XÁC ĐỊNH Aspergillus NHÓM Flavi SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN TRONG NÔNG SẢN BẰNG KỸ THUẬT PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH Aspergillus NHÓM Flavi SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN TRONG NÔNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH Aspergillus NHÓM Flavi SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN

TRONG NÔNG SẢN BẰNG KỸ THUẬT PCR

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN XUÂN DANH Niên khóa: 2011 - 2013

Tháng 12/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH Aspergillus NHÓM Flavi SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN

TRONG NÔNG SẢN BẰNG KỸ THUẬT PCR

ThS TRẦN THỊ VÂN

Tháng 12/2013

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận, tôi luôn nhận được sự chỉ dẫn tận tình của Quý Thầy Cô, sự động viên của gia đình và sự giúp đỡ của bạn bè, chính nhờ những điều này đã giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận

Lời cảm ơn đầu tiên tôi xin gửi đến Quý Thầy Cô khoa Nông Nghiệp và Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt hai năm học qua

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy Lê Đình Đôn đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện khóa luận này tại Viện nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường trường Đại Học Nông Lâm, Thành Phố Hồ Chí Minh

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy Huỳnh Văn Biết và cô Trần Thị Vân đã hết lòng hướng dẫn, chỉ dạy cho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn

TP.HCM, Ngày 06 Tháng 12 Năm 2013

Nguyễn Xuân Danh

TÓM TẮT

Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus gây nhiễn nghiêm trọng của các

nông sản vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Sự xâm nhiễm của các loại nấm này trong nông sản có thể là gây ô nhiễm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bởi độc tố Aflatoxin gây ung thư mạnh Việc ăn phải các loại thực phẩm nhiễm Aflatoxin được ghi nhận

là một yếu tố gây nguy cơ ung thư biểu mô gan cho người Trong bài báo cáo này nghiên cứu trên một số loại nông sản như bắp, đậu phộng và cà phê nhằm kiểm tra

sự hiện diện của các loại nấm sinh Aflatoxin Từ 45 mẫu bao gồm Bắp (15 mẫu), Đậu Phộng (15 mẫu) và Cà Phê (15 mẫu), phân lập được 30 chủng nấm mốc Dựa

vào hình thái khuẩn lạc và đăc điểm tế bào chi nấm Aspergillus flavus được phát hiện, không có sự hiện diện của nấm Aspergillus parasticus Nấm Aspergillus flavus

hiện diện trên bắp 35,33%, 36,80 % trên đậu phộng và 0 % trên mẫu cà phê

Về đặc điểm hình thái học, chủ yêu dựa vào màu sắc khuẩn lạc trên môi

trường PDA và hình thái bào tử, nấm Aspergillus flavus có khuẩn lạc màu xanh lá

hơi vàng, bào tử đính trơn hoặc nhám

Về phân tử, sự hiện diện của một gene aflQ (=ord1=ordA) liên quan đến con

đường sinh tổng hợp Aflatoxin đã được kiểm tra (bằng phương pháp PCR) Sự hiện diện của gene này có mối tương quan tới các chủng nấm mốc sinh Aflatoxin Tất cả

các chủng nấm Aspergillus flavus phân lập được đều cho kết quả dương tính với sự hiện diện của gene aflQ

SUMMARY

Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus cause perennial infection of

agriculturally important agricultural products in tropical and subtropical areas Invasion of crops by these fungi may result in contamination of food and feed by potent carcinogenic aflatoxins Consumption of aflatoxin contaminated foods is a recognised risk factor for human hepatocellular carcinoma This study conducted some agricultural products such as: peanuts, corn and coffee beans for the presence

of aflatoxigenic fungi From a total of 45 samples comprising peanut (15), corn (15) and coffee beans (15), 30 strains of fungi were isolated Identification of strains by

colony morphology found to be Aspergillus flavus with no Aspergillus parasiticus isolated Aspergillus flavus was present in 35.33% of peanut samples, 36.80 % of

corn samples and 0 % of coffee beans samples

On the basis of morphological characters (mainly colony color on Potato

D-glucose agar and conidia orphology), Aspergillus flavus had yellow-green (yellow

is less than) colonies and smooth tofinely rough globose conidia

Molecularly, the presence of one genes of the aflatoxin biosynthetic pathway,

aflQ (=ord1=ordA) were tested (by PCR method) The presence of genes correlate

with aflatoxigenicity All of Asperglillus flavus isolates were positive with the presence of aflQ (ord1)

Keywords: Asperglillus, PCR, Aflatoxin, morphological characters

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH viii

Chương 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của để tài 2

1.3 Nội dung đề tài 2

Chương: 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Nhóm Aspergillus flavi sinh độc tố Aflatoxin 3

