cấu trúc hóa học của ACE trong cơ thể người

ACE (EC 3.4.15.1) được phân loại là dipeptidase peptidy trong siêu họ metallopeptidase zinc Nó được phá hiện bởi Skeggs và đồng nghiệp vào năm 1954, trong khi Das và Soffer phân loại nó là peptidase chứa kẽm vào năm 1975 [41]

Trong cơ thể người ACE tồn tại ở hai dạng chủ yếu là ACE sinh dưỡng ( sACE, trọng lượng phân tử 180 kDal) và ACE sinh dục (tACE, trọng lượng phân tử 100 kDa) [41]

1.2.2 Đặc tính của ACE

Đặc tính enzym của ACE là nó hoạt động với tư cách là dipeptyl cacboxypeptidase có khả năng giải phóng dipeptit đầu C từ các cơ chất có một nhóm cacboxyl tự do cuối cùng ACE ưu tiên phân cắt những cơ chất có các amino axit kị nước tại vị trí thứ 3 từ dưới lên và có ít ái lực với những cơ chất có các amino axit dicacboxylic đầu C (Glu, Asp) hoặc với prolin ở vị trí cuối cùng [22] Theo cơ chế này, nó sẽ xúc tác việc phân cắt angiotensin I thành peptit gây co mạch AngII và làm bất hoạt các peptit gây giãn mạch như bradykinin và kallidin ACE là một enzym không đặc hiệu, nó còn thủy phân một số peptidase có hoạt tính sinh học quan trọng như là cholecystokinin, luliberin và cơ chất P [41]

Mức độ thủy phân AngI và bradykinin của hai vùng N và C là khác nhau, vùng

C đòi hỏi nồng độ ion clo cao hơn để hoạt động tối ưu, đặc tính này được tạo nên do arginin có trong vùng Tại hai vùng, ái lực liên kết với một vài chất ức chế ACE là khác nhau, ví dụ với enalapril thích hợp liên kết tại vùng C, trong khi ramipril lại bị cản trở ở cả hai vùng [41]

Ngoài vai trò như kẽm Metallopeptidase, ACE cũng cho thấy tác dụng như một endopeptidase tác dụng lên cơ chất P, cholecystokinin và Luliberin (LHRH),…[41]

1.2.3 Vai trò của ACE trong điều hòa huyết áp

 Hoạt động của ACE trong hệ thống Renin-Angiotensin-Aldosteron (RAAS)

Hệ thống này được hoạt hóa khi áp suất máu giảm, thận sẽ tiết ra renin là một enzym protease Enzym này xúc tác chuyển hóa angiotensinogen có trong gan thành angiotensin I Lúc này, tại bề mặt của phổi và màng trong của thận sẽ tiết ra enzym ACE có tác dụng chuyển hóa Angiotensin I thành Angiotensin II, kích thích hệ thần kinh trung ương đồng thời tiết ra một loại hormone là aldosteron từ vỏ thượng thận Aldosteron có vai trò giữ natri, tiết kali và làm tăng quá trình giữ nước Sự gia tăng này làm cho thể tích chất lỏng trong cơ thể tăng lên, làm gia tăng áp suất máu, gây tăng huyết áp [49]

 Hoạt động của ACE trong hệ thống kallikrein-kinin

Khi áp suất máu trong cơ thể tăng lên, hệ thống này sẽ được hoạt hóa Lúc này, trong cơ thể sẽ tiết ra enzym kallikrein thủy phân kininogen có chủ yếu trong gan, tạo thành bradykinin là chất có khả năng gây giãn mạch mạnh (do nó giải phóng NO dẫn đến hạ huyết áp) Khi đó, ACE sẽ làm bất hoạt bradykinin, làm áp suất máu tăng lên, gây tăng huyết áp [49]

Hình 1.2: Vai trò của ACE trong điều hòa huyết áp [39]

1.3 Một số phương pháp xác định tác dụng ức chế enzym chuyển angiotensin

in vitro

1.3.1 Phương pháp quang phổ tử ngoại

Lần đầu được phát triển bởi Cushman và Cheung (1970) Hip-His-Leu (HHL)

bị ACE thủy phân thành Hippuric axit (HA) và His-Leu Sau đó sản phẩm HA được chiết bởi ethyl acetat và định lượng bằng phương pháp quang phổ tử ngoại tại bước sóng 228 nm [20]

Tuy nhiên, một số hạn chế của phương pháp bao gồm quá trình thực hiện phức tạp và tốn thời gian, sự không ổn định trong việc phân tách HHL từ HA bởi cả hai chất đều có độ hấp thụ ở bước sóng 228 nm Do đó, lượng HA có thể bị định lượng quá mức, gây là việc ước tính quá mức hoạt động của ACE [21]

