LUẬN VĂN 2021 Đánh giá đa dạng sinh học và khả năng sinh độc tố aflatoxin của quần thể aspergillus flavus từ đất trồng lạc tại …

Đánh giá đa dạng sinh học và khả năng sinh độc tố aflatoxin của quần thể aspergillus flavus từ đất trồng lạc tại … Đánh giá đa dạng sinh học và khả năng sinh độc tố aflatoxin của quần thể aspergillus flavus từ đất trồng lạc tại … Đánh giá đa dạng sinh học và khả năng sinh độc tố aflatoxin của quần thể aspergillus flavus từ đất trồng lạc tại … Đánh giá đa dạng sinh học và khả năng sinh độc tố aflatoxin của quần thể aspergillus flavus từ đất trồng lạc tại … Đánh giá đa dạng sinh học và khả năng sinh độc tố aflatoxin của quần thể aspergillus flavus từ đất trồng lạc tại …

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗlực của bản thân tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ nhà trường, thầy cô, gia đình

và bạn bè Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ chân tình đó

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và lời cảm ơn sâu sắc nhất đến người … kính mến, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi từ nhữngbước đầu làm quen với nghiên cứu khoa học cũng như trong suốt quá trình thực hiện

và hoàn thiện luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong bộ môn … đã luôn động viên, giúp

đỡ và tạo điều kiện cho tôi được thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm bệnh cây, khoa

… đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu ở phòng thí nghiệm khoa

Xin gửi tới các bạn cùng lớp lời cám ơn chân thành nhất trước tình cảm, sự giúp

đỡ nhiệt tình và sự động viên to lớn giúp tôi vượt qua khó khăn để hoàn thành khóahọc cũng như luận văn này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn bè đãkhích lệ, động viên tinh thần, góp ý và lo lắng cho tôi trong suốt thời gian học tập chođến khi hoàn thành luận văn

Trong suốt quá trình thực tập và hoàn thành luận văn không thể tránh khỏi nhữngthiếu sót, tôi sẽ ghi nhận những ý kiến đóng góp và sẽ cố gắng hoàn thiện mình đểngày một tốt hơn

Học viên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Tất

cả các số liệu trong vùng nghiên cứu của luận văn là trung thực và chưatừng được ai công bố trong bất kỳ luận văn nào khác

Tôi xin cảm ơn mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này vàtôi xin cam đoan các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ

rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG BIỂU vii

DANH MỤC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 Cơ sở lý luận của các vấn đề nghiên cứu 3

1.2 Cơ sở thực tiễn của các vấn đề nghiên cứu 3

1.3 Tổng quan về Aspergillus flavus 4

1.3.1 Đặc điểm hình thái của chủng A flavus 4

1.3.2 Đặc điểm sinh thái học và phân bố địa lý 7

1.4 Tổng quan về độc tố aflatoxin 9

1.4.1 Đặc điểm cấu tạo 9

1.4.2 Phân loại, đặc tính của aflatoxin 10

1.4.3 Cơ chất và các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh độc tố aflatoxin 11

1.4.4 Hạch nấm và khả năng sinh độc tố aflatoxin 14

1.4.5 Tác hại của aflatoxin 14

1.5 Tình hình nghiên cứu độc tố aflatoxin do A flavus sản sinh ra ở Việt Nam và trên thế giới 15

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 15

1.5.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 16

1.6 Tình hình sản xuất lạc 17

1.6.1 Trên thế giới 17

1.6.2 Việt Nam 18

1.7 Các phương pháp được ứng dụng trong sinh học phân tử: 20

1.7.1 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction): 20

1.7.2 Phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism): 21

1.7.3 Phương pháp đọc trình tự: 22

1.7.4 Một số phương pháp được sử dụng trong xây dựng cây phả hệ: 23

1.8 Cơ sở của việc sử dụng vùng ITS-rDNA trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm A flavus: 24

1.8.1 Giới thiệu về vùng rDNA: 24

1.8.2 Sử dụng vùng rDNA để nghiên cứu sự đa dạng di truyền: 25

1.9 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): 26

1.9.1 Các thông số của phương pháp sắc ký lỏng 26

1.9.2 Giới thiệu các bộ phận của thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao: 29

1.10 Các công trình nghiên cứu đã có của các tác giả trong và ngoài nước liên quan mật thiết đến đề tài luận văn 31

1.10.1 Những nghiên cứu trong nước 31

1.10.2 Những nghiên cứu trên thế giới 33

Chương 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 Mục tiêu cụ thể 35

2.2 Nội dung nghiên cứu 35

2.3 Phương pháp nghiên cứu 35

2.3.1 Xác định mật độ A flavus trong đất trồng lạc ở và nhận diện 35

2.3.2 Đánh giá khả năng sinh hạch nấm và độc tố aflatoxin của các chủng nấm A flavus được phân lập từ mẫu đất thu thập được 40

2.3.3 Đánh giá đa dạng sinh học của quần thể nấm A flavus ở các vùng đất trồng lạc thâm canh ở 45

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 46

3.1 Kết quả xác định mật độ A flavus trong đất trồng lạc ở và nhận diện 46

3.1.1 Mật độ A flavus trong đất trồng lạc ở 46

3.1.2 Làm thuần các chủng A flavus phân lập được 46

3.1.3 Đặc điểm hình thái học của nấm A flavus thu được từ đất trồng lạc ở 47

3.3 Đánh giá đa dạng sinh học của quần thể nấm A flavus ở các vùng đất trồng lạc thâm canh ở và khả năng sinh độc tố aflatoxin của các chủng nấm A flavus phân

lập được tại 56

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63

Kết luận 63

Đề nghị 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

PHỤ LỤC 69

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Ý nghĩa

AFB1 : Aflatoxin B1

A flavus : Aspergillus flavus

CFU : Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc)CYA : Czapek Yeast Extract Agar

DG-18 : Dichloran Glycerol Agar Base

HPLC : High Performance Liquid Chromatograpphy

( Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao)MEA : Malt Extract Agar

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Đặc điểm đại thể và vi thể của nấm A flavus [51] 6

Bảng 1.2 Kết quả kiểm tra vi sinh của 968 mẫu ngũ cốc [42] 8

Bảng 1.3 Ảnh hưởng của các đường hexose đến hàm lượng aflatoxin [15], [19] 13

Bảng 1.4 Diện tích, năng suất, sản lượng lạc trên thế giới và một số nước 17

Bảng 1.5 Diện tích, năng suất, sản lượng lạc ở Việt Nam 18

Bảng 1.6 Tình hình sản xuất lạc ở 19

Bảng 1.7 Loại cột, pha tĩnh, pha động và hợp chất phân tích thông dụng 30

Bảng 2.1 Nồng độ tương ứng với dung dịch aflatoxin chuẩn 44

Bảng 3.1 Mật độ A flavus trong đất trồng lạc tại 46

Bảng 3.2 Khả năng sinh hạch nấm của các chủng A flavus phân lập được từ đất trồng lạc ở 51

Bảng 3.3 Số lượng và kích thước hạch nấm của các chủng A flavus phân lập từ đất trồng lạc ở 51

Bảng 3.4 Dạng hạch nấm của các chủng A flavus phân lập được từ đất trồng lạc ở 52

Bảng 3.5 Khả năng sinh độc tố của các chủng A flavus phân lập được từ đất trồng lạc ở 52

Bảng 3.6 Hàm lượng độc tố của các chủng A flavus phân lập được từ đất trồng lạc ở 53

Bảng 3.7 Kết quả giải trình tự và tìm kiếm các chuỗi gần gũi trên Ngân Hàng Gen (GenBank) 57

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái nấm A flavus [53] 4

Hình 1.2 Nấm A flavus với khuẩn ty, túi bào tử và thể bình (Sharma, 1998) [6] 5

Hình 1.3 Cấu tạo hóa học của aflatoxin B1, aflatoxin B2, aflatoxin G1, aflatoxin G2 [51] 10

Hình 1.4 Sơ đồ vùng rDNA-ITS của nấm 24

Hình 2.1 Lấy mẫu đất 36

Hình 2.2 Đĩa môi trường phân lập A flavus trên môi trường DG18 trong 5 ngày ở 30 0 C 37 Hình 2.3 Quan sát hình thái nấm A.flavus dưới kính hiển vi quang học 39

Hình 2.4 Hạch nấm được đo đường kính bằng kính hiển vi quang học có thước đo 40

Hình 2.5 Khuẩn lạc nấm A flavus phát triển trong môi trường YES ở 25 o C trong 5 ngày 42

Hình 2.6 Quy trình thu dịch chiết phân tích aflatoxin B1 42

Hình 2.7 Dịch chiết nấm A flavus thu được từ môi trường YES lỏng 43

Hình 2.8 Hệ thống sắc ký lỏng cao áp hiệu năng cao (HPLC) 43

Hình 3.1 Đĩa môi trường chứa các khuẩn lạc mọc riêng rẽ sau khi pha loãng 47

Hình 3.2 Chủng A flavus đã thuần 47

Hình 3.3 Hình thái bào tử nấm A flavus 48

Hình 3.4 Sợi nấm A flavus phát triển môi trường Cz nuôi cấy ở 6 ngày, nhiệt độ 28 o C 48

Hình 3.5 Cuống bào tử đính nấm A flavus 49

Hình 3.6 Hình thái tản nấm A flavus 49

Hình 3.7 Tản nấm A flavus phát triển môi trường CZ nuôi cấy ở 6 ngày, nhiệt độ 28 o C 50

Hình 3.8 Hạch nấm của A flavus hình thành trên môi trường Cz ở 30 o C trong 14 ngày50 Hình 3.9 Kích thước hạch nấm được soi dưới kính hiển vi điện tử (10X) 51

ở 53

Hình 3.10 Đường chuẩn aflatoxin B1 54

Hình 3.11 Hình ảnh peak sắc ký thu được của mẫu DT.2.3.5 54

Hình 3.12 Hình ảnh peak sắc ký thu được của mẫu ND.1.7.1 55

Hình 3.13 Hình ảnh peak sắc ký thu được của mẫu NL.3.13.2 55

Hình 3.14 Kết quả giải trình tự gen 28S mẫu nấm DP.2.2.1 58

Hình 3.15 Kết quả tra cứu ngân hàng dữ liệu gen NCBI trên BLAST SEARCH của mẫu DP.2.2.1 61

Hình 3.16 Hình ảnh điện di của các chủng nấm A flavus đã phân lập được 61

Hình 3.17 Phân tích phả hệ dựa trên trình tự toàn bộ vùng ITS của các mẫu nấm 62

MỞ ĐẦU

Lý do chọn đề tài:

Aspergillus flavus (A flavus) được xem như là nấm mốc nguy hiểm nhất trong sản xuất nông nghiệp Ở nhiều vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, nấm mốc A flavus và độc tố aflatoxin gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản lượng và phẩm chất của lạc (Arachis hypogaea L.) và nhiều loại cây trồng quan trọng khác như bông, ngô, đậu

tương v.v [31], [49], [52]

Ở Việt Nam, lạc là loại cây trồng đem lại nhiều lợi nhuận từ việc xuất khẩu vàsản xuất dầu ăn Về mặt sản lượng, Việt Nam xếp thứ 5 trong số hơn 25 nước sản xuấtlạc ở châu Á Tuy nhiên, năng suất lạc ở Việt Nam vẫn còn thấp do ảnh hưởng của các

nạn dịch gây ra bởi aflatoxin, một loại độc tố do nấm mốc A flavus gây ra So với các

loại cây trồng khác, lạc rất mẫn cảm với nấm mốc tại các giai đoạn trước thu hoạch vàsau thu hoạch do vị trí của quả lạc nằm ở trong đất, nơi tiếp xúc nhiều với các mầmbệnh Lạc bị nhiễm nấm mốc trong giai đoạn bảo quản dẫn đến sự thối rữa hạt lạc, hạtlạc bị mốc từ đó ảnh hưởng đến sự phát triển của hạt giống trong nhiều vùng sản xuấtlạc ở Châu Á Ngoài ra, theo Barros và cộng sự (2006) [26], việc tiêu thụ lạc bị nhiễm

nấm mốc A flavus và độc tố aflatoxin sẽ gây nguy hại đến sức khỏe của con người và

gia súc Do vậy, việc nghiên cứu các biện pháp bảo quản hữu hiệu nhất để quản lý dịch

hại nấm mốc A.flavus là mục tiêu hàng đầu trong nền nông nghiệp sản xuất lạc ở Việt

Nam hiện nay Nghiên cứu của chúng tôi nhằm mục tiêu điều tra sự đa dạng sinh học

của nấm mốc A.flavus và khả năng sinh độc tố aflatoxin của chúng ở nhiều vùng sản

xuất lạc ở , Việt Nam

Cho đến nay, những thông tin về quần thể nấm mốc A flavus và sự nhiễm độc tố

aflatoxin trên sản xuất lạc vẫn còn rất hạn chế ở Việt Nam Hầu hết những nghiên cứuchỉ tập trung vào việc ứng dụng các kết quả của các nghiên cứu ở nước ngoài Vì vậy,việc đánh giá mức độ nhiễm , khả năng sinh độc tố aflatoxin và nghiên cứu thực địa về

đa dạng sinh học của A flavus mang ý nghĩa cấp thiết trong giai đoạn hiện nay.

Chính vì vậy đề tài này thực hiện nhằm:

Đánh giá mức độ nhiếm nấm A.flavus ở đất trồng lạc ở

Đánh giá sự đa dạng sinh học của nấm mốc A.flavus và khả năng sinh độc tố

aflatoxin của chúng ở nhiều vùng sản xuất lạc ở

Mục đích và yêu cầu của đề tài

- Xác định được mật độ A flavus trong đất trồng lạc ở

- Phân tích sự đa dạng sinh học của quần thể nấm A flavus ở các vùng đất

trồng lạc thâm canh ở

- Phân tích khả năng sinh hạch nấm và độc tố của các chủng A flavus phân lập được.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ý nghĩa khoa học

Đề tài nghiên cứu và đánh giá mức độ nhiễm nấm A.flavus trong đất trồng lạc

ở , phân tích khả năng sinh độc tố aflatoxin của các chủng nấm phân lập được và

đánh giá sự đa dạng sinh học của quần thể A.flavus trên cơ sở sinh học phân tử Từ đó, chúng ta có những hiểu biết sâu sắc hơn về nấm mốc A.flavus

Ý nghĩa thực tiễn

Với tình hình gây hại và mức độ nguy hiểm của A.flavus đối với người trồng lạc

nói riêng và người tiêu dùng nói chung thì thực tiễn đặt ra một yêu cầu phải có những

nghiên cứu sâu hơn về A.flavus.

Những nghiên cứu về A.flavus của đề tài sẽ là cơ sở cho việc áp dụng các biện pháp sinh học trong việc hạn chế mật độ A.flavus trong đất trồng lạc ở , từ đó giảm

thiểu được nguy cơ nhiễm độc tố aflatoxin cho con người và động vật

Có thể nói đây là lần đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu của chúng tôi sử dụng

cộng cụ sinh học phân tử để đi sâu nghiên cứu về vấn đề đa dạng sinh học của A flavus,

khả năng sinh độc tố của chúng trên các vùng đất trồng lạc thâm canh ở

Vật liệu và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu

- Nấm A.flavus gây bệnh héo vàng trên lạc.

- Đất trồng lạc ở …., … ,……

Phạm vi nghiên cứu

- Thời gian thực hiện đề tài: tháng 9/2013- 5/2014

- Địa bàn nghiên cứu: , và , ; Phòng thí nghiệm công nghệ tế bào thựcvật - Viện tài nguyên môi trường và công nghệ sinh học – ; Phòng thí nghiệm bệnhcây – khoa , trường đại học

Chương 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Cơ sở lý luận của các vấn đề nghiên cứu

Vi sinh vật gây hại cho cây trồng nói chung, cho cây lạc nói riêng xâm nhập vàocây và hình thành mối quan hệ ký sinh - ký chủ giữa các loài gây hại và cây trồng.Trong đó vi sinh vật là nhân tố chủ động, còn cây trồng là nhân tố bị động Chúng gâynên những rối loạn về sinh lý ở cây, làm cây bị hủy hoại từng phần hoặc gây ảnhhưởng toàn thân dẫn đến cây bị giảm sút về năng suất hoặc bị chết

Bệnh hại cây trồng luôn là vấn đề nan giải đối với sản xuất nông nghiệp nói chung

và sản xuất lạc nói riêng Mỗi loại cây trồng có rất nhiều loại bệnh khác nhau, tác nhângây bệnh vô cùng đa dạng và phong phú, mỗi giai đoạn trưởng của cây trồng khácnhau đặc điểm của tác nhân gây bệnh cũng khác nhau Bệnh làm giảm năng suất,phẩm chất lạc khi thu hoạch, cất trữ Chủ yếu làm giảm giá trị sử dụng, giá trị hànghóa, thẩm mỹ và chất lượng chế biến Bệnh làm giảm sức sống và chất lượng hạtgiống Ngoài ra, quan trọng hơn nấm bệnh còn có khả năng sinh độc tố gây ảnh hưởngxấu đến sức khỏe cho người và gia súc, ảnh hưởng đến đất đai trồng trọt, cơ cấu giốngcây trồng, chế độ luân canh, tính chất hoạt động của các vi sinh vật đất

Với cây lạc bệnh hại xuất hiện từ khi nảy mầm cho đến thu hoạch, nhưng mức độgây hại khác nhau và mỗi thời kỳ có một loại bệnh phổ biến khác nhau Tỉ lệ bệnh nặnghay nhẹ, bệnh xuất hiện sớm hay muộn phụ thuộc vào điều kiện canh tác, khí hậu thờitiết, đất đai và biện pháp phòng trừ của người dân

Thực tế cho thấy nhóm bệnh hại phần gốc và rễ cây lạc là rất nguy hiểm, gây thiệthại rất nặng có thể gây mất trắng lạc Nhóm bệnh này hại ở phần rễ và gốc cây lạc,làm cho cây bị héo một phần hoặc toàn cây và dẫn đến cây chết Khi đã phát hiện triệuchứng bên ngoài thì cây đã chết, vì phải nhổ bỏ do đó nếu không phòng trừ thì bệnhnày rất nguy hiểm làm giảm năng suất lạc

là tỉnh có tiềm năng phát triển cây lạc nhất nước ta, tuy nhiên bệnh hại nói

chung và bệnh héo vàng lạc do A flavus gây hại nói riêng đang gây thiệt hại rất lớn.

Vì vậy cần có những cơ sở nghiên cứu về nấm bệnh cũng như nắm được tình hìnhbệnh hại trên lạc ở là điều cần thiết

1.2 Cơ sở thực tiễn của các vấn đề nghiên cứu

Trong thực tiễn sản xuất hiện nay, cây lạc đã khẳng định vai trò vị trí trên thịtrường trong nước và thế giới Lạc là mặt hàng tiêu dùng rộng rãi trong thị trường nộiđịa cũng là mặt hàng xuất khẩu mang lại giá trị kinh tế cao đem lại thu nhập quốc dân,

từ đó làm diện tích trồng lạc được mở rộng, năm 2012 diện tích trồng lạc của nước takhoảng 223800 ha, trong đó là tỉnh có diện tích trồng lạc lớn nhất 20100 ha

(Nguồn: FAOSTAT ORG.COM).

Bệnh héo vàng lạc xuất do nấm A flavus gây hại trên cây lạc gây thối mầm,

chết cây con, làm thiệt hại năng suất, phẩm chất của lạc sau thu hoạch và bảo quản,ngoài ra nấm hại còn sản sinh ra độc tố aflatoxin gây ảnh hưởng đến sức khỏe chongười và động vật

Đã có rất nhiều đề tài nghiên cứu điều tra xác định thành phần bệnh héo lạc, song

hiện có rất ít các đề tài đi sâu nghiên cứu nấm mốc A flavus và phân tích độc tố aflatoxin từ các chủng A flavus được phân lập được từ đất trồng lạc ở

Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm làm cơ sở để đề

ra các phương pháp giảm thiểu hạn chế nhiễm nấm A flavus trong đất lạc ở tỉnh nói

riêng và cả nước nói chung

1.3 Tổng quan về Aspergillus flavus

1.3.1 Đặc điểm hình thái của chủng A flavus

Chi nấm Aspergillus có thể lên đến 200 loài, trong đó có khoảng 20 loài gây hại cho con người A flavus thuộc chi Aspergillus, là loài có số lượng lớn thứ hai sau Aspergillus fumigatus A flavus thuộc [1]:

- Loài: Aspergillus flavus

Hình 1.1 Hình thái nấm A flavus [53]

Khóm nấm A flavus có đường kính 3 - 5 cm trên thạch Cz sau 5 ngày Khóm nấm

lúc đầu hơi vàng, sau trở nên xanh lục hoặc vàng lục, đôi khi hóa nâu khi già [2] Trong

môi trường CYA, bào tử của A flavus có màu xanh xám đến xanh lục, sợi nấm có màu

trắng kem đến màu trắng và có giọt tiết xuất hiện trên bề mặt, mặt sau không màu đếnvàng hoặc da cam và có sợi nhăn nheo, lúc trưởng thành sắc tố của tế bào có thể biến mất

A flavus là nấm mốc sinh sản vô tính bằng cách tạo thân quả hoặc bào tử đính Các nang

quả phình to ở bên trên gọi là túi đính, từ túi đính có rất nhiều những mầm nhỏ gọi là thểbình mọc ra khắp mọi hướng, ở phần cuối của các mầm này là các bào tử đính [51]

Đặc điểm vi thể của nấm A flavus thường có bông lớn hình cầu, hình tia, đôi

khi tạo thành những cột không rõ rệt Bọng hình cầu đến gần cầu, thể bình 1 hoặc 2tầng, vách cuống xù xì, hạt đính hình cầu đến gần cầu, trơn hoặc gai [2] Khuẩn typhân nhánh, có vách ngăn ngang hoàn chỉnh (hình 1.3), nhiều khuẩn ty phát triển trên

bề mặt cơ chất để hấp thu chất dinh dưỡng Khuẩn ty đứt thành khúc và mỗi khúc hayđoạn có thể phát triển cho ra một khuẩn ty mới [5]

Hình 1.2 Nấm A flavus với khuẩn ty, túi bào tử và thể bình (Sharma, 1998) [6]

Bảng 1.1 Đặc điểm đại thể và vi thể của nấm A flavus [51].

