Các bước cơ bản của phương pháp lai Southern và ứng dụng
Trang 1Họ tên: Vũ Thị Hà Lớp : K33C_Sinh Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2
Bài tiểu luận: Các bước cơ bản của phương pháp lai Southern
và ứng dụng.
- Phương pháp lai Southern là phương pháp lai DNA với mẫu dò (DNA)
- Gồm các bước:
+ Tách chiết DNA nghiên cứu ra khỏi mô, tế bào Sử dụng các enzyme giới hạn cắt DNA để tạo ra hỗn hợp các đoạn DNA có kích thước khác nhau
+ Tiến hành điện di hỗn hợp sản phẩm đã bị xử lý bởi enzyme giới hạn trên gel agarose (nồng độ agarose 0.8%; đệm TBE
(Tris-Borat-EDTA), hiệu điện thế 1.5 V/cm chiều dài bản gel)
+ Biến tính các băng DNA kép trên gel điện di bằng cách xử lý gel đã chạy điện di với khoảng thời gian 20p trong dung dịch NAOH 0.4M để tạo thành các DNA mạch đơn
+ Chuyển các đoạn DNA mạch đơn từ gel sang màng lai (màng nitrocellulo, hoặc nilon filter) bằng hệ thống tạo mao dẫn (máy Bloting) Dung dịch dẫn truyền là NAOH 0.4M Vị trí của các đoạn DNA đơn được giữ chặt trên màng lai
Trang 2+ Các đoạn DNA cố định trên màng lai được đem lai với dung dịch mẫu dò (DNA probe) đã được đánh dấu bằng P32, hoặc phản ứng tạo màu Quá trình này được thực hiện ở buồng lai có nhiệt độ 650C – 680C, trong thời gian từ 6- 12 giờ
+ Rửa màng lai bằng lai bằng hỗn hợp Nacl, Natricitrat và nước cất ở nhiệt độ 650C từ 2-3 lần Thấm khô bằng giấy thấm hoặc sấy khô ở nhiệt
độ 650C
+ Xác định vị trí lai nhờ kĩ thuật phóng xạ tự ghi Nơi xảy ra phản ứng lai sẽ phát quang và chụp được nhờ phim X quang Nơi phát quang
sẽ thể hiện là vệt đen sau khi rửa phim X quang, và đó là vị trí lai DNA
Trang 3*) Ứng dụng của phương pháp lai Southern:
+ Ứng dụng để phát hiện đoạn gen cụ thể (ví dụ: phát hiện sự có mặt và số bản sao trong cây chuyển gen)
+ Phát hiện đoạn gen tương đồng từ các cơ thể khác nhau
Trang 4+ Dò tìm một gen mục tiêu trong hệ gen của sinh vật nghiên cứu + Xác định độ lớn của DNA
+ Kỹ thuật Southern là phuơng pháp chuẩn để áp dụng thành công trong nghiên cứu sự đa hình của DNA và đánh giá sự đa hình của các đoạn giới hạn được gọi là kỹ thuật RFLP