1.3.2 Phương pháp quan phổ khả kiến (VSP)

Sự thành công của phương pháp đánh giá hoạt động các chất ức chế ACE của Cushman và Cheung vẫn phụ thuộc vào khả năng tách HA tạo thành ra khỏi cơ chất HHL Do đó, một hướng tiếp cận khác được sử dụng nhằm tối ưu phương pháp này bao gồm: (1) thêm 2,4,6-trichloro-s-triazin vào hỗn hợp mẫu bao gồm HA, một phản ứng giữa 2,4,6-trichloro-s-triazin với HA tạo thành nên được đo ở bước sóng 382 nm; (2) sử dụng 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic axit (HEPES) để dừng phản ứng và Cyanuric chloride trong 1,4-dioxan như là một tác nhân màu đo phổ ở bước sóng 504 nm; (3) thêm o-Phthaldialdehyd cái sau đó phản ứng với cơ chất thủy phân His-Leu được đo bởi thiết bị màu huỳnh quang ở bước sóng 495nm và 365 nm; (4) sử dụng benzene-sulfonyl-chlorid (BSC) như là tác nhân màu trong sự có mặt của quinolin (quang phổ khả kiến) và sau đó biến đổi sử dụng một máy đọc đĩa microtiter [13]

Một phương pháp VSP khác đánh giác tác dụng ức chế ACE sử dụng cơ chất

là FA-PGG (một loại furanacryloyl tripeptit) Phương pháp này lần đầu được giới thiệu bởi Holmquist và cộng sự lần đầu vào năm 1979, được Lundberg và cộng sự khẳng định lại sau đó Phương pháp dựa trên sự dịch chuyển màu phổ hấp thụ xảy ra trong quá trình thủy phân cơ chất tạo một dipeptit (glycyl-glcycin) và furancroyl-phenylalanin và được đo ở bước sóng 328 nm và 352 nm EDTA được thêm vào để dừng phản ứng của enzym [13]

Phương pháp VSP nhìn chung đơn giản hơn, độ nhạy cao hơn, tiết kiệm chi phí hơn do bỏ được giai đoạn tách HA khỏi hỗn hợp phản ứng [21]

1.3.3 Phương pháp HPLC

Phương pháp sử dụng HPLC lần được thực hiện bởi Elbl và Wagner vào năm

1991, dựa trên phản ứng thủy phân bởi ACE sử dụng cơ chất

5-N,N-dimethylaminonaphthalene -sulphony triglycin được gắn chromophore- và fluorophore- Sản phẩm tạo thành 5-N,N-dimethylaminonaphthalene -sulphony glycin sau đó được định lượng bằng việc sử dụng HPLC [13]

Dựa trên nguyên lí phản ứng tương tự với phương pháp của Cushman và Cheung, HPLC cũng được sử dụng nhằm cải thiện độ nhạy khi phân tích hoạt tính ACE Phương pháp lần đầu được hiện bởi Mehanna và Dowling (năm 1999), sau đó được cải tiến bởi Wu (năm 2002) để giảm thời gian thí nghiệm và tăng khả năng tách

HA và HHL

Phương pháp HPLC cho thấy độ chính xác và độ lặp lại cao Tuy nhiên sử dụng HPLC đòi hỏi thiết bị, dung môi có độ tinh khiết cao hơn, tiêu tốn thời gian hơn, quy trình phức tạp [21]

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của ACE trong thí nghiệm ức chế

ACE in vitro

Nồng độ cơ chất: Khi nồng độ cơ chất tăng thì tốc độ phản ứng chuyển hóa sẽ

tăng, lượng sản phẩm tạo ra càng nhiều Tuy nhiên, đến một mức nào đó, enzym sẽ bão hòa cơ chất và tốc độ phản ứng không tăng thêm [2]

Nồng độ enzym: Khi nồng độ enzym tăng lên, tốc độ phản ứng cũng tăng Tuy

nhiên, khi nồng độ enzym tăng đến một mức nhất định, sản phẩm tạo ra quá nhiều sẽ tác động và trung tâm dị thể của enzym, phản ứng bão hòa và tốc độ phản ứng sẽ không tăng lên nữa [2]