Đường kính khuẩn lạc

Hệ sợi Bông mịn màu trắng đến vàng lục Trắng đến xanh lục Bông mịn màu trắng đếnxanh lục Bông mịn màu xanh lục bình thườngXanh lục

Mặt trái Màu vàng đến cam, có sợi nhăn lúctrưởng thành Màu vàng đến cam và sợi bìnhthường lúc trưởng thành Màu vàng, sợi nhăn nheo Màu vàng đến cam, có sợinhăn lúc trưởng thành Màu vàng cam,sợi nhăn nheo.

-Kích thước vi thể

Cấu trúc bề mặt Nhẵn đến xù xì Nhẵn đến xù xì Không kiểm tra Nhẵn đến xù xì Nhẵn đến xù xì

* Chú thích: CYA 25: khuẩn lạc phát triển trên môi trường CYA ở 25oC.

MEA: khuẩn lạc phát triển trên môi trường MEA CYA 37: khuẩn lạc phát triển trên môi trường CYA ở 37oC.

CYA 20S: khuẩn lạc phát triển trên môi trường CYA 20S.

Cz: khuẩn lạc phát triển trên môi trường Cz.

1.3.2 Đặc điểm sinh thái học và phân bố địa lý

1.3.2.1 Đặc điểm sinh thái học

A flavus phát triển ở vùng khí hậu nóng và ẩm, hoạt độ nước (a w) từ 0,84

-0,96 Nhiệt độ tối thích cho A flavus phát triển là 37oC, nhưng loài nấm này có thểsống được trong phạm vi nhiệt độ từ 12 - 48oC Nhiệt độ tối thích cao sẽ tạo điều kiện

cho nấm gây bệnh ở người [30] Độ ẩm thích hợp để A flavus phát triển đối với các loại cây trồng khác nhau là khác nhau Đối với các loại ngũ cốc giàu tinh bột, nấm A flavus phát triển ở độ ẩm 13 - 13,2%, đậu nành là 11,5 - 11,8%, các loại cây trồng

khác, sự tăng trưởng sẽ xảy ra ở mức độ ẩm 14% [23]

Nấm bệnh xâm nhiễm và phát triển sớm trên cây lạc còn non, trên quả lạc vàhạt lạc trong đất trước khi bảo quản và chúng cũng xâm nhập vào củ và hạt lạc tronggiai đoạn thu hoạch và bảo quản [32]

Nấm A flavus được xác định là nguyên nhân gây nên bệnh mốc vàng Dicken,

J.W 1977 xác định đây là một loại nấm hoại sinh tồn tại trên nhiều loại đất và tàn dưcây trồng Khả năng gây bệnh của chúng liên quan đến thành phần vi sinh vật có trongđất Nấm bệnh xâm nhiễm và phát triển sớm trên cây lạc còn non, trên quả lạc và hạtlạc trong đất, trong giai đoạn thu hoạch và bảo quản [33]

1.3.2.2 Phân bố địa lý

- Trong tự nhiên: A flavus có mặt ở khắp nơi trên thế giới, trong đất, không khí, nước Trong đất, A flavus được xem như một thực vật hoại tử, là công cụ quan trọng

trong việc tái chế chất dinh dưỡng cho đất, phân hủy xác động và thực vật Số lượng

A flavus trong đất trồng ngô có thể nằm trong khoảng từ 200 đến trên 300.000 đơn vị CFU/g đất Sự hiện diện của loài A flavus trong bụi là nguyên nhân gây bệnh dị ứng

với nấm ở người Khảo sát trong nước uống đã thu được nhiều loại nấm khác nhau,

trong đó có cả A flavus [30].

- Trong nguyên liệu thực phẩm và sản phẩm thực phẩm:

A flavus thường xuất hiện nhiều trong các loại lương thực, ngũ cốc khi bị

ẩm ướt và nhiệt độ bảo quản cao, đặc biệt là các loại lương thực giàu tinh bột vàcác hạt có dầu

Jakic - Dimic và cộng sự đã tiến hành phân tích vi sinh học cho 968 mẫu cácloại ngũ cốc trong 5 năm và thu được kết quả sau:

Bảng 1.2 Kết quả kiểm tra vi sinh của 968 mẫu ngũ cốc [42]

Như vậy, trong các loại ngũ cốc, ngô và lúa mì là hai loại có mức độ nhiễm

nấm A flavus và hàm lượng độc tố aflatoxin là cao nhất.

Trong ngô, A flavus tồn tại cả trên đồng ruộng và trong quá trình lưu trữ Nhiễm trùng A flavus lên ngô trên đồng ruộng có thể dẫn đến sản xuất aflatoxin trong

ngô trước khi thu hoạch Các loại nấm có thể xâm nhập thông qua rau ngô hay kết hợp

với sự phá hoại do côn trùng Trên ruộng ngô, A flavus có màu vàng xanh đến nâu

vàng, hoặc kết hợp cả hai màu trên Nấm mốc có khả năng tăng trưởng, mở rộng một

bên hoặc từ bên trong vết hư hại do côn trùng gây ra A flavus đã phát triển hoặc tiếp

tục phát triển trên ngô khi lưu trữ

Mức độ nhiễm nghiêm trọng khi nhiễm A flavus cũng như khả năng sản sinh

độc tố khi lưu trữ ngô chịu ảnh hưởng của các yếu tố như độ ẩm, nhiệt độ lưu trữ, tính

chất vật lý của hạt và thời gian lưu trữ A flavus phát triển tốt nhất trên ngô tại độ ẩm

18 - 18,5%, độ ẩm dưới 13% sẽ ngăn chặn sự tăng trưởng của A flavus Nấm bắt đầu

tăng trưởng trên ngô có độ ẩm thấp hơn 18%, sau đó, khi nấm phát triển, xảy ra quátrình hô hấp, giải phóng nhiệt và độ ẩm vào môi trường xung quanh trong khối hạt.Kết quả là gây ra hiện tượng tăng nhiệt và làm ẩm cục bộ trong khối ngô, nếu độ ẩm

và nhiệt độ tiếp tục tăng sẽ là môi trường thuận lợi cho A flavus phát triển hơn nữa [22].

Bào tử của nấm A flavus có khả năng phát tán trong không khí , trong nước,

trong đất Đặc biệt khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát sinh phát triển trên lươngthực, thực phẩm, hoa quả và thậm chí còn gây hại một số loài cây trồng Vì phạm vi kýchủ rộng, khả năng phát tán rất lớn nên phòng trừ nấm hại này thường rất khó khăn

Nấm A flavus có thể ký sinh, gây hại các loại lương thực như: lúa, ngô, sắn, trên một

số loại hạt làm thực phẩm như : lạc, đậu, vừng , trên thực phẩm như : các sản phẩmchế biến từ ngũ cốc, lạc, vừng, đậu đỗ, và thậm chí cả trên hoa quả tươi bị dập như :thanh long, nhãn, xoài, vải, Trong quá trình xâm nhiễm, sinh trưởng phát triển chúngtiết ra độc tố Aflatoxin [15]

Lạc là loại ngũ cốc chứa nhiều chất dinh dưỡng, là cơ chất thuận lợi cho sự tăng

trưởng và sinh trưởng của nấm mốc, đặc biệt là A flavus Sự lây nhiễm A flavus phụ

thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm và sự tổn thương hạt

Ngoài ra, người ta còn thấy A flavus xuất hiện trên hạt và khô dầu tương, dừa,

nhân hạt ca cao, quả cà phê, quả hồ đào Brazin, thuốc lá, hạt lúa miến, hạt hướngdương, hạt thông, kê, ớt, hạt tiêu đỏ, củ cải đường, giăm bông, dồi thịt và nhiều thức

ăn khác Trong quá trình xâm nhiễm, chúng sinh trưởng, phát triển và tiết ra độc tốaflatoxin [15]

1.4 Tổng quan về độc tố aflatoxin

Nông sản dễ bị tấn công bởi một nhóm nấm mốc có khả năng sinh độc tố, đượcgọi chung là mycotoxin Trong các loại mycotoxin, aflatoxin là loại độc tố nguy hiểmnhất bởi những độc tính của nó đối với người và vật nuôi Aflatoxin được phát hiện lầnđầu vào năm 1960 trong đợt bệnh dịch tại Mỹ với hơn 100.000 con gà tây bị chết

Nguyên nhân của dịch bệnh do đậu trong thức ăn của gà nhiễm nấm mốc A flavus, và

độc tố của nấm này được đặt tên là aflatoxin [10]

1.4.1 Đặc điểm cấu tạo

Aflatoxin là một nhóm khoảng 20 chất chuyển hóa liên quan đến nhau được tạo

thành chủ yếu bởi nấm thuộc chi Aspergillus mà phổ biến nhất là A flavus và A paraciticus [35] Aflatoxin chỉ một nhóm chất độc được hình thành bởi loài A flavus trong đó “A” là chữ cái đầu trong từ Aspergillus, “fla” là viết tắt của flavus, còn

“toxin” chỉ một chất độc vi sinh vật [29]

Bốn aflatoxin chủ yếu sản xuất trong tự nhiên được biết đến là aflatoxin B 1,aflatoxin B2, aflatoxin G1, aflatoxin G2, “B” và “G” là để chỉ màu huỳnh quang xanhlam và màu xanh lá cây khi chiếu dưới ánh sáng tử ngoại UV trên sắc ký bản mỏng,còn các chỉ số dưới “1”, “2” để chỉ hợp chất đó lớn hay nhỏ [35]