2.1.1 Phân loại học 3

2.1.2 Hình thái 3

2.1.3 Sinh thái 4

2.2 Phương pháp phát hiện nhóm Aspecgillus flavi 5

2.2.1 Dựa vào đặc điểm hình thái 5

2.2.2 Dựa trên phương pháp sinh học phân tử 6

2.3 Độc chất Aflatoxin 7

2.3.1 Lịch sử phát hiện aflatoxin 7

2.3.2 Công thức cấu tạo và một số tính chất vật lý của Aflatoxin 8

2.3.3 Tác hại của Aflatoxin 9

2.4 Giới thiệu về kỹ thuật PCR 10

2.4.1 Khái quát về kỹ thuật PCR 10

2.4.1.1 Khái niệm 10

2.4.1.2 Lịch sử 10

2.3.2 Nguyên lý 11

2.3.3 Các thành phần phản ứng 11

2.3.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 12

2.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 13

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 14

3.2 Vật liệu 14

3.2.1 Mẫu thực hiện 14

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ chính 14

3.3 Phương pháp 15

3.3.1 Phương pháp định danh nấm mốc 15

3.3.2 Phương pháp tách chết DNA 16

3.3.3 Phương pháp PCR 16

3.3.4 Phương pháp điện di trên gel agarose 18

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

4.1 Kết quả 19

4.1.1 Kết quả xác định tỉ lệ nhiễm Aspergillus nhóm Flavi trong nông sản 19

4.1.1.1 Kết quả xác định tỉ lệ nhiễm Aspergillus nhóm Flavi trên mẫu bắp 19

4.1.1.2 Kết quả xác định tỉ lệ nhiễm Aspergillus nhóm Flavi trên mẫu đậu phộng 20

4.1.1.3 Kết quả xác định tỉ lệ nhiễm Aspergillus nhóm Flavi trên mẫu cà phê 21

4.1.2 Kết quả mô tả hình thái nấm Aspergillus flavus 22

4.1.3 Kết quả tách DNA nấm Aspergillus flavus 24

4.1.3.1 Kết quả tách DNA mẫu nấm Aspergillus flavus phân lập từ bắp 25

4.1.3.1 Kết quả tách DNA mẫu nấm Aspergillus flavus phân lập từ hạt đậu phộng 26

4.1.4 Kết quả xác định nhóm nấm Aspergillus flavus bằng phương pháp PCR 26

4.1.4.1 Kết quả thử nghiệm quy trình PCR xác định Aspergillus flavus 26

4.1.4.2 Kết quả PCR xác định Aspergillus flavus phân lập từ mẫu bắp 28

4.1.4.3 Kết quả PCR xác định Aspergillus flavus phân lập từ mẫu đậu phộng 29

4.2 Thảo Luận 29

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32

5.1 Kết luận 32

5.2 Đề nghị 32

TÀI LIỆU THAM KHÀO 33

PHỤ LỤC 36

AFPA Aspergillus flavus và Aspergilus parasiticus agar

CCA Coconut cream agar

PCR Polymer chain reaction

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms

SDS Sodium dodecyl sulfate

SSCP Single strand conformation polymorphyrism

Ta Annealing temperature

Tm Melting temperature

UV Ultraviolet

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Phân loại học nấm Aspecgillus flavus 3

Bảng 2.2 Phân loại học nấm Aspecgillus parasiticus 3

Bảng 3.1 Một số mẫu nông sản tiến hành thí nghiệm 14

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 17

Bảng 4.1 Kết quả xác định tỉ lệ nhiễm Aspergillus flavus trên mẫu bắp 20

Bảng 4.2 Kết quả xác định tỉ lệ nhiễm Aspergillus flavus trên mẫu đậu phộng 21

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

2.1 Aspergillus flavus 3

Hình 2.2 Aspergillus parasiticus 3

Hình 2.3 Công thức cấu tạo hoá học của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 8

Hình 3.1 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 17

Hình 4.1 Nấm Aspergillus flavus nhiễm trên mẫu nông sản 19

Hình 4.2 Mẫu ca phe trên môi trường PDA sau 5 ngày nuôi cấy 22

Hình 4.3 Nấm Aspergillus flavus trên bắp và đậu phộng 22

Hình 4.4 Khuẩn lạc Aspergillus flavus trên môi trường PDA sau 5 ngày nuôi cấy 23

Hình 4.5 Tản nấm Aspergillus flavus trên môi trường PDA sau 15 ngày nuôi cấy 23

Hình 4.6 Bông bào tử nấm Aspergillus flavus 24

Hình 4.7 Bào tử nấm Aspergillus flavus 24

Hình 4.8 Sợi nấm Aspergillus flavus trên môi trường PD broth sau 72 giờ nuôi cấy 25 Hình 4.9 Kết quả điện di DNA genome nấm Aspergillus flavus phân lập từ hạt bắp 25 Hình 4.10 Kết quả điện di DNA genome nấm Aspergillus flavus phân lập từ hạt đậu phộng 26

Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu bắp B.5 26

Hình 4.12 Xử lý kết quả giải trình tự với phần mềm BioEdit 27

Hình 4.13 Blast ssDNA đã xử lý lên ngân hàng dữ liệu NCBI 27

Hình 4.14 Kết quả blast trình tự đã giải lên ngân hang giư liệu NCBI 28

Hình 4.15 Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu nấm Aspergillus flavus phân lập từ bắp 28