Nhiệt độ: vận tốc phản ứng do enzym xúc tác chỉ tăng theo nhiệt độ trong một

giới hạn nhất định mà ở đó phân tử enzym còn bền chưa bị biến tính Nhiệt độ ứng với hoạt độ enzym cao nhất gọi là nhiệt độ tối ưu của enzym Nhiệt độ tối ưu của enzym không cố định mà có thể thay đổi tùy cơ chất, pH môi trường, thời gian phản ứng… Nhiệt độ enzym bị biến tính gọi là nhiệt độ giới hạn, thường vào khoảng 700C [2]

pH: pH môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzym vì nó ảnh hưởng

đến mức độ ion hóa cơ chất, enzym và ảnh hưởng đến độ bền protein enzym Độ bền enzym có thể tăng lên khi có cơ chất, coenzym, Ca2+… pH ứng với hoạt độ enzym

cao nhất gọi là pH tối ưu và nó phụ thuộc vào bản chất của enzym đó Dựa vào pH tối ưu của enzym người ta có thể kết luận enzym kiềm tính, trung tính hay axit [2]

Các yếu tố khác:

ACE là một metallopeptidase phụ thuộc kẽm và clo, các thành phần đóng cai trò quan trọng trong hoạt tính phân cắt peptit [48], [49] Do đó, nồng độ clo, các ion kim loại có khả năng tạo phức với enzym cũng ảnh hưởng đến khả năng phản ứng của enzyme Ngoài ra, tannin là một nhóm polyphenol, có khả năng tạo phức với protein, peptit, tạo các phức có màu gây nhiễu và định lượng quá mức kết quả phản ứng tạo màu của sản phẩm tạo bởi phản ứng thủy phân HHL

1.4 Các nghiên cứu sàng lọc dược liệu có tác dụng hạ huyết áp thông qua ức

chế enzym chuyển angiotensin

Việc sàng lọc tác dụng hạ huyết áp của các sản phẩm tự nhiên, đặc biệt là các dược liệu được sử dụng trong điều trị tăng huyết áp và lợi tiểu theo kinh nghiệm dân gian, đã được thực hiện từ rất sớm Các phương pháp đánh giá khả năng ức chế ACE

in vitro để sàng lọc tác dụng hạ huyết áp của các sản phẩm tự nhiên được sử dụng

rộng rãi, do kết quả thu được nhanh chóng, chính xác Dựa trên loại cơ chất và thiết

bị sẵn có để lựa chọn phương pháp đánh giá tác dụng ức chế ACE in vitro Từ kết

quả sàng lọc của các chất ức chế ACE từ một số nguồn dữ liệu cho thấy, các nghiên cứu phát triển thuốc mới từ dược liệu vẫn còn rất hạn chế so với tiềm năng của nguồn tài nguyên thiên nhiên sẵn có [13]

1.4.1 Các hướng nghiên cứu trên thế giới

Liên quan đến tác dụng ức chế ACE in vitro, trên thế giới đã có nhiều nghiên

cứu sàng lọc trên dược liệu và các nhóm chất phân lập từ dược liệu chủ yếu theo 2 hướng tiếp cận chính:

1.4.1.1 Tiếp cận sàng lọc dựa trên kinh nghiệm sử dụng dược liệu trong dân

gian hoặc nền y học cổ truyền của một số nước

Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống tăng huyết áp của các dược liệu cổ truyền

đã được thực hiện qua nhiều năm [16], trong đó các cây được lựa chọn một phần dựa

trên việc sử dụng rộng rãi chúng trong điều trị tăng huyết áp và lợi tiểu theo các trị liệu cổ truyền [16], [23], [25]

Năm 1991, Elbl và Wagner đã tiến hành thí nghiệm in vitro để đánh giá các

chất ức chế ACE trong cao chiết thực vật và đã phát hiện một số các loài thực vật có

hoạt tính như là Lespedeza capitata (phân đoạn flavonoid) [16]

Năm 1995, Klaus Hansen đã tiến hành sàng lọc các dược liệu cổ truyền với tác dụng chống tăng huyết áp dựa trên sự ức chế ACE Nghiên cứu này áp dụng phương pháp của Elbl và Wagner để đánh giá tác dụng của 31 dược liệu từ các vùng khác nhau trên thế giới (Trung Quốc, Ấn Độ, Nam Mỹ) Kết quả cho thấy cao chiết thô từ

7 loài ức chế ACE trên 50% bao gồm rau má (Centella asiatica), ké đay vàng

(Triumfetta rhomboidea Jacq), câu đằng (Uncaria rhynchophylla Jack), Gunnera tinctorial L, Hexachlamys edulis, Pseudarthria viscida W & Arn, Pseudathria hookeri W & Am [13], [25]