Theo Van Der Zijden, aflatoxin là một difurocoumarolactones (dẫn xuấtdifurocoumarin), gồm một vòng bifuran hợp nhất với nhân coumarin và một vòngpentenone đối với aflatoxin B và aflatoxin G hoặc một vòng nhóm lactone đối vớiaflatoxin M [46]

Hình 1.3 Cấu tạo hóa học của aflatoxin B1, aflatoxin B2, aflatoxin G1, aflatoxin G2 [51] 1.4.2 Phân loại, đặc tính của aflatoxin

Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), aflatoxin B1 là chất gây ung thư loại 1.Mức độ độc tính gây ung thư được sắp xếp theo thứ tự aflatoxin B1 > aflatoxin G1>aflatoxin B2 > aflatoxin G2 Mức độ độc tính do aflatoxin gây ra phụ thuộc vào cơquan bị ảnh hưởng, đặc biệt là gan Các loại động vật khác nhau, có mức độ nhiễm độckhác nhau từ cực kỳ nhạy cảm (cừu, chó, chuột) đến các loài có thể kháng độc (khỉ,gà…) [27]

1.4.2.2 Đặc tính của aflatoxin

- Tính chất vật lý: Tất cả các aflatoxin đều thể hiện dưới dạng tinh thể nhỏ, mịn,

không màu, không vị, dễ hòa tan trong các dung môi ít phân cực như cloroform,

metanol Hòa tan trong nước ở mức 10 - 20 mg/l Chúng phát huỳnh quang dưới ánhsáng tử ngoại của tia cực tím [47]

- Tính chất hóa học: Trong phân tử aflatoxin có vòng lactone nên làm cho

chúng nhạy cảm với việc thủy phân trong môi trường kiềm Đây là đặc tính quantrọng trong việc thủy phân trong môi trường này ở các sản phẩm thực phẩm bằng cách

xử lý kiềm nhẹ nguyên liệu trước khi chế biến Tuy nhiên, việc xử lý kiềm nhẹ sẽ dễdẫn đến acid hóa và hình thành lại aflatoxin ban đầu

Nhiều tác nhân oxy hóa, chẳng hạn như natri hypochlorite, thuốc tím, chlorine,ozone và peborat natri phản ứng với aflatoxin, thay đổi các phân tử aflatoxin, một sốphản ứng làm mất màu huỳnh quang [47]

1.4.3 Cơ chất và các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh độc tố aflatoxin

1.4.3.1 Các chủng sinh độc tố aflatoxin

Các chủng A flavus sản sinh aflatoxin được gọi là A flavus aflatoxingenic, không phải bất kỳ chủng A flavus nào cũng sinh độc tố aflatoxin [10] Thông thường,

trong môi trường, các chủng sản sinh độc tố aflatoxin chiếm khoảng 50 - 80% Sựphân bố tương đối của các chủng sinh aflatoxin và các chủng không sinh aflatoxin chịuảnh hưởng bởi các yếu tố như: cây trồng, thành phần đất, lịch sử canh tác, quản lý câytrồng, điều kiện môi trường như lượng mưa, nhiệt độ… [40]

Ở Pháp, 25% số chủng A flavus phân lập từ lương thực, thực phẩm và thức ăn

gia súc, ở một số nước Châu Phi và một số vùng Tây Nam Á, số chủng này chiếm

50% Một số thông báo ở Mỹ năm 1973 cho thấy, A flavus sản sinh aflatoxin trên lạc

chiếm 96%, ở hạt bông 78%, ở lúa mạch 49% và ở gạo là 35% [10]

1.4.3.2 Ảnh hưởng của cơ chất đến khả năng sinh độc tố aflatoxin

Hàm lượng aflatoxin thường tỷ lệ với khối lượng hệ sợi nấm tạo thành khi nuôicấy, khi số lượng hệ sợi nấm đạt đến trị số cao nhất thì hàm lượng lớn nhất, nhưng nógiảm sút rất nhanh chóng bắt đầu từ lúc hệ sợi nấm tự phân giải Sự phân giải nàytương ứng với sự phân hủy các aflatoxin Nhìn chung, sự sản sinh aflatoxin trong điềukiện nuôi cấy thông thường bắt đầu từ lúc hình thành các cơ quan mang bào tử đính

của A flavus, tăng dần cho đến giai đoạn sinh bào tử mạnh mẽ, tức là khoảng ngày thứ

6 rồi giảm sút [15]

Tính độc của một số chủng được giảm nếu sau này các chất độc của chúngđược những vi sinh vật khác chuyển hóa thành những dẫn xuất không độc Ở Texas,

người ta rất ngạc nhiên khi thấy lạc có vỏ nhiễm A flavus rất nặng nhưng lại có độ độc

tố thấp Nghiên cứu các củ lạc đó, người ta phát hiện có những loài vi khuẩn và nấm

có khả năng chuyển hóa aflatoxin sản sinh ra thành những chất ít độc hơn Người ta đã

dựa trên hiện tượng này để tìm những biện pháp sinh học nhằm khử độc các sản phẩm

bị hư hỏng [15]

1.4.3.3 Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý đến khả năng sinh độc tố aflatoxin

- Nhiệt độ

A flavus có thể bị nhiễm trước hoặc sau thu hoạch và có thể là nguyên nhân

trong việc gia tăng sự nhiễm độc tố aflatoxin nếu quá trình sấy và điều kiện bảo quản

nghèo nàn Những yếu tố trên sẽ ảnh hưởng đến quá trình phát triển của A flavus và sản sinh aflatoxin A flavus phát triển trong khoảng nhiệt độ 19 - 35oC (Northolt vàEgmond, 1981) và nhiệt độ tối thích cho quá trình hình thành độc tố ở 28oC (Scott vàcộng sự, 1970; Sanchis và Magan, 2004) [34]

Yếu tố quan trọng nhất kiểm soát tỷ lệ aflatoxin B1 và aflatoxin G1 sản xuất với

A flavus là nhiệt độ Nhiệt độ tối ưu cho sản xuất aflatoxin B1 là 24oC, trong khi nhiệt

độ tối ưu cho sản xuất aflatoxin G1 là 30oC [34]

- Độ ẩm và hoạt độ nước

A flavus có thể phát triển và sản sinh độc tố trong khoảng hoạt độ nước (aw) từ0,73 - 0,85 (Sanchis và Magan, 2004) Hàm lượng độ ẩm tương ứng từ 8 - 12% và 17 -19% (Battilani và cộng sự, 2007) Quá trình sấy hoặc làm khô không hiệu quả lànguyên nhân dẫn đến hiện tượng độ ẩm tăng cao cục bộ (Magan và Aldred, 2007).Trong quá trình bảo quản, cần xác định ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, độ ẩm, hoạt

độ nước, thành phần không khí, đặc biệt là sự tương tác giữa các yếu tố này để xácđịnh mức độ nhiễm nấm và sản sinh độc tố [34]

Theo tài liệu của Đặng Vũ Hồng Miên, hàm lượng nước của cơ chất có vai trò

trong việc sản sinh aflatoxin, gắn liền với sự phát triển tương đối của A flavus,

aflatoxin hình thành trên lạc sau 2 ngày ở 32oC với hàm ẩm khoảng 15 - 30% Nhưvậy, trong điều kiện nhiệt đới ẩm, sau 48h, có thể phát hiện được aflatoxin [15]

1.4.3.4 Ảnh hưởng của các yếu tố hóa học đến khả năng sinh độc tố aflatoxin

- Nguồn cacbon

Đường đơn giản như glucose, fructose, saccharose, hoặc sorbitol tăng cường sựsản sinh aflatoxin, trong khi các nguồn carbon phức tạp như peptone, galactose,manitol và lactose không có lợi cho sinh tổng hợp aflatoxin Hàm lượng aflatoxin đượcsản sinh còn phụ thuộc vào nồng độ của đường trong môi trường (bảng 2.3) [40]

Bảng 1.3 Ảnh hưởng của các đường hexose đến hàm lượng aflatoxin [15], [19]

- Nguồn nitơ

A flavus và A parasiticus có khả năng đồng hóa muối amoni và nitrat Có

những loài nấm không phát triển được trên môi trường có muối amoni, do khi cơ thểđồng hóa NH4+ trong môi trường sẽ tích lũy các anion SO42-, HPO42-, Cl- thì hạ thấp pHcủa môi trường, ngược lại khi đồng hóa nitrat thì môi trường sẽ tích lũy các ion kiềm

làm tăng pH của môi trường A flavus đồng hóa được cả amoni và nitrat, tuy nhiên

trong môi trường amoni thì lượng aflatoxin sản sinh ra nhiều hơn [10], [54]

Nghiên cứu ảnh hưởng của các acid amin đến sự tạo thành aflatoxin bởi

A flavus người ta thấy glutamic, prolin kích thích sự tạo thành các aflatoxin B,

trytophan kích thích sự tạo thành các aflatoxin G, alanin, asparagin, histidin, lysin,methionin không làm tăng khả năng sản sinh aflatoxin [10]

1.4.4 Hạch nấm và khả năng sinh độc tố aflatoxin

Khi gặp điều kiện bất lợi như khô hanh, môi trường nghèo chất dinh dưỡng, các

sợi nấm tập hợp lại thành một cấu trúc kháng gọi là hạch nấm A flavus chia làm hai

nhóm dựa theo kích thước hạch nấm Nhóm S có kích thước đường kính < 400 msản sinh hàm lượng độc tố aflatoxin cao (Cotty, 1989) Nhóm L có kích thước đườngkính > 400 μm, thường sản sinh aflatoxin ở mức trung bình hoặc ít hơn Chủng S ởThái Lan, Australia, Benin và Argentina sản sinh aflatoxin B1 hoặc aflatoxin B2 vàaflatoxin G Tuy nhiên, ở vùng Đông Mỹ, chỉ có chủng S sản sinh aflatoxin B được

báo cáo Một số nghiên cứu khác chia A flavus làm hai nhóm (Nhóm I và nhóm II).