Hình 4.16 Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu nấm Aspergillus flavus phân lập từ đậu phộng 29

Chương 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay, ngày càng xuất hiện nhiều bệnh liên quan đến chất lượng thực phẩm Rất nhiều mối quan tâm xoay quanh vấn đề dinh dưỡng, an toàn thực phẩm Trong đó nhiễm các chất gây hại cho người như độc tố nấm mốc, vi khuẩn, kim loại nặng, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật được chú trọng đặc biệt

Nước ta có khí hậu nóng ẩm, lượng mưa hằng năm cao, các điều kiện bảo quản chưa được quan tâmgây ảnh hưởng đến chất lượng nông sản.Trong điều kiện như vậy, nấm mốc có thể phát triển sinh độc tố gây ảnh hưởng đáng kể đến sức khỏe người tiêu dùng, đặc biệt là gây ung thư Trong đó, có thể kể đến Aflatoxin gây ung thư

Độc chất Aflatoxin được tạo ra từ các lọai nấm mốc thuộc giống Aspergillus, trong đó chủ yếu do Aspergillus nhóm Flavi sinh ra.Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển các phương pháp chẩn đoán nấm Aspergillus nhóm Flavi sinh độc tố Aflatoxin

có ý nghĩa cực kỳ quan trọng

Phương pháp phân tích định danh nấm Aspergillus nhóm Flavi chủ yếu dựa

vào các đặc điểm hình thái khuẩn lạc và đặc điểm tế bào (tiêu chuẩn ngành y tế,

2003) rất dễ nhầm lẫn với các loài nấm mốc Aspergillus khác

Hiện nay, kỹ thuật PCR dựa trên kết quả nghiên cứu hệ gen và con đường

sinh tổng hợp Aflatoxin có thể xác định chính xác nấm Aspergillus nhóm Flavi

Từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định

Aspergillus nhóm Flavi sinh độc tố Aflatoxin trong một số nông sản bằng kỹ thuật PCR”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của để tài

Kết hợp nuôi cấy truyền thống và phương pháp PCR, xác định tỉ lệ nhiễm

nấm Aspergillus nhóm Flavi trong nông sản

1.3 Nội dung đề tài

- Thu thập và phân lập các chủng Aspergillus nhóm Flavi từ mẫu nông sản (hạt

đậu phộng, cà phê, hạt bắp)

- Xác nhận Aspergillus nhóm Flavi phân lập từ nông sản bằng phương pháp

PCR

Chương: 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Aspergillus nhóm Flavi sinh độc tố Aflatoxin

Loài Aspergillus flavus rất dễ nhận biết bởi màu vàng hơi lục và dạng ít

nhiều vón cục của tán.Ở đỉnh các cuống bào tử đính mọc thẳng đứng, có vách sần sùi, hình thành những đầu mang bào tử đính có dạng gần hình cầu đến thuôn dài Các thể chai hoặc đính trực tiếp vào đầu mang bào tử đính (thể bình một lớp) hoặc

Hình 2.1 Aspergillus flavus

Hình 2.2 Aspergillus parasiticus

qua một lớp thể bình trung gian (thể bình 2 lớp); đôi khi cả hai kiểu đồng thời tồn tại (Đặng Vũ Hồng Miên (1980)

Các bào tử có kích thước khá lớn (đường kính từ 5-7μm) hình cầu, màu vàng

nâu đến hơi lục, hơi sần sùi Đôi khi A flavus chỉ được coi là thuộc loài những loài nấm có cuống bào tử đính xù xì và hai lớp thể bình, còn ở loài A parasiticus thì

cuống bào tử đính nhẵn và thể bình một lớp

2.1.3 Sinh thái

Aspergillus flavus được xem là loài được phân bố khắp mọi nơi: dưới đất,

trên các chất hữu cơ, và các loại hạt nhất là các hạt có dầu Từ lâu, người ta đã phát hiện sự có mặt của nó ở dưới đất, dù là trong rừng, ở vùng than bùn, vùng đất hoang

sa mạc, hoặc trong đất cày cấy, đất mùn, hệ rễ cà chua, hoặc hệ rễ lúa mì Người ta còn coi nó là có thể nhanh chóng xâm nhập lại đất đã khử trùng bằng hơi nước Đất đai vùng nhiệt đới chứa nhiều loài này hơn nhiều so với đất đai vùng ôn đới Nó thường gặp trên lúa mì, bột, trên các chế phẩm bột sống, trong bánh mì