Năm 1999, Duncan AC áp dụng phương pháp của Elbl và Wagner để sàng lọc tác dụng ức chế ACE của 20 dược liệu ở Zulu Kết quả cho thấy, ở nồng độ 0,33

mg/ml, lá Adenopodia spicata có khả năng ức chế mạnh nhất (97%) Bảy loài thực

vật khác đạt được tác dụng ức chế lớn hơn 70% và 5 loài đạt trên 50% Các cây có tác dụng ức chế cao hơn 50% sau đó được thử sự có mặt của tannin để loại khả năng dương tính giả [23]

Năm 2000, Castro Braga và cộng sự sử dụng phương pháp đánh giá tác dụng

ức chế ACE của Elbl và Wagner để đánh giá khả năng hạ huyết áp của19 loài thực vật thuộc 13 họ Ở nồng độ 0,33 mg/ml, các cao chiết của các loài cho thấy tác dụng

ức chế ACE mạnh bao gồm: Ouratea semiserrata (Mart & Nees) Engl – thân (68%);

Cuphea cartagenesis (Jacq.) Macbride (50%) - lá và Mansoa birsuta DC - lá (54%)

[18]

Năm 2007, các dược liệu tiềm năng trong điều trị tăng huyết áp ở Braxin được

đánh giá tác dụng ức chế ACE in vitro Nghiên cứu được tiến hành trên 44 loài thực

vật thuộc 30 họ Phương pháp nghiên cứu được phát triển dựa trên phương pháp của Cushman Sản phẩm HA được đánh giá thông qua phản ứng tạo màu với 2,4,6-

trinitrobenzenesulfonic axit (TNBS) để tạo thành 2,4,6-trinitrophenyl-glycyl-glycine, được đo độ hấp thụ ở bước sóng 415 nm [19] Kết quả cho thấy, ở nồng độ 0,1 mg/ml, các cây cho thấy tác dụng ức chế ACE trên 50% bao gồm: Calophyllum brasiliense, Combretum fruticosum, gối hạc (Leea rubra), chà là cảnh (Phoenix roebelinii) và bàng (Terminalia catappa)

Năm 2008, một nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế ACE của 9 loài thực vật được thu hái ở Lebanon trên các các cao chiết methanol, n-hexan và choloroform của

Calamintha origanifolia, Satureja thymbra, Satureja thymbra, Prangos asperula, Sideritis perfoliata, Asperula glomerata, Hyssopus officinalis, Erythraea centaurium, Marrubium radiatum và Salvia acetabulosa Kết quả cho thấy, cao chiết methanol

của Marrubium radiatum và Salvia acetabulosa có tác dụng ức chế ACE mạnh với

IC50 tương ứng là 72,7 µg/ml và 52,7 µg/ml [34]

Năm 2013, một nghiên cứu tiến hành đánh giá tác dụng ức chế ACE in vitro

với 50 dược liệu ở Iran Nghiên cứu này sử dụng phương pháp thủy phân cơ chất HHL bởi ACE, sau đó sử dụng HPLC để đánh giá Kết quả cho thấy, 6 cao chiết có

tác dụng ức chế ACE > 50% ở nồng độ 330 µg/ml là Berberis integerrima Bunge, (Berberidaceae) (88,2 ± 1,7%), Crataegus microphylla C Koch (Rosaceae) (80,9 ± 1,3%), Nymphaea alba L (Nymphaeaceae) (66,3 ± 1,2%), Onopordon

acanthium L (Asteraceae) (80,2 ± 2,0%), Quercus infectoria G Olivier (Fagaceae)

(93,9 ± 2,5%) và Rubus sp (Rosaceae) (51,3 ± 1,0%) [44]

Năm 2015, nhóm nghiên cứu của Sapuchi F.C sử dụng phương pháp của Cushman, đánh giá tác dụng ức chế ACE trên cao chiết methanol của các thực vật ăn

được ở Indonesia Theo đó, rau càng cua (Peperomia pellucida L.) cho thấy tác dụng

ức chế ACE mạnh với IC50 là 7,17 μg/ml, sau đó là cải xoong (Nasturtium officinale)

và hạt vừng (Sesamum indicum L.) với giá trị IC50 tương ứng là 15,44 μg/ml và 30,16

μg/ml [43]