Tất cả chủng thuộc nhóm I sản sinh aflatoxin B, nhóm II sản sinh cả aflatoxin B vàaflatoxin G Tất cả các chủng thuộc nhóm II đều có kích thước khuẩn lạc thuộc dạng Scòn nhóm I bao gồm cả dạng S và L [28]

1.4.5 Tác hại của aflatoxin

1.4.5.1 Tác hại của aflatoxin đến con người

- Ảnh hưởng cấp tính: Tác động cấp tính của aflatoxin đối với con người xảy rakhi tiêu thụ hàm lượng aflatoxin từ mức trung bình đến cao Biểu hiện cấp tính cụ thểgồm: xuất huyết, nhiễm độc gan nghiêm trọng với tỷ lệ tử vong khoảng 25%, chứngphù, rối loạn hấp thu dinh dưỡng với các triệu chứng như chán ăn, khó chịu, sốt nhẹ.Tác động cấp tính khi tiếp xúc với liều lượng cao có thể tiến triển thành viêm gan gâyđau bụng, nôn mửa, vàng da, gan nổi hạt u nhỏ và cuối cùng là tử vong [46]

- Ảnh hưởng mãn tính:

Ảnh hưởng mãn tính là kết quả từ việc tiêu thụ aflatoxin ở liều thấp hoặc vừaphải, các dấu hiệu lâm sàng khó nhận biết [46] Aflatoxin B1 được xem như là mộtnguyên nhân gây ung thư biểu mô tế bào gan đồng thời với việc nhiễm vi rút viêm gan

B [21] Cho đến nay, người ta tạm thời công nhận khả năng tác động lên tế bào gancủa aflatoxin qua 5 giai đoạn:

- Tác động qua lại với DNA và ức chế các polymeraza chịu trách nhiệm tổnghợp DNA và rDNA

- Ngừng tổng hợp DNA

- Giảm tổng hợp DNA và ức chế tổng hợp rDNA truyền tin

- Biến đổi hình thái nhân tế bào

- Giảm tổng hợp protein [51]

Hậu quả của quá trình tác động sinh hóa lên tế bào gan này là gây ung thư biểu

mô tế bào gan Dữ liệu tổng hợp từ Kenya và cộng sự, Thái Lan, cho thấy mối quan hệ

giữa lượng aflatoxin trong chế độ ăn uống từ 3,5 - 222,4 mg/kg thể trọng cơ thể/ngày

và tỷ lệ ung thư gan nguyên phát (1,2 - 13 trường hợp trong 100000 người mỗi năm).Aflatoxin B1 cũng liên kết hóa học với DNA và gây ra các thay đổi cấu trúc DNA dẫnđến đột biến gen [40]

1.4.5.2 Tác hại của aflatoxin đến động vật nuôi

Ảnh hưởng của nhiễm độc aflatoxin đối với tất cả các loài động vật là tương tựnhau, tuy nhiên, tính nhạy cảm đối với aflatoxin phụ thuộc vào từng loài, độ tuổi, giớitính, sức khỏe và sự sai khác của các cá thể Các triệu chứng của aflatoxin cấp tính ởđộng vật gồm: trầm cảm, chán ăn, giảm cân, xuất huyết tiêu hóa, phù phổi và tổnthương gan Dấu hiệu của tổn thương gan cấp tính là rối loạn đông máu, tăng độ mỏngcủa các mao dẫn, xuất huyết, thời gian đông máu kéo dài [40]

Aflatoxin B1 có thể được xếp vào hợp chất có độc tính cao cho hầu hết các loàiđộng vật, vô cùng độc hại đối với một số loài dễ nhạy cảm như cá hồi vân, mèo, vịt.Độc tính của aflatoxin B2, G1, G2 tương ứng với khoảng 50, 20 và 10% so với độctính của aflatoxin B1 Các loài động vật khác nhau, tính nhạy cảm thay đổi nên hàmlượng aflatoxin để gây ra ngộ độc cấp tính có giá trị độc tố dao động từ 0,3 - 17,9mg/kg [21]

1.5 Tình hình nghiên cứu độc tố aflatoxin do A flavus sản sinh ra ở Việt Nam và

trên thế giới

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Aflatoxin được phát hiện năm 1960 ở Anh, sau khi xảy ra một dịch bệnh “gà tâyX” Kết quả đã giết chết hơn 100.000 con gà tây và 20.000 vịt con, gà lôi đỏ và gà gô

Nguyên nhân được tìm thấy là do một loại thức ăn từ đậu Brazilian bị nhiễm A flavus

rất nặng Sau khi phân tích các loại thức ăn này bằng sắc ký bản mỏng, người ta pháthiện nhiều hợp chất có khả năng phát huỳnh quang (Jacobesen và cộng sự năm 1993;Rustom năm 1997; Devero năm 1999) [21]

Năm 1962, loại độc tố có nguồn gốc từ nấm A flavus được đặt tên là “aflatoxin” (Sargeant và cộng sự, 1963) Ban đầu, hai thành phần độc tố aflatoxin được nhận dạng

trên sắc ký bản mỏng và được đặt tên là aflatoxin B và aflatoxin G do chúng phát màuhuỳnh quang với hai màu xanh lam và màu lục dưới ánh sáng của tia cực tím (Sargeant

và cộng sự, 1963) [21].

Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật hiện đại, các nghiên cứu

và độc tố aflatoxin không dừng lại ở việc định tính, định lượng mà còn ở mức độ gâyđộc cho vật nuôi và con người khi mắc phải Từ đó, có những nghiên cứu sâu rộng hơn

và có biện pháp kiểm soát hoặc loại bỏ loại độc tố này trong thực phẩm

S.A Bankole và cộng sự (2004) đã nghiên cứu hàm lượng aflatoxin trên lạcrang Nigeria cho thấy: Hàm lượng aflatoxin B1 đã được tìm thấy trong 64,2% các mẫuvới trung bình 25,5 ppb Aflatoxin B2, G1 và G2 đã được phát hiện trong 26,4%, 11,3%

và 2,8% số mẫu Việc tiêu thụ thường xuyên đậu lạc rang có thể gây hại cho sức khỏengười tiêu dùng [25]

K Arrusa và cộng sự (2004) đã nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm, nhiệt độ đến

việc sản xuất aflatoxin và phân lập các chủng A flavus trên hạt lạc Brazil Shami Elhaj

Alssafi Bakhiet và cộng sự (2010), đã khảo sát và xác định hàm lượng aflatoxin tronglạc bảo quản ở Sudan Kết quả cho thấy, 58,33% số mẫu có kết quả dương tính vớiaflatoxin bằng kỹ thuật TLC với hàm lượng độc tố cao [54]

Ngoài ra, nhiều nghiên cứu trên thế giới về các biện pháp làm giảm hàm lượngaflatoxin, đặc biệt là hàm lượng aflatoxin B1, điển hình là nghiên cứu của AlemayehuChala và cộng sự [54] và nhiều nghiên cứu khác

1.5.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Năm 1970, Nguyễn Phùng Tiến và cộng sự đã nghiên cứu mức độ nhiễm nấmmốc trên thóc ở kho bảo quản lương thực miền Bắc Việt Nam và một số lương thựckhác đậu đỗ, lạc [18]

Năm 1997, Nguyễn Thụy Châu và cộng sự đã nghiên cứu tình hình nhiễm độc

tố nấm mốc aflatoxin trên ngô và các biện pháp phòng ngừa, đồng thời đề ra một sốbiện pháp khử độc tố [4 ], [5 ]

Năm 1992 - 1993, Đậu Ngọc Hào đã nghiên cứu sự nhiễm nấm mốc và độc tốaflatoxin đối với gà công nghiệp, đồng thời, sử dụng các hợp chất Amin và NaHSO3

làm giảm hoạt tính aflatoxin B1 trên ngô hạt và khô dầu lạc bị nhiễm nấm mốc [7].Trương Quốc Phú và Dương Thúy Yên đã nghiên cứu ảnh hưởng của aflatoxin

B1 lên cấu trúc mô gan cá tra và cá basa, kết quả cho thấy gan cá tra và cá ba sa bị tổnthương khi thức ăn có chứa hàm lượng aflatoxin B1 từ 10 mg/kg trở lên, mức độ tổnthương càng lớn khi hàm lượng aflatoxin B1 càng cao Đối với cá, thức ăn chứaaflatoxin B1 từ 2,5 mg/kg trở xuống, những tổn thương mô gan không rõ ràng vàkhông khác biệt so với lô đối chứng [17]

Nguyễn Như Viên cũng tiến hành nghiên cứu độc tố nấm mốc, điển hình là

A flavus và kết luận, thức ăn của gia súc trong điều kiện sản xuất và bảo quản hiện nay

bị nhiễm aflatoxin B1 và tiến hành các thí nghiệm kiểm tra hàm lượng aflatoxin B1 gâyđộc cho các động vật như vịt con, gà, lợn, chuột, vịt [56]

Độc chất aflatoxin được tạo ra từ các loại nấm mốc thuộc giống Aspergillus sp., mọc trên các loài ngũ cốc, trong đó Aflatoxin B1(AFB1) chủ yếu do loài A flavus sinh

ra có độc tính rất cao (Nabil Saad, 2004 ; Victoria, 2001 ; Roberts, 2002) [11] Các

loài động vật, kể cả con người, nếu ăn phải thức ăn có chứa AFB1, hoặc sử dụng

nguyên liệu, thức ăn có nguồn gốc từ ngũ cốc bị nhiễm nấm mốc A flavus có thể nguy hại đến tính mạng Nấm A flavus sản sinh độc tố aflatoxin thay đổi theo từng chủng Mặt

khác, nó còn phụ thuộc vào điều kiện xung quanh, sự sản sinh aflatoxin là kết quả của sự

tác động qua lại giữa kiểu gen của chủng đó và điều kiện phát triển của nó [9].