Bắp gạo cũng như các sản phẩm từ Bắp gạo thường chứa loài này Nó có rất nhiều trên sợi bông và nhất là trên hạt bông, nó xâm nhập vào hạt qua các điểm hợp hoặc nhờ những chỗ hủy hoại do côn trùng gây ra Ngoài ra người ta còn thấy nó trên: hạt và khô dầu tương, củi dừa, sắn, nhân hạt ca cao, quả cà phê, quả hồ đào Brazin, thuốc lá, hạt lúa miến, hạt hướng dương, hạt thông, kê, ớt hạt tiêu đỏ, củ cải đường, quả lê, giăm bông, dồi thịt và nhiều thức ăn khác Sự có mặt của các loài này trong các thức ăn phức hợp của gia súc, ngay khi nuôi không có bắp, đậu phộng, trên cỏ khô gia súc cũng vậy Nếu có điều kiện thuận lợi, nó sinh sôi này nở rất nhiều; trên lúa mì tồn trữ trong kho kín có độ ẩm 15,2 % đến 17% bào tử của nó chiếm từ 50-100% tổng số bào tử có mặt, nhiều đến nỗi trên mặt kho đóng vón lại thành một lớp vỏ cứng sâu tới 0.6m Nó cũng thường có mặt trên bẹ bắp khi độ ẩm vượt quá 15,5% (Đặng Vũ Hồng Miên (1980)

Nấm mốc độc Aspergillus flavus gặp nhiều ở các loại lương thực, thực phẩm

khác nhau, nhưng các loại hạt có dầu (đặc biệt là đậu phộng) thích hợp nhất cho sự phát triển của nó, và cũng ở đậu phộng độc tố Aflatoxin hình thành mạnh nhất Người ta nghiên cứu hơn 1.000 mẫu đậu phộng thí nghiệm thì thấy có 3,3% số củ là

rất độc; 1kg chứa trên 0,25mg Aflatoxin B1 (độc tố chủ yếu của Aspergillus flavus)

và 21,7% số củ độc vừa, 75% số củ không độc Còn trên đậu phộng khô: 42% số

mẫu là rất độc, 49,3% độc vừa và chỉ có 8,7% là không độc Như vậy chất độc tích

lũy lại trong đậu phộng khô là do sự chế biến, hoặc do Aspergillus flavus phát triển mạnh lên (Nguyễn Thị Hiền và ctv, 2003)

Bào tử của nấm A flavus có khả năng phát tán trong không khí, trong nước,

trong đất Đặc biệt khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát sinh phát triển trên lương thực, thực phẩm, hoa quả và thậm chí còn gây hại một số loài cây trồng Vì phạm vi

ký chủ rộng, khả năng phát tán rất lớn nên phòng trừ nấm hại này thường rất khó

khăn Nấm A flavus có thể ký sinh, gây hại các loại lương thực như: lúa, bắp, sắn,

trên một số loại hạt làm thực phẩm như: đậu phộng, đậu, vừng, trên thực phẩm như: các sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, đậu phộng, vừng, đậu đỗ và thậm chí cả trên hoa quả tươi bị dập như: thanh long, nhãn, xoài, vải Trong quá trình xâm nhiễm, sinh trưởng phát triển, chúng tiết ra độc tố Aflatoxin (Đặng Vũ Hồng Miên, 1980)

Đậu Phộng là một loại hạt có tỉ lệ nước: 7,4 %, protein: 28 %, lipid: 44,5 %, glucid: 15 % Các nhà khoa học cũng đã phân lập được ở trong đậu phộng có một

chủng nấm độc Aspergillus flavus và thấy rằng các trường hợp ngộ độc trước đây

đều liên quan đến nấm độc này Nấm mốc độc này cũng có gặp ở trong một số ngũ cốc khác nhưng với đậu phộng có thể là môi trường thuận lợi nhất cho nó phát triển Nấm mốc khi xâm nhập vào trong đậu phộng chúng phát triển làm cho đậu phộng bị mốc xanh hoặc mốc vàng Đặc biệt nấm mốc này sinh ra độc tố Aflatoxin (Dương Thanh Liêm 2003)

2.2 Phương pháp phát hiện Aspergillus nhóm Flavi

2.2.1 Dựa vào đặc điểm hình thái

Việc phát hiện nấm mốc Aspergillus nhóm Flavi thường dựa vào đặc điểm

hình thái Nếu phân loại đến giống thì rất dễ nhận biết dựa vào cuống đính bào tử, nhưng để phân biệt đến loài thì rất phức tạp, thường dựa vào các đặc điểm sau:

- Đặc điểm đại thể: bao gồm màu sắc bào tử và sợi nấm, đường kính tản nấm, màu sắc khuẩn lạc thay đổi, sự tạo sắc tố của các giọt tiết

- Đặc điểm vi thể: phần lớn dựa vào sự sắp xếp, hình dạng và kích thước của bọng, bào tử và hình thái cuống, sự hiện diện tế bào Hülle, và hình thái của nang bào

tử Hơn nữa, tất cả các đặc điểm hình thái phải được xác định trong điều kiện phòng thí nghiệm chuẩn được thực hiện bởi các chuyên gia phân tích nấm để có thể nhận diện chính xác