1.4.1.2 Tiếp cận theo nhóm hợp chất tự nhiên phân lập từ dược liệu

Việc xác định các phân tử đích (enzym hoặc thụ thể) đóng vai trò thiết yếu trong điều hòa huyết áp, từ đó việc tìm ra các chất cụ thể là lí do phát triển các mô

hình đánh giá tác dụng ức chế ACE [16] Việc tìm kiếm các hoạt chất có tác dụng ức chế ACE có thể được thực hiện bắt đầu từ sàng lọc tác dụng ức chế ACE của cao chiết tổng, phân đoạn và sau đó là phân lập các chất hóa học Các chất đã được phân lập và đánh giá tác dụng ức chế ACE cũng có thể xác định cấu trúc để đưa ra tổng quan dự đoán về cơ chế tác dụng lên ACE, các nhóm chức có tác dụng

Năm 2001, nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế ACE của cao chiết chiết

MeOH, các phân đoạn và chất tinh khiết từ loài Musanga cecropioides, Cecropia and

Crataegus oxyacantha /C monogyna sử dụng phương pháp của Elbl và Wagner Các

axit phenolic cho thấy không có tác dụng ức chế ACE trong khi flavonoids và proanthocyanidins có tác dụng ức chế ở nồng độ 0,33 mg/ml [32]

Các đipeptit được phân lập từ tỏi (Allium sativum) là Phe, Ser-Phe,

Gly-Tyr, Ser-Gly-Tyr, Asn-Phe, Asn-Gly-Tyr, và Phe-Tyr ức chế ACE với IC50 lần lượt là 277,9

µM, 130,2 µM, 72,1 µM, 66,3 µM, 46,3 µM, 32,6 µM và 3,74 μM Hợp chất dihydroxycyclopentyl-3-(3’,4’-dihydroxyphenyl) acrylat phân lập từ cà dại hoa trắng

(E)-2,3-(Solanum torvum) ức chế ACE với giá trị IC50 =778 mg/ml Các thành phần phân lập được từ Suaeda physophora Pall bao gồm quinoline alkaloids và các flavonoid cũng

có khả năng ức chế ACE mạnh Phân lập Erythroxylum gonocladum được astilbin có

tác dụng ức chế ACE với IC50 = 4,53 mg/ml Quercetin phân lập từ rau càng cua

(Peperomia pellucida) cho thấy tác dụng ức chế ACE với IC50= 7,72 mg/ml

Việc phân lập và phát hiện ra các có tác dụng ức chế ACE từ sản phẩm tự nhiên giúp các nhà nghiên cứu tập trung tổng hợp lại, loại nhiễu và tách các hợp chất

có khả năng ức chế ACE mạnh, phục vụ cho nghiên cứu phát triển thuốc mới trong y học hiện đại [13]

1.4.2 Tình hình tại Việt Nam

Tài nguyên thực vật ở Việt Nam rất phong phú và đa dạng, nền y học cố truyền phát triển từ lâu đời Nhiều loài đã được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để chữa bệnh Nhiều loài có tính chất đặc hữu, có tiềm năng phát triển thuốc mới [47] Tuy nhiên, vẫn chưa có có nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym chuyển angiotensin của các dược liệu được thực hiện

Năm 2014, nhóm nghiên cứu thực hiện phân lập các hoạt chất từ rau chua

Hibiscus sabdariffa có tác dụng ức chế enzym chuyển hóa angiotensin, với 7 hợp chất

bao gồm: methyl 5-O-caffeoylquinate; trimethyl 2-hydroxicitrate; methyl caffeoylquinate; caffeic axit; methyl 3-O-caffeoylquinate; methyl 5-O-p-

4-O-coumaroylquinat and chlorogenic axit Trong đó, 3 dẫn xuất của axit quinic, chlorogenic axit và caffeic axit được xác định là chất ức chế ACE với giá trị IC50 lần lượt là 413,76; 569,47; 463,71; 373,25 và 253,12 µg/ml 5 hợp chất này được xác định là các chất có khả năng chống oxi hóa mạnh với giá trị IC50 ở khoảng giống với resveratrol [6]

1.5 Các dược liệu tiềm năng trong điều trị tăng huyết áp

Dựa trên các thông tin tìm kiếm được về kinh nghiệm sử dụng trong dân gian cũng như tác dụng ức chế ACE, nghiên cứu này tiến hành đánh giá, sàng lọc tác dụng

ức chế ACE các cao chiết của các dược liệu được trình bày dưới đây:

Đỗ trọng (Eucommia ulmoides): Đỗ trọng là cây thuốc di thực, đang được

phát triển trồng ở vùng núi phía bắc Vỏ thân cây Đỗ trọng được dùng để điều trị thận

hư, đau lung, chân gối yếu mỏi, phong thấp, chân tê phù, dị tinh, liệt dương và tăng huyết áp [10] Trong đỗ trọng có hai nhóm thành phần hóa học chính là iridoid glycoside và ligan glycoside Các kết quả nghiên cứu thực nghiệm cho thấy vỏ thân