Nhiễm aflatoxin là một vấn đề quan trọng của lạc ở nhiều nơi trên thế giới Nấm

A flavus có thể xâm nhập vào hạt lạc trước thu hoạch, trong thời gian bảo quản nghèo

nàn, lạc bị hút ẩm trở lại và tạo điều kiện thuận lợi cho nấm bệnh xâm nhiễm và gây

Năng suất(tấn/ha)

Sản lượng(triệu tấn)

2008 2009 2010 2008 2009 2010 2008 2009 2010Thế giới 24,0

8 23,91 24,07 1,58 1,53 1,56 38,02 36,60 37,64

Ấn Độ 6,16 5,47 4,93 1,20 1,00 1,10 7,17 5,51 5,64Trung Quốc 4,27 4,40 4,55 3,40 3,40 3,50 14,34 14,76 15,71Indonesia 0,64 0,62 0,62 1,20 1,20 1,30 0,77 0,78 0,79Nigeria 2,33 2,64 2,64 1,60 1,10 1,00 2,87 2,97 2,64Myanma 0,82 0,84 0,82 1,20 1,60 1,40 1,30 1,36 1,14Việt Nam 0,26 0,25 0,23 2,10 2,10 2,10 0,53 0,53 0,49

(Nguồn: faostat.fao.org)

Cây lạc được trồng tập trung ở Châu Á, Châu Phi và Châu Mỹ Trong đó, Châu

Á có diện tích trồng lạc lớn nhất chiếm 63,17%; Châu Phi chiếm 30,80%; Châu Mỹchiếm 5,80% diện tích trồng lạc trên thế giới Qua bảng số liệu cho thấy: Ấn Độ lànước đứng đầu thế giới về diện tích trồng lạc là 4,93 triệu ha (năm 2010), Trung Quốc

là nước đứng thứ 2 khoảng 4,50 triệu ha nhưng sản lượng lại vươn lên đứng đầu thếgiới với 15,70 triệu tấn (năm 2010) Ở Trung Quốc, nhờ có sự quan tâm đặc biệt đếncông tác nghiên cứu và áp dụng những chuyển giao tiến bộ khoa học kỹ thuật trongnhiều năm qua đã làm cho sản xuất lạc có bước phát triển lớn, trong khi năng suất lạc

bình quân của thế giới (năm 2010) là 1,56 tấn/ha thì ở Trung Quốc đạt 3,50 tấn /ha.Bên cạnh đó vẫn có nhiều nước diện tích trồng lạc còn ít như Myanma (0,82 triệu ha),Indonesia (0,62 triệu ha), Việt Nam (0,23 triệu ha) (năm 2010) Năng suất và sảnlượng lạc của các nước chênh lệch nhau khá lớn và không ổn định qua các năm nhưngnhìn chung năng suất lạc của các nước có chiều hướng gia tăng.

1.6.2 Việt Nam

Ở Việt Nam cây lạc được trồng từ lâu đời và được sử dụng rộng rãi trong đờisống hằng ngày của nhân dân ta Hiện nay, lạc được phân bố chủ yếu ở 4 vùng lớn là:trung du và miền núi Phía Bắc, đồng bằng Sông Hồng, Bắc Trung Bộ và duyên hảiMiền Trung, miền Đông Nam Bộ Cả 4 vùng này chiếm đến 3/4 diện tích và sảnlượng, còn lại rải rác ở một số vùng

Trong những năm gần đây, Đảng và nhà nước ta đã có những chủ trương vàchính sách khuyến khích, đầu tư phát triển sản xuất lạc So với các cây công nghiệpkhác, lạc hiện nay chiếm diện tích khá lớn Tình hình sản xuất lạc trong nước tính đếnhết niên vụ 2012 được trình bày ở bảng 1.5

Bảng 1.5 Diện tích, năng suất, sản lượng lạc ở Việt Nam

(nghìn ha)

Sản lượng(nghìn tấn)

Qua bảng 1.5 cho ta thấy: Từ 2004 - 2012 nhờ mở rộng được thị trường tiêu thụ

và áp dụng các tiến bộ kỹ thuật, diện tích và sản lượng lạc đã tăng lên đáng kể, sảnlượng đã đạt được 470600 tấn (năm 2012)

Diện tích trồng lạc ở nước ta trong những năm gần đây không mở rộng mà càng

bị thu hẹp dần (năm 2004 là 263,70 nghìn ha đến năm 2012 cũng chỉ có 220,50 nghìnha) nhưng do áp dụng được các tiến bộ kỹ thuật nên sản lượng lạc đã tăng lên nhiều từ469,00 nghìn tấn (năm 2004) tăng lên 470,6 nghìn tấn (năm 2012)

Tiềm năng để nâng cao năng suất lạc ở nước ta còn rất lớn nhưng để có thể khaithác triệt để tiềm năng này cần đẩy mạnh hơn nữa công tác nghiên cứu và ứng dụngtiến bộ kỹ thuật một cách rộng rãi trong sản xuất, tạo điều kiện để mọi người dân cóthể tiếp thu một cách nhanh chóng nhằm góp phần đưa năng suất lạc của Việt Namsánh kịp với các nước bạn và trên hết là nâng cao được đời sống cho nhân dân.

là một tỉnh thuộc vùng Bắc Trung Bộ Vì có nhiều tiềm năng để phát triểncây lạc nên hiện nay là tỉnh có diện tích trồng lạc lớn nhất cả nước Theo thống kê

sơ bộ năm 2012, diện tích trồng lạc toàn tỉnh hàng năm khoảng 20,10 nghìn ha và sảnlượng đạt 39,70 nghìn tấn Trong những năm gần đây, ở một số vùng sản xuất nôngnghiệp của tỉnh như , , cây lạc được xem là cây chủ lực có hiệu quả kinh tếcao so với các loại cây khác Nông dân đã từng bước thay thế các cây trồng có hiệuquả kinh tế thấp bằng cây lạc Vì vậy, đã góp phần làm cho diện tích lạc ở ngàycàng được mở rộng

Diện tích, năng suất, sản lượng lạc ở đến năm 2012 được thể hiện ở Bảng1.6

Bảng 1.6 Tình hình sản xuất lạc ở

(nghìn ha)

Sản lượng(nghìn tấn)

Trong những năm gần đây, sự gia tăng về diện tích trồng và việc áp dụng cácbiện pháp kỹ thuật thâm canh làm phát sinh ngày càng nhiều dịch hại nguy hiểm, đặcbiệt là nhóm nấm gây bệnh hại gốc rễ, chết cây con gây ra Nhóm nấm này phát sinh

và gây hại trong cả chu kỳ sống của cây trên đồng ruộng và trong kho bảo quản, ảnhhưởng đến chất lượng hạt giống Đây cũng là một trong những nguyên nhân chính dẫn

đến sự giảm sút về năng suất và phẩm chất lạc nhân, ảnh hưởng đến sức khoẻ con người.Bên cạnh đó, người nông dân lại chưa có bất kỳ biện pháp nào mang lại hiệu quảtrong việc phòng trừ, hạn chế tác hại của chúng Chính vì vây, việc chú trọng đến côngtác bảo vệ thực vật trên đồng ruộng và trong kho bảo quản cũng là yếu tố quan trọng

để nâng cao năng suất và chất lượng lạc trước và sau thu hoạch

1.7 Các phương pháp được ứng dụng trong sinh học phân tử:

1.7.1 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction):

Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao của các đoạnDNA mà không cần phải qua tạo dòng Phương pháp này được K Mullis đưa ranăm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988 [52],[53] Đây là phương pháp được thựchiện hoàn toàn trong ống nghiệm và trong một thời gian ngắn có thể thu rất nhiềubản sao DNA

1.7.1.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR:

Phương pháp này được thực hiện trong phòng thí nghiệm với sự hiện diện củaenzyme DNA-polymerase, theo nguyên tắc bán bảo tồn trong nhân bản DNA Sựkhuếch đại được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại Phản ứng xảy ra nhờ enzymeDNA-polymerase Dưới tác dụng của nhiệt độ sợi đôi DNA sẽ biến tính và tách thành haimạch đơn, từ hai mạch đơn làm khuôn ban đầu này sẽ được nhân lên thành 4 mạch DNA,

từ 4 mạch DNA sẽ tạo nên 8 mạch và cứ như thế nhân lên đến vô cùng

1.7.1.2 Thực hiện phản ứng PCR:

Một phản ứng PCR thường gồm có 3 giai đoạn

Giai đoạn 1: nâng nhiệt độ lên cao, thường từ 94 - 95°C Ở nhiệt độ này tất cả cácmạch xoắn kép của DNA được tách ra

Giai đoạn 2: nhiệt độ được hạ nhanh xuống khoảng 50 - 60°C, phụ thuộc vàonhiệt độ bắt cặp (Tm) của primer Ở nhiệt độ này hai primer sẽ bắt cặp với hai sợiDNA cùng theo hướng 5’ – 3’

Giai đoạn 3: nhiệt độ của phản ứng được nâng lên 72°C Ở nhiệt độ này DNApolymerase sẽ hoạt động trong việc kéo dài các mạch DNA Nguyên liệu dùng tronggiai đoạn này là 4 loại dNTP

Cứ sau một chu kỳ gồm 3 giai đoạn như trên từ 1 DNA khuôn sẽ tạo được 2 DNAkhuôn Như vậy, sau 30 chu kỳ phản ứng ta sẽ có khoảng 100 triệu DNA khuôn (228).Ngoài 3 giai đoạn chính, người ta còn thực hiện một chu kỳ khởi động trước khithực hiện các giai đoạn trên và một chu kỳ kết thúc sau khi thực hiện các chu kỳ lặp lại

1.7.2 Phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism):

Phương pháp RFLP - đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt bởi các enzyme giớihạn (restriction enzyme), là phương pháp tạo nên các đoạn cắt khác nhau phân biệtđược bằng điện di đồ, các đoạn cắt còn được gọi là các fingerprinting đặc trưng chotừng phân tử DNA Khi xử lý các mẫu DNA bằng cùng một enzyme cắt giới hạn, cácgen có cấu trúc khác nhau tạo nên số lượng các đoạn cắt có chiều dài khác nhau, cònnhững gen có cấu trúc hoàn toàn giống nhau tạo nên các đoạn cắt giống nhau.

1.7.2.1 Restriction endonuclease:

Trong phân tích genome, restriction endonuclease là nhóm enzyme có nhiệm vụcực kỳ quan trọng Đó là nhóm của DNase, ghi nhận các trình tự đặc biệt củanucleotide, và cắt DNA tại những vị trí rất đặc biệt Người ta xem nó như là chìa khóa

để nghiên cứu kỹ thuật DNA tái tổ hợp (recombinant)

Các enzyme này được nghiên cứu lần đầu tiên vào những năm 1950 Nó bao gồmmột phần của tính chất giới hạn (restriction) viết tắt là R, và một phần của tính chất cảitiến (modification) viết tắt là M Hệ thống R-M trong vi khuẩn giúp bảo vệ nó chốnglại sự xâm nhập của thực khuẩn thể, và những nhân tố di truyền lạ Hệ thống R-M của

vi khuẩn có xu hướng tạo ra một thế cân bằng ở sinh vật tiền nhân (prokaryote) như làmột hệ thống miễn dịch

Hệ thống R-M thường có hai hoạt động chính:

Một là restriction endonuclease, viết tắt là R-Enase, rất chuyên tính tại một vị trínào đó, nó có nhiệm vụ phân hủy DNA ngoại sinh (exogenus DNA)

Hai là modification methylase của DNA, còn được gọi là methyltranferase, còngọi là M-MTase, có sự chuyên tính về chuỗi mã rất đồng nhất M-MTase có nhiệm vụcải tiến và bảo vệ DNA nội sinh (endogenus DNA) không bị phân hủy bởi R-ENase

1.7.2.2 Quy trình phương pháp RFLP:

Quy trình phương pháp RFLP thông thường:

- Tách chiết và tinh sạch DNA

- Cắt các mẫu DNA cần phân tích bởi cùng một enzyme cắt giới hạn

- Điện di và thực hiện phản ứng lai Southern blot

Tuy nhiên, DNA của genome là rất lớn, nên khi cắt bởi enzyme và điện di trêngel ta không thể quan sát được trực tiếp mà phải thông qua kỹ thuật lai Southern blotrất tốn kém và phức tạp Do đó, khi đã biết được sự khác nhau trong trình tự của cácloài lân cận chỉ xảy ra ở một vùng nào đó trong genome thì RFLP dựa trên PCR có thểđược sử dụng để phân biệt các sản phẩm PCR

Quy trình phương pháp RFLP dựa trên PCR:

- Tách chiết DNA tổng số.