Thông thường, dựa vào một số môi trường nuôi cấy chọn lọc cho nấm như Czapek Dox agar, Potato Dextrose Agar, Malt Extract Agar để nhận diện nấm mốc

hoặc sử dụng một số môi trường khác như: để nhận diện nhóm A flavus dựa trên

đặc tính chuyển hóa màu môi trường ở mặt sau đĩa thạch sang vàng cam đối với môi

trường Aspergillus flavus và Aspergilus parasiticus agar (AFPA) và Coconut cream

agar (CCA) dùng để phát hiện những chủng sinh Aflatoxin, sự tạo Aflatoxin được phát hiện bằng cách quan sát huỳnh quang màu xanh lam dưới đèn UV (Rahimi và ctv, 2007)

2.2.2 Dựa trên phương pháp sinh học phân tử

Phương pháp sinh học phân tử được áp dụng rộng rãi để nhận diện các loài

A flavus Phần lớn thường sử dụng trình tự DNA mục tiêu là một trong những phức

rDNA, thường là vùng ITS1 and ITS2 bên trong vùng phiên mã và vùng thay đổi ở

đầu 5’ vùng D1-D2 của 28S rRNA Tuy nhiên, các loài thuộc nhóm A flavus rất khó phân biệt dựa vào trình tự gen Các loài A flavus, A parasiticus, A oryzae and A

sojae có trình tự tương đồng cao và kích thước cũng tương tự nhau, trình tự DNA

của chúng tương đồng từ 91 đếm 100% Kỹ thuật phân tích Random Amplified

Polymorphic DNA (RAPD) có thể phân biệt được 2 loài A parasiticus and A sojae

Do đó, để nghiên cứu A flavus, hoặc để so sánh A flavus với các loài Aspergillus

khác và thậm chí nghiên cứu sự khác biệt về đặc tính sinh Aflatoxin, nhiều vùng phức hợp rDNA và các gen liên quan đến quá trình sản sinh Aflatoxin đã được thử nghiệm dùng làm markers với những mức độ thành công khác nhau (González-Salgado và ctv, 2007)

Một số nghiên cứu dựa trên kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) dùng

để phân tích sự khác biệt trên trình tự được khuếch đại Nhưng sự khuếch đại trình

tự mục tiêu của PCR phải được thực hiện thêm bằng kỹ thuật Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP), Single-Strand Conformation Polymorphisms

(SSCP) thì mới dễ dàng phân biệt A flavus với các loài khác dựa trên đoạn 600bp

tương ứng với vùng khuếch đại ITS1/5.8S/ITS2 với cặp mồi ITS1-ITS4 Một số tác giả cho rằng khi sử dụng trình tự khuếch đại lớn kết hợp với phân tích PCR-SSCP

có thể loại bỏ được khó khăn lớn khi có sự thay đổi về mặt chủng loại Tuy nhiên, những phân tích này không phân biệt được những chủng có sinh Aflatoxin và không sinh Aflatoxin.(González-Salgado và ctv, 2007)

Chang và cộng sự (1995) đã tìm thấy gen aflR để có thể nhận biết chủng A

flavus và A parasiticus, nhưng Somashekar và công sự (2004) có thể phân biệt

được riêng biệt 2 chủng A flavus và A parasiticus dựa trên kỹ thuật RFLP bằng cách dùng enzyme cắt giới hạn PvuII Multiplex PCR, sử dụng nhiều cặp mồi để

nhận diện vùng mục tiêu là bước tiến nhằm phân biệt các loài này và đã thành công

khi sử dụng aflR, ver-1, omt-1 and nor-1 genes Nhưng phương pháp này không

phân biệt được những chủng sinh độc tố hay không sinh độc tố Aflatoxin (Erami và ctv, 2007)

Để phân biệt được những chủng sinh độc tố hay không sinh độc tố Aflatoxin phải sử dụng phương pháp reverse transcription PCR (RT-PCR) để xem sự biểu hiện của gen sản sinh Aflatoxin dựa vào các gen liên quan đến quá trình điều hòa và gen cấu trúc trong quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin Scherm và cộng sự (2005) đã

nghiên cứu trên 13 chủng ở cả 2 loài A flavus và A parasiticus và tìm thấy 3 gen (aflD, aflQ [syn dmtA=omtB] and aflP [syn omtA]) có thể sử dụng để phát hiện khả

năng sinh Aflatoxin và được sử dụng làm marker để nhận diện chúng

Do đó, thật khó để phân biệt được chủng A flavus với các loài tương tự như

A nomius and A parasiticus Để có thể nhận diện và phân biệt chính xác các loài có

khả năng sinh Aflatoxin thường phải kết hợp nhiều phương pháp khác nhau

2.3 Độc chất Aflatoxin

2.3.1 Lịch sử phát hiện aflatoxin

Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở nước Anh bị tổn thất rất nặng nề, lúc đầu hơn 10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là “ bệnh gà tây X” (Turkey X disease) Sau đó, các loại gia cầm khác như vịt, gà lôi cũng bị nhiễm bệnh và chết rất nhiều Qua điều tra người ta xác định được bệnh đó có liên quan đến một loại độc tố do nấm có trong thức ăn sinh ra Đến năm 1961, người ta đã tìm ra bản chất

hoá học của chất này là Aflatoxin do vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus

parasiticus Aflatoxin có 4 dẫn xuất quan trọng là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 Giữa

