Các loại mẫu dò và phương pháp đánh dấu

Các loại mẫu dò và phương pháp đánh dấu

Các loại mẫu dò và phương pháp đánh dấu

Khái niệm: mẫu dò (probe) là một trình tự

DNA/RNA được đánh dấu phóng xạ hay huỳnh

quang dùng để phát hiện một trình tự axit nucleic xác định, cần tìm

- Mẫu dò có tính đặc hiệu cao: chỉ lai với đoạn axit

nucleic cần tìm theo nguyên tắc bổ sung

- Mẫu dò có độ nhạy cao: là phân tử đánh dấu nên

dễ phát hiện và định lượng

- Mẫu dò chỉ là một đoạn oligonucleotide ngắn

1 Tác nhân đánh dấu mẫu dò

1) Đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ

- Các chất đồng vi phóng xạ thường dùng để đánh mẫu dò

( 32 P, 35 S và 3 H) 32 P được sử dụng nhiều nhất.

+ Ưu điểm: có độ nhạy cao cho tín hiệu mạnh.

+ Nhược điểm: rất độc hại cho sức khoẻ con người và mẫu

dò không sử dụng được trong thời gian dài do chu kỳ bán

rã của các đồng vi phóng xạ

2) Đánh dấu huỳnh quang

- Khắc phục được các nhược điểm của việc đánh dấu

bằng phóng xạ.

+ Ít độc hại cho người làm thí nghiệm, xử lý dễ dàng.

+ Độ nhạy kém hơn

- Hai hệ thống đánh dấu huỳnh quang thông dụng nhất:

+ Hệ thống sử dụng phức avidine-biotine

Mầu dò được đánh dầu bằng biotine, sau khi lai, biotine được phát hiện bằng avidine đã được gắn với nhóm

phát huỳnh quang hoặc 1 enzyme xúc tác phản ứng tạo màu Kết quả là tín hiệu mầu nhận được trên màng lai.

+ Hệ thống dựa trên sự phát quang sinh học

- Trước tiên mâu dò được đánh dấu bằng enzyme

peroxidase (DNA và enzyme hình thành một phức bền vững).

- Sau khi lai, cho màng lai tiếp xúc với 1 cơ chất của

enzyme peroxidase có khả năng phát sáng khi bị

biến đổi Ánh sáng phát ra in dấu ấn lên phim.

2 Các phương pháp đánh dấu

1) Phương pháp nick-translation

Nguyên tắc:

- Enzyme desoxiribonuclease I-Dnase I sẽ cắt phân tử

DNA ở nhiều vị trí tạo nhiều vết đứt trên 2 sợi đơn.

- Từ những vết đứt này, DNA polymerase I một mặt “gặm”

dần mạch bị cắt theo chiều 5’-3’ (nhờ hoạt tính

exonuclease 5’-3’), mặt khác lại tổng hợp bù đoạn bị

thiếu.

- Trong 4 loại (dCTP, dTTP, dATP, dGTP) cần đánh dấu 1

loại là được.

- KQ: DNA được đánh dấu trên khắp chiều dài phân tử

- Sau phản ứng các dNTPs tự do được loại bỏ.

2) Phương pháp

random priming

- Mồi ngẫu nhiên sử dụng ở đầy là các đoạn oligonucleotide

- dài 6 nucleotide

3) Phương pháp đánh dấu các oligonucleotide

* Đánh dấu ở đầu 5’

- Các oligonucleotide được tổng hợp dưới dạng mạch đơn rồi đánh dấu ở đầu 5’ nhờ enzyme T4 polynucleotide kinase với sự hiện diện của một nucleotide đánh dấu ở vị trí 

P

A - P P P32

T4 polynucleotide kinase

* Đánh dấu ở đầu 3’

4) Phương pháp tạo mẫu dò RNA

3 Ứng dụng của mẫu dò (probe)

- Sử dụng mẫu dò để phát hiện sự có mặt của

gen quan tâm ở các cơ thể sinh vật khác nhau

- Kiểm tra mức độ biểu hiện của gen quan tâm ở

các cơ quan khác nhau, giai đoạn sinh trưởng khác nhau, điều kiện môi trường khác nhau.

- Sử dụng mẫu dò để kiểm tra sinh vật biến đổi

gen:

+ Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển

+ Kiểm tra mức độ biểu hiện của gen chuyển