- Tiến hành pha loãng mẫu DNA đến một lượng nhất định

- Thực hiện phản ứng PCR với các cặp primer chuyên biệt để khuếch đại trình tự đích

- Tiến hành cắt các sản phẩm PCR bằng các enzyme cắt giới hạn

- Phân tích trên gel các sản phẩm PCR đã được cắt

Ưu điểm của phương pháp RFLP-PCR so với phương pháp RFLP thông thường:

- Cần lượng DNA ít

- Có thể đọc được kết quả trực tiếp bằng mắt thông qua điện di trên gel

- Không cần phải sử dụng các đoạn dò phức tạp và tốn kém

1.7.3 Phương pháp đọc trình tự:

1.7.3.1 Nguyên tắc phương pháp đọc chuỗi mã Sanger:

Phương pháp đọc chuỗi mã Sanger dựa trên sự tổng hợp sợi DNA bổ sung củasợi cần được xác định trình tự Trong phản ứng tổng hợp sợi bổ sung,dideoxynucleotide được bổ sung vào thành phần phản ứng Dideoxynucleotide(ddNTP) là các deoxynucleotide đã được khử nhóm OH ở đầu 3’, khi deoxynucleotidegia nhập vào chuỗi, sự kéo dài chuỗi sẽ ngưng lại

1.7.3.2 Nguyên tắc giải trình tự gen bằng máy sequencer:

Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gen tự động dựa trên cơ sở phương phápdideoxy Máy đọc trình tự cả trên hai mạch đơn, do vậy có thể phát hiện và giảm cácnhầm lẫn do kỹ thuật Cả hai loại primer xuôi và ngược đều được sử dụng để đọc cảhai mạch đơn DNA [3]

Giải trình tự theo phương pháp tự động không phải dùng chất phóng xạ mà sửdụng các chất huỳnh quang để đánh dấu DNA, máy sequencer có thể phát hiện cùngmột lúc hiện tượng huỳnh quang ở bốn độ dài sóng khác nhau [3]

1.7.3.3 Đọc trình tự sản phẩm PCR:

1.7.4 Một số phương pháp được sử dụng trong xây dựng cây phả hệ:

1.7.4.1 Phương pháp Neighbors-joining:

Đây là chương trình vẽ cây phả hệ nằm trong chương trình ClustalX, hoặc làchương trình neighbor trong gói phần mềm Phylip 3.61

Phương pháp này có thể làm giảm tối thiểu tổng chiều dài của cây

Phương pháp này bắt đầu từ một cây có hình sao, không có nhóm OTUs

(Operational Taxonomic Unit – đơn vị tiến hóa – cá thể) và chỉ có một nhánh(node) Y

Tách những cặp OTUs giống nhau nhất ra khỏi node Y và các nhánh khác bằngcách thêm một node X và nhánh trung gian nối X và Y lại Như vậy node Y chỉ còn

là node chung cho những OTUs còn lại

1.7.4.2 Phương pháp Maximum Parsimony:

Đây là chương trình nằm trong gói phần mềm Phylip 3.61, được phát triển đầutiên cho các trình tự protein

Nguyên tắc của phương pháp: xác định kiểu hình nhánh của cây sao cho sự thayđổi về mặt tiến hóa (sự thay thế nucleotide hay protein) là nhỏ nhất để giải thíchnhững khác biệt được quan sát giữa các OTUs Cây sử dụng những tập ký tự rời rạc và

có con đường dẫn tới những tập ký tự đó ngắn nhất là cây tốt nhất

Phương pháp này không cho ta chiều dài nhánh mà chỉ cho cách sắp xếp và thứ

tự nhánh

1.7.4.3 Phương pháp Bootstrap:

Là phương pháp dùng để đo lường độ tin cậy của một node nào đó trong cây phả

hệ Nhưng đây không phải là thước đo sự tốt xấu cho cả cây phả hệ

Chương trình sử dụng:

- ClustalX: Bootstrap N – J Tree

- Phylip 3.61: seqboot (tạo dữ liệu Bootstrap từ đầu vào (input) là tập tin sắpgoing cột đa trình tự có định dạng là phylip [*.phy], consense (tạo cây bảo tồn trong

100 cây được tạo ra từ dữ liệu Bootstrap)

Quy luật như sau

- 70 – 100 % là tốt

- 30 – 70 % khó kết luận

- 0 – 30 % là xấu

1.8 Cơ sở của việc sử dụng vùng ITS-rDNA trong nghiên cứu sự đa dạng di

truyền của nấm A flavus:

1.8.1 Giới thiệu về vùng rDNA:

Những gen mã hóa rRNA được tìm thấy trong vùng rDNA Sản phẩm của nhữnggen này (rRNA) kết hợp với những phân tử protein hình thành những ribosom có chứcnăng tổng hợp protein Do nhu cầu tổng hợp protein cao, có nhiều bản sao của gen nàytrong các genome khác nhau (E coli có 7 bản sao, và người có khoảng 200 bản saotrong tế bào đơn bội) Ở eukaryote, có hai tiểu đơn vị gồm một tiểu đơn vị nhỏ (smallsubunit - SSU tổng hợp từ gen 18S) và một tiểu đơn vị lớn (large subunit - LSUtổng hợp từ gen 28S, 5,8S và một gen 5S, nhưng thường chỉ có gen 28S được nhắc đếnnhư là gen tổng hợp LSU)

Ribosom DNA chứa vùng 18S, ITS1 (internal transcribed spacer), 5,8S (một tiểuđơn vị ribosom nhỏ hơn trở thành một phần của LSU), ITS2, 28S và vùng IGS(intergenic spacer) Vùng phiên mã 18S kết thúc tiểu đơn vị nhỏ (SSU), trong khi 28Scộng với 5,8S và một gen 5S thêm vào từ những thành phần khác của genome hìnhthành tiểu đơn vị lớn (LSU) của ribosom RNA Những vùng ITS được phiên mã (tổnghợp từ RNA), nhưng bị cắt trước khi rRNA hoàn thiện được hình thành, mặc dù chúng

có thể có một chức năng trong sự hình thành ribosom Ở đầu 5’ của 18S và đầu 3’ của28S, cũng có một vùng được biết đến là ETS (external transcribed spacer) Toàn bộvùng này bao gồm ETS-18S-ITS1-5,8S-ITS2-28S-ETS dài khoảng 13000 bp ở người

và lặp lại 200 lần trong mỗi genome đơn bội, và hình thành tiền rRNA 45S Giữa mỗicassette của gen có một vùng gọi là IGS (intergenic spacer) Vùng này kém bảo tồnnhất của rDNA Vùng IGS là quan trọng bởi vì nó chứa trình tự kết thúc phiên mã củanhững gen rRNA

Hình 1.4 Sơ đồ vùng rDNA-ITS của nấm

Những gen rRNA ở sinh vật có nhân điển hình (còn được gọi là ribosomal DNAhoặc RNA) được tìm thấy ở những phần đơn vị lặp lại được sắp xếp thành cặp, nằm tạivùng chromosom Vùng này được biết đến như vùng tổ chức nhân (NORs) Mỗi đơn vị lặplại chứa một vùng phiên mã (có những gen rRNAs như 18S, 5,8S, và 26S và những vùngphiên mã bên ngoài như ETS1 và ETS2) và một vùng không phiên mã (NTS)

Trong vùng phiên mã, ITS được tìm thấy trên gen 5,8S rRNA bao gồm ITS1

và ITS2

1.8.2 Sử dụng vùng rDNA để nghiên cứu sự đa dạng di truyền:

rDNA chứa những vùng bảo tồn (18S, 28S, 5,8S) cũng như những vùng ít bảotồn (ITS) và những vùng biến động hơn (IGS) Những vùng này có thể được sử dụng

để phân tích sự đa dạng về di truyền và sự phát sinh loài của sinh vật Trình tự củavùng này cũng được sử dụng để tìm ra và xác định sự biến thiên số lượng của nhiềuloài hoặc nhóm nấm

Vùng ITS1 và ITS2 được tìm thấy giữa gen của tiểu đơn vị ribosom nhỏ (18S) vàtiểu đơn vị lớn (28S) chỉ ra sự biến thiên trong cùng loài Khuếch đại vùng ITS nàysau đó phân tích bằng các enzyme cắt giới hạn, được sử dụng để phân tích sự khácnhau của các loại nấm Vùng ITS2 khám phá sau vùng ITS1, và vùng ITS2 có tínhbảo tồn cao hơn ở một vài vùng tương đồng của vùng 18S Vùng IGS thậm chí chothấy sự biến động lớn hơn và IGS-RFLP (giống với ITS-RFLP) đã được sử dụng đểnghiên cứu sự đa dạng di truyền trong cùng loài

Gen rDNA 16S mã hóa một phân tử RNA hình thành tiểu đơn vị ribosom nhỏcủa vi khuẩn điển hình (thành phần protein của tế bào) Trình tự của gen này thích hợp16S là một mô hình phổ biến để nghiên cứu sự tiến hóa và phân loại vi khuẩn GenerDNA được tìm thấy ở hầu hết các dạng sống (ngoại trừ virus và prion) Các thànhphần của trình tự rDNA từ những sinh vật có quan hệ với nhau được đánh dấu giốngnhau Điều này có nghĩa, trình tự của những sinh vật thân cận đã được sắp xếp, làmcho những khác biệt được dễ dàng đánh giá Điều đó cũng có nghĩa là chỉ một vàinhóm primer PCR là cần thiết để khuếch đại gen rDNA từ bất cứ loài nấm nào Trình

tự rDNA của 16S đã được xác định cho nhiều loài

Chiều dài và trình tự của những vùng ITS của rDNA được cho rằng là vùng tiếnhóa nhanh nhất và vì vậy có thể rất biến đổi Những universal primer được thiết kế từnhững vùng bảo tồn nằm hai đầu vùng ITS và vùng ITS có kích thước nhỏ (600- 700bp) dễ dàng được khuếch đại bởi vì số bản sao lớn (lên tới 30.000 bản sao trên một tếbào (Dubouzed and Shinoda, 1999) của vùng lặp lại trên rDNA Điều này làm chovùng ITS trở thành một đề tài được quan tâm cho việc nghiên cứu về sự tiến hóa vàphát sinh loài cũng như những nghiên cứu về địa lý sinh vật (biogeographic) [24],[38],[39]