4 loại trên thì Aflatoxin B1 chiếm nhiều nhất trong nông sản và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh nhất và phổ biến nhất (P Rodrigues và ctv, 2007)

Năm 1961, các công trình nghiên cứu công nhận rằng Aflatoxin được sinh ra

bởi nấm Aspergillus flavus và có thể là nguyên nhân gây ra khối u gan của động vật

Từ đó trở đi có nhiều công trình nghiên cứu về độc tố Aflatoxin Các nhà khoa học

cũng đã xác định được công thức phân tử và công thức cấu tạo của Aflatoxin (Dương Thanh Liêm 2003)

2.3.2 Công thức cấu tạo và một số tính chất vật lý của Aflatoxin

Công thức phân tử của 4 loại Aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2):

Tính chất vật lý của các loại Aflatoxin:

 AFB1: có điểm nóng chảy 268-269oC, có màu xanh lam trên đèn huỳnh quang

 AFB2: có điểm nóng chảy 286-289oC, có màu xanh lam trên đèn huỳnh quang

 AFG1: có điểm nóng chảy 244-246oC, có màu xanh lục trên đèn huỳnh quang

 AFG2: có điểm nóng chảy 229-231oC, có màu xanh lục trên đèn huỳnh quang

Hình 2.3 Công thức cấu tạo hoá học của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2

2.3.3 Tác hại của Aflatoxin

Ngoài việc gây ngộ độc cấp tính (gây chết người với liều 10 mg), độc tố Aflatoxin còn là hoạt chất gây xơ gan, ung thư gan Aflatoxin là một trong nhưng chất gây ung thư gan mạnh nhất, nếu hâp thu một lượng là 2,5 mg Aflatoxin trong thơi gian 3 tháng có thể dẫn đến ung thư gan sau 1 năm (Lương Đức Phẩm 2002) Aflatoxin gây ra các tác hại chính sau đây:

- Phá vỡ tế bào gan, thận và các bộ phân khác

- Ức chế miễn dịch

- Ăn mòn thành dạ dày và thành ruột

- Suy dinh dưỡng, chậm lớn và chết

- Gây ung thư gan ở người và gia súc

Như vậy, Aflatoxin có khả năng gây ngộ độc cấp tính và mãn tính ở người và động vật Nghiêm trọng nhất và nguy hiểm nhất là khả năng gây xơ gan và ung thư gan

2.4 Giới thiệu về kỹ thuật PCR

2.4.1 Khái quát về kỹ thuật PCR

2.4.1.1 Khái niệm

Kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp – Polymerase Chain Reaction) là

kỹ thuật khuyếch đại đoạn DNA (hàm lượng rất nhỏ) với tốc độ nhanh, chính xác

cao được thực hiện trên máy chu trình nhiệt (máy PCR) (Phạm Hùng Vân 2009)

2.4.1.2 Lịch sử

Phương pháp PCR là một phát minh của nhà hóa - sinh học Karl Mullis và các cộng sự, được nhóm nghiên cứu thuộc phòng Di Truyền Người ở Cetus ứng dụng ban đầu để khuyếch đại DNA β - globulin và chuẩn đoán trước sinh bệnh thiếu máu tế bào hình liềm Phản ứng chuỗi PCR nhanh chóng trở thành một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi nhất trong sinh học phân tử với những lý do: là một phương tiện nhanh, rẻ tiền và đơn giản để tạo ra một lượng tương đối lớn các bản sao phân

tử DNA từ một lượng vật liệu DNA gốc, ngay cả khi nguồn DNA có số lượng tương đối thấp

Phương pháp PCR ban đầu sử dụng phân đoạn Klenow của E.coli DNA

polymerase I để kéo dài các mồi bắt cặp Enzyme này bị bất hoạt bởi nhiệt độ cao cần để tách hai sợi DNA ra khi bắt đầu mỗi chu kỳ PCR Cho nên enzyme mới phải

được bổ sung vào mỗi chu kỳ

Sau này, việc đưa vào sử dụng một enzyme DNA polymerase bền nhiệt (Taq DNA polymerase, Taq polymerase) tinh sạch từ chủng Thermus aquaticus đã biến

PCR thành một phản ứng đơn giản và mạnh, có thể được tự động hóa bằng thiết bị chu trình nhiệt (máy PCR)

Phương pháp PCR đầu tiên tổng hợp DNA bằng enzyme Klenow ở 37o

C cho sản phẩm PCR không đặc hiệu.Mặc dù phân đoạn đích đặc hiệu có thể được nhân lên hàng triệu lần, nhưng trong hầu hết sản phẩm tổng hợp PCR lại không phải phân đoạn này Bằng nhân dòng sản phẩm khuyếch đại β-globin và sàng lọc các dòng đơn với mẫu dò β-globin để phát hiện trình tự đích và với một mồi để phát hiện trình tự khuyếch đại, tính đặc hiệu PCR được đánh giá khoảng 1% Các mồi khác cũng đều