đỗ trọng có tác dụng hạ áp do ảnh hưởng lên trung tâm vận mạch ở hành tủy và trên

hệ thống dây thần kinh phế vị và làm tăng sức co bóp của cơ tim Nước sắc thân làm tăng tiết niệu ở chuột nhắt Ngoài ra, tác dụng hạ áp còn do giãn tĩnh mạch ngoại vi

và tác dụng trực tiếp lên cơ trơn mạch vành Nước sắc vỏ thân có tác dụng hạ áp trên

mô hình động vật thí nghiệm gây tăng huyết áp do thận

Cần tây (Apium graveolens): Cao chiết cồn, hexan và methanol từ hạt cần tây

liều 300 mg/kg đã được chứng minh là có tác dụng hạ huyết áp trên mô hình chuột gây tăng huyết áp bằng deoxycorticosterone acetate Trong đó, cao chiết hexan có tác dụng tốt nhất trong số cao chiết được nghiên cứu, được giải thích là do thành phần n-

butylphthalide, chất tạo nên mùi vị đặc trưng của cần tây [37] Chất phthalide này

cũng đã được báo cáo là có tác dụng là hạ huyết áp trong một mô hình tăng huyết áp

khác [31] Apigenin, một flavon được phân lập từ cần tây có tác dụng giãn mạch do khả năng ức chế dòng canxi từ ngoại bào vào nội bào trên động mạch chuột cống phân lập gây co mạch bằng noradrenalin Quan trọng hơn, cao chiết và các thành phần của cần tây đã được chứng minh là có tác dụng hạ huyết áp trên người, cơ chế có thể

là làm giảm catecholamin trong hệ tuần hoàn và làm giảm sức kháng mạch máu [26]

Gối hạc (Leea rubra): Rễ gối hạc được dùng chữa bệnh đau nhức xương, tê

thấp, đau bụng, rong kinh, yếu mệt sau khi đẻ Mặc dù chưa có nghiên cứu nào công

bố về tác dụng hạ huyết áp của gối hạc hay tác dụng hạ huyết áp trong y học dân tộc

nhưng loài khác thuộc chi này là L guineen được sử dụng phổ biến trong điều trị chứng tăng huyết áp Các hợp chất được phân lập từ lá của L guineense bao gồm các

dẫn xuất của quercetin, cùng với kaempferol, quercetin, quercitrin, mearnsitrin, axit gallic và ethyl gallat Trong nghiên cứu sàng lọc và tác dụng ức chế ACE từ các dược

liệu Braxin, trong số 40 cây thuộc 30 họ khác nhau được đánh giá thì gối hạc (Leea

rubra) là một trong 5 cây có tác dụng ức chế ACE mạnh nhất, gợi ý về tiềm năng của

gối hạc trong điều trị chứng tăng huyết áp [19]

Lược vàng (Callisia fragrans): còn có tên là địa lan vòi, lan rũ, cây bạch tuộc,

trái lá phất dũ, giả khóm Toàn cây có chứa các chất có hoạt tính sinh học bao gồm flanovoid, steroid, và nhiều khoáng tố vi lượng, có lợi cho sức khỏe Chất flanovoid

có vai trò như vitamin P, có khả năng làm bền mạch máu, và tăng tác dụng của vitamin

C Theo một số thông tin dân gian, cây lược vàng có nhiều công dụng chữa bệnh, trong đó có một số bệnh khó chữa Đó là các chứng bệnh tim mạch, tăng huyết áp, thoái hóa đốt sống cổ, viêm đại tràng mạn tính, viêm gan, táo bón, chảy máu dạ dày, tiểu đường, mỡ máu, thấp khớp, chấn thương trầy xước, bầm tím, viêm họng, viêm mũi, viêm thận, đau răng, loét lợi, eczema, sỏi thận, tai biến mạch máu não, u xơ tuyến tiền liệt, ung thư, đau lưng, bỏng, say rượu Tuy nhiên công dụng của cây lược vàng vẫn chưa được kiểm chứng một cách khoa học cụ thể, chủ yếu là thông tin dân gian truyền miệng

Lá hồng (Diospyros kaki): Cây hồng thuộc họ Thị (Ebenaceae) là một cây ăn

quả lâu năm Ở Việt Nam, cây hồng đã có từ lâu đời, được trồng nhiều ở phía Bắc từ