1.9 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):

HPLC là một phương pháp tách và phân tích các hợp chất được sử dụng rộng rãi

và phổ biến nhất hiện nay vì nhiều lí do: có độ nhạy tương đối cao, có khả năng địnhlượng tốt, thích hợp cho việc tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ bị phân hủy nhiệt,

có phạm vi ứng dụng trải rộng trong nhiều lĩnh vực từ nghiên cứu khoa học trong cácphòng thí nghiệm đến công nghiệp và một số lĩnh vực khác

Hợp chất có thểphân tích bằng sắc ký lỏng như acid amin, protein, acid nucleic,hydrocacbon, carbohydrate, thuốc kháng sinh, thuốc trừ sâu, các hợp chất vô cơ… Dựavào sự khác nhau về cơ chế chiết tách sử dụng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao màngười ta có thể phân chia nó ra làm các loại: sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc kýion, sắc ký rây phân tử… trong đó sắc ký phân bố được ứng dụng rộng rãi và phổ biến.Tùy theo độ phân cực pha tĩnh và dung môi pha động, người ta phân biệt: sắc ký lỏngpha thường và sắc ký lỏng pha đảo

- Sắc ký lỏng pha thường: pha tĩnh có độ phân cực cao hơn độ phân cực của dungmôi pha động, dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phântửlượng không lớn lắm

- Sắc ký lỏng pha đảo: ngược với sắc ký pha thường, pha tĩnh có độ phân cựcthấp, pha động có độ phân cực cao hơn Phương pháp này dùng để phân tích các hợpchất từ không phân cực đến phân cực vừa Dung môi sử dụng là dung môi phân cực,trong đó nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền, do đó sắc ký lỏng pha đảo được

sử dụng nhiều nhất

1.9.1 Các thông số của phương pháp sắc ký lỏng

1.9.1.1 Hệ số phân bố:

Cân bằng của một cấu tử trong hệ sắc ký có thể được mô tả bằng phương trìnhđơn giản sau:

A pha động A pha tĩnh

Hệ số cân bằng K cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố và được tính như sau:

Cs: nồng độ cấu tử trong pha tĩnh

Cm: nồng độ cấu tử trong pha động

S: Pha tĩnh

M: Pha động

K tùy thuộc bản chất pha tĩnh, pha động và chất hòa tan K nhỏ: chất di chuyểnnhanh; K lớn: chất di chuyển chậm

Thông thường K ≥1 để chất có ái lực với pha tĩnh nếu không thì nó sẽ di chuyểnnhanh quá làm cho khó tách Hai chất muốn tách ra khỏi nhau thì phải có K khác nhau.

1.9.1.2 Thời gian lưu tR

Là thời gian để chất phân tích sau khi tiêm vào cột đến đầu dò được tính theocông thức:

1.9.1.3 Hệ số dung lượng

Để mô tả tốc độ lưu của cấu tử hân tích trong cột người ta sử dụng một hệ sốquan trọng gọi là hệ số dung lượng k’

k’ tăng hoặc giảm tùy thuộc độ mạnh của dung môi pha động Trong sắc ký phân

bố pha đảo ngược, độ mạnh của dung môi tăng theo phần trăm chất hữu cơ

Thông thường trong sắc ký phân bố pha đảo ngược, khi giảm dung môi hữu cơtrong pha động 10% thì k’ sẽ tăng lên gấp 2 đến 3 lần

1.9.1.4 Hiệu năng

Khi nói đến hiệu năng của cột là nói đến khả năng tách mũi sắc ký của một cấu

tử trên cột Độ hiệu năng N được biểu diễn như số đĩa lý thuyết của cột N càng lớnhiệu năng tách của cột càng lớn

Với W: bề rộng mũi sắc ký

W1/2: bề rộng của mũi ở phân nửa chiều cao

Số đĩa lý thuyết càng lớn, bề rộng W càng nhỏ, mũi càng nhọn

1.9.1.5 Độ chọn lọc α

Độ chọn lọc α là một thông số rất quan trọng, liên quan tới khả năng tách của cáccấu tử cần phân tích, nó tùy thuộc bản chất của pha tĩnh, pha động

Hai chất tách được khi α # 1 và α càng lớn, khả năng tách càng cao

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến độ chọn lọc như thành phần dung môi pha động,

pH của môi trường, bản chất của pha tĩnh, nhiệt độ Trong đó sự thay đổi pha độngtừdung môi này sang dung môi khác sẽ làm α thay đổi đáng kể

1.9.1.6 Độ phân giải

Độ phân giải (Rs) tùy thuộc vào điều kiện pha động, pha tĩnh và đặc tính của hợpchất cần phân tích mà ta có được sắc ký đồ với những mũi phủ lên nhau hoặc tách hẳnnhau Độ phân giải Rs là một thông số dùng để đánh giá mức độ tách phổ, khả năng táchcủa các mũi sắc ký sẽ có ý nghĩa quan trọng trong việc phân tích một cách định lượng

Phương trình trên thích hợp cho việc tính Rs khi 2 mũi tách hẳn nhau (Rs ≥1,5).Trong trường hợp Rs nhỏ hơn, tức mũi bị trùng lấp thì việc xác định W1và W2

sẽ khó khăn hơn là W1/2(1) và W1/2(2) lúc này Rs sẽ được tính theo:

1.9.2 Giới thiệu các bộ phận của thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao:

Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận chính: bơm, bộ phậntiêm mẫu, cột sắc ký phân tích, đầu dò, bộ phận điều khiển và xử lý số liệu

Nguyên lý hoạt động: mẫu sau khi được tiêm vào cột sẽ được pha động lôi kéoqua cột Dựa vào khả năng tương tác khác nhau giữa các chất có trong nền mẫu với

pha tĩnh và pha động mà chúng được tách ra khỏi nhau và sau khi ra khỏi cột sẽ đượcghi nhận bởi bộ dò cụ thể.

Sắc ký lỏng có thể ghép với nhiều loại đầu dò khác nhau như đầu dò phổ tử ngoạikhả kiến UV-Vis, đầu dò huỳnh quang FLD, đầu dò chỉ số khúc xạ RID, đầu dò điệnhóa ECD, đầu dò khối phổ MS… Hiện nay đầu dò khối phổ được ứng dụng rộng rãitrong phân tích vết và các hợp chất nhận danh chính xác

Tùy theo tính chất của chất cần khảo sát mà ta có thể chọn lựa pha tĩnh, pha động(bảng 1.7)

Bảng 1.7 Loại cột, pha tĩnh, pha động và hợp chất phân tích thông dụng.

Để định lượng anthocyanin trong các dịch trích bằng phương pháp HPLC người

ta còn kết hợp đầu dò UV/Vis với đầu dò ECD Không giống HPLC bán định lượng

chỉ để làm sạch, HPLC- UV/Vis- ECD dùng để phân tích Chất phân tích được tiêm tựđộng và cùng với pha động tới cột Các hợp phần khác tương tác khác nhau với phatĩnh và pha động Chất phân tích sau khi được rửa giải đi đến detector một cách riêngbiệt Phương pháp HPLC-UV/Vis-ECD có một số đặc điểm sau:

Pha động:

Pha động trong HPLC được đưa liên tục vào hệ thống Pha động có thể theochương trình gradient dòng hoặc đẳng dòng, nhưng pha động cố định thường mất thờigian lâu và khó tách các mũi Hiện nay thường dùng nhất là dạng gradient Khi rửagiải trong sắc ký pha đảo, lượng dung môi hữu cơ tăng dần lên Tại lúc tiêm mẫu, mộtlượng pha động yếu hơn đi vào hệ(ít hợp phần hữu cơ hơn) Sau đó lại tăng tỉ lệ hữu

cơ trong pha động lên để rửa giải tất cả những chất bị giữ lại ở pha tĩnh

Cột:

Có nhiều loại pha tĩnh khác nhau, dẫn đến cơ chế rửa giải cũng khác nhau Trongnghiên cứu này sử dụng cột pha đảo với pha tĩnh không phân cực và pha động phâncực Pha tĩnh chứa các hợp phần giống RMe2SiCl với R là các nhóm alkyl (C18H37hoặc C8H17) Hợp phần không phân cực có ái lực với pha tĩnh nên thời gian lưu dàihơn Thời gian lưu có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi độ phân cực của pha động.Đường kính trong của cột lớn tạo sức chứa lớn, được dùng trong HPLC bán điều chế

để làm sạch anthocyanin Cột phân tích dùng trong HPLC-UV/Vis-ECD có đườngkính trong ID nhỏ hơn (C18250 x 4.6mm)

1.10 Các công trình nghiên cứu đã có của các tác giả trong và ngoài nước liên quan mật thiết đến đề tài luận văn

1.10.1 Những nghiên cứu trong nước

Bằng phương pháp Sắc ký lớp mỏng, Bộ môn vi sinh vật thuộc Viện công nghệ sau

thu hoạch đã kiểm tra 50 mẫu nấm A flavus phân lập từ lạc, kết quả có 41 mẫu nấm chứa độc tố aflatoxin B1(chiếm 82%) Điều này chứng tỏ rằng đa số các dòng nấm A flavus

xâm nhiễm và gây bệnh trên lạc đều có khả năng sinh độc tố aflatoxin [13] Kết quả lây

nhiễm nấm A flavus trên 41 hạt giống lạc và dòng lai của Viện Bảo vệ thực vật cho thấy

100% hạt giống đều nhiễm bệnh biến động từ 8-100% trong đó giống Cúc bị nhiễmnặng [12]

Nấm mốc độc A flavus gặp nhiều ở các loại lương thực, thực phẩm khác nhau,

nhưng các loại hạt có dầu (đặc biệt là lạc) thích hợp nhất cho sự phát triển của nó, vàcũng ở lạc độc tố aflatoxin hình thành mạnh nhất Người ta nghiên cứu hơn 1000 mẫulạc thí nghiệm thì thấy hạt lạc có 3,3% số củ là rất độc – 1kg chứa trên 0,25mg

aflatoxin B1 (độc tố chủ yếu của A flavus) và 21,7% số củ độc vừa, 75% số củ không