đặc hiệu hơn hay ít hơn Nhưng PCR bằng enzyme Klenow không phải là phản ứng

đặc hiệu cao Nó cần được phân tích tiếp với mẫu dò đặc hiệu, hoặc một số trường hợp với các mồi lồng nội phân tử để phát hiện và xác định tính chất trình tự đích của khuyếch đại

2.3.3 Các thành phần phản ứng

Để tiến hành phản ứng PCR, cần có các thành phần sau:

- DNA khuôn (DNA template): có thể là DNA kép, đơn hoặc tách chiết từ các đối

tượng nghiên cứu DNA khuôn phải có độ nguyên vẹn cao, tránh lẫn tạp (hệ số

OD 260/280 đạt từ 1,8 đến 2) và có số lượng ban đầu từ 1 đến hàng chục nanogram

- Đoạn mồi: lựa chọn cặp mồi rất quan trọng cho phản ứng PCR Đoạn mồi là các oligonucleotit có độ dài từ 6 đến 30 nucleotit, có trình tự bắt cặp bổ sung với trình tự hai đầu mạch khuôn DNA Trình tự mồi xuôi và mồi ngược bảo đảm không tự bổ sung cho nhau, không có cấu trúc kẹp tóc, giàu G (guanine) và C (canine) (chiếm trên 60%) Mồi phải đảm bảo đủ dài và bắt cặp chính xác Nhiệt độ mồi (Tm) không khác nhau quá lớn (sai khác <5 o

C) Nồng độ mồi thường khoảng 100-500 nM Thời gian gắn mồi 30-60 giây Nhiệt độ gắn mồi được tính theo công thức:

+ Đối với mồi nhỏ hơn hoặc bằng 20 nucleotit:

Tm = [2(A+T) + 4(G+C)]oC + Đối với mồi có chiều dài lớn hơn 20 nucleotit:

aquaticus, không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ biến tính DNA (92oC – 94oC) Taq

DNA polymerase có hoạt tính ở dải nhiệt độ cao, làm cho phản ứng PCR xảy ra nhanh, chính xác và đặc hiệu

- Các deoxyribonucleotit triphotphat (dNTP): gồm bốn loại dATP, dTTP, dGTP,

dCTP làm nguyên liệu tham gia phản ứng Nồng độ tối ưu của dNTP thường

dùng từ 100-200 µM Tuy nhiên, ở nồng độ dTNP thấp (10-100 µM) thì Taq

DNA polymerase hoạt động chính xác hơn

- Dung dịch đệm (buffer): thành phần làm dung dịch đệm cho phản ứng PCR

thường phụ thuộc vào loại enzyme DNA polymerase sử dụng trong PCR Ví

dụ: thành phần dung dịch đệm 10X cho phản ứng PCR khi sử dụng Taq DNA

Nồng độ MgCl2 có thể giao động từ 0,5 đến 5 mM Chính ion Mg2+ có tác dụng liên kết dNTP với DNA polymerase tăng khả năng bám nối của mồi Ngoài ra,

Mg2+ còn là một co-factor giúp enzyme DNA polymerase hoạt động hiệu quả

2.3.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại, mỗi chu kỳ gồm 3 bước chính:

- Hạ nhiệt độ xuống 30oC-65oC trong khoảng 30 giây đến 2 phút Các đoạn mồi

sẽ bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên tắc bổ sung Đây là giai đoạn quan trọng Nhiệt độ gắn mồi phải bảo đảm đúng để khả năng gắn tốt nhất, tránh hiện tượng gắn không đặc hiệu

- Thường nhiệt độ bắt cặp tối thích hợp nhất thấp hơn 5oC so với nhiệt đô nóng chảy của sợi kép mồi – khuôn DNA

- Độ dài và trình tự mồi là những yếu tố quan trọng làm thông số thiết kế để khuyếch đại thành công Nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) của sợi kép DNA tăng theo độ dài của mồi và hàm lượng GC cao Cách tính nhiệt độ nóng chảy Tm đã được đề cập ở trên

- Do vậy, nhiệt độ bắt cặp được chọn cho PCR phụ thuộc trực tiếp vào độ dài và thành phần mồi Người ta nên sử dụng nhiệt độ bắt cặp Ta (annealing temperature) thấp hơn 5oC so với nhiệt độ nóng chảy Tm của cặp mồi được sử dụng

- Có thể xử lý nhiệt độ bắt cặp chính xác hơn nếu Ta được tăng 1oC với mỗi chu

kỳ, thì tính đặc hiệu của khuyếch đại và hiệu suất thu sản phẩm có độ dài nhỏ hơn 1kb được tăng lên

Bước 3: Kéo dài (tổng hợp – extending)

- Thường bước tổng hợp (kéo dài) được thực hiện ở 72oC Tốc độ tổng hợp DNA

bằng enzyme Taq DNA polymerase đạt cao nhất ở nhiệt độ này Thời gian tổng

hợp phân đoạn PCR dài 2 kilobase (kb) được đề xuất là một phút Khi tổng hợp các phân đoạn dài hơn, thời gian tổng hợp sẽ được tăng lên một phút cho mỗi

kb

- Nhiệt độ và thời gian tổng hợp phụ thuộc vào loại enzyme, kích thước đoạn DNA cần tổng hợp Trong bước này, các dNTP được lắp ráp để tạo thành mạch đơn DNA mới bổ sung với mạch khuôn bắt đầu từ mồi

Mỗi chu kỳ của phản ứng PCR gồm 3 bước như trên, lặp lại từ 25 đến 50 lần tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu Tuy nhiên cần lưu ý rằng, nếu kéo dài thời gian quá 30 chu kỳ thì khả năng sai xót sẽ tăng theo Số lượng bản sao sau n chu kỳ sẽ là

a x2n (trong đó a là số đoạn khuôn) Cũng cần lưu ý rằng, sau chu kỳ thứ nhất, nhiệt

độ tăng lên 94-95oC thì ở chu kỳ thứ hai chỉ cần 20 giây thay vì 2-5 phút như trong chu kỳ thứ nhất (Quỳnh Đình Thi và Nông Văn Hải, 2008)

2.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

- Khuôn DNA có vai trò rất quan trọng, ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả PCR Phản ứng PCR tối ưu với các đoạn khuôn hoàn toàn tinh sạch, khi các đoạn khuôn không sạch còn lẫn protein, hiệu quả PCR giảm theo tỷ lệ thuận với độ tinh sạch của DNA khuôn

- Enzyme DNA polymerase càng mạnh, phản ứng PCR càng triệt để Tùy các đặc tính của enzyme DNA polymerase, tùy thuộc gốc tách chiết enzyme, hiệu quả các phản

ứng PCR khác nhau Enzyme Th polymerase có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược, còn enzyme Taq polymerase xúc tác phản ứng khuyếch đại DNA

- Mồi là yếu tố quan trọng nhất quyết định hiệu quả của phản ứng PCR Chọn mồi cần tính toán đảm bảo Tm của mồi xuôi và ngược không chênh lệch nhau quá lớn, các mồi phải có trình tự nucleotide để chỉ có thể bắt cặp bổ sung ở hai đầu của các mạch khuôn, nếu mồi bặt cặp giữa khuôn PCR không thành công Trình tự DNA cần khuếch đại, là trình tự nằm giữa hai mồi không lớn quá 1kb

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian làm đề tài: từ ngày 15/07/2013 đến ngày 15/12/2013

- Địa điểm: Viện nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường

3.3 Phương pháp

3.3.1 Phương pháp định danh nấm mốc

Các sợi nấm Aspergillus nhóm Flavi thường tồn tại sâu bên trong hạt nông

sản, khi gặp điều kiện thích hợp sẽ phát triển ra phía ngoài bề mặt hạt Mẫu hạt được rửa sạch bằng nước sạch, xử lý tạp nhiễm bên ngoài mẫu hạt nông sản bằng cồn 96o

trong thời gian ngắn, rửa lại bằng nước cất đã hấp khử trùng Mẫu hạt được cấy lên môi trường dinh dưỡng để tạo điều kiện cho nấm phát triển Nhận diện

Aspergillus nhóm Flavi qua hình thái tản nấm đặc trưng

Tiến Hành

Bước 1: Nuôi cấy mẫu

- Mẫu hạt nông sản được rửa sạch bằng nước máy và để ráo nước

- Chuyển mẫu hạt vào becher và phun cồn 96o thật kỹ lên bề mặt trong 30 giây

- Rửa lại 3 lần bằng nước hấp khử trùng

- Làm khô mẫu trên giấy thấm khử trùng 15 – 30 phút

- Cấy mẫu hạt lên môi trường PDA

- Mỗi mẫu cấy lên 10 đĩa petri, mỗi đĩa cấy 5 hạt

- 3 - 5 ngày sau khi cấy, kiểm tra kết quả sơ bộ

Bước 2: Nhận định kết quả sơ bộ

- Đếm và ghi lại số tản nấm nghi ngờ là A.flavus (có màu xanh lục hoặc vàng lục)

ở từng đậm độ Sau đó dùng que cấy móc lấy một ít bào tử cấy một điểm trên đĩa thạch PDA trong 5 ngày Không lật ngược các đĩa

- Đếm và ghi lại số tản nấm nghi ngờ là A.parasiticus (Có mầu xanh lá cây, hơi

vàng) ở từng đậm độ Sau đó dùng que cấy móc lấy một ít bào tử cấy một điểm trên đĩa thạch PDA trong 5 ngày Không lật ngược các đĩa

Bước 2: Định danh

- Từ những tản nấm trên thạch PDA tiến hành nhận xét đại thể, vi thể sau 5 ngày nuôi cấy