Hà Tĩnh trở ra, ở phía Nam hồng được trồng ở vùng Đà Lạt - Lâm Đồng nơi có độ cao từ 1000-1500 m so với mặt nước biển Lá hồng chứa flavonoid: quercetin và glycosid của nó (hyperin, và isoquercitrin), kaempferol và glycosid của nó (astragalin vv) 3-O-β-D-glucopyrannosid, isorhamnetin 3-O- β -D-glucopyranosid, quercetin 3-O- β-D-galactopyranosid, quercetin 3-O-β-D-glucopyranosyl-(6 1)-α-L- rhamnopyranosid, các tritecpenoid và nhiều hợp chất khác Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu chứng minh các chất được phân lập từ lá hồng có nhiều tác dụng sinh học như hạ huyết áp, kháng khuẩn, chống ung thư, chống oxy hóa, hạ lipid máu, chống đột quỵ…

Xa kê (Artocarpus altilis) là một loài cây gỗ có hoa trong họ dâu

tằm (Moraceae), được trồng phổ biến ở khắp nơi trong vùng nhiệt đới Đông Nam Á, Nam Á và nhiều đảo ở Thái Bình Dương, trong đó có miền Nam Việt Nam Xa kê được sử dụng như một nguồn bổ sung carbohydrate, ở Tây Ấn, nó còn được xem là một cây thuốc tác động lên huyết áp và giảm nhẹ bệnh hen suyễn Từ cao chiết ethyl acetat của lá xa kê phân lập và xác định cấu trúc của 3 hợp chất thuộc loại geranyl flavonoid Trong dân gian còn sử dụng lá xa kê để điều trị phù thúng, viêm gan vàng da; sử dụng phối hợp với một số vị thuốc khác trị gout, tiểu đường, tăng huyết áp [59]

Dừa cạn (Catharanthus roseus) là cây mọc hoang dại và được trồng ở nhiều

nước nhiệt đới như Việt Nam, Ấn Độ, Indonesia, Philippine, … Ở Việt Nam, gặp nhiều nhất ở các tỉnh ven biển Trong dân gian, dừa cạn dùng dưới dạng thuốc sắc có tác dụng lợi tiểu, chữa tăng huyết áp, tiểu đường [3] Nghiên cứu của Ara và cộng sự

trên chuột năm 2009 cho thấy rằng dịch chiết lá dừa cạn (C roseus) làm thay đổi

đáng kể các thông số tim mạch trong việc làm hạ huyết áp và lipid máu ở chuột tăng huyết áp do tiêm adrenaline [14] Ngoài ra, Xiao-Lin Wu và cộng sự năm 2014 chứng minh rằng vindorosin, một thành phần chính trong dừa cạn gây giãn tĩnh mạch chuột phụ thuộc vào nồng độ thông qua phong tỏa các kênh Ca2+ kiểu L ở cơ trơn và một

số cơ chế khác Các kết quả cho thấy, vindorosin có tiềm năng trong việc làm giảm

áp lực mạch máu trong bệnh lí như tăng huyết áp [52] Ngoài ra, trong dừa cạn chứa

nhiều loại alkaloid Cao lỏng có tác dụng hạ áp trên lâm sàng, giảm cả trị số tối đa lẫn tối thiểu, điều trị đơn giản, dễ áp dụng, không thấy biến chứng ngộ độc [10]

CHƯƠNG HAI: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu – thiết bị

2.1.1 Mẫu nghiên cứu:

Chuẩn bị mẫu dược liệu để chiết:

Mẫu dược liệu được cung cấp bởi khoa Tài nguyên, Viện Dược liệu, sau đó được sấy tiếp ở 500 đến giòn, sau đó cất trong túi nilon kín, tránh ẩm, bảo quản nơi khô ráo

Bảng 2.1: Thông tin về mẫu nghiên cứu

Tên Bộ phận dùng Nơi thu hái Thời gian thu

hái

Đỗ trọng (Eucommia ulmoides): Vỏ thân Hà Nội 5/2018

Cần tây (Apium graveolens) Toàn cây Thái Bình 4/2018

Gối hạc (Leea rubra): Cành lá;

Thân rễ Hà Nội 5/2018

Lược vàng (Callisia fragrans): Lá Hải Dương 4/2018

Dừa cạn (Catharanthus roseus) Bộ phận trên

- HHL (N-Hippuryl-His-Leu hydrate powder, ≥98% (HPLC)) – (Sigma)

- Chất đối chiếu: Captopril, 98% - (ACROS ORGANICS)

- Hóa chất chiết dược liệu: ethanol (EtOH) công nghiệp tuyệt đối, nước; dung môi hữu cơ công nghiệp: diclomethan (DCM), n-hexan (Hex), ethyl acetat (EtAc), n-butanol (BuOH)

- Hóa chất pha mẫu dược liệu: Dimethyl sulfoxide (VWR- BDH prolabo)

- Hóa chất pha đệm: Natri tetraborate, NaCl - (Sigma)

- Benzene sulfonyl chloride 99% (BSC) - (Sigma)

- Quinoline 99% - (Acros Organics)

- HCl 1M, Ethanol absolute for analysis - (Merck)

2.1.3 Máy móc, thiết bị, dụng cụ

 Cho chuẩn bị cao dược liệu

- Cân, máy đo hàm ẩm, bể điều nhiệt, bộ sinh hàn

- Bình cầu chiết dung tích 0,5 L, 1 L, 2 L

- Máy thu hồi dung môi áp suất giảm

 Cho thí nghiệm đánh giá hoạt động ức chế enzym

- Cân phân tích, máy đo pH, bể siêu âm, thiết bị khuấy từ

- Bể điều nhiệt SHEL LAB

- Máy voltage MS1 minishaker

- Tủ hút

- Hệ thống ELISA gồm máy đọc khay vi tinh thể (Biotek) ELx808

- Máy lắc nghiêng mini Rocker -Shaker BioSan

- Đĩa UV 96 giếng đáy phẳng SPL Life Science

- Micropipet một đầu kênh với các thể tích: 0,5-10 µl, 2-20 µl, 10-100 µl,

50-200 µl, 100-1000 µl -Eppendorf

- Microtube thể tích 1,5 ml, 15 ml, 50 ml -Eppendorf

Hình 2.1: Hệ thống đo ELISA 96 giếng - EL x808 Biotek

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện mục tiêu đề ra, đề tài được thiết kế với 3 nội dung:

(1) Chuẩn bị các cao chiết từ 8 mẫu dược liệu được nêu trong Bảng 2.1

(2) Sàng lọc tác dụng của các mẫu cao dược liệu tại Việt Nam trên thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym chuyển angiotensin

+ Chuẩn bị mẫu thử in vitro

+ Tiến hành thử với các mẫu dược liệu pha với nồng độ 100 µg/ml; 50 µg/ml (3) Xác định IC50 của cao dược liệu có khả năng ức chế ACE tốt nhất

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chuẩn bị cao chiết

 Cao chiết tổng (cao nước và cao cồn 500)

+ Nguyên tắc: chiết hồi lưu Dược liệu chia nhỏ, được ngâm cùng dung môi trong một bình cầu đáy tròn thể tích 500 ml được nối với hệ thống ngưng tụ Đun nóng bình cầu chứa dược liệu và dung môi đến nhiệt độ sôi, dung môi bốc hơi sẽ ngưng tụ và quay trở lại bình chiết

+ Dung môi: nước hoặc Ethanol 500 tương ứng cao tổng chiết nước và cao tổng chiết cồn

+ Chiết 3 lần, thời gian mỗi lần 2 giờ 30 phút – 2 giờ - 2 giờ

+ Tỉ lệ dung môi ở 3 lần chiết so với khối lượng dược liệu (sau đây sẽ gọi tắt là tỉ

lệ dung môi): 10/8/8

Dịch chiết mỗi lần được lọc, gộp dịch lọc, bốc hơi dung môi thu được cao tổng

Hình 2.2: Sơ đồ chiết cao tổng dược liệu

 Cao chiết phân đoạn

+ Cho dược liệu đã chia nhỏ, cân vào bình cầu đáy tròn thể tích 2 L được nối với

hệ thống ngưng tụ Đun nóng bình cầu chứa dược liệu và dung môi đến nhiệt độ sôi, dung môi bốc hơi sẽ ngưng tụ và quay trở lại bình chiết

+ Dung môi là cồn 900 được thêm vào, tỉ lệ dung môi là 10/8/8 ở ba lần chiết (đảm bảo rằng dung môi ngập hết dược liệu)

+ Lọc dịch chiết mỗi lần, gộp dịch lọc Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm + Dịch còn lại sau khi thu hồi dung môi, thêm vào lượng nước tối thiểu Sau đó tiến hành lắc phân đoạn trong bình chiết với thứ tự các dung môi: n-hexan, diclomethan, ethyl acetat và n-butanol, giữ lại phần dung dịch nước cuối cùng Các phân đoạn dịch chiết được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 5 phân đoạn cao chiết tương ứng (kể cả phần dung dịch nước cuối cùng)