Các bước cơ bản của Phương pháp tách chiết DNA

Các bước cơ bản của Phương pháp tách chiết DNA

HOÀNG THỊ DUNG LỚP K33C – KHOA SINH – TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

BÀI TIỂU LUẬN MÔN CÔNG NGHỆ GEN

1.1.1.Các bước cơ bản của Phương pháp tách chiết DNA:

- DNA có kích thước lớn do đó cần tránh các tách nhân gây đứt gãy.

- DNA genome (ĐV, TV) sau khi tách chiết phải có kích thước lớn (15kb-300kb).

• Phương pháp tách chiết cơ bản gồm 4 bước chính sau:

 Bước 1 Phá vở màng tế bào và màng nhân Ở tế bào ĐV hoặc TV, bằng cách nghiền tế bào hoặc mô trong nitơ lỏng – 1960C hoặc dùng hỗn hợp chất tẩy (SDS, Sarcosyl) và proteinase K.



Loại bỏ thành phần không mong muốn trong

mẫu, như các protein, polysaccharide Mẫu được bổ sung hỗn hợp dung dịch (phenol: chloroform: isoamine tỉ lệ 25:24:1), lắc mạnh cho đến khi dung dịch có dạng trắng sữa.

- Protein sẽ bị biến tính và kết tủa

- DNA, RNA được hoà tan trong nước.

Sau ly tâm cao tốc hỗn hợp dung dịch chia làm 3 pha:

+ Pha trên cùng là pha nước chứa DNA, RNA

+ Pha giữa là pha chứa protein và các chất thứ cấp bị kết tủa

+ Phá dưới là dung dịch phenol: chloroform: isoamine

 Bước 3 Tủa axít nucleic

+ Tủa bằng ethanol tuyệt đối (tỉ lệ 2:1), tủa tốt nhất ở - 20oC trong 30 phút hoặc

ở 0oC qua đêm Hầu như toàn bộ các phân tử axít nucleic đều kết tủa

+ Tủa bằng isopropanol (tỉ lệ 1:1) ở 0oC, các phân tử DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị kết tủa

>>> Sau đó ly tâm ta sẽ thu được cặn (DNA, RNA), cặn được rửa bằng cồn 70% để loại bỏ muối và isopropanol còn lại

 Bước 4 Hoà tan căn (DNA, RNA) và xử lý loại bỏ RNA bằng enzyme Ribonuclease Sau đó kết tủa lại